Abstract
Membraaneiwit vervoer op de enkel eiwit niveau ontwijkt nog een gedetailleerde analyse, wanneer het substraat translocatie is niet elektrogene. Aanzienlijke inspanningen zijn gedaan op dit gebied, maar technieken voor directe high-throughput transport analyse in combinatie met oplosmiddelvrije lipide bilaag technieken die nodig zijn voor de analyse van membraan transporters zijn zeldzaam. Deze klasse van vervoerders is echter van cruciaal belang in cel homeostase en dus een belangrijke doelgroep in de ontwikkeling en methodologieën om nieuwe inzichten drug hard nodig.
De hier gepresenteerde manuscript beschrijft de inrichting en het beheer van een nieuwe biochip voor de analyse van membraaneiwit gemedieerd transportprocessen in één transporter resolutie. De biochip bestaat uit microcavities omsloten door nanoporiën die zeer parallel in het ontwerp en kunnen in industriële kwaliteit en kwantiteit. Eiwit-herbergen liposomen kunnen direct worden aangebracht opde chip oppervlak vormen van zelf-geassembleerde poriën verspreid over lipidedubbellagen behulp van SSM-technieken (vast ondersteund lipide membranen). Pore omspant delen van het membraan vrijstaand, door een interface voor translocatie substraat in of uit de holle ruimte, eventueel gevolgd door multispectrale de fluorescentie in real-time. De oprichting van Standard Operating Procedures (SOP's) maakt het mogelijk de eenvoudige oprichting van-eiwit herbergen lipidedubbellagen op de chip oppervlak van vrijwel elke membraaneiwit dat functioneel kan worden opgelost. De enige voorwaarde is de oprichting van een tl-read-out systeem voor niet-elektrogene transport substraten.
High content toepassingen accomplishable door geautomatiseerde omgekeerde fluorescentie microscoop opnamen meerdere chips parallel. Grote datasets worden geanalyseerd met de vrij beschikbare maat gemaakt analysesoftware. Drie-kleuren multi-spectrale tlVerder lees-out zorgt voor een onpartijdige discriminatie data in verschillende event klassen, waardoor vals-positieve resultaten.
De chiptechnologie is momenteel gebaseerd op SiO2 oppervlakken, maar verdere functionalisering behulp goud gecoate chip oppervlakken mogelijk.
Introduction
De analyse van membraaneiwitten is geworden van de toenemende belangstelling voor fundamenteel en farmaceutisch onderzoek in de afgelopen 20 jaar. De ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen is afhankelijk van de identificatie en de gedetailleerde karakterisering van nieuwe targets, momenteel één van de beperkende factoren. Het feit dat ongeveer 60% van alle targets zijn membraaneiwitten 1, maakt de ontwikkeling van technieken om hun belangrijkste functie helderen.
In het verleden, zijn technieken voor het bestuderen van elektrogene kanalen en transporters ontwikkeld veelheid 2-4. Non-elektrogene substraten in tegenstelling presenteren een meer uitdagende taak. Zij zijn echter van bijzonder belang als voornaamste drug targets, omdat ze de flux van opgeloste stoffen en voedingsstoffen door het celmembraan en fungeren als de belangrijkste receptoren controle bij het signaleren van cascades 5.
Aanzienlijke inspanningen werden in de ontwikkeling van t gezetechniques de functie van membraan transporteiwitten 6, 7 bestuderen. Systemen met vaste drager als membranen meest veelbelovende hulpmiddelen ontstond in dit gebied 8-10, waaronder vaste drager lipidendubbellagen gebonden dubbellagen 11, 12, microblack lipide membranen 13, 14 en inheemse vesicle arrays 15, 16 te noemen. Sommige zijn zelfs verkrijgbaar als commerciële opstellingen 17, 18. Voorbeelden zijn gepubliceerd combineren vermogen enkelvoudige membraaneiwitten te bestuderen op een zeer parallelle wijze 14, 19, een voorwaarde voor screening toepassingen. Echter, deze methoden zelden overbruggen van fundamenteel onderzoek tot de industriële omgeving. Het feitelijke probleem vaak het vermogen van het systeem om automatiseerbare, de kostbare productie en / of bewerkelijke bereiding. Een aanpak overcoming alle hierboven genoemde obstakels is het einddoel.
De techniek die hier werd ontwikkeld om membraankanalen en transporters studie in vitro in een gecontroleerde omgeving voor de interne eiwitniveau 20-22. Reconstructie van gezuiverde membraaneiwitten in LUV's is veel meer gevestigde dan vergelijkbare aanpak voor GUVs 23-26 of zwarte lipide membranen 27. Ze kunnen direct worden aangebracht op het chip oppervlak, waarbij bilaag vorming plaatsvindt via een zelf-assemblageproces. De glazen bodem ontwerp van de nanoporeuze chip (fig. 1) maakt lucht microscopie, die de eenvoudige automatisering van het systeem mogelijk maakt. In combinatie met een gemotoriseerde fase kan meerdere chips worden gemeten op hetzelfde tijdstip, waarbij elke gezichtsveld met duizenden afgesloten holtes voor analyse.
Figuur 1. Ontwerp van multiplex nanogaatje biochips. A) een silicon-on-insulator (SOI) wafer wordt gestructureerd door reactief-ion etsen. Ongeveer 1.150 individuele chips worden vervaardigd uit elk wafer met identieke eigenschappen en kwaliteit. B) Elke chip bestaat uit 250.000 individuele microcaviteiten met nano openingen. Schaal bar:. 200 pm C) elke holte is adresseerbare via multispectrale fluorescentie uitlezing. Een ondoorzichtige bovenlaag blokkeert de fluorescentiesignalen uit het bufferreservoir, waardoor de biochip compatibel met omgekeerde fluorescentie microscoop. D) Atomic Force Microscopy (AFM) beeldvorming openbaart gelijk geschikt poriënopeningen en oppervlakteruwheid van de siliciumdioxide-laag van 3,6 nm (n = 40) optimaal voor blaasje fusion. Schaal bar:. 5 micrometer E) Scanning electron microscopy beeld (SEM) toont een dwarsdoorsnede door de nanoporiën de toegang tot de femtoliter holten in de siliciumchip. Dit cijfer werd hergebruikt met toestemming van 21. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Alle data-analyse wordt uitgevoerd met behulp van freeware naar onbeperkte toegang voor eindgebruikers te garanderen. Tijdreeksen worden geanalyseerd met behulp van gratis software voor beeldverwerking en een custom build curve analyse software die batch processing en ongecompliceerd correlatie van grote datasets met meerdere fluorescerende kanalen en duizenden bochten.
