Abstract
Membran protein transport på enkelt protein niveauet stadig undviger detaljeret analyse, hvis underlaget omplantes er non-elektrogen. Der er gjort en stor indsats på dette område, men teknikker muliggør automatiseret high-throughput transport analyse i kombination med opløsningsmidler fri lipid dobbeltlag teknikker, der kræves til analyse af membrantransportører er sjældne. Denne klasse af transportvirksomheder dog er afgørende i celle homeostase, og derfor et vigtigt target i lægemiddeludvikling og metoder til at opnå nye indsigter hårdt tiltrængt.
Den her præsenterede manuskript beskriver etablering og håndtering af en roman biochip til analyse af membranprotein medieret transportprocesser på enkelt transporter opløsning. Biochip består af mikrohulrum, der afgrænses af nanopores som er yderst parallelt i sit design og kan fremstilles i industriel kvalitet og mængde. Protein-huser liposomer kan direkte anvendes påchip overfladen danner selv-samlet pore-spanning lipiddobbeltlag under anvendelse SSM-teknikker (faste understøttede lipidmembraner). Pore-spanning dele af membranen fritstående og fungerer som bindeled til substratet translokation ind i eller ud af hulrummet rum, som kan efterfølges af multi-spektral fluorescerende udlæsning i realtid. Etableringen af standardprocedurer (SOP) tillader ligetil etablering af protein-huser lipid dobbeltlag på chippen overfladen af stort set alle membranprotein, der kan rekonstitueres funktionelt. Den eneste forudsætning er etableringen af en fluorescerende udlæsning system til ikke-elektrogen transport substrater.
Høje-indhold screening applikationer er accomplishable ved anvendelse af automatiserede inverterede fluorescerende mikroskoper optagelse af flere chips i parallel. Store datasæt kan analyseres ved hjælp af frit tilgængelige specialdesignede analyse software. Tre-farve multi spektrale fluorescerendeudlæsning desuden muliggør objektiv diskrimination data i forskellige event klasser, eliminerer falske positive resultater.
Chippen teknologi er i øjeblikket baseret på SiO2 overflader, men yderligere funktionalisering ved hjælp guldbelagte chip overflader er også mulig.
Introduction
Analysen af membranproteiner er blevet af stigende interesse for grundlæggende og farmaceutisk forskning i de sidste 20 år. Udviklingen af nye lægemidler afhænger af identificering og detaljeret karakterisering af nye mål, som i øjeblikket er en af de begrænsende faktorer. Det forhold, at omkring 60% af alle lægemiddelmål er membranproteiner 1, gør udviklingen af teknikker for at belyse deres funktion vigtigste.
I fortiden, har teknikker til undersøgelse af elektrogen kanaler og transportere blevet udviklet i mange 2 - 4. Ikke-elektrogen substrater i modsætning fremlægge en mere udfordrende opgave. De er imidlertid af særlig interesse som primære lægemiddelmål, da de kontrollerer strømningen af opløste stoffer og næringsstoffer gennem cellemembranen og funktion som centrale receptorer i signaleringskaskader 5.
Betydelig indsats har været lagt i udviklingen af techniques at studere funktionen af membrantransportproteiner 6, 7. Systemer med fast-understøttede membraner er dukket op som mest lovende redskaber i denne felt 8 - 10 herunder faste understøttede lipiddobbeltlag, tøjrede dobbeltlag 11, 12, microblack lipidmembraner 13, 14 og native vesikel arrays 15, 16 at nævne nogle få. Nogle af dem er endda tilgængelige som kommercielle opsætninger 17, 18. Nogle eksempler er blevet offentliggjort kombinere evnen til at studere enkelt membranproteiner i en yderst parallel måde 14, 19, en forudsætning for screening applikationer. Men disse metoder sjældent bro fra grundforskning til det industrielle miljø. Vanskelighederne ligger ofte i systemets evne til at være automatiserbar, cost-intensiv produktion og / eller besværlige forberedelse. En tilgang overcoming alle de ovennævnte forhindringer er det endelige mål.
Teknikken præsenteres her blev udviklet for at studere membran kanaler og transportere in vitro i et kontrolleret miljø på enkelt protein niveauet 20-22. Rekonstituering af oprensede membranproteiner i LUV er langt mere etableret end sammenlignelige tilgange til GUVs 23 - 26 eller sort lipidmembraner 27. De kan direkte påføres chipoverfladen, hvor dobbeltlagsformation finder sted via et selvsamlende proces. Den glasbund design af nanoporøse chip (fig. 1) tillader luft mikroskopi, som tillader enkel automatisering af systemet. I kombination med et motoriseret trin flere chips kan måles på samme tid, med hver synsfelt indeholdende tusinder af forseglede hulrum til analyse.
Figur 1. Design af multiplex nanopore biochips. A) En silicium-på-isolator (SOI) wafer er struktureret af reaktiv-ion ætsning. Ca. 1150 individuelle chips er fremstillet af hver wafer med identiske egenskaber og kvalitet. B) Hver chip består af 250.000 individuelle mikrokaviteter med nano åbninger. Målestok:. 200 um C) Hvert hulrum er adresserbare via multi-spektral fluorescens udlæsning. En uigennemsigtig øverste lag blokerer de fluorescerende signaler fra stødpudebeholderen, hvilket gør biochip forenelig med omvendte fluorescens mikroskoper. D) atomic force mikroskopi (AFM) afbildning afslører jævnt arrangeret poreåbninger og overfladeruhed af siliciumdioxid lag på 3,6 nm (n = 40) optimalt til vesikelfusion. Målestok:. 5 um E) Scanning elektron microscopy (SEM) billede viser et tværsnit gennem nanopore giver adgang til de femtoliter hulrum inde i silicium chip. Dette tal blev genbrugt med tilladelse fra 21. Klik her for at se en større version af dette tal.
Alle data analyse udføres under anvendelse freeware at garantere ubegrænset adgang for slutbrugerne. Tidsserier analyseres ved hjælp af gratis billedbehandling software og en brugerdefineret build kurve analyse software muliggør batch behandling og ligetil korrelation af store datasæt med flere fluorescerende kanaler og tusindvis af kurver.
