Abstract
Membranprotein transport på den enda proteinnivå undviker fortfarande detaljerad analys, om substratet flyttad är icke-electrogenic. Betydande ansträngningar har gjorts på detta område, men tekniker som gör det möjligt automatiserad transportanalys med hög genomströmning i kombination med lösningsmedelsfria lipiddubbelskiktet teknik som krävs för analys av membrantransportörer är sällsynta. Denna klass av transportörer är dock avgörande för cell homeostas och därför en viktig mål inom läkemedelsutveckling och metoder för att få nya insikter desperat behov.
Den här presenterade manuskript beskriver upprättande och hantering av en ny biochip för analys av membranproteinmedierad transportprocesser vid enstaka transportör upplösning. Den biochip består av mikrokaviteter omges av nanoporer som är mycket parallellt i sin design och kan framställas i industriell kvalitet och kvantitet. Protein-hyser liposomer kan direkt appliceras påspånytan bildar själv monterade por överbryggande lipiddubbelskikt använder SSM-tekniker (fast stöd lipidmembran). Pore överbryggande delar av membranet är fristående, vilket ger det gränssnitt för substrat translokering in i eller ut ur håligheten utrymme, vilket kan följas av multispektralt fluorescerande avläsning i realtid. Inrättandet av standardrutiner (SOP) gör det möjligt att enkelt upprättande av protein hyser lipiddubbelskikt på spånytan av praktiskt taget varje membranprotein som kan beredas funktionellt. Den enda förutsättningen är att inrätta en fluorescerande avläsningssystem för icke-electrogenic transport substrat.
Hög-content screening program är accomplishable genom användning av automatiserade inverterade fluorescerande mikroskop inspelning flera chips parallellt. Stora datamängder kan analyseras med hjälp av fritt tillgängliga skräddarsydda analysprogram. Tre färger flera spektrala fluorescerandeutläsning dessutom möjliggör opartisk diskriminering data i olika händelseklasser, vilket eliminerar falska positiva resultat.
Chip-teknik är för närvarande baserad på SiO 2 ytor, men ytterligare funktionalisering med hjälp av guldbelagda spånytor är också möjligt.
Introduction
Analysen av membranproteiner har blivit av allt större intresse för grundläggande och läkemedelsforskning under de senaste 20 åren. Utvecklingen av nya läkemedel beror på identifiering och detaljerad karakterisering av nya mål, för närvarande är en av de begränsande faktorerna. Det faktum att omkring 60% av alla läkemedelsmål är membranproteiner 1, gör utvecklingen av tekniker för att belysa deras funktion viktigast.
I det förflutna, har tekniker för att studera electrogenic kanaler och transportörer utvecklats i många 2-4. Icke-electrogenic substrat i motsats presentera en mer utmanande uppgift. De är emellertid av speciellt intresse som de främsta läkemedelsmål, eftersom de kontrollerar flödet av upplösta ämnen och näringsämnen genom cellmembranet och fungerar som nyckel receptorer i signaleringskaskader 5.
Betydande ansträngningar har lagts på utveckling av techniques att studera funktionen av membrantransportproteiner 6, 7. System som använder fasta stödda membran har visat sig vara mest lovande verktyg inom detta område 8-10, inklusive fastfasbundna lipiddubbelskikt, förankrade biskikt 11, 12, microblack lipidmembran 13, 14 och nativa vesikel arrayer 15, 16 för att nämna några. Några av dem är även tillgängliga som kommersiella inställningar 17, 18. Några exempel har publicerats som kombinerar förmågan att studera enstaka membranproteiner på ett mycket parallellt sätt 14, 19, en förutsättning för screening program. Men dessa metoder sällan överbrygga från grundforskning till industriell miljö. Svårigheterna ligger ofta i systemets förmåga att vara automatiserade, kostnadsintensiv produktion och / eller mödosam beredning. Ett tillvägagångssätt overcoming alla ovan nämnda hinder är slutmålet.
Tekniken som presenteras här har utvecklats för att studera membrankanalerna och transportörer in vitro i en kontrollerad miljö på den enda proteinnivå 20-22. Beredning av renade membranproteiner i LUV är mycket mer etablerad än jämförbara metoder för GUVs 23 - 26 eller svart lipidmembran 27. De kan direkt appliceras på spånytan, där dubbelskiktsbildningen sker via en självorganiserande processen. Den glasbotten utformning av nanoporösa chip (1 Fig.) Gör det möjligt för luft mikroskopi, som medger enkel automatisering av systemet. I kombination med en motoriserad skede flera chips kan mätas samtidigt, med varje synfält som innehåller tusentals av slutna hålrum för analys.
Figur 1. Design multiplexerade nanopore biochips. A) En kisel-på-isolator (SOI) skiva är uppbyggd av reaktiv jonetsning. Cirka 1150 enskilda chips tillverkas av varje skiva med samma egenskaper och kvalitet. B) Varje chip omfattar 250.000 enskilda mikrokaviteter med nano öppningar. Skala bar:. 200 um C) Varje hålrum är adresserbara via multispektrala fluorescens avläsning. En oklar topplagerblock de fluorescerande signalerna från buffertreservoaren, vilket gör biochip kompatibel med inverterat fluorescensmikroskop. D) atomkraftsmikroskopi (AFM) imaging avslöjar jämnt anordnade poröppningar och ytråheten hos kiseldioxidskiktet av 3,6 nm (n = 40) optimal för vesikelfusion. Skala bar. 5 pm E) Svepelektron microscopy (SEM) bild visar en tvärsektion genom nanopore som ger tillgång till de femtoliter håligheter inuti kiselchipset. Denna siffra används med tillstånd från 21. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Alla dataanalys utförs med hjälp av gratisprogram för att garantera obegränsat tillträde för slutanvändare. Tidsserier analyseras med fri programvara för bildbehandling och en anpassad bygga kurva analys mjukvara för batch-bearbetning och rättfram korrelation av stora datamängder med flera fluorescerande kanaler och tusentals kurvor.