De model-eiwit gebruikt in dit protocol is de mechanosensitieve kanaal van grote geleidbaarheid (MscL) kanaal eiwitten afkomstig van E. coli. Het functioneert als een klep om osmotische shock aard vrij, maar werd aangepast zodanig dat rationeel ontworpen Synthetic functionaliteiten kunnen covalent aan de kanalen vernauwing zijde worden bevestigd. Via charge-afstoting van het covalent gebonden activator (MTSET) het kanaal wordt geactiveerd om te openen, het creëren van een nano-klep. Kleine moleculen zoals ionen, water, kleine eiwitten, maar ook kleine fluoroforen kan doordringen door het kanaal. Hier wordt het eiwit gebruikt als een model om het vermogen van het systeem om eiwit gemedieerde translocatie detecteren tonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van grote unilamellaire blaasjes (LUV's)
- Reinig een rondbodemkolf (10 ml volume) met stikstofgas om stof te verwijderen. Spoel de rondbodemkolf met ethanol.
Opmerking: Residuele ethanol kan worden getolereerd en geen latere stappen verstoren. - Was een 1 ml glazen injectiespuit 4x met chloroform, om eventuele verontreinigingen te verwijderen. Voeg 4 ml SoyPC20 (25 mg / ml in chloroform) aan de rondbodemkolf en de dope lipideoplossing een extra DOPE ATTO 390 tot een uiteindelijke concentratie van 0,1 mol%.
Opmerking: In plaats van DOPE ATTO 390 andere fluorofoor-gemerkte lipiden en lipofiele kleurstoffen kunnen ook worden gebruikt, afhankelijk van de beschikbare excitatiebronnen. - Sluit de rondbodemkolf een rotatieverdamper. Droog het lipide film voor 40 min bij 300 mbar, 30 ° C badtemperatuur en maximale rotatiesnelheid, een homogene vetfilm op de glazen wand van de kolf te vormen.
- transfer de kolf met een hoge vacuümpomp en de droge lipide film aanvullende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 5 ml buffer (20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8,0; steriel gefiltreerd) en 8 glasparels (2,7 mm diameter, ethanol gewassen en gedroogd) aan de kolf. Verbind de kolf met het roterende verdamper en roteren zonder vacuüm bij 50 ° C op maximale snelheid.
Opmerking: Glazen kralen mechanisch verdringen de lipide film van de glazen wand, wat leidt tot (multilamellaire) vorming van blaasjes. Na 45 min rotatie van de oplossing blijkt melkachtige en geen overblijvende lipide film moet zichtbaar zijn op de kolf muren. In plaats van glasparels andere methoden zoals sonicatie de kolf in een waterbad sonifier, vortexen de kolf of de zachte rehydratie methode is bruikbaar. - Breng de kolf onder inert gas (argon) een ultrasoonbad ultrasone trillingen gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur.
Opmerking: De ultrasone schokgolven verstoren de liposomen, waardoor ze unilamellaire. - Splits de LUV-oplossingin 1 ml porties.
- Voer 5 vries / ontdooi cycli van bevriezen van de LUV oplossing in vloeibare stikstof, gevolgd door ontdooien bij 40 ° C in een waterbad.
Opmerking: Dit leidt tot scheuren en spontane omlegging van afzonderlijke liposomen met elkaar, wat leidt tot vergroot. - Voor deze laatste bevriezingsstap slaan alle monsters bij -80 ° C.
Opmerking: De LUV stabiel blijft gedurende tenminste 6 maanden.
2. Eiwit Reconstitutie
- Ontdooien 1 ml LUV monster op ijs. Direct voor reconstructie, extruderen liposomen 17x door een 400 nm polycarbonaat filter membraan met behulp van een mini-extruder.
Opmerking: Lipide aggregaten worden verwijderd en de uiteindelijke homogene grootteverdeling wordt bereikt. - (V / v) destabiliseren LUV door toevoeging van 4% Triton X-100 (v / v) tot een eindconcentratie van 0,25% en incubeer gedurende 5 minuten bij 50 ° C.
Opmerking: De hoeveelheid liposomen in deze stap is afhankelijk van de massa van het gezuiverde MscL G <sup> 22 C gebruikt (zie stap 2.3). Zuiver MscL G 22 C (afgeleid van E. coli) zoals beschreven in 28. - Mix gezuiverd MscL G 22 C en detergens verzadigde liposomen 1:20 (w / w) verhouding en incubeer gedurende nog 30 minuten bij 50 ° C.
- Voor het verwijderen afwasmiddel bio-korrels in Tris buffer (20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8,0; steriel gefiltreerd) het eiwit / liposoom-oplossing, met 16 mg (vers gewicht) bio-korrels per ul detergent gebruikt om liposomen te destabiliseren stap 2.2.
- Voer detergens verwijderen overnacht (16 uur) bij 4 ° C op een roterende plaat.
Opmerking: Het constant mengen van de oplossing optimale detergensverwijdering. - Na verwijdering detergens proteoliposomen opslag bij 4 ° C en gebruikt voor experimenten op dezelfde dag.
3. Activity Assay
- Tijdens eiwit reconstructie neem een 100 pl hoeveelheid van een schoonmaakmiddelgedestabiliseerd proteoliposoom oplossing na afwerkingsstap 2,3.
- Voeg 1 volume calceïne (30 mM) aan het eiwit-liposoom-oplossing en incubeer aanvullende 5 minuten bij 50 ° C.
- Verwijderen detergens uit de oplossing als beschreven in stap 2,4-2,6.
- Na verwijdering detergent in evenwicht een grootte-uitsluiting-kolom (20 ml bed volume of meer) met Tris buffer (3x het volume bed).
Opmerking: proteoliposoom scheiding kan worden uitgevoerd bij kamertemperatuur, maar het houden van het monster constant op 4 ° C wordt aangeraden om optimaal eiwit activiteit mogelijk na fractionering. - Proteoliposomen gescheiden van vrij calceïne door toepassing van het gehele monster (200 pl) aan de gelfiltratiekolom. Laat het mengsel dringen in de kolom, gevolgd door elutie van de proteoliposomen uit de kolom via continue buffer applicatie geplaatst middels zwaartekracht. Let op de calceïnebevattende proteoliposomen als een discrete oranje band in de elutie front. Verzamel fracties van 500 & #181; l respectievelijk.