Modellen protein anvendt i denne protokol er den mekanosensitive kanal af store ledningsevne (MscL) kanal protein afledt af E. coli. Den fungerer som en ventil til at frigive osmotisk chok i naturen, men blev ændret på en sådan måde, at rationelt designet Synthetic funktionaliteter kan kovalent fastgøres til kanaler konstriktion side. Via charge-frastødning af covalent bundet aktivator (MTSET) kanalen udløses til at åbne, hvilket skaber en nano-ventil. Små molekyler såsom ioner, vand, små proteiner, men også små fluoroforer kan trænge igennem kanalen. Her proteinet anvendes som model for at demonstrere evnen af systemet til at detektere protein-medieret translokation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af store unilamellare vesikler (LUV'er)
- Rense en rundbundet kolbe (10 ml volumen) med nitrogengas for at fjerne eventuelle støvpartikler. Skyl rundbundet kolbe med ethanol.
Bemærk: Resterende ethanol kan tolereres og ikke forstyrrer efterfølgende trin. - Vask en 1 ml glassprøjte 4x med chloroform, for at fjerne alle forureninger. Tilsæt 4 ml SoyPC20 (25 mg / ml i chloroform) til den rundbundede kolbe og dope lipidopløsningen med en ekstra DOPE ATTO 390 til en slutkoncentration på 0,1 mol%.
Bemærk: I stedet for DOPE ATTO 390 andre fluoroforen-mærkede lipider eller lipofile farvestoffer kan også anvendes, afhængigt af tilgængelige excitationskilder. - Forbind den rundbundede kolbe til en rotationsfordamper. Tør lipidfilmen i 40 minutter ved 300 mbar, 30 ° C vandbad temperatur og maksimal rotationshastighed, for at danne en homogen lipidfilm på glasvæggen på kolben.
- Transis de kolben til en høj vakuumpumpe og tør lipidfilmen i yderligere 30 minutter ved stuetemperatur.
- Tilsæt 5 ml buffer (20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8,0; sterilfiltreret) og 8 glasperler (2,7-mm diameter, ethanol vaskes og tørres) til kolben. Kolben forbindes til den roterende fordamper og rotere uden vakuum ved 50 ° C ved maksimal hastighed.
Bemærk: Glasperler mekanisk forskyde lipidfilmen fra glasvæggen, hvilket fører til (multilamellær) vesikeldannelse. Efter 45 min rotation opløsningen er mælkeagtig og ingen tilbageværende lipidfilm skal være synlig på kolbens vægge. I stedet for glasperler andre metoder som kolben sonikering i vandbad ultralydsapparat, kolben eller den blide rehydrering metode vortexing er også anvendelige. - Overfør kolbe under inert gas (argon) til et ultralydsbad og soniker i 4 minutter ved stuetemperatur.
Bemærk: De ultralyd chokbølger forstyrre liposomer, hvilket gør dem unilamellare. - Split LUV løsningi 1 ml alikvoter.
- Udfør 5 fryse / optøningscykler ved frysning LUV opløsning i flydende nitrogen, efterfulgt af optøning ved 40 ° C i et vandbad.
Bemærk: Dette fører til at briste og spontan omlejring af individuelle liposomer med hinanden, hvilket fører til størrelse stigning. - På sidstnævnte frysetrin butik alle prøver ved -80 ° C.
Bemærk: LUV'erne vil være stabil i mindst 6 måneder.
2. Protein Rekonstituering
- Tø 1 ml LUV alikvot på is. Umiddelbart før rekonstituering, ekstrudere liposomer 17x gennem et 400 nm polycarbonat filter membran ved hjælp af en mini ekstruder.
Bemærk: lipidaggregater vil blive fjernet, og den endelige homogen størrelsesfordeling er nået. - Destabilisere LUV'er ved tilsætning af 4% Triton X-100 (v / v) til en endelig koncentration på 0,25% (v / v) og inkuberes i 5 minutter ved 50 ° C.
Bemærk: Mængden af liposomer anvendes i dette trin, afhænger af massen af den oprensede MscL G <sup> 22 C anvendes (se trin 2.3). Oprense MscL G 22 C (afledt af E. coli) som beskrevet detaljeret i 28. - Mix oprenset MscL G 22 C og detergent-mættet liposomer på 1:20 (vægt / vægt) forhold, og der inkuberes i yderligere 30 minutter ved 50 ° C.
- Til fjernelse detergent tilføje bio-perler i Tris-buffer (20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8,0; sterilfiltreret) til proteinet / liposomopløsningen, med 16 mg (våd vægt) bio-perler pr pi detergent anvendes til at destabilisere liposomer i trin 2.2.
- Udfør detergent fjernelse natten over (16 timer) ved 4 ° C på en roterende plade.
Bemærk: Den konstante blanding af løsning sikrer fjernelse optimal rengøringsmiddel. - Efter fjernelse vaskemiddel butik proteoliposomer ved 4 ° C og anvendelse til forsøg på samme dag.
3. Aktivitet Assay
- Under protein rekonstituering tage en 100 pi portion af detergent-destabiliseret proteoliposomet løsning efter endt trin 2.3.
- Tilsæt 1 volumen af calcein (30 mM) til den proteinholdige liposomopløsningen og inkuberes i yderligere 5 min ved 50 ° C.
- Fjern opløsningsmiddel fra som beskrevet i trin 2.4 - 2.6.
- Efter fjernelse detergent ækvilibrere en størrelse-eksklusion søjle (20 ml lejevolumen eller mere) med Tris-buffer (3x søjlevoluminet).
Bemærk: proteoliposom separation kan udføres ved stuetemperatur, men holder prøven konstant ved 4 ° C, anbefales det at sikre bedst proteinaktivitet efter fraktionering. - Separate proteoliposomer fra fri calcein ved at anvende hele prøve (200 pi) til kolonnen størrelseseksklusion. Lad blandingen suges ind i kolonnen, efterfulgt af eluering af proteoliposomer fra søjlen via kontinuerlig puffer ansøgning oven ved hjælp af tyngdekraften flow. Overhold calcein indeholder proteoliposomer som en diskret appelsin band i eluering front. Opsaml fraktioner på 500 & #181; l hhv.