Modellen protein som används i detta protokoll är mechanosensitive kanalen för stora konduktans (MsCl) kanal protein från E. coli. Den fungerar som en ventil för att frisätta osmotisk chock i naturen, men modifierades på ett sådant sätt att rationellt utformade synthetic funktionaliteter kan kovalent fästas på kanalerna sammandragning sidan. Via laddnings repulsion av den kovalent bundna aktivator (MTSET) kanalen triggas att öppna, vilket skapar en nano-ventil. Små molekyler som joner, vatten, små proteiner, men även små fluoroforer kan tränga igenom kanalen. Här, är det protein som används som modell för att visa förmågan hos systemet att detektera protein-förmedlad translokation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av stora unilamellära vesiklar (LUV)
- Rengör en rundkolv (10 ml volym) med kvävgas för att avlägsna eventuella dammpartiklar. Skölj rundkolv med etanol.
Notera: Rest etanol kan tolereras och inte stör efterföljande steg. - Tvätta en 1 ml glasspruta 4x med kloroform, för att avlägsna eventuell kontaminering. Tillsätt 4 ml SoyPC20 (25 mg / ml i kloroform) till den rundkolv och dopa lipidlösningen med en ytterligare DOPE ATTO 390 till en slutlig koncentration av 0,1 mol-%.
Notera: I stället för DOPE ATTO 390 andra fluoroformärkta lipider eller lipofila färgämnen kan också användas, beroende på tillgängliga excitationskällor. - Ansluta den rundbottnade kolven till en rotationsindunstare. Torka lipidfilmen under 40 minuter vid 300 mbar, 30 ° C vattenbadtemperatur och maximal rotationshastighet, för att bilda en homogen lipidfilm på glasväggen av kolven.
- transfER de kolven till en högvakuumpump och torr lipidfilmen under ytterligare 30 minuter vid rumstemperatur.
- Tillsätt 5 ml buffert (20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8,0; sterilfiltrerades) och 8 glaspärlor (2,7-mm diameter, etanol tvättas och torkas) och kolven. Anslut kolven till rotationsindunstare och rotera utan vakuum vid 50 ° C vid maximal hastighet.
Obs: Glaspärlor mekaniskt förskjuta lipidfilmen från glasväggen, vilket leder till (multilamellär) vesikelbildning. Efter 45 min rotation lösningen verkar mjölkig och ingen kvarvarande lipidfilm bör vara synlig på kolvens väggar. I stället för glaspärlor andra metoder som sonikering kolven i ett vattenbad Sonifier, vortexa kolven eller den milda rehydrering metoden är också tillämpliga. - Överföra kolv under inert gas (argon) till ett ultraljudsbad och sonikeras under 4 min vid rumstemperatur.
Obs! Ultraljudsvågor störa liposomerna, vilket gör dem unilamellära. - Split LUV lösningi 1 ml alikvoter.
- Utföra fem frysnings / upptiningscykler genom frysning av LUV-lösning i flytande kväve, följt av tining vid 40 ° C i ett vattenbad.
Not: Detta leder till bristning och spontan omlagring av enskilda liposomer med varandra, vilket leder till storleksökning. - Vid det sista frys steg lagra alla prover vid -80 ° C.
Notera: LUV kommer att vara stabil i minst 6 månader.
2. Protein Rekonstitution
- Tina en ml LUV alikvot på is. Direkt före beredning, pressa liposomer 17x genom en 400 nm polykarbonatfiltermembran med hjälp av en mini extruder.
Notera: lipidaggregat kommer att tas bort och den slutliga homogen storleksfördelning är uppnådd. - Destabilisera LUV: er genom tillsats av 4% Triton X-100 (v / v) till en slutlig koncentration av 0,25% (volym / volym) och inkubera under 5 min vid 50 ° C.
Obs: Mängden liposomer används i detta steg beror på massan av det renade MsCl G <sup> 22 C som används (se steg 2,3). Rena MsCl G 22 C (härledd från E. coli), såsom beskrivs i detalj i 28. - Blanda renat MsCl G 22 C och detergent-mättad liposomer vid 1:20 (vikt / vikt) förhållande och inkubera under ytterligare 30 min vid 50 ° C.
- För att avlägsna detergent lägga bio-pärlor i Tris-buffert (20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8,0; sterilfiltrerad) till proteinet / liposomlösningen, med 16 mg (våtvikt) bio-pärlor per | il detergent som används för att destabilisera liposomer i steg 2,2.
- Utföra detergent borttagning över natten (16 h) vid 4 ° C på en roterande platta.
Obs: Den konstant blandning av lösningen säkerställer optimal detergentavlägsnande. - Efter avlägsnande tvättmedel butiks proteoliposomer vid 4 ° C och använd för experiment på samma dag.
3. Aktivitetsanalys
- Under protein rekonstituering ta en 100 | il alikvot av detergent-destabiliseras proteoliposome lösning efter avslutad steg 2,3.
- Lägga en volym av kalcein (30 mM) till proteinet-liposom-lösning och inkubera ytterligare 5 min vid 50 ° C.
- Avlägsna detergent från lösningen som beskrivs i steg 2,4 - 2,6.
- Efter avlägsnande tvättmedel jämvikt en storleksuteslutningskolonn (20 ml bäddvolym eller mer) med Tris-buffert (3x bäddvolymen).
Obs: Proteoliposome separation kan utföras vid rumstemperatur, men att hålla provet konstant vid 4 ° C rekommenderas för att säkerställa bästa proteinaktivitet efter fraktionering. - Separata proteoliposomer från fri kalcein genom att tillämpa hela alikvot (200 | il) till storleksuteslutningskolonn. Låt blandningen för att kunna suga in i kolonnen, följt av eluering av de proteoliposomer från kolonnen via kontinuerligt buffert applikation på toppen med hjälp av gravitationsflöde. Observera kalcein innehåller proteoliposomer som en diskret apelsin band i elueringen front. Samla fraktioner av 500 & #181; l.