Opmerking: vrij calceïne kleurstof elueren na proteoliposoom fractie met volledige scheiding. - Pipetteer 80 ul van elke fractie op een micro-well plaat voor TL uitlezing en identificeren van de fractie die het hoogste bedrag van de calceïnebevattende proteoliposomen via fluorescentie-emissie. Detecteren fluorescentie bij 520 nm met excitatie bij 490 nm. Gebruik het proteoliposoom fractie met het hoogste signaal voor volgende activiteitstest.
- Meng 20 pl van de proteoliposoom-bevattende fractie met 980 ul Tris-buffer in een 1 ml cuvette fluorescentie.
- Meet fluorescentie-emissie bij 520 nm (excitatie 490 nm) met een spectrofluorometer. Record voor 1 min en voeg 25 ul van MTSET ([2- (trimethylammonium) ethyl] methanethiosulfonate) van een voorraadoplossing (160 mM) en meng. Blijf op de opname tijdens het mengen. bereiden altijd de voorraad oplossing verse direct voor gebruik.
Let op: Eenmaal opgelost in buffer MTSET hydrolyserenB binnen 30 minuten en niet-reactief. MTSET kunnen worden gewogen en bewaard in droge poeder monster bij -20 ° C tot gebruik.
Noot: Eenmaal geactiveerd de MscL G 22 C kanaal opent en laat de ingesloten calceïne, wat leidt tot een plaatselijke afname van de concentratie van calceïne als effluxing de proteoliposomen en daaropvolgende dequenching van de kleurstof, wat resulteert in een toename van de fluorescentie-emissie. - Na de fluorescentie-emissie een stabiel plateau weer heeft bereikt, oplosbaar de liposomen door toevoeging van 50 pl Triton X-100 (4% v / v).
Opmerking: niet op een grotere fluorescentie stijging kon worden vastgesteld, wat impliceert actief eiwit in elk liposoom.
4. Grootte Distributie Meting van LUV's met behulp van nano-deeltjes Tracking
- Merk op dat slechts minimale monsters van het liposoom of proteoliposoom oplossing nodig grootteverdeling analyse met behulp van nanodeeltjes tracker zijn. Verdun een liposoom oplossing van 5 mg / ml lipide concentratie 1: 5000 (v / v) in buffer (20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8,0; steriel gefiltreerd) voor analyse naar een eindvolume van 1 ml. Filter alle buffers gebruikt voor het verdunnen en LUV voorbereiding vooraf en reconstructie met behulp van een 0,2 um membraan om eventuele zwevende deeltjes zoals stof die grootteverdeling metingen verstoren verwijderen.
- Was de stroom-kamer met ultra-zuiver water.
- Gebruik het oppervlak markers om zich te concentreren op de lichtbundel. Injecteren ongeveer 300 pi van de verdunde liposoom monster en onmiddellijk sluit de uitgang klep om de stroom in de stroom kamer te stoppen, zonder dat er eventuele luchtbellen.
- Pas de scherpstelling en de sluiter van de camera / gain-instellingen om voldoende verstrooiing signaal van het monster voor de detectie te garanderen.
Opmerking: 20 - 80 signalen moeten duidelijk zichtbaar in het gezichtsveld worden. Voorkom overbevolking (> 80 signalen) als de software niet in staat zal zijn om de individuele signalen bijhouden wanneer overlappen. - Ga naar de "Capture" scrEén. Stel de temperatuur tot 25 ° C en de vangst duur tot 90 seconden met behulp van de software controles. Druk op "Record" om te beginnen met het opnemen van een tijdreeks.
Let op: Na afloop van de tijdreeks een nieuw venster geopend. - Sla de tijdreeksen in de gegeven-formaat (* .avi). Om praktische redenen tijdens de batch-analyse op te slaan alle bestanden in één map.
- Open de uitlaatklep en injecteer nog eens 300 ul in de stroom kamer. Sluit het ventiel en herhaal de stappen 4,3-4,6 maal.
- Na het voltooien van alle steekproef runs was de stroom kamer met 5 ml ultrapuur water. Ga naar het scherm "Pre-Process". Stel de kalibratieparameters temperatuur = 25 ° C en de viscositeit = 0,91 voor de Tris buffer die in dit protocol.
- Open de partij proces-venster en laadt de geregistreerde tijdreeksen (Advanced / Batch Process / Set File 1-3). Druk op "GA" om de grootteverdeling analyse starten.
Let op: de analytische software automatisch volgt de enkele deeltjes en berekent de diameter op basis van hun bewegingsgedrag met behulp van de in stap 4.8 parameters.
Opmerking: De resulterende grootteverdeling analyse slaat automatisch in dezelfde map als de tijdreeks bestanden. - Daarnaast maakt u een rapport bestand naar de resultaten (Export / Rapport PDF) samen te vatten.
5. Chip Holder Voorbereiding
- Weeg 1,0 g MDX4 medische kwaliteit elastomeer base en 0,1 g MDX4 verharder in een 50 ml reageerbuis. Blend zowel grondig met een glazen bar.
- Doe de buis in een exsiccator gedurende 1 uur ontgassen de kleefstof. Daarna gebruiken binnen 30 minuten voor de chip lijmen, omdat de kleefstof zal verharden en zijn te moeilijk om mee te werken.
- Tijdens elastomeer ontgassen (stap 5.1) schoon te maken een objectieve glasplaatje grondig met chloroform om eventuele verontreinigingen voordat chip bonding verwijderen. Spoel de dia met 5 ml chloroform met een glazen injectiespuit. Verzamel dechloroform in een daaronder geplaatste beker. Na het wassen laat de dia drogen.
Let op: Voer deze stap onder een zuurkast. Alternatief chloroform, kunnen andere organische oplosmiddelen zoals aceton worden gebruikt. - Stort een kleine hoeveelheid van het lijmen materiaal op het deksel glas met een pipet tip (crystal tips voor 10 pi pipetten). Herinner dat de chips moeten later in de 8-kamer diahouder passen en hebben derhalve de slede worden geplaatst.