Bemærk: Gratis calcein farvestof vil elueres efter proteoliposom fraktion med fuldstændig adskillelse. - Pipette 80 pi af hver fraktion onto en mikro-brønds plade til fluorescerende udlæsning og identificere den del, der indeholder den største mængde af calcein indeholder proteoliposomer via fluorescensemission. Detect fluorescens ved 520 nm med excitation ved 490 nm. Brug proteoliposom fraktionen med det højeste signal for følgende aktivitet assay.
- Bland 20 pi af proteoliposom fraktion med 980 pi Tris-buffer i en 1 ml fluorescens kuvette.
- Måle fluorescensemission ved 520 nm (excitation 490 nm) under anvendelse af et spektrofluorometer. Optag i 1 min og tilsæt derefter 25 pi MTSET ([2- (trimethylammonium) ethyl] methanethiosulfonate) fra en stamopløsning (160 mM) og blandes godt. Hold på optagelse under blanding. Altid forberede stamopløsning frisk direkte før brug.
Bemærk: Når løst i buffer MTSET hydrolyseres indenfor 30 min og vil være ikke-reaktive. MTSET kan vejes og opbevares som tørt pulver alikvot ved -20 ° C indtil anvendelse.
Bemærk: Når aktiveret MscL G 22 C kanal åbner og frigiver det indesluttede calcein, hvilket fører til en lokal koncentration formindskelse af calcein ved effluxing de proteoliposomer og efterfølgende dequenching af farvestoffet, hvilket resulterer i en forøgelse af fluorescensemission. - Efter fluorescensemissionen har nået et stabilt plateau igen, solubilisere liposomer ved tilsætning af 50 pi Triton X-100 (4% volumen / volumen).
Bemærk: Ideelt ingen yderligere fluorescens stigning kan observeres, hvilket indebærer aktivt protein i hvert liposom.
4. Størrelse Distribution Måling af LUV Brug Nano-partikel Tracking
- Bemærk, at kun minimale prøver af liposomet eller proteoliposom løsning er nødvendige for størrelsesfordelingen analyse under anvendelse af nanopartikel tracker. Fortynd et liposom opløsning af 5 mg / ml lipidkoncentration 1: 5000 (v / v) i puffer (20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8,0; sterilfiltreret) til analyse på et endeligt volumen på 1 ml. Filtrere alle puffere, der anvendes til fortynding og forberedelse forud LUV og rekonstituering ved anvendelse af en 0,2 um membran for at fjerne eventuelle suspenderede partikler såsom støv, der ville forstyrre størrelsesfordelingsdata målinger.
- Vask flow-kammer med ultrarent vand.
- Brug overflademarkører at fokusere på lysstrålen. Injicere ca. 300 pi af den fortyndede liposom prøven og straks lukke udgangsventilen at stoppe strømmen inde i strømningskammeret, uden at der indføres luftbobler.
- Juster fokus og kamera lukkeren / gevinst at sikre tilstrækkelig spredning signal af prøven til påvisning.
Bemærk: 20 - 80 signaler, skal være klart synlige i synsfeltet. Undgå overbelægning (> 80 signaler), da softwaren ikke vil være i stand til at spore individuelle signaler, når overlappende. - Gå til "Capture" screen. Juster temperaturkontrol til 25 ° C, og opsamling varighed til 90 sek ved hjælp af softwarens kontroller. Tryk på "Record" for at starte optagelsen en tidsserie.
Bemærk: Ved afslutningen af tidsserien et nyt vindue åbnes. - Spar tidsserierne i den givne format (* .avi). Af praktiske årsager under batch analyse gemme alle filer i en enkelt mappe.
- Åbn exit ventil og injicere anden 300 pi i strømmen kammeret. Luk ventilen og gentage trin 4,3-4,6 gange.
- Efter at have afsluttet alle prøve kørsler vaske flow kammer med 5 ml ultra-rent vand. Gå til "Pre-proces" skærm. Indstil kalibreringsparametre temperatur = 25 ° C og viskositet = 0,91 for Tris buffer anvendes i denne protokol.
- Åbn batchproces vinduet og indlæse indspillede tidsserie (Advanced / Batch Process / Set File 1-3). Tryk på "GO" for at starte analysen størrelsesfordeling.
Bemærk: de analytiske software automatisk sporer de enkelte partikler og beregner deres diameter baseret på deres bevægelse adfærd ved hjælp af de parametre, der i trin 4.8.
Bemærk: Den resulterende størrelsesfordelingen analyse gemmer automatisk ind i den samme mappe som tidsserien filer. - Derudover oprette en rapport fil at opsummere resultaterne (Export / Opret rapport PDF).
5. Chip Holder Forberedelse
- Afvej 1,0 g MDX4 medicinsk kvalitet elastomer base og 0,1 g MDX4 hærdemiddel i et 50 ml reagensglas. Blend begge grundigt med et glas bar.
- Sætte røret i en ekssikkator i 1 time til afgasse klæbemidlet. Bagefter bruge det inden for 30 min til chip limning, da limen hærder og være for svært at arbejde med.
- Under elastomer afgasning (trin 5.1) rense en objektiv glasplade grundigt med chloroform for at fjerne eventuelle forureninger før chip bonding. Skyl objektglasset med 5 ml chloroform ved anvendelse af en glassprøjte. Opsamlchloroform i en nedenunder anbragt bægerglas. Efter vask lad slæden tørre.
Bemærk: Udfør dette trin under en emhætte. Alternativ til chloroform, kan andre organiske opløsningsmidler som acetone også anvendes. - Deponere en lille mængde af det klæbende bonding materiale på dækglasset ved anvendelse af en pipettespids (krystal tips til 10 pi pipetter). Husk, at chips er nødt til at passe ind slide holderen 8-kammer senere og skal placeres på dias i overensstemmelse hermed.