Obs: Fri kalcein färgämnet eluera efter proteoliposome fraktion med fullständig separation. - Pipett 80 ul av varje fraktion på en mikrobrunnsplatta för fluorescerande utläsning och identifiera den fraktion som innehåller den högsta mängden kalcein innehåller proteoliposomer via fluorescensemission. Detektera fluorescens vid 520 nm med excitation vid 490 nm. Använda proteoliposome fraktionen med den högsta signal för följande aktivitetsanalys.
- Blanda 20 pl av proteoliposome fraktionen med 980 pl trisbuffert i en 1 ml fluorescens kyvett.
- Mät fluorescensemission vid 520 nm (excitation 490 nm) med en spektrofluorometer. Rekord för ett min och sedan tillsätt 25 | il av MTSET ([2- (trimetylammonium) etyl] methanethiosulfonate) från en stamlösning (160 mM) och blanda väl. Håll på inspelningen under blandning. Alltid förbereda stamlösningen färsk direkt före användning.
Obs! När löst i buffert MTSET hydrolyseras inom 30 minuter och kommer att vara icke-reaktiva. MTSET kan vägas och hållas så torrt pulver alikvot vid -20 ° C fram till användning.
Anmärkning: När aktiverat MsCl G 22 C-kanal öppnar och frigör den inneslutna calcein, vilket leder till en lokal koncentrationsminskning av kalcein när effluxing de proteoliposomer och efterföljande dequenching av färgämnet, vilket resulterar i en ökning av fluorescensemissionen. - Efter fluorescensemissionen har nått en stabil platå igen, solubilisera liposomerna genom tillsats av 50 | il Triton X-100 (4% volym / volym).
Obs: Helst kan observeras ingen ytterligare fluorescensökning, vilket innebär aktivt protein i varje liposom.
4. Storleksfördelning Mätning av LUV Använda Nano-partikel spårning
- Observera att endast minimala prover av liposomen eller proteoliposome lösning är nödvändig för analys storleksfördelning med hjälp av nanopartiklar tracker. Späd en liposom lösning av 5 mg / ml lipidkoncentration 1: 5000 (volym / volym) i buffert (20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8,0; sterilfiltrerad) för analys till en slutlig volym av 1 ml. Filtrera alla buffertar som används för spädning och före LUV förberedelse och beredning med hjälp av en 0,2 um membran för att avlägsna eventuella suspenderade partiklar som damm som skulle störa mätningarna storleksfördelning.
- Tvätta flödet-kammare med ultrarent vatten.
- Använd ytmarkörer för att fokusera på ljusstrålen. Injicera cirka 300 pl av det utspädda liposomer provet och stäng omedelbart avfarten ventilen för att stoppa flödet i flödet kammaren, utan att införa luftbubblor.
- Justera fokus och kamerans slutare / förstärkningsinställningar för att säkerställa tillräcklig spridning signal av provet för detektion.
Obs: 20 - 80 signaler bör vara tydligt i synfältet. Förhindra överbeläggning (> 80 signaler) som programmet inte kommer att kunna spåra enskilda signaler när överlappande. - Gå till "Capture" screen. Ställ in temperaturkontrollen på 25 ° C och fånga varaktighet till 90 sekunder med hjälp av kontrollerna programvara. Tryck på "Record" för att börja spela in en tidsserie.
Obs: Efter avslutad tidsserierna ett nytt fönster öppnas. - Spara tidsserierna i det givna formatet (* .avi). Av praktiska skäl under satsanalys spara alla filer i en mapp.
- Öppna utgången ventilen och injicera ytterligare 300 pl i flödet kammaren. Stäng ventilen och upprepa steg från 4,3 till 4,6 gånger.
- Efter att ha avslutat alla provkörningar tvätta flödet kammaren med 5 ml ultrarent vatten. Gå till "Pre-Process" skärm. Ställ in kalibreringsparametrar temperatur = 25 ° C och viskositet = 0,91 för Tris-buffert som används i detta protokoll.
- Öppna satsprocessfönstret och ladda den inspelade tidsserier (Advanced / Batch Process / Set File 1-3). Tryck på "GO" för att starta analysen storleksfördelning.
Obs: de analytiska mjukvaru abonnemangstiskt spårar enskilda partiklar och beräknar deras diameter baserat på deras rörelsebeteende med hjälp av parametrar som i steg 4,8.
Obs: Den resulterande analys storleksfördelningen sparar automatiskt i samma mapp som serien filer gång. - Dessutom skapar en rapport fil att sammanfatta resultaten (Export / Skapa rapport PDF).
5. Chip Holder Beredning
- Väg 1,0 g av MDX4 medicinsk kvalitet elastomer bas och 0,1 g MDX4 härdningsmedel i en 50 ml reaktionsrör. Blanda båda grundligt med ett glas bar.
- Sätta in röret i en exsickator under 1 h för avgasning av limmet. Efteråt använda den inom 30 minuter för spån limning, eftersom limmet härdar och vara alltför svårt att arbeta med.
- Under elastomer avgas (steg 5,1) rengör en objektiv glasskiva noggrant med kloroform för att avlägsna eventuella föroreningar innan chip bindning. Skölj objektglaset med 5 ml kloroform genom att använda en glasspruta. samla inkloroform i en underpositionerade bägare. Efter tvättning låta glid torr.
Obs: Utför detta steg i ett dragskåp. Alternativ till kloroform, kan andra organiska lösningsmedel som aceton också användas. - Deponera en liten mängd av det vidhäftande bindematerialet på täckglas med användning av en pipettspets (kristall tips för 10 | il pipetter). Kom ihåg att markerna måste passa in i 8-kammar diapositivhållaren senare och måste placeras på objektglaset i enlighet därmed.
