Abstract
Membrane transport des protéines au niveau de protéine unique échappe encore une analyse détaillée, si le substrat translocation est non-électrogénique. Des efforts considérables ont été faits dans ce domaine, mais les techniques permettant l'analyse automatisée de transport à haut débit en combinaison avec des techniques de bicouches lipidiques sans solvant requis pour l'analyse des transporteurs membranaires sont rares. Cette classe de transporteurs est toutefois crucial dans l'homéostasie cellulaire et donc une cible clé dans le développement de médicaments et de méthodologies pour acquérir de nouvelles connaissances désespérément besoin.
Le manuscrit présenté ici décrit la création et la manipulation d'un roman biopuce pour l'analyse des processus de transport de protéines membranaires médiation à la résolution du transporteur unique. La biopuce est composé de microcavités fermées par nanopores qui est hautement parallèle dans sa conception et peuvent être produits de qualité industrielle et de la quantité. liposomes Protein-hébergeant peuvent être directement appliquées àla surface de la puce formant des bicouches lipidiques pores transmembranaires auto-assemblées à l'aide de SSM-techniques (solide supporté membranes lipidiques). Pores transmembranaires parties de la membrane sont autonomes, fournissant l'interface substrat pour la translocation dans ou hors de l'espace de la cavité, qui peut être suivie par la lecture de fluorescence multispectral en temps réel. La mise en place de procédures normalisées d'exploitation (SOP) permet à la mise en place directe des bicouches lipidiques de protéines hébergeant sur la surface de la puce de pratiquement toutes les protéines de la membrane qui peut être reconstituée fonctionnellement. La seule condition préalable est la mise en place d'un système de lecture fluorescent pour les substrats de transport non électrogènes.
Les applications à haute teneur dépistage sont accomplishable par l'utilisation de microscopes automatisés fluorescents inversés d'enregistrement multiples puces en parallèle. Les grands ensembles de données peuvent être analysées en utilisant le logiciel d'analyse conçu sur mesure librement disponibles. Trois couleurs multiples spectrale fluorescentelecture permet en outre de discrimination de données impartiale dans différentes classes d'événements, ce qui élimine des résultats faussement positifs.
La technologie de la puce est actuellement basée sur SiO 2 surfaces, mais fonctionnalisation supplémentaire en utilisant des surfaces de puces revêtues d' or est également possible.
Introduction
L'analyse des protéines membranaires est devenue d'un intérêt croissant pour la recherche fondamentale et pharmaceutique au cours des 20 dernières années. Le développement de nouveaux médicaments dépend de l'identification et de la caractérisation détaillée des nouvelles cibles, étant actuellement l'un des facteurs limitants. Le fait que 60% de toutes les cibles médicamenteuses sont des protéines membranaires 1, rend le développement de techniques pour élucider leur fonction la plus importante.
Dans le passé, des techniques pour l'étude des canaux électrogènes et les transporteurs ont été développés dans la multitude 2-4. substrats non électrogènes en contraire présentent une tâche plus difficile. Ils sont cependant d' un intérêt particulier en tant que cibles de médicaments de choix, car ils contrôlent le flux de solutés et de nutriments à travers la membrane cellulaire et la fonction des récepteurs 5 clés en cascades de signalisation.
Des efforts considérables ont été mis dans le développement de techniques pour étudier la fonction des protéines de transport membranaire 6, 7. Les systèmes utilisant des membranes sur support solide ont émergé comme des outils les plus prometteurs dans ce domaine 8-10, y compris solides bicouches lipidiques supportées, bicouches captifs 11, 12, membranes microblack lipidiques 13, 14 et natifs tableaux vésiculaires 15, 16 pour ne citer que quelques - uns. Certains d'entre eux sont même disponibles en configurations commerciales 17, 18. Quelques exemples ont été publiés en combinant la capacité d'étudier les protéines membranaires simples d'une manière hautement parallèle 14, 19, une condition préalable pour les applications de dépistage. Cependant, ces méthodes combler rarement de la recherche fondamentale à l'environnement industriel. Les difficultés se situent souvent dans la capacité du système à être automatisable, la production coûteuse et / ou d'une préparation laborieuse. Une approche overcoming tous les obstacles mentionnés ci-dessus est le but final.
La technique présentée ici a été développé pour étudier les canaux de membrane et des transporteurs in vitro dans un environnement contrôlé , le niveau de protéine unique 20-22. Reconstitution des protéines membranaires purifiées en LUV est beaucoup plus établi que les approches comparables pour GUVs 23 - 26 ou lipides noir membranes 27. Ils peuvent être directement appliqués sur la surface de la puce, où la formation de deux couches se déroule par l'intermédiaire d'un processus d'auto-assemblage. La conception à fond de verre de la puce nanoporeux (Fig. 1) permet pour la microscopie de l' air, ce qui permet l'automatisation simple du système. En combinaison avec une platine motorisée plusieurs puces peuvent être mesurées en même temps, chaque champ de vision contenant des milliers de cavités scellées pour l'analyse.