- Fjern forsigtigt én chip ad gangen fra wafer bord ved hjælp fin spids pincet og deponere chip på dråbe klæbemiddel på dækglasset. Sikre, at den belagte side af chippen vender opad.
- Skub forsigtigt chip på dækglasset med bagsiden af en stump PE pincet. At sikre, at limen dispenseres jævnt under chippen forsigtigt at skubbe chip frem og tilbage. KRITISK STEP: Sørg for, at ingen luftbobler fanget under chippen, da det vil forstyrre optisk billeddannelseaf chippen hulrum senere. Også sikre, at ingen klæbende materiale forurener chip overfladen.
- Udtørre den færdige dækglas i 2 timer ved 65 ° C i et kabinet tørretumbler.
Bemærk: Chips stadig belagt med et beskyttende lag stammer fra deres fremstilling, der skal fjernes. - For at fjerne det beskyttende lag, udføre en sekventiel opløsningsmiddel vasketrin. Under hærdningen af chips, forvarmes et vandbad til 54 ° C.
- Place 3 Bægerglas i vandbadet, to af dem fyldt med isopropanol og en fyldt med acetone.
- Sæt chip dækglasset i et dias holder og nedsænke det i første isopropanol fyldt fad i 10 min. Bagefter overføre den til acetone fyldt skålen, inkuberes igen i 10 minutter før den overføres ved den endelige vasketrin til den anden isopropanol skålen og inkuberes yderligere 10 min.
- Fjern holderen dias fra fadet og omhyggeligt vaske det i udstrakt grad med ultrarene vand, efterfulgt af tørring chips med en blid strøm af nitrogengas.
- Take-off laminering ark fra 8-godt klistret-slide og sætte det tilbage på bænken. afhente forsigtigt dækslet dias og tryk forsigtigt på klæbrig-slide med chips står brøndene. Lad den færdige chip indehaveren hvile i et par minutter før brug.
6. Assay Forberedelse
Bemærk: nanopore chips limet til et dækglas og adskilt af en 8-brønds sticky-slide besidder den fordel, kan at flere chips blive behandlet i en enkelt eksperimentel kørsel, med chips bliver fuldstændig adskilt fra hinanden.
- Efter chip holder forberedelse, skylles hver chip med ren ethanol og blæse tør med nitrogen gas, for at fjerne eventuelle forureninger som støv.
- Rengør chip overflade med luft, oxygen eller nitrogen plasma. Afhængigt af typen af plasma rengøring tidsperioder variere: udføre oxygen plasmabehandling i 1 min, luft og nitRogen plasma i 5 minutter ved 0,3 mbar ved 80% effekt indstilling (RF-effekt medium eller høj).
- Efter plasmarensning inkuberes chips i ren ethanol i 10-15 min for at sikre hulhed befugtning.
- Trinvis udveksling ethanol i buffer ved tilsætning 400 pi Tris-buffer (20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8,0; sterilfiltreret), efterfulgt af blanding af opløsningen uden at indføre luftbobler og efterfølgende fjernelse af 400 pi. Gentag denne procedure 12 gange, for at sikre fjernelse ethanol.
Bemærk: Ethanol ville være skadelig for liposomer og suspenderede lipid dobbeltlag. - Dope Tris-buffer (20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8,0; sterilfiltreret) med 5 mM CaCl2 og 1 uM Oy647 farvestof. Helt at fjerne vaskebufferen fra chippen og straks tilføje det doterede buffer til chippen. Bemærk: Chips vil blive dækket af et tyndt buffer filmen efter vaskebuffer fjernelse, så chippen ikke er i direkte kontakt med luft, hvilket sikrer en konstant befugtning af hulrummene og chip overfladen.
- Tilsæt 1 mg / ml LUV'er eller Proteo-LUV'er i Tris-buffer (20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8,0; sterilfiltreret) til hver brønd.
Bemærk: Det endelige volumen i hver brønd er 300 pi. Overvej efterfølgende tilføjelser af kontrol farvestof og den kemiske modifier MTSET løbet doteret Tris buffer tilføjelse. - For pore-spanning lipiddobbeltlag formation på chipoverfladen inkubere chippen i 1 time ved stuetemperatur med liposomopløsningen. Bagefter vask hver chip med 4x 400 pi Ca 2 + -fri Tris-buffer.
- Tilsæt kontrol farvestof til hver brønd, med en endelig koncentration på 5 uM. Chips er nu klar til translokationen assay.
7. Assay Setup
- Monter chip indehaveren til epifluorescensmikroskop (20X luft mål, lange arbejdsafstand). Fokus på randen af nanopore chip til lettere at finde brændplanet af mikro-hulrum. Når hulrummene er i fokus scanne nanopore array til en region thpå skærme højeste forsegling ratio.
Bemærk: Hver inverteret epifluorescensmikroskop kan anvendes til at udføre chip assays. Alt efter formålet forstørrelse (20X - 60X) antallet af analyserede kaviteter vil variere med op til 9.000 hulrum i en enkelt synsfelt ved hjælp 20X forstørrelse. Air mål med en lang arbejdsafstand er at foretrække. Anvendelsen af inverterede konfokale laserscanningmikroskoper (CLSM) er også mulige, men billedoptagelse kan være den begrænsende faktor på grund af den begrænsede dybde af fokus. - Optimer belysningen chip.
Bemærk: Sørg for, at begge farvestof kanaler ikke overskrider den maksimale værdi grå skala, som ikke kan observeres ændringer. Til eksport eksperimenter justere belysning af translokeres farvestof til 90% af maksimal signal kapacitet. Juster kontrol farvestof i åbne hulrum til 80-90% af den maksimale signal kapacitet til klart at afsløre eventuelle utæt membran forsegling. - Når alle kanaler justeres starte tidsserier. Tag billeder hver 10-20 sec i 90 minutter.
Bemærk: Dette er tilstrækkeligt til også at følge specifikke og uspecifikke efflux begivenheder. - Initialiser udstrømning af det fluorescerende substrat ved tilsætning af cystein-specifik, ladet positivt forbindelse MTSET til en slutkoncentration på 3 mM. Tillade mindst 5 min af eksperiment runtime før MTSET Foruden kunne senere etablere et stabilt fluorescerende signal baseline før kanalåbning. Altid forberede MTSET løsning frisk umiddelbart før brug.