- Försiktigt bort ett chip i taget från skivan ombord med hjälp av fin spets pincett och deponera chip på droppe lim på täckglaset. Säkerställa att den belagda sidan av chipet är vänd uppåt.
- Tryck försiktigt chip på täckglaset med baksidan av en trubbig PE pincett. För att säkerställa att limmet fördelas jämnt under chipet, skjut försiktigt chip fram och tillbaka. Kritiskt steg: Se till att inga luftbubblor fastnar under chip, eftersom det kommer att störa optisk avbildningav chip håligheter senare. Se också till att inget lim kan fastna i spånytan.
- Uttorka den färdiga täckglas under 2 timmar vid 65 ° C i ett skåp torktumlare.
Note: Chips fortfarande belagd med ett skyddande skikt som kommer från deras tillverkning som behöver tas bort. - För att ta bort det skyddande lagret, utför en sekventiell lösningsmedel tvättsteg. Under härdningen av chips, förvärma ett vattenbad till 54 ° C.
- Placera 3 glasbägare i vattenbadet, två av dem fyllda med isopropanol och en fylld med aceton.
- Sätt spåntäckglaset i en hållare för objekt och dränka den i första isopropanol fylld skålen för 10 minuter. Efteråt överföra den till aceton fyllda skålen, inkubera igen under 10 minuter innan den överförs till det slutliga tvättsteget till det andra isopropanol skålen och inkubera ytterligare 10 min.
- Ta diapositivhållaren från skålen och försiktigt tvätta det i stor utsträckning med Ultrapure vatten, följt av torkning flisen med en mild ström av kvävgas.
- Take-off lamineringsarket från åtta brunnar klibbig-bild och lägg den bakåt på bänken. plocka försiktigt upp locket bilden och tryck försiktigt på den klibbiga-slide med marker inför brunnarna. Låt den färdiga chipshållaren vila i ett par minuter före användning.
6. Assay Framställning
Obs: nanopore chip som limmats på en täckglaset och åtskilda av en 8-väl klibbig-slide har förmånen kan att flera marker tas upp i en enda försökskörning, med marker som helt separerade från varandra.
- Efter chipshållaren förberedelser, skölj varje chip med ren etanol och föna med kvävgas för att avlägsna eventuella föroreningar som damm.
- Rengör spånytan med luft, syre eller kväve plasma. Beroende på vilken typ av plasmarengöringstidsperioder varierar: utföra syrgasplasmabehandling under 1 minut, luft och nitrogen plasma under 5 min vid 0,3 mbar vid 80% effektinställning (RF-effekt medium eller hög).
- Efter plasma rengöring inkubera marker i ren etanol under 10-15 minuter för att säkerställa hålighet vätning.
- Stegvis utbyte etanol för buffert genom att tillsätta 400 | il Tris-buffert (20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8,0; sterilfiltrerat), följt av blandning av lösningen utan att införa luftbubblor och efterföljande avlägsnande av 400 | il. Upprepa denna procedur 12 gånger, för att säkerställa avlägsnande etanol.
Obs: Etanol skulle vara skadligt för liposomer och svävande lipiddubbelskikt. - Dope Tris-buffert (20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8,0; sterilfiltrerades) med 5 mM CaCl2 och 1 pM Oy647 färgämne. Helt ta bort tvättbufferten från chipet och omedelbart lägga det dopade bufferten till chipet. Notera: Chips kommer att täckas med ett tunt buffert film efter tvättbuffert avlägsnande, så chipet inte är i direkt kontakt med luft, vilket garanterar en konstant vätning av håligheterna och spånytan.
- Lägg 1 mg / ml LUV: er eller Proteo-LUV: er i Tris-buffert (20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8,0; sterilfiltrerat) till varje brunn.
Obs: Den slutliga volymen i varje brunn är 300 pl. Överväga efterföljande tillsatser av styr färgämnet och kemiska modifierings MTSET under dopad Trisbuffert tillägg. - För por-överbryggande lipiddubbelskikt bildning på chipytan inkubera chipet under 1 timme vid rumstemperatur med liposomlösningen. Efteråt tvätta varje chip med 4x 400 pl Ca 2 + -fri Tris-buffert.
- Lägga kontrollfärgämnet till varje brunn, med en slutlig koncentration av 5 ^ M. Marker är nu redo för translokation analysen.
7. Assay Setup
- Montera chipshållaren till epifluorescensmikroskop (20X luft mål, långa arbetsavstånd). Fokus på kanten av nanopore chip för att enkelt hitta fokalplan mikro hålrum. När hålrummen står i fokus skanna nanopore array för en region thpå displayer högsta tätningsförhållande.
Obs: Varje inverterat epifluorescensmikroskop kan användas för att utföra chip-analyser. Beroende på det aktuella förstoringsobjektivet (20X - 60X) antalet analyserade håligheter varierar med upp till 9000 hål i en enda synfält med hjälp av 20X förstoring. Luft mål med en lång arbetsavstånd är att föredra. Användningen av inverterade konfokala laserscannande mikroskop (CLSM) är också möjlig, men bildförvärv kan vara den begränsande faktorn på grund av den begränsade skärpedjup. - Optimera chip belysning.
Observera: Se till att båda färgkanaler inte överskrider den maximala gråskalevärdet som inte kan observeras förändringar. För export experiment justera belysning av flyttad färgämnet till 90% av maximal signalkapacitet. Justera styr färgämnet i öppna hålrum till 80-90% av maximal signal kapacitet att tydligt upptäcka läckande membran tätning. - När alla kanaler är justerad starta tidsserierna. Ta bilder varje 10-20 sec under 90 min.
Obs: Detta är tillräckligt för att också följa specifika och ospecifika utflödes händelser. - Initialisera utflöde av det fluorescerande substratet genom tillsats av cystein-specifika, positivt laddad förening MTSET till en slutlig koncentration av 3 mM. Låt åtminstone 5 min experiment runtime innan MTSET Förutom att kunna senare etablera en stabil fluorescerande signal baslinje före kanalöppningen. Alltid förbereda MTSET lösning färsk direkt före användning.