- Haal een chip op een moment uit de wafer board met behulp van fijne tip pincet en de chip deponeren op de daling van de lijm op de deksel glas. Zorg ervoor dat de gecoate zijde van de chip naar boven wijst.
- Duw de chip op de dekking van glas met de achterkant van een stompe PE pincet. Opdat de lijm gelijkmatig verdeeld onder de chip, schuif de chip heen en weer. Kritische stap: Zorg ervoor dat er geen luchtbellen gevangen onder de chip, zoals het optische beeldvorming verstorenvan de chip holten later. Ook voor zorgen dat er geen zelfklevend materiaal vervuilt de chip oppervlak.
- Uitdrogen de afgewerkte dekglas gedurende 2 uur bij 65 ° C in een kast droger.
Noot: chips nog steeds bedekt met een beschermende laag afkomstig van de fabricage die moet worden verwijderd. - Om de beschermende laag te verwijderen, het uitvoeren van een sequentiële oplosmiddel wasstap. Tijdens het uitharden van chips Verwarm een waterbad tot 54 ° C.
- Plaats 3 glazen bekers in het waterbad, beiden gevuld met isopropanol en één gevuld met aceton.
- Plaats de chip dekglas in een houder en dompel het in de eerste isopropanol gevuld schotel voor 10 min. Daarna mogelijk in een aceton gevulde schotel, opnieuw incubeer 10 min door te verbinden voor de laatste wasstap aan de tweede isopropanol schotel en incubeer nog 10 min.
- Haal de diahouder van het gerecht en zorgvuldig wassen uitgebreid met Ultrapure water, gevolgd door drogen van de chips met een voorzichtige stroom stikstofgas.
- Take-off van de lamineren vel uit de 8-well sticky-slide en zet deze naar achteren op de bank. pick voorzichtig op de cover glijbaan en druk voorzichtig op de sticky-slide met de chips tegenover de putten. Laat de afgewerkte chip houder rust voor een paar minuten voor gebruik.
6. Assay Voorbereiding
Opmerking: Nanopore chips vastgelijmd aan een dekking van glas en van elkaar gescheiden door een 8-well sticky-slide bezitten het voordeel, kan die meerdere chips worden aangepakt in een enkele experimentele run, met chips wordt volledig gescheiden van elkaar.
- Na chip houder voorbereiding, spoel elke chip met pure ethanol en drogen onder een stikstofgas, om eventuele verontreinigingen zoals stof te verwijderen.
- Maak de chip oppervlak met lucht, zuurstof of stikstof plasma. Afhankelijk van het type plasmareiniging termijnen variëren: uitvoeren zuurstofplasma behandeling van 1 min, lucht en nitrogen plasma gedurende 5 min bij 0,3 mbar bij 80% vermogensinstelling (RF-vermogen gemiddeld of hoog).
- Na incuberen plasmareiniging chips in zuivere ethanol gedurende 10-15 min holte nat wordt.
- Stapsgewijze uitwisseling ethanol buffer door het toevoegen van 400 pl Tris-buffer (20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8,0; steriel gefiltreerd), gevolgd door mengen van de oplossing zonder dat er luchtbellen en daaropvolgende verwijdering van 400 pl. Herhaal deze procedure 12 keer, om ethanol te verwijderen te garanderen.
Opmerking: Ethanol is schadelijk voor liposomen en zwevende lipide dubbellagen zijn. - Dope Tris buffer (20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8,0; steriel gefiltreerd) met 5 mM CaCl2 en 1 uM Oy647 kleurstof. Volledig verwijderen van de wasbuffer uit de chip en onmiddellijk de gedoteerde buffer toe te voegen aan de chip. Opmerking: Chips worden bedekt met een dunne film na buffer wasbuffer verwijderd, zodat de chip niet in direct contact met lucht teneinde een constante bevochtiging van de holten en het chip oppervlak.
- Voeg 1 mg / ml of LUV's proteo-LUV in Tris buffer (20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8,0; steriel gefiltreerd) aan elk putje.
Opmerking: Het eindvolume in elk putje is 300 pi. Overweeg latere toevoegingen van de controle kleurstof en de chemische modifier MTSET tijdens gedoteerde Tris buffer toevoeging. - Voor porie spanning lipide bilaag formatie op het chip oppervlak incubeer de chip gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met de liposoomoplossing. Daarna wassen elke chip met 4x 400 ul van Ca 2 + -vrij Tris buffer.
- Voeg de besturing kleurstof aan elk putje met een uiteindelijke concentratie van 5 uM. De chips zijn nu klaar voor de translocatie assay.
7. Assay Setup
- Monteer de chip houder aan de epifluorescentie microscoop (20X lucht doelstelling, lange werkafstand). Focus op de rand van de nanogaatje chip gemakkelijker vinden het brandvlak van de micro-holten. Zodra de holten in instelaftasting de nanoporiën array voor een regio thten hoogste displays afdichtende verhouding.
Opmerking: Elke geïnverteerde epifluorescentiemicroscoop kan worden gebruikt om chip assays. Afhankelijk van het doel vergroting (20X - 60X) het aantal getest holten variëren met tot 9000 gaatjes in één gezichtsveld gebruik 20X vergroting. Air doelstellingen met een lange werkafstand de voorkeur. Het gebruik van omgekeerde confocale laser scanning microscoop (CLSM) is ook mogelijk, maar beeldacquisitie kan de beperkende factor als gevolg van de beperkte diepte van de focus. - Optimaliseer de chip verlichting.
Let op: Zorg ervoor dat beide kleurstof kanalen niet hoger zijn dan de maximale grijswaarde, de veranderingen niet kunnen worden waargenomen. Voor de export experimenten aan te passen verlichting van de translocatie kleurstof tot 90% van de maximale capaciteit van het signaal. Stel de controle kleurstof in de open holten tot 80-90% van de maximale signaal capaciteit om duidelijk te detecteren die lek membraan afdichting. - Wanneer alle kanalen zijn ingesteld start de tijdreeks. Neem beelden elke 10-20 seC gedurende 90 min.
Opmerking: Dit is voldoende om ook te volgen specifieke en niet-specifieke efflux evenementen. - Initialiseer efflux van het fluorescerende substraat door toevoeging van cysteïne-specifieke, positief geladen verbinding MTSET tot een eindconcentratie van 3 mM. Tenminste 5 min experiment runtime voordat MTSET aanvulling kunnen een stabiele fluorescentiesignaal basislijn vóór opening kanaal later vaststelt. bereiden altijd MTSET oplossing verse direct voor gebruik.