8. Data Analysis
- Åbn tidsserier billedstak med en standard version af ImageJ (File / Import / Image Sequence).
- Hvis stables fluorescerende kanaler, opdele kanalerne i de enkelte stakke for hver kanal (Billede / Stacks / Stak til billeder).
- Dupliker det første billede af translokationen substrat kanal for ROI (regioner af interesse) identifikation (Billede / Duplicate).
- Konverter billedet til et binært billede (Billede / Juster / Threshold). Sikreat algoritmen anvendt afbilder signaler for alle forseglede hulrum uden overlapning pixilation.
- definere automatisk regioner af interesse med partiklen analysator værktøj (analyse / Analyser Particle). Definer et minimum partikelstørrelse defineret, for at undgå partikel støj. Kontroller indstillingerne "udelukker på kanter" og "omfatter huller". Sørg for, at følge ROIs afspejler microcavity arraymønster. Mellemliggende ROIs er artefakter, derfor fjerne dem. Gem listen ROI.
Bemærk: Måling parameter skal indstilles til "område" før partikel analyse (analyse / Set Målinger / Area) - Åbn Time Series Analyzer plug-in (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/time-series.html), der tilpasser alle ROI'er automatisk til den samme størrelse. Re-size alle eksisterende ROI'er til en bredde / højde på 6x6 pixels og oval form (Timer Series Analyzer / AutoROIProperties). Kontroller indstillingen "Resize eksisterende ROIS". Gem den resulterende liste skaleres ROI.
- Åbn ROI leder(Analyse / Værktøj / ROI Manager) og indlæse listen skaleres ROI for hver kanal af tidsserien (ROI Manger / Mere / Open). ROIs vil blive overlejret. For at analysere signalet ændring for hver ROI starte Multi måleværktøjet (ROI manager / Mere / Multi Measure), skal du vælge "Mål alle skiver" og "En række pr slice" og start multi foranstaltning.
Bemærk: Måling parameter skal indstilles til "betyde grå værdi" til dette trin (analyse / Set Målinger / Mean grå værdi) - Gem den resulterende tabel, der giver den gennemsnitlige grå værdi for hver ROI i * .txt eller * .xls-format.
- Importer analyse af hver imaging kanal til NanoCalcFX ROI via "Import File" valgmulighed. Indstil "Brug første linje for navngivning serien". Indstil trin størrelse mellem billeder i henhold til de i erhvervelse serien billede perioder, og vælg den tilsvarende kolonne og decimaladskiller.
- Brug indstillingen "multiple sheet" for automatisk at korrelere graferne for den enkelte fluospare- kanaler.
Bemærk: Begivenhederne kan nu analyseres og klassificeres ved hjælp af oplysninger fra 3-farve spektral information. - Monter udvalgte kurver ved hjælp af indbyggede fit funktion (fit option).
Bemærk: Den implementerede udstrømning og tilstrømning ligning er velegnet til kan indstilles alle monoeksponentiel diffusion-drevet begivenheder og fit grænser. Resulterende hastighedskonstanter kan plottes ved hjælp af histogrammet værktøj eller eksporteres til yderligere data raffinement.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Pore-spænder membraner kan nemt oprettes på nanostrukturerede chip overflade i en selv-samlet måde. Men den underliggende proces er stadig delikat og påvirkes af mange parametre som liposomstørrelsen, monodispersitet liposomets befolkning, lamellarity, lipid- og salt-koncentration og kemiske overfladeegenskaber. De fleste af disse parametre er særligt karakteriseret og standardiseret i den ovennævnte protokol. Andre parametre bør dog kontrolleres under hver ny forberedelse, for at sikre en vellykket eksperiment. Disse er liposomet størrelsesfordeling og population dispersitet (fig. 2 A). For optimal pore-spanning membran-dannelse og for at undgå liposom indtrængen i formhulrummet liposomstørrelser godt over porediameteren er en nødvendighed. Endvidere monodisperse liposompræparater har vist, hvilket gav de bedste resultater i membranen spredning og Fusipå. Et andet afgørende skridt, der skal kontrolleres for hver forberedelse er protein aktivitet efter rekonstituering. Ved hjælp af en fluorescens-dequenching assay for liposomer rekonstitueret med MscL G 22 C, kan kanalåbning overvåges via fluorescensspektroskopi, hvilket giver et forhold af liposomer indeholdende aktive MscL G 22 C-protein (fig. 2 B).
Når spredes til chipoverfladen kan solut translokation af et fluorescerende mål ved MscL G 22 C ved ligandaktivering følges (fig. 3 B). Udviklet MscL G 22 C-kanaler er lukkede i deres standard tilstand, indfange små fluorescerende molekyler inde i hulrummet plads. Ved tilsætning af kemiske modulator MTSET indføres positive ladninger til indsnævringen regionDen MscL G 22 C pore, skubbe det åbne via elektrostatisk frastødning. Den kendte indesluttet fluorofor undviger formhulrummet for at opnå diffusion ligevægt. Den efterfølgende fald i fluorescens inde i formhulrummet kan overvåges. Denne proces er meget reproducerbar, hvilket resulterer i en homogen population af efflux hændelser (fig. 3 C). De resulterende efflux kurver klynge i to forskellige populationer, hvilket viser evnen af assayet til at skelne mellem single- og multikanals translokation arrangementer (fig. 3 D). Desuden er systemet i stand til at følge op på tre spektralt godt adskilt farvestoffer parallelt og i realtid, hvilket gør det muligt at optage high-indhold screeninger og diskriminere præcist og objektivt mellem positive, falsk positive og negative resultater. I denne undersøgelse blev analyseret 9.046 forseglede hulrum, hvoraf 8% viste efflux adfærd. Implementering af de forskellige fluorescerende read-out kanaler, kan begivenheder forskelsbehandles i monoeksponentiel efflux begivenheder, komplekse kinetik, lipid indtrængen og membran brister (fig. 3 E). Kun begivenheder, der viser stabil signaler til kontrol opløste stof og membranen farvestof anses for endelige analyse. Komplekse kinetik repræsenterer efflux begivenheder med ustabile styresignaler og er derfor udeladt. Lipid indtrængen og membran bristninger er artefakt begivenheder uløseligt forekommende hjælp pore-spanning lipiddobbeltlag systemer. De kan kasseres med kontrol-farvestof signaler som nævnt ovenfor (fig. 4).