8. Dataanalys
- Öppna tidsseriebildstapel med en standardversion av ImageJ (File / Import / bildsekvens).
- Om fluorescerande kanaler staplas, dela upp kanalerna i enskilda staplar för varje kanal (Bild / Stacks / Stack till bilder).
- Duplicera den första bilden av translokasubstratkanal för ROI (regioner av intresse) identifiering (Bild / Duplicera).
- Konvertera bilden till en binär bild (Bild / Justeringar / tröskeln). Säkerställaatt den algoritm som används visar signaler för alla slutna håligheter utan överlappning pixillationen.
- Automatiskt definiera områden av intresse med partikel Analyzer (Analyze / Analysera Particle). Definiera en minimipartikelstorlek som definieras, för att undvika partikel buller. Kontrollera alternativen "utesluter på kanterna" och "inkluderar hål". Se till att resulterande ROI spegla mikrokavitet gruppsmönstret. Mellanliggande ROI är artefakter, därför ta bort dem. Spara ROI listan.
Obs: Mätning parameter måste ställas in på "area" innan partikelanalys (Analysera / Set Mått / Area) - Öppna Time Series Analyzer plug-in (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/time-series.html), som ändrar storlek alla ROI automatiskt till samma storlek. Re-storlek alla befintliga ROI till en bredd / höjd av 6x6 pixlar och oval form (Timer serien Analyzer / AutoROIProperties). Markera alternativet "Ändra storlek befintlig ROIS". Spara den resulterande listan storlek ROI.
- Öppna ROI manager(Analysera / Verktyg / ROI Manager) och ladda listan storlek ROI för varje kanal av tidsserierna (ROI Manger / Mer / Open). ROI kommer att överlagras. För att analysera signaländring för varje ROI starta Multi mätverktyget (ROI manager / Mer / Multi Measure), välj "Mät alla skivor" och "En rad per skiva" och starta multimätning.
Obs: Mätning parameter måste ställas in på "betyder grå värde" för detta steg (Analysera / Set Mått / Medelvärde gråvärde) - Spara den resulterande tabellen, vilket ger genomsnittliga grå värde för varje ROI i * .txt eller * .xls-format.
- Importera ROI-analys av varje bildkanal i NanoCalcFX via "Importera fil" alternativet. Ställ in "Använd första raden för att namnge serien". Ställ in stegstorleken mellan bilder enligt tidsseriebildupptagningsperioder och välj motsvarande kolumn och decimalkommat.
- Använd "multiple ark" för att automatiskt korrelera grafer individens fluorescent kanaler.
Obs: Händelserna kan nu analyseras och klassificeras med hjälp av informationen som ges av tre färger spektral information. - Montera valda kurvor med hjälp av inbyggd passningsfunktion (fit alternativ).
Obs: Den genomförda utflödet och inflödet ekvation är lämplig för alla monoexponentiellt diffusion drivna händelser och passar gränser kan ställas in. Resulterande hastighetskonstanterna kan ritas med hjälp av histogrammet verktyg eller exporteras för ytterligare data förfining.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Pore överbryggande membran kan lätt skapas på nanostrukturerade spånytan i en självmonterat sätt. den underliggande processen är dock fortfarande känslig och påverkas av många parametrar som liposomstorlek, monodispersitet av liposomen befolkningen, lamellarity, lipid- och saltkoncentration och kemiska ytegenskaper. De flesta av dessa parametrar har noggrant karakteriserats och standardiserade i ovanstående protokoll. Andra parametrar bör dock kontrolleras vid varje nytt preparat, för att säkerställa ett lyckat experiment. Dessa är fördelningen liposomstorleken och befolknings dispersitet (Fig. 2 A). För optimal por överbryggande membranbildning och för att undvika liposomer intrång i hålrummet liposomstorlekar väl över pordiametern är en nödvändighet. Vidare har monodispersa liposompreparat visat sig ge bäst resultat i membran spridnings- och fusipå. En annan avgörande steg som måste kontrolleras för varje beredning är proteinaktivitet efter beredning. Med hjälp av en fluorescens dequenching analys för liposomer ombildade med MsCl G 22 C, kan kanalöppning övervakas via fluorescensspektroskopi, vilket ger ett förhållande av liposomer hyser aktiv MsCl G 22 C-proteinet (Fig. 2 B).
När spridit sig till spånytan, kan lösta translokation av ett fluorescerande mål av MsCl G 22 C vid ligandaktivering följas (Fig. 3 B). Engineered MsCl G 22 C-kanaler är stängda i sin standardläge, infångning små fluorescerande molekyler inuti hålrummet. Genom tillsats av den kemiska modulatorn MTSET positiva laddningar introduceras till förträngningen regionen avden MsCl G 22 C por, trycka den öppna via elektrostatisk repulsion. Den tidigare inneslutna fluoroforen undgår hålrummet för att uppnå diffusion jämvikt. Den efterföljande minskningen av fluorescens inuti kaviteten utrymme kan övervakas. Denna process är mycket reproducerbar, vilket resulterar i en homogen population av utflödeshändelser (Fig. 3 C). De resulterande utflödeskurvor samlas i två distinkta populationer, vilket visar förmågan hos analysen att skilja mellan enkel- och flerkanalsslokahändelser (Fig. 3 D). Dessutom är systemet kunna följa upp till tre spektralt väl åtskilda färgämnen parallellt och i realtid, vilket gör det möjligt att spela in med hög innehålls filmvisningar och diskriminera exakt och objektivt mellan positiva, falskt positiva och negativa resultat. I denna studie 9.046 slutna hålrum analyserades, varav 8% visas efflux beteende. Distribuera de olika fluorescerande utlästa kanaler, kan händelserna diskrimineras i monoexponentiellt utflödes händelser, komplex kinetik, lipid intrång och membran spricker (Fig. 3 E). Endast händelser som visar stabila signaler för styr lösta och membran färgämnet anses för slutlig analys. Komplexa kinetik representerar utflödes händelser med ostadiga styrsignaler och därför utelämnas. Lipid intrång och membranbrott är artefakt händelser i sig som inträffar med användning av pore överbryggande lipiddubbelskikt system. De kan kasseras genom att använda kontrollfärgämnet signaler såsom nämnts ovan (fig. 4).