8. Data Analysis
- Open de time beeld-serie stapel met een standaard versie van ImageJ (File / Import / Image Sequence).
- Als fluorescerende kanalen worden gestapeld, splitsen de kanalen in afzonderlijke stapels voor elk kanaal (Image / Stacks / Stack Images).
- Dupliceren het eerste beeld van de translocatie substraat kanaal voor ROI (regio's van belang) identificatie (Image / Duplicate).
- Converteren het beeld naar een binair beeld (Image / Aanpassen / Threshold). verzekerendat het gebruikte algoritme geeft signalen voor alle gesloten holten zonder overlapping pixilation.
- regio's van belang met het deeltje Analyzer automatisch define (Analyze / Analyseer Particle). Definieer een minimale deeltjesgrootte gedefinieerd, om deeltjes ruis te voorkomen. Controleer de opties 'te sluiten op de randen "en" bevatten gaten ". Zorg ervoor dat de resulterende ROI weerspiegelen de microcavity matrix patroon. Tussenliggende ROI zijn artefacten, dus ze te verwijderen. Sla de ROI lijst.
Opmerking: Meting parameter moet worden ingesteld op "ruimte" voor analyse van deeltjes (Analyseren / Set Metingen / Area) - Open de Time Series Analyzer plug-in (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/time-series.html), die alle ROI automatisch het formaat van dezelfde grootte. Re-size alle bestaande ROI tot een breedte / hoogte van 6x6 pixels en ovale vorm (Timer Serie Analyzer / AutoROIProperties). Vink de optie "Resize bestaande ROIS". Sla de resulterende ROI lijst aangepast.
- Open de ROI manager(Analyseer / Tools / ROI Manager) en laad het aangepast ROI lijst voor elk kanaal van de tijdreeks (ROI Manger / Meer / Open). ROI wordt gesuperponeerd. Om het signaal verandering voor elke ROI analyseren start de Multi Measure gereedschap (ROI Manager / Meer / Multi Measure), selecteer "Maatregel alle segmenten" en "One rij per slice" en start de multi-maatregel.
Opmerking: Meting parameter moet worden ingesteld op "betekenen grijswaarde 'voor deze stap (Analyseer / Set Metingen / Mean grijswaarde) - Sla de resulterende tabel, waardoor de gemiddelde grijswaarde voor elk ROI in * .txt of * .xls-indeling.
- Importeer de ROI-analyse van elk imaging kanaal in NanoCalcFX via de optie 'Import File ". Stel "Gebruik eerste regel voor het benoemen serie". Stel de grootte stap tussen afbeeldingen op basis van de termijnen afbeelding serie acquisitie en kies de overeenkomstige kolom en decimaal teken.
- Gebruik de optie 'multiple sheet "om automatisch te correleren de grafieken van de individuele fluorescent kanalen.
Opmerking: De gebeurtenissen kunnen nu worden geanalyseerd en ingedeeld aan de hand van de informatie die door de 3-kleur spectrale informatie. - Fit geselecteerde krommen met behulp van de ingebouwde fit-functie (fit optie).
Opmerking: De uitgevoerde uitstroom en instroom vergelijking is geschikt voor alle monoexponential basis van diffusie gebeurtenissen en geschikte grenzen kunnen worden ingesteld. Resulterende snelheidsconstanten kunnen worden uitgezet met behulp van het histogram gereedschap of geëxporteerd voor nadere gegevens verfijning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
-Pore spanning membranen kunnen eenvoudig worden gemaakt op de nanostructuur chip oppervlak in een zelf-geassembleerde manier. Maar het onderliggende proces is nog steeds delicaat en beïnvloed door vele parameters zoals liposoom omvang, monodispersiteit van het liposoom bevolking, lamellarity, lipide en zout-concentratie en chemische oppervlakte-eigenschappen. De meeste van deze parameters zijn zorgvuldig gekarakteriseerd en gestandaardiseerd in bovenstaande protocol. Andere parameters echter moeten worden gecontroleerd bij elke nieuw preparaat, een geslaagd experiment te verzekeren. Dit zijn de liposomen grootteverdeling en dispersiteit populatie (Fig. 2 A). Voor een optimale porie spanning membraan vorming en liposoom binnendringen in de holte ruimte liposoom maten ruim boven de poriediameter te voorkomen zijn een noodzaak. Bovendien zijn monodisperse liposoompreparaten aangetoond dat de beste resultaten opleveren membraan verspreiden en fusiop. Een andere cruciale stap die moet worden gecontroleerd voor elk preparaat eiwit activiteit na reconstitutie. Met behulp van een fluorescentie dequenching assay voor liposomen gereconstitueerd met MscL G 22 C kan kanaalopening worden bewaakt via fluorescentiespectroscopie, waardoor een verhouding van liposomen herbergen actieve MscL G 22 C-eiwit (Fig. 2 B).
Verspreidden de chipoppervlak, kan opgeloste translocatie van een fluorescente doelstelling van MscL G 22 C op ligandactivatie gevolgd (Fig. 3 B). Engineered MscL G 22 C-kanalen gesloten zijn in hun oorspronkelijke staat, het insluiten van kleine fluorescente moleculen in de holte ruimte. Door toevoeging van de chemische modulator MTSET positieve ladingen worden ingevoerd om de vernauwing regiode MscL G 22 C porie, duwen geopend via elektrostatische afstoting. Voorafgaande ingevangen fluorofoor ontwijkt de holle ruimte diffusie evenwicht te bereiken. De daaropvolgende afname van fluorescentie binnen de holle ruimte kan worden gecontroleerd. Deze werkwijze is sterk reproduceerbaar, waardoor een homogene populatie van efflux gebeurtenissen (Fig. 3 C). De resulterende curven efflux cluster in twee verschillende populaties, die het vermogen aantonen van de test om onderscheid tussen één- en meerkanaals translocatie gebeurtenissen (Fig. 3 D). Verder is het systeem in staat is om de follow-up tot drie spectraal goed gescheiden kleurstoffen in parallel en in real-time, waardoor het mogelijk om high-inhoud screenings op te nemen en nauwkeurig en objectief onderscheid tussen positieve, vals-positieve en negatieve resultaten. In deze studie werden 9,046 afgesloten holten geanalyseerd, waarvan 8% weergegeven efflux gedrag. Het inzetten van de verschillende fluorescerende uitlezen kanalen, kunnen gebeurtenissen worden onderscheiden in monoexponential efflux gebeurtenissen, complexe kinetiek, lipide-inbraken en het membraan scheurt (Fig. 3 E). Alleen gebeurtenissen die gestage signalen voor de controle opgeloste stof en het membraan kleurstof weer te worden beschouwd voor de uiteindelijke analyse. Complexe kinetiek vertegenwoordigen efflux gebeurtenissen met onvaste besturingssignalen en worden daarom weggelaten. Lipid inbraken en membraan breuken zijn artefact gebeurtenissen intrinsiek optreden met behulp van poriën verspreid over lipidedubbellaag systemen. Ze kunnen worden verwijderd via het bedieningspaneel kleurstof signalen zoals hierboven beschreven (fig. 4) genoemd.