Figur 2. størrelsesfordelingen af proteoliposomer og MscL funktion. A) Vesikler var analyz ed af nano-partikel sporing analyse. LUV prøver blev undersøgt før (sort trace), og efter rekonstituering af MscL G 22 C (rød trace). Efter LUV forberedelse, er en gennemsnitlig partikelstørrelse på 214 ± 70 nm opnået. Størrelsen er faldet i rekonstituering, hvilket resulterer i proteoliposomer af 158 ± 60 nm i størrelse. B) MscL aktivitet blev valideret efter rekonstituering af en udstrømning assay. 28 Self-slukket calcein frigives fra proteoliposomer gennem MTSET-medieret åbning af MscL kanal fører til dequenching af fluoroforen (rød) og en hurtig stigning af fluorescensintensiteten. Liposomer uden protein viser ingen sådan efflux, selv efter gentagen MTSET tilsætning (sort). Efterfølgende detergent-introduceret opløseliggørelse (TX-100) af liposomerne frigiver alle tidligere indkapslet farvestof. Dette tal blev genbrugt med tilladelse fra 21.et = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Ligand-gated opløst stof translokation af MscL på single-molekyle-niveau. A) Engineered MscL G 22 C-kanaler er lukkede i deres standard tilstand. Små opløste stoffer såsom en fluorofor er ude af stand til at passere hverken gennem kanalen eller lipiddobbeltlaget. Efter tilsætning af MTSET, en manipuleret enkelt cystein i hver MscL G 22 C protomer bliver modificeret, indføre flere positive ladninger i indsnævringen side af pentamere kanal-komplekset. The MscL G 22 C kanal skubbes åben af ladningsfrastødning og det indesluttede farvestof kan diffundere ud af hulrummet, hvilket fører til et fald i fluorescensintensitet. B) Timig spor af MscL G 22 C åbning ved tilsætning af MTSET. Proteoliposomer indeholdende funktionelt rekonstitueret MscL G 22 C blev spredt på chip overfladen. Oy647 (rød) blev indesluttet inde i hulrummene som translokation substrat. OregonGreen Dextran (70 kDa, grøn) blev tilsat som kanal uigennemtrængelig kontrol substrat til overvågning af substratspecificiteten af transporten hændelsen samt integriteten membran under forsøget. LUV'er blev suppleret med DOPE ATTO 390 (0,1 mol%; lilla) at kontrollere for lipid kontaminering inde hulrum. Tilsætning af MTSET (3 mM endelig) ved t = 0 sek åbner kanalen, der fører til Oy647 udstrømning fra hulrummene, indspillet via fluorescens udlæsning. C) Tilfældigt plukket MscL G 22 C efflux kurver demonstrerer typiske efflux begivenheder. D) Pris konstanter for translokation arrangementer (n = 242) klynge i to Gauss befolknings, hvilket viser, at single- og multi-kanal transport begivenheder kan diskrimineret. E) High-indhold screening og statistisk analyse af 9,046 forseglede chip hulrum ved triple-farve realtid udlæsning. 8% af alle analyserede chip hulrum viser eksponentielle efflux begivenheder. På grund af spektral dekodning (rød: omplantes opløst stof, grøn: kontrol opløst stof; violet: lipid), efflux begivenheder, komplekse kinetik, lipid indtrængen, og membran brud kunne blive diskrimineret, og dermed fjerne falske positiver. Dette tal blev genbrugt med tilladelse fra 21. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Møde- og klasser udmærker sig ved tre farver afsløring. Omplantes opløst stof (rød), control opløst stof (grøn) og et lipid farvestof (violet) kan spektralt diskrimineret muliggør objektiv udvælgelse af data. A) og forseglet hulrum, der huser ingen membranprotein viser ingen flux begivenheder under forsøgsbetingelserne beskrevet for MscL kanal optagelse (se fig. 3A) . Den fluorescerende udlæsning er stabil i alle kanaler. B) dårligt defineret suspenderede lipiddobbeltlag kan trænge hulrummet. C) membranbrud resulterer i diskontinuerlig lipiddobbeltlag spænder over nanopore sprækker. Derved formhulrummet ikke længere adskilt fra pufferkammer. Indkapslede farvestoffer (rød) unddrage hulrummet ned koncentrationsgradienten. Styringen solut (grøn), der tidligere ikke i stand til at passere hen over membranen, kommer ind i hulrummet. D) Eksempel på et lipid indtrængen begivenhed. Mens det fluorescerende signal for lipidet farvestof (violet) stiger på grund af membranen invaderende formhulrummet, translokationen opløste stof er Pushed ud af hulrummet (rød), hvilket fører til et fald i fluorescerende signal. Den nanopore bliver blokeret af lipiddobbeltlaget, forhindre gennemtrængning af kontrollen substrat (grøn). E) Under membran brud, den vedlagte transport solut undviger hurtigt fra hulrummet (rød), mens kontrolgruppen solut diffunderer i (grøn). Dette tal blev genbrugt med tilladelse fra 21. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Teknikken præsenteres her giver en yderst parallel analyse af membranprotein transport. Rekonstituerede membranprotein-systemer kan direkte påføres på biochip, hvilket gør tilpasningen af teoretisk hver membran transportør eller kanal mulig. Transport analyse er kun begrænset af etableringen af en fluorescerende udlæsning systemet, enten via direkte fluorescens ændring (translokation af fluoroforer eller fluorescens-mærkede substrater) eller indirekte fluorescens ændring (pH-følsomme farvestoffer, sekundære enzymatiske reaktioner). De sidstnævnte kan dog endnu ikke fastlagt.