Figur 2. Storleksfördelning av proteoliposomer och MsCl funktion. A) Blåsor var analyz ed av nanopartikelspårning analys. LUV prover undersöktes före (svart spår) och efter beredning av MsCl G 22 C (röd spår). Efter LUV beredning, en medelpartikelstorlek av 214 ± 70 nm uppnåtts. Storleken minskas under beredning, vilket resulterar i proteoliposomer av 158 ± 60 nm i B) MsCl storlek. Aktivitet validerades efter beredning av en utflödesanalys. 28 Själv kylda kalcein frisätts från proteoliposomer genom MTSET-medierad öppnandet av MsCl kanalen, vilket leder till dequenching av fluoroforen (röd) och en snabb ökning av fluorescensintensiteten. Liposomer utan protein visar ingen sådan utflöde, även efter upprepad MTSET tillsats (svart). Efterföljande detergent-presenterad solubilisering (TX-100) av liposomerna släpper alla tidigare inkapslat färgämne. Denna siffra används med tillstånd från 21.et = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Ligand-gated lösta sloka av MsCl vid enda molekyl nivå. A) Engineered MsCl G 22 C-kanaler är stängda i deras standardläge. Små lösta ämnen, såsom en fluorofor kan inte passera varken genom kanalen eller lipiddubbelskiktet. Vid tillsats av MTSET, konstruerad enda cystein varje MsCl G 22 C protomer blir modifierad, införa flera positiva laddningar i förträngningen sidan av pentakanalkomplexet. Den MsCl G 22 C-kanal trycks öppet av laddningsrepulsion och den inneslutna färgämnet kan diffundera ut ur kaviteten, vilket leder till en minskning i fluorescensintensitet. B) Timig spår av MsCl G 22 C öppning vid tillsättning av MTSET. Proteoliposomer innehållande funktionellt rekonstituerade MsCl G 22 C spreds på chipytan. Oy647 (röd) infångades i hålrummen som transloka substrat. OregonGreen Dextran (70 kDa, grön) tillsattes som kanal ogenomträngligt kontrollsubstrat för att övervaka substratspecificitet av händelsen transport samt membranintegritet under experimentet. LUV kompletterades med DOPE ATTO 390 (0,1 mol%; lila) till kontrollen för lipid kontamination inuti håligheter. Tillsats av MTSET (3 mM slutlig) vid t = 0 sek öppnar kanalen, vilket leder till Oy647 utflöde från hålrummen, registrerades via fluorescens avläsning. C) Slumpvis plockade MsCl G 22 C utflödes kurvor visar typiska utflödes händelser. D) Rate konstanter för transloka händelser (n = 242) kluster i två Gauss befolknings, vilket visar att enkel- och flerkanaliga transport händelser kan särskiljas. E) med hög halt screening och statistisk analys av 9,046 förseglade chip håligheter av triple-färg i realtid avläsning. 8% av alla analyserade chip håligheter visar exponentiell utflödes händelser. På grund av spektral avkodning (red: flyttad lösta, grön: kontroll lösta; violett: lipid), utflödes händelser, komplex kinetik, lipid intrång, och membranbrott kan diskrimineras, vilket eliminerar falsklarm. Denna siffra används med tillstånd från 21. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Händelseklasser kännetecknas av tre färger upptäckt. Flyttad lösta (röd), control lösta (grön) och en lipid färgämne (violett) kan spektralt diskrimineras möjliggör opartisk dataurval. A) Slutna hålrum hyser ingen membranprotein visar inga flödes händelser under försöksbetingelserna beskrivna för MsCl kanal inspelning (se fig. 3A) . Den fluorescerande avläsning är stabil för alla kanaler. B) dåligt definierad suspenderade lipidbiskikt kan tränga kaviteten. C) Membranbrottresulterar i diskontinuerliga lipiddubbelskikt som spänner över nanopore sprickor. Därigenom är kaviteten utrymmet inte längre separeras från buffertutrymmet. Infångade färgämnen (röd) kringgå kaviteten ner koncentrationsgradienten. Styr lösta (grön), som tidigare inte kan passera genom membranet, in i D) Exempel på en lipid intrång händelse hålighet.. Medan den fluorescerande signalen för lipiden färgämne (violett) ökar på grund av att membranet invaderar kavitetsutrymmet, är den transloka löst ämne pushed ur kaviteten (röd), vilket leder till en minskning i fluorescenssignal. Den nanopore är blockerad av lipiddubbelskiktet, vilket förhindrar passage av den kontrollsubstrat (grön). E) Under membranbrott, den inneslutna transport lösta ämnet undflyr snabbt från kaviteten (röd), medan kontroll lösta ämnet diffunderar in (grön). Denna siffra används med tillstånd från 21. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tekniken presenteras här medger en i hög grad parallell analys av membranproteintransport. Rekonstituerade membranproteinsystem kan direkt appliceras på biochip, vilket gör anpassningen av teoretiskt varje membran transportör eller kanal möjlig. Trafikanalys begränsas endast genom inrättandet av ett fluorescerande avläsningssystemet, antingen genom direkt fluorescensförändring (translokation av fluoroforer eller fluorescerande substrat) eller indirekt fluorescens förändring (pH-känsliga färgämnen, sekundära enzymatiska reaktioner). Den senare har dock ännu inte fastställts.