Figuur 2. grootteverdeling van proteoliposomen en MscL functie. A) vesicles Analyz ed door nano-deeltjes volgen analyse. LUV monsters werden onderzocht vóór (zwart trace) en na reconstructie van MscL G 22 C (rood trace). Na LUV bereiding wordt een gemiddelde deeltjesgrootte van 214 ± 70 nm bereikt. De omvang is afgenomen tijdens de bereiding, wat resulteert in proteoliposomen van 158 ± 60 nm in grootte. B) MscL activiteit werd gevalideerd na oplossen door een efflux assay. 28 Zelf geblust calceïne wordt vrijgelaten uit proteoliposomen tot MTSET-gemedieerde opening van het MscL kanaal, waardoor dequenching van de fluorofoor (rood) en een snelle toename van de fluorescentie intensiteit. Liposomen zonder eiwitten lopen niet efflux, ook na herhaald MTSET toevoeging (zwart). Latere-detergent geïntroduceerd oplossen (TX-100) van de liposomen releases alle eerder ingekapselde kleurstof. Dit cijfer werd hergebruikt met toestemming van 21.et = "_ blank"> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Ligand-gated opgeloste stof translocatie door MscL bij single-molecule-niveau. A) Engineered MscL G 22 C-kanalen gesloten zijn in hun oorspronkelijke staat. Kleine opgeloste stoffen zoals een fluorofoor niet kunnen noch pass kanaal of de lipide dubbellaag. Na toevoeging van MTSET, een aangelegde enkele cysteïne van elk MscL G 22 C promoter wordt gewijzigd, de invoering van meerdere positieve ladingen in de vernauwing van het pentamere kanaal complex. De MscL G 22 C-kanaal wordt opengeduwd door ladingsafstoting en de ingesloten kleurstof kan diffunderen van de holte, waardoor een afname in fluorescentie-intensiteit. B) Time sporen van MscL G 22 C opening na toevoeging van MTSET. Proteoliposomen met functioneel opgelost MscL G 22 C werden verspreid over de chip oppervlak. Oy647 (rood) werd ingesloten in de holtes als translocatie substraat. OregonGreen Dextraan (70 kDa, groen) werd toegevoegd als kanaal ondoordringbaar controlesubstraat de substraatspecificiteit van het transport gebeurtenis en de membraan integriteit tijdens het experiment te volgen. LUV's werden aangevuld met DOPE ATTO 390 (0,1 mol%; paars) om te controleren op besmetting lipide binnen holtes. Toevoeging van MTSET (3 mM finale) op t = 0 sec opent het kanaal, wat leidt tot Oy647 uitstroom uit de holtes, opgenomen via fluorescentie uitlezing. C) willekeurig gekozen MscL G 22 C uitstroom curves tonen typische uitstroom evenementen. D) Rate constanten voor translocatie gebeurtenissen (n = 242) cluster in twee Gauss bevolkings, waaruit blijkt dat single- en multi-channel vervoer evenementen kunnen worden onderscheiden. E) high content en statistische analyse van 9046 afgesloten chip holtes door triple-color real-time uitlezing. 8% van alle geanalyseerde chip holtes vertonen exponentiële efflux evenementen. Als gevolg van spectrale decodering (red: translocatie opgeloste stof; groen: controle opgeloste stof; violet: lipide), efflux evenementen, complexe kinetiek, lipide-inbraken en membraan breuken konden worden onderscheiden, zodat het niet langer valse positieven. Dit cijfer werd hergebruikt met toestemming van 21. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Event klassen onderscheiden door drie-kleuren detectie. Translocatie opgeloste stof (rood), control opgeloste stof (groen) en een lipide kleurstof (violet) kan spectraal worden onderscheiden waardoor onpartijdige dataselectie. A) Sealed holten harboring geen membraaneiwit vertonen geen flux gebeurtenissen onder beschreven voor de MscL tweekanaalsopname experimentele omstandigheden (zie fig. 3A) . De fluorescente uitlezing stabiel voor alle kanalen. B) onduidelijke gesuspendeerd lipide bilagen kunnen de holte. C) membraan breuk leidt discontinue lipide dubbellaag overspant de nanoporiën spleten dringen. Daardoor wordt de holle ruimte niet meer gescheiden van het buffercompartiment. Ingesloten kleurstoffen (rood) onttrekken aan de holte langs de concentratiegradiënt. De besturing opgeloste stof (groen), eerder niet passeren door het membraan, treedt de holte. D) Voorbeeld van een lipide inbraak event. Terwijl het fluorescentiesignaal van de kleurstof lipide (violet) toeneemt als gevolg van het membraan invasie van de holle ruimte, de translocatie opgeloste stof Pushed uit de holte (rood), leidend tot een afname van fluorescent signaal. De nanopore wordt geblokkeerd door de lipide bilaag, het passeren van het controlesubstraat (groen). E) Tijdens membraan scheuren, de ingesloten opgeloste stof snel transport ontwijkt uit de holte (rood), terwijl de controlegroep in opgeloste stof (groen diffundeert). Dit cijfer werd hergebruikt met toestemming van 21. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De techniek die hier kan een zeer parallelle analyse membraaneiwit transport. Gereconstitueerd membraaneiwit systemen kunnen direct worden aangebracht op de biochip, waardoor de aanpassing van theoretisch elke membraantransporter of kanaal mogelijk. Transport analyse wordt alleen beperkt door de oprichting van een tl-read-out systeem, hetzij via directe fluorescentie verandering (translocatie van fluoroforen of fluorescent gelabelde substraten) of indirecte fluorescentie change (pH-gevoelige kleurstoffen, secundaire enzymatische reacties). De laatste, maar moeten nog worden vastgesteld.