Funktionel karakterisering af membran kanaler eller transportører på enkelt protein niveau er det vigtigste fokus i denne teknik. I kombination med et automatiseret mikroskop, etablering af screening applikationer til proteinholdige effektorer er også mulig. Assayet opsætning tillader parallel optagelse af op til 8 chip, med flere assaypunkter på hver chip. På grund af fuldstændig adskillelse af de chips, det er virkelig parallel, der giver mulighed for flere eksperimentelle gentagelser herunder kontrol i en enkelt eksperimentel køre, når betingelserne er blevet etableret.
Kritiske trin under opsætning af et eksperiment er fremstillingen af virkelig unilamellare vesikler, den aktive rekonstitution af valgte protein, spredning effektiviteten af proteoliposomer på chippen overfladen og retentionsevne af det suspenderede lipiddobbeltlaget mod substraterne anvendt i assayet.
Mens fremstillingen af unilamellare vesikler er af grundlæggende betydning for dette assay for at undgå etablering af multilamellare membranplader på chippen overfladen under suspenderet lipiddobbeltlag dannelse, er det ret let at sikre unilamellarity af vesiklerne via sonikering liposomerne under fremstillingen.
Den direkte anvendelse af proteoliposomer er den store udvikling af metoden presented. I modsætning til tidligere tilgange mere komplekse og medicinsk relevante proteiner nu kan målrettes, kræver selvfølgelig forudgående etablering af en rekonstituering protokol giver funktionelt protein valg i LUV'er. Derudover membranproteiner besidder store ekstra-membran domæner nedsætte dannelsen af egentlige SSM'er. Dette skal optimeres for hvert nyt protein, fx ved at variere CaCl2 koncentration.
Rekonstitueringen Forholdet af proteinet af interesse skal vælges med omhu. Analysen af enkelt protein begivenheder er ønsket og accomplishable hjælp af her præsenteret teknik. Mængden af rekonstitueret protein bør derfor ikke overstige 1-2 funktionelle protein enheder pr pore-spænder membran plaster antager en ideel rekonstituering og at membranen protein stokastisk fordelt over dobbeltlaget. Derudover retningen af proteinet efter rekonstitution bør også erindres, som det har not at være lig mellem begge directionalities.
Endelig når alle disse spørgsmål er nøje kontrolleret og optimeret, kan ingen af de anvendte substrater vise nogen uspecifik membran permeabilitet af pore-spænder membran. Positivt ladede fluoroforer, ligesom de fleste rhodamin-baserede farvestoffer i det røde spektrale regime tendens til hurtigt at overvinde membranbarrieren. Stærke hydrofobe interaktioner kan også føre til en uspecifik binding til lipiddobbeltlaget. Begge ejendomme er ikke ønsket.
Studiet af ionkanaler i en kvalitativ måde er også tænkelige. Screening for kanal effektorer bruger binær Ja / Nej udlæsning kunne betragtes anvendelse af ion-følsomme farvestoffer. Den største hindring her ville være etableringen af en i det mindste delvis ion-fastholde lipid dobbeltlag. Dette kan kun være opnåelige via overfladen modifikation af nanopore chip.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| [2-(Trimethylammonium)ethyl] methanethiosulfonate |
Toronto Research Chemicals Inc. | T792900 | MTSET; hydrolized by water. Keep as dry pouder aliquot at -80 °C. Use immediately (30 minutes) after solubilization in buffer. |
| 1 ml gas-tight syringe | Hamilton | #1001 | |
| 10 ml round flask | Schott Duran | ||
| 2.7 mm glas beads | Roth | N032.1 | |
| 2-Propanole | Roth | 9866.5 | |
| 30 cm Luer-Lock Extension Tube | Sarstedt | 744304 | |
| Acetone | Roth | 5025.5 | |
| Bio-Beads SM-2 Adsorbent | Bio-Rad | 152-3920 | need to be activated before first use |
| CaCl2 Dihydrat | Roth | HN04.3 | |
| Calcein | Sigma | C0875 | store dark at -20 °C |
| Chloroform reagent grade | VWR Chemicals | 22711324 | |
| DOPEATTO390 | ATTO-TEC | AD 390-165 | store dark at -20 °C |
| Ethanol absolute | Sigma-Aldrich | 32205 | |
| Injekt Single-use syringe | Braun | 460 60 51V | |
| Injekt-F single-use syringe | Braun | 91 66 017V | |
| Keck clips | Schott | KC29 | |
| L-α-Phosphatidylcholine, 20% (Soy) | Avanti Polar Lipids | 5416016 | store under inert gas at -20 °C |
| NaCl 99.5% p.a. | Roth | 3957.2 | |
| Nanopore E100 wafer/chips | Micromotive (Mainz/Germany) | available on request | |
| Nucleopore Track-Etch Membrane 0.4 µm | Whatman | 800282 | |
| Oregon Green Dextran 488 (70 kDa) | life Technologies | D-7173 | store dark at -20 °C |
| Oy647 | Luminartis (Münster/Germany) | OY-647-T-1mg | store dark at -20 °C |
| Rotilabo-syringe filtration, unsterile, pore-size 0.22 µm | Roth | P 818.1 | |
| Sephadex G-50 | Sigma-Aldrich | G5080 | column material for size exclusion chromatography |
| Silastic MDX4-4210 | Dow Corning | curing agent for chip fixation onto cover glass support | |
| sticky-Slide 8-well | ibidi | 80828 | multi-well chamber for the mounting onto glass slides (chip holder) |
| Three-way stopcock blue | Sarstedt | 744410001 | |
| Tris Pufferan 99.9% Ultra Quality | Roth | 5429.2 | |
| Triton-X 100 | Roth | 6683.1 | |
| Whatman 0.2 µm cellulose nitrate membrane filter | Roth | NH69.1 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Büchi 461 water bath | Büchi | ||
| Büchi Rotavapor RE 111 | Büchi | ||
| Cary Eclipse Fluorescence Spectrophtometer | Varian | ||
| LiposoFast Mini Extruder | Avestin | ||
| Membrane pump | Vaccubrand | 15430 | |
| Nanosight Nanoparticle Tracking Microscope | Malvern / Nanosight | LM 14C | |
| NyONE microscope | Synentec | available on request | |
| Pump control | Vaccubrand | CVC 2II | |
| Sonicator bath Sonorex RK100H | Brandelin electronic | 31200001107477 | |
| Vaccum pump RC5 | Vaccubrand | 1805400204 | |
| Water bath W13 | Haake | 002-9910 | |
| Plasma Cleaner PDC-37G | Harrick Plasma | PDC-37G | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| ImageJ | Open Source | http://imagej.nih.gov/ij/ | scientific image processing software |
| NanoCalcFX | Freeware | http://sourceforge.net/projects/nanocalc/ | data analysis/evaluation software for massive transport kinetic datasets |
| NTA 2.3 Analytical Software | Nanosight | data acquisition and analysis software for nanoparticle tracking microscope | |
| NTA 2.3 Temperature Comms | Nanosight | temperature controle software for nanoparticle tracking microscope |
References
- Yildirim, M. A., Goh, K. I., Cusick, M. E., Barabasi, A. L., Vidal, M. Drug-target network. Nat Biotechnol. 25, 1119 (2007).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).