Funktionell karakterisering av membran kanaler eller transportörer på den enda proteinnivå är i fokus för denna teknik. I kombination med ett automatiserat mikroskop, är också möjligt att inrätta screeningsapplikationer för protein effektorer. Analys inställning tillåter parallell inspelning av upp till 8 chips, med flera analyspunkter på varje chip. På grund av fullständig separation av flisen, är det verkligen parallellt, vilket möjliggör flera experimentella upprepningar inklusive kontroller i ett enda försökskörning, när villkoren har fastställts.
Kritiska steg under inrätta ett experiment är framställningen av verkligt unilamellära vesiklar, den aktiva rekonstitution av proteinet enligt val, spridnings effektivitet proteoliposomer på chipytan och inte kvar i den suspenderade lipiddubbelskiktet mot substrat som används i analysen.
Medan framställning av unilamellära vesiklar är av grundläggande betydelse för denna analys för att undvika upprättandet av multilamellära membranark på spånytan under suspenderad lipiddubbelskikt bildning, är det ganska lätt att se till unilamellarity av vesiklarna genom sonikering liposomerna under framställning.
Direkt tillämpning av proteoliposomer är den stora utvecklingen av metoden presented. I motsats till tidigare metoder nu kan riktas mer komplexa och medicinskt relevanta proteiner, kräver naturligtvis att först grunda en beredning protokoll ger funktionellt protein val i LUV. Dessutom, membranproteiner som har stora extra membrandomäner minska bildningen av lämpliga SSMS. Detta måste optimeras för varje nytt protein, t ex genom att variera CaCl 2 koncentration.
Rekonstitueringen förhållandet av proteinet av intresse måste väljas noggrant. Analysen av enskilda proteinhändelser önskas och accomplishable med användning av här presenterade tekniken. Mängden beredda protein bör därför inte överstiga 1-2 funktionellt protein enheter per por överbryggande membran patch antar en idealisk beredning och att membranproteinet stokastiskt fördelade över dubbelskiktet. Dessutom riktverkan av proteinet efter beredning bör även hållas i minnet, eftersom den har not vara lika mellan de båda directionalities.
Slutligen när alla dessa frågor noga kontrolleras och optimeras, kan ingen av de använda substraten visa någon ospecifik membranpermeabiliteten av por överbryggande membran. Positivt laddade fluoroforer, liksom de flesta rodamin baserade färgämnen i den röda spektrala regimen tenderar att snabbt övervinna membranbarriär. Starka hydrofoba interaktioner kan också leda till en ospecifik bindning till det dubbla lipidskiktet. Båda fastigheterna är inte önskvärt.
Studien av jonkanaler på ett kvalitativt sätt är också tänkbara. Screening för kanal effektorer med hjälp av en binär Ja / Nej avläsning kan tänkas använda jon-känsliga färgämnen. Det största hindret här skulle vara att inrätta en åtminstone delvis jon hållande lipidbiskiktet. Detta kan endast kunna uppnås genom ytmodifiering av nanopore chip.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| [2-(Trimethylammonium)ethyl] methanethiosulfonate |
Toronto Research Chemicals Inc. | T792900 | MTSET; hydrolized by water. Keep as dry pouder aliquot at -80 °C. Use immediately (30 minutes) after solubilization in buffer. |
| 1 ml gas-tight syringe | Hamilton | #1001 | |
| 10 ml round flask | Schott Duran | ||
| 2.7 mm glas beads | Roth | N032.1 | |
| 2-Propanole | Roth | 9866.5 | |
| 30 cm Luer-Lock Extension Tube | Sarstedt | 744304 | |
| Acetone | Roth | 5025.5 | |
| Bio-Beads SM-2 Adsorbent | Bio-Rad | 152-3920 | need to be activated before first use |
| CaCl2 Dihydrat | Roth | HN04.3 | |
| Calcein | Sigma | C0875 | store dark at -20 °C |
| Chloroform reagent grade | VWR Chemicals | 22711324 | |
| DOPEATTO390 | ATTO-TEC | AD 390-165 | store dark at -20 °C |
| Ethanol absolute | Sigma-Aldrich | 32205 | |
| Injekt Single-use syringe | Braun | 460 60 51V | |
| Injekt-F single-use syringe | Braun | 91 66 017V | |
| Keck clips | Schott | KC29 | |
| L-α-Phosphatidylcholine, 20% (Soy) | Avanti Polar Lipids | 5416016 | store under inert gas at -20 °C |
| NaCl 99.5% p.a. | Roth | 3957.2 | |
| Nanopore E100 wafer/chips | Micromotive (Mainz/Germany) | available on request | |
| Nucleopore Track-Etch Membrane 0.4 µm | Whatman | 800282 | |
| Oregon Green Dextran 488 (70 kDa) | life Technologies | D-7173 | store dark at -20 °C |
| Oy647 | Luminartis (Münster/Germany) | OY-647-T-1mg | store dark at -20 °C |
| Rotilabo-syringe filtration, unsterile, pore-size 0.22 µm | Roth | P 818.1 | |
| Sephadex G-50 | Sigma-Aldrich | G5080 | column material for size exclusion chromatography |
| Silastic MDX4-4210 | Dow Corning | curing agent for chip fixation onto cover glass support | |
| sticky-Slide 8-well | ibidi | 80828 | multi-well chamber for the mounting onto glass slides (chip holder) |
| Three-way stopcock blue | Sarstedt | 744410001 | |
| Tris Pufferan 99.9% Ultra Quality | Roth | 5429.2 | |
| Triton-X 100 | Roth | 6683.1 | |
| Whatman 0.2 µm cellulose nitrate membrane filter | Roth | NH69.1 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Büchi 461 water bath | Büchi | ||
| Büchi Rotavapor RE 111 | Büchi | ||
| Cary Eclipse Fluorescence Spectrophtometer | Varian | ||
| LiposoFast Mini Extruder | Avestin | ||
| Membrane pump | Vaccubrand | 15430 | |
| Nanosight Nanoparticle Tracking Microscope | Malvern / Nanosight | LM 14C | |
| NyONE microscope | Synentec | available on request | |
| Pump control | Vaccubrand | CVC 2II | |
| Sonicator bath Sonorex RK100H | Brandelin electronic | 31200001107477 | |
| Vaccum pump RC5 | Vaccubrand | 1805400204 | |
| Water bath W13 | Haake | 002-9910 | |
| Plasma Cleaner PDC-37G | Harrick Plasma | PDC-37G | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| ImageJ | Open Source | http://imagej.nih.gov/ij/ | scientific image processing software |
| NanoCalcFX | Freeware | http://sourceforge.net/projects/nanocalc/ | data analysis/evaluation software for massive transport kinetic datasets |
| NTA 2.3 Analytical Software | Nanosight | data acquisition and analysis software for nanoparticle tracking microscope | |
| NTA 2.3 Temperature Comms | Nanosight | temperature controle software for nanoparticle tracking microscope |
References
- Yildirim, M. A., Goh, K. I., Cusick, M. E., Barabasi, A. L., Vidal, M. Drug-target network. Nat Biotechnol. 25, 1119 (2007).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).