Functionele karakterisering van membraan kanalen of transporters op de single eiwitgehalte is de belangrijkste focus van deze techniek. In combinatie met een geautomatiseerde microscoop, de invoering van het screenen op eiwit effectoren is ook mogelijk. De test opstelling laat de parallelle opname van maximaal 8 chips, met meerdere assay punten op elke chip. Vanwege de volledige scheiding van de chips, het is echt parallel, waardoor voor meerdere experimentele herhalingen inbegrip van de controles in een enkele experimentele run, zodra aan de voorwaarden zijn vastgesteld.
Kritische stappen tijdens het opzetten van een experiment zijn de bereiding van unilamellaire vesicles werkelijk de actieve reconstitutie van het proteïne van keuze, verspreiding efficiëntie van proteoliposomen op het chip oppervlak en de retentiecapaciteit van de gesuspendeerde lipide bilaag richting van de substraten die in de test.
Terwijl de bereiding van unilamellaire vesicles is van fundamenteel belang voor deze test om de instelling van multilamellaire membraanlagen op het chip oppervlak tijdens gesuspendeerd lipide bilaag vorming te vermijden, is het vrij gemakkelijk om unilamellarity van de vesicles te garanderen via sonicatie de liposomen tijdens de bereiding.
De directe toepassing van proteoliposomen is de grote vooruitgang van de methode presented. In tegenstelling tot eerdere benaderingen complexer en medisch relevante proteïnen nu kan worden gericht, waarbij natuurlijk de voorafgaande instelling van een protocol waarbij reconstitutie functioneel eiwit keuze LUV's. Daarnaast membraaneiwitten het bezit van grote extra-membraan domeinen verminderen de vorming van een goede SSM. Dit moet worden geoptimaliseerd voor elke nieuwe eiwitten, bijvoorbeeld door variatie van de CaCl2-concentratie.
De reconstitutie verhouding van het eiwit van belang moet zorgvuldig worden gekozen. De analyse van afzonderlijke eiwitten gebeurtenissen gewenst en accomplishable met de hier gepresenteerde techniek. De hoeveelheid opgeloste eiwitten dient derhalve niet meer dan 1-2 functioneel eiwit eenheden per porie spanning membraanplaat aanname van een ideale reconstitutie en dat het membraaneiwit stochastisch verdeeld over de bilaag. Bovendien is de gerichtheid van het eiwit na bereiding moet ook rekening worden gehouden, want het heeft not gelijke tussen beide directionalities zijn.
Eindelijk eens al deze kwesties worden zorgvuldig gecontroleerd en geoptimaliseerd, kan geen van de gebruikte substraten elke niet-specifieke membraan permeabiliteit van de porie spanning membraan weer te geven. Positief geladen fluoroforen, zoals de meeste-rhodamine gebaseerde kleurstoffen in het rode spectrale regime neiging om de membraanbarrière snel worden weggenomen. Sterke hydrofobe interacties kunnen leiden tot een niet-specifieke hechting aan de lipide bilaag. Beide woningen zijn niet gewenst.
De studie van ionenkanalen op kwalitatieve wijze is denkbaar. Screening voor kanaal effectoren met een binaire ja / nee uitlezing kan worden gezien via ion-gevoelige kleurstoffen. Het grootste obstakel zou hier de oprichting van een ten minste gedeeltelijk-ion behoud lipidedubbellaag zijn. Dit kan alleen worden bereikt via modificatie van het oppervlak van de nanogaatje chip.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| [2-(Trimethylammonium)ethyl] methanethiosulfonate |
Toronto Research Chemicals Inc. | T792900 | MTSET; hydrolized by water. Keep as dry pouder aliquot at -80 °C. Use immediately (30 minutes) after solubilization in buffer. |
| 1 ml gas-tight syringe | Hamilton | #1001 | |
| 10 ml round flask | Schott Duran | ||
| 2.7 mm glas beads | Roth | N032.1 | |
| 2-Propanole | Roth | 9866.5 | |
| 30 cm Luer-Lock Extension Tube | Sarstedt | 744304 | |
| Acetone | Roth | 5025.5 | |
| Bio-Beads SM-2 Adsorbent | Bio-Rad | 152-3920 | need to be activated before first use |
| CaCl2 Dihydrat | Roth | HN04.3 | |
| Calcein | Sigma | C0875 | store dark at -20 °C |
| Chloroform reagent grade | VWR Chemicals | 22711324 | |
| DOPEATTO390 | ATTO-TEC | AD 390-165 | store dark at -20 °C |
| Ethanol absolute | Sigma-Aldrich | 32205 | |
| Injekt Single-use syringe | Braun | 460 60 51V | |
| Injekt-F single-use syringe | Braun | 91 66 017V | |
| Keck clips | Schott | KC29 | |
| L-α-Phosphatidylcholine, 20% (Soy) | Avanti Polar Lipids | 5416016 | store under inert gas at -20 °C |
| NaCl 99.5% p.a. | Roth | 3957.2 | |
| Nanopore E100 wafer/chips | Micromotive (Mainz/Germany) | available on request | |
| Nucleopore Track-Etch Membrane 0.4 µm | Whatman | 800282 | |
| Oregon Green Dextran 488 (70 kDa) | life Technologies | D-7173 | store dark at -20 °C |
| Oy647 | Luminartis (Münster/Germany) | OY-647-T-1mg | store dark at -20 °C |
| Rotilabo-syringe filtration, unsterile, pore-size 0.22 µm | Roth | P 818.1 | |
| Sephadex G-50 | Sigma-Aldrich | G5080 | column material for size exclusion chromatography |
| Silastic MDX4-4210 | Dow Corning | curing agent for chip fixation onto cover glass support | |
| sticky-Slide 8-well | ibidi | 80828 | multi-well chamber for the mounting onto glass slides (chip holder) |
| Three-way stopcock blue | Sarstedt | 744410001 | |
| Tris Pufferan 99.9% Ultra Quality | Roth | 5429.2 | |
| Triton-X 100 | Roth | 6683.1 | |
| Whatman 0.2 µm cellulose nitrate membrane filter | Roth | NH69.1 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Büchi 461 water bath | Büchi | ||
| Büchi Rotavapor RE 111 | Büchi | ||
| Cary Eclipse Fluorescence Spectrophtometer | Varian | ||
| LiposoFast Mini Extruder | Avestin | ||
| Membrane pump | Vaccubrand | 15430 | |
| Nanosight Nanoparticle Tracking Microscope | Malvern / Nanosight | LM 14C | |
| NyONE microscope | Synentec | available on request | |
| Pump control | Vaccubrand | CVC 2II | |
| Sonicator bath Sonorex RK100H | Brandelin electronic | 31200001107477 | |
| Vaccum pump RC5 | Vaccubrand | 1805400204 | |
| Water bath W13 | Haake | 002-9910 | |
| Plasma Cleaner PDC-37G | Harrick Plasma | PDC-37G | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| ImageJ | Open Source | http://imagej.nih.gov/ij/ | scientific image processing software |
| NanoCalcFX | Freeware | http://sourceforge.net/projects/nanocalc/ | data analysis/evaluation software for massive transport kinetic datasets |
| NTA 2.3 Analytical Software | Nanosight | data acquisition and analysis software for nanoparticle tracking microscope | |
| NTA 2.3 Temperature Comms | Nanosight | temperature controle software for nanoparticle tracking microscope |
References
- Yildirim, M. A., Goh, K. I., Cusick, M. E., Barabasi, A. L., Vidal, M. Drug-target network. Nat Biotechnol. 25, 1119 (2007).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).