- Osaki, T., Suzuki, H., Le Pioufle, B., Takeuchi, S. Multichannel simultaneous measurements of single-molecule translocation in α-hemolysin nanopore array. Anal. Chem. 81, 9866-9870 (2009).
- Carrillo, L., et al. High-resolution membrane capacitance measurements for studying endocytosis and exocytosis in yeast. Traffic. , (2015).
- Giacomini, K. M., et al. Membrane transporters in drug development. Nat. Rev. Drug Discov. 9, 215-236 (2010).
- Castell, O. K., Berridge, J., Wallace, M. I. Quantification of membrane protein inhibition by optical ion flux in a droplet interface bilayer array. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 3134-3138 (2012).
- Zollmann, T., et al. Single liposome analysis of peptide translocation by the ABC transporter TAPL. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112, 2046-2051 (2015).
- Tamm, L. K., McConnell, H. M. Supported phospholipid bilayers. Biophys. J. 47, 105-113 (1985).
- Sackmann, E. Supported membranes: scientific and practical applications. Science. 271, 43-48 (1996).
- Castellana, E. T., Cremer, P. S. Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design. Surf. Sci. Rep. 61, 429-444 (2006).
- Wagner, M. L., Tamm, L. K. Tethered polymer-supported planar lipid bilayers for reconstitution of integral membrane proteins: silane-polyethyleneglycol-lipid as a cushion and covalent linker. Biophys. J. 79, 1400-1414 (2000).
- Naumann, C. A., et al. The polymer-supported phospholipid bilayer: tethering as a new approach to substrate-membrane stabilization. Biomacromolecules. 3, 27-35 (2002).
- Weiskopf, D., Schmitt, E. K., Klühr, M. H., Dertinger, S. K., Steinem, C. Micro-BLMs on highly ordered porous silicon substrates: Rupture process and lateral mobility. Langmuir. 23, 9134-9139 (2007).
- Watanabe, R., et al. Arrayed lipid bilayer chambers allow single-molecule analysis of membrane transporter activity. Nat. Commun. 5, (2014).
- Stamou, D., Duschl, C., Delamarche, E., Vogel, H. Self-Assembled Microarrays of Attoliter Molecular Vessels. Angew. Chem. Int. Ed. 115, 5738-5741 (2003).
- Lohr, C., et al. Single Liposomes Used to Study the Activity of Individual Transporters. Biophysical Journal. 106, 229a (2014).
- Dunlop, J., Bowlby, M., Peri, R., Vasilyev, D., Arias, R. High-throughput electrophysiology: an emerging paradigm for ion-channel screening and physiology. Nat. Rev. Drug Discov. 7, 358-368 (2008).
- Milligan, C. J., et al. Robotic multiwell planar patch-clamp for native and primary mammalian cells. Nat. Protoc. 4, 244-255 (2009).
- Soga, N., Watanabe, R., Noji, H. Attolitre-sized lipid bilayer chamber array for rapid detection of single transporters. Sci. Rep. 5, (2015).
- Kleefen, A., et al. Multiplexed parallel single transport recordings on nanopore arrays. Nano Lett. 10, 5080-5087 (2010).
- Wei, R., Gatterdam, V., Wieneke, R., Tampé, R., Rant, U. Stochastic sensing of proteins with receptor-modified solid-state nanopores. Nat. Nanotechnol. 7, 257-263 (2012).
- Urban, M., et al. Highly parallel transport recordings on a membrane-on-nanopore chip at single molecule resolution. Nano Lett. 14, 1674-1680 (2014).
- Kusters, I., Van Oijen, A. M., Driessen, A. J. Membrane-on-a-Chip: Microstructured Silicon/Silicon-Dioxide Chips for High-Throughput Screening of Membrane Transport and Viral Membrane Fusion. ACS Nano. 8, 3380-3392 (2014).
- Hansen, J. S., Thompson, J. R., Hélix-Nielsen, C., Malmstadt, N. Lipid directed intrinsic membrane protein segregation. J. Am. Chem. Soc. 135, 17294-17297 (2013).
- Heinemann, F., Schwille, P. Preparation of Micrometer-Sized Free-Standing Membranes. ChemPhysChem. 12, 2568-2571 (2011).
- Lazzara, T. D., Carnarius, C., Kocun, M., Janshoff, A., Steinem, C. Separating attoliter-sized compartments using fluid pore-spanning lipid bilayers. ACS nano. 5, 6935-6944 (2011).
- Winterhalter, M. Black lipid membranes. Curr. Opin. Colloid Interface Sci. 5, 250-255 (2000).
- Koçer, A., Walko, M., Feringa, B. L. Synthesis and utilization of reversible and irreversible light-activated nanovalves derived from the channel protein MscL. Nat. Protoc. 2, 1426-1437 (2007).