- Osaki, T., Suzuki, H., Le Pioufle, B., Takeuchi, S. Multichannel simultaneous measurements of single-molecule translocation in α-hemolysin nanopore array. Anal. Chem. 81, 9866-9870 (2009).
- Carrillo, L., et al. High-resolution membrane capacitance measurements for studying endocytosis and exocytosis in yeast. Traffic. , (2015).
- Giacomini, K. M., et al. Membrane transporters in drug development. Nat. Rev. Drug Discov. 9, 215-236 (2010).
- Castell, O. K., Berridge, J., Wallace, M. I. Quantification of membrane protein inhibition by optical ion flux in a droplet interface bilayer array. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 3134-3138 (2012).
- Zollmann, T., et al. Single liposome analysis of peptide translocation by the ABC transporter TAPL. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112, 2046-2051 (2015).
- Tamm, L. K., McConnell, H. M. Supported phospholipid bilayers. Biophys. J. 47, 105-113 (1985).
- Sackmann, E. Supported membranes: scientific and practical applications. Science. 271, 43-48 (1996).
- Castellana, E. T., Cremer, P. S. Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design. Surf. Sci. Rep. 61, 429-444 (2006).
- Wagner, M. L., Tamm, L. K. Tethered polymer-supported planar lipid bilayers for reconstitution of integral membrane proteins: silane-polyethyleneglycol-lipid as a cushion and covalent linker. Biophys. J. 79, 1400-1414 (2000).
- Naumann, C. A., et al. The polymer-supported phospholipid bilayer: tethering as a new approach to substrate-membrane stabilization. Biomacromolecules. 3, 27-35 (2002).
- Weiskopf, D., Schmitt, E. K., Klühr, M. H., Dertinger, S. K., Steinem, C. Micro-BLMs on highly ordered porous silicon substrates: Rupture process and lateral mobility. Langmuir. 23, 9134-9139 (2007).
- Watanabe, R., et al. Arrayed lipid bilayer chambers allow single-molecule analysis of membrane transporter activity. Nat. Commun. 5, (2014).
- Stamou, D., Duschl, C., Delamarche, E., Vogel, H. Self-Assembled Microarrays of Attoliter Molecular Vessels. Angew. Chem. Int. Ed. 115, 5738-5741 (2003).
- Lohr, C., et al. Single Liposomes Used to Study the Activity of Individual Transporters. Biophysical Journal. 106, 229a (2014).
- Dunlop, J., Bowlby, M., Peri, R., Vasilyev, D., Arias, R. High-throughput electrophysiology: an emerging paradigm for ion-channel screening and physiology. Nat. Rev. Drug Discov. 7, 358-368 (2008).
- Milligan, C. J., et al. Robotic multiwell planar patch-clamp for native and primary mammalian cells. Nat. Protoc. 4, 244-255 (2009).
- Soga, N., Watanabe, R., Noji, H. Attolitre-sized lipid bilayer chamber array for rapid detection of single transporters. Sci. Rep. 5, (2015).
- Kleefen, A., et al. Multiplexed parallel single transport recordings on nanopore arrays. Nano Lett. 10, 5080-5087 (2010).
- Wei, R., Gatterdam, V., Wieneke, R., Tampé, R., Rant, U. Stochastic sensing of proteins with receptor-modified solid-state nanopores. Nat. Nanotechnol. 7, 257-263 (2012).
- Urban, M., et al. Highly parallel transport recordings on a membrane-on-nanopore chip at single molecule resolution. Nano Lett. 14, 1674-1680 (2014).
- Kusters, I., Van Oijen, A. M., Driessen, A. J. Membrane-on-a-Chip: Microstructured Silicon/Silicon-Dioxide Chips for High-Throughput Screening of Membrane Transport and Viral Membrane Fusion. ACS Nano. 8, 3380-3392 (2014).
- Hansen, J. S., Thompson, J. R., Hélix-Nielsen, C., Malmstadt, N. Lipid directed intrinsic membrane protein segregation. J. Am. Chem. Soc. 135, 17294-17297 (2013).
- Heinemann, F., Schwille, P. Preparation of Micrometer-Sized Free-Standing Membranes. ChemPhysChem. 12, 2568-2571 (2011).
- Lazzara, T. D., Carnarius, C., Kocun, M., Janshoff, A., Steinem, C. Separating attoliter-sized compartments using fluid pore-spanning lipid bilayers. ACS nano. 5, 6935-6944 (2011).
- Winterhalter, M. Black lipid membranes. Curr. Opin. Colloid Interface Sci. 5, 250-255 (2000).
- Koçer, A., Walko, M., Feringa, B. L. Synthesis and utilization of reversible and irreversible light-activated nanovalves derived from the channel protein MscL. Nat. Protoc. 2, 1426-1437 (2007).