- Osaki, T., Suzuki, H., Le Pioufle, B., Takeuchi, S. Multichannel simultaneous measurements of single-molecule translocation in α-hemolysin nanopore array. Anal. Chem. 81, 9866-9870 (2009).
- Carrillo, L., et al. High-resolution membrane capacitance measurements for studying endocytosis and exocytosis in yeast. Traffic. , (2015).
- Giacomini, K. M., et al. Membrane transporters in drug development. Nat. Rev. Drug Discov. 9, 215-236 (2010).
- Castell, O. K., Berridge, J., Wallace, M. I. Quantification of membrane protein inhibition by optical ion flux in a droplet interface bilayer array. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 3134-3138 (2012).
- Zollmann, T., et al. Single liposome analysis of peptide translocation by the ABC transporter TAPL. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112, 2046-2051 (2015).
- Tamm, L. K., McConnell, H. M. Supported phospholipid bilayers. Biophys. J. 47, 105-113 (1985).
- Sackmann, E. Supported membranes: scientific and practical applications. Science. 271, 43-48 (1996).
- Castellana, E. T., Cremer, P. S. Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design. Surf. Sci. Rep. 61, 429-444 (2006).
- Wagner, M. L., Tamm, L. K. Tethered polymer-supported planar lipid bilayers for reconstitution of integral membrane proteins: silane-polyethyleneglycol-lipid as a cushion and covalent linker. Biophys. J. 79, 1400-1414 (2000).
- Naumann, C. A., et al. The polymer-supported phospholipid bilayer: tethering as a new approach to substrate-membrane stabilization. Biomacromolecules. 3, 27-35 (2002).
- Weiskopf, D., Schmitt, E. K., Klühr, M. H., Dertinger, S. K., Steinem, C. Micro-BLMs on highly ordered porous silicon substrates: Rupture process and lateral mobility. Langmuir. 23, 9134-9139 (2007).
- Watanabe, R., et al. Arrayed lipid bilayer chambers allow single-molecule analysis of membrane transporter activity. Nat. Commun. 5, (2014).
- Stamou, D., Duschl, C., Delamarche, E., Vogel, H. Self-Assembled Microarrays of Attoliter Molecular Vessels. Angew. Chem. Int. Ed. 115, 5738-5741 (2003).
- Lohr, C., et al. Single Liposomes Used to Study the Activity of Individual Transporters. Biophysical Journal. 106, 229a (2014).
- Dunlop, J., Bowlby, M., Peri, R., Vasilyev, D., Arias, R. High-throughput electrophysiology: an emerging paradigm for ion-channel screening and physiology. Nat. Rev. Drug Discov. 7, 358-368 (2008).
- Milligan, C. J., et al. Robotic multiwell planar patch-clamp for native and primary mammalian cells. Nat. Protoc. 4, 244-255 (2009).
- Soga, N., Watanabe, R., Noji, H. Attolitre-sized lipid bilayer chamber array for rapid detection of single transporters. Sci. Rep. 5, (2015).
- Kleefen, A., et al. Multiplexed parallel single transport recordings on nanopore arrays. Nano Lett. 10, 5080-5087 (2010).
- Wei, R., Gatterdam, V., Wieneke, R., Tampé, R., Rant, U. Stochastic sensing of proteins with receptor-modified solid-state nanopores. Nat. Nanotechnol. 7, 257-263 (2012).
- Urban, M., et al. Highly parallel transport recordings on a membrane-on-nanopore chip at single molecule resolution. Nano Lett. 14, 1674-1680 (2014).
- Kusters, I., Van Oijen, A. M., Driessen, A. J. Membrane-on-a-Chip: Microstructured Silicon/Silicon-Dioxide Chips for High-Throughput Screening of Membrane Transport and Viral Membrane Fusion. ACS Nano. 8, 3380-3392 (2014).
- Hansen, J. S., Thompson, J. R., Hélix-Nielsen, C., Malmstadt, N. Lipid directed intrinsic membrane protein segregation. J. Am. Chem. Soc. 135, 17294-17297 (2013).
- Heinemann, F., Schwille, P. Preparation of Micrometer-Sized Free-Standing Membranes. ChemPhysChem. 12, 2568-2571 (2011).
- Lazzara, T. D., Carnarius, C., Kocun, M., Janshoff, A., Steinem, C. Separating attoliter-sized compartments using fluid pore-spanning lipid bilayers. ACS nano. 5, 6935-6944 (2011).
- Winterhalter, M. Black lipid membranes. Curr. Opin. Colloid Interface Sci. 5, 250-255 (2000).
- Koçer, A., Walko, M., Feringa, B. L. Synthesis and utilization of reversible and irreversible light-activated nanovalves derived from the channel protein MscL. Nat. Protoc. 2, 1426-1437 (2007).