La figure 1. Conception de biopuces nanopore multiplexés. A) de silicium sur isolant (SOI) wafer est structuré par gravure ionique réactive. Environ 1.150 puces individuelles sont fabriquées à partir de chaque plaquette avec des propriétés identiques et de qualité. B) Chaque puce comprend 250.000 microcavités individuels avec des ouvertures nano. Barre d' échelle:. 200 um C) Chaque cavité est adressable par fluorescence multi-spectrale lecture. Un opaques blocs supérieurs de la couche les signaux fluorescents provenant du réservoir tampon, ce qui rend la biopuce compatible avec inversées microscopes à fluorescence. D) microscopie à force atomique (AFM) imagerie révèle disposés de manière uniforme des ouvertures de pores et la rugosité de la surface de la couche de dioxyde de silicium de 3,6 nm (n = 40) optimale pour la fusion des vésicules. Barre d' échelle: 5 um E) micro électronique à balayage.roscopie d'image (SEM) montre une coupe transversale à travers le nanopore permettant l'accès aux cavités femtolitre à l'intérieur de la puce de silicium. Ce chiffre a été réutilisé avec l' autorisation de 21. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Toute analyse des données est effectuée en utilisant freeware pour garantir un accès sans restriction pour les utilisateurs finaux. Les séries temporelles sont analysées en utilisant un logiciel de traitement d'images gratuit et d'un traitement par lots logiciel d'analyse de la courbe de génération personnalisée permettant et la corrélation directe de grands ensembles de données avec de multiples canaux fluorescents et des milliers de courbes.
La protéine de modèle utilisé dans ce protocole est le canal mécanosensible de protéines grande conductance (MscL) de canal dérivé de E. coli. Il fonctionne comme une soupape pour libérer un choc osmotique dans la nature, mais a été modifiée d'une manière telle que conçue rationnellement syntfonctionnalités HETIC peuvent covalente être fixés sur le côté des canaux d'étranglement. Via charge la répulsion de l'activateur lié de façon covalente (MTSET) le canal est déclenché pour ouvrir, créer une nano-valve. Les petites molécules comme les ions, l'eau, de petites protéines, mais aussi les petites fluorophores peuvent passer à travers le canal. Ici, la protéine est utilisée comme modèle pour démontrer la capacité du système pour détecter la translocation de la protéine à médiation.
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Protocol
1. Préparation du Grand vésicules unilamellaires (LUV)
- Nettoyer un ballon à fond rond (10 ml de volume) avec de l'azote gazeux pour éliminer les particules de poussière. Rincer le ballon à fond rond avec de l'éthanol.
Remarque: L'éthanol résiduel peut être tolérée et ne perturbe pas les étapes ultérieures. - Laver un 1 ml 4x seringue en verre avec du chloroforme, pour éliminer toute contamination. Ajouter 4 ml SoyPC20 (25 mg / ml dans du chloroforme) dans le ballon à fond rond et à doper la solution de lipide DOPE avec une ATTO 390 supplémentaire à une concentration finale de 0,1% en moles.
Remarque: Au lieu de DOPE ATTO 390 Autres lipides marqué par un fluorophore ou des colorants lipophiles peuvent également être utilisés, en fonction de sources d'excitation disponibles. - Raccorder le ballon à fond rond dans un évaporateur rotatif. Sécher le film lipidique pendant 40 min à 300 mbar, 30 ° C Température du bain d'eau C et la vitesse de rotation maximale, pour former un film homogène de lipides sur la paroi en verre du flacon.
- Transfer le ballon à une pompe à vide poussé et sécher le film lipidique pendant encore 30 minutes à la température ambiante.
- Ajouter 5 ml de tampon (Tris 20 mM, NaCl 150 mM, pH 8,0; stérilisée par filtration) et 8 perles de verre (diamètre 2,7 mm, l'éthanol lavé et séché) dans le ballon. Raccorder le ballon à l'évaporateur rotatif et tourner sans vide à 50 ° C à la vitesse maximale.
Nota: Les perles de verre déplacer mécaniquement le film lipidique de la paroi de verre, ce qui conduit à (multilamellaire) la formation de vésicules. Après 45 min rotation la solution apparaît laiteux et aucun film lipidique résiduel devrait être visible au niveau des parois du ballon. Au lieu de perles de verre d'autres méthodes telles que la sonication le ballon dans un appareil à ultrasons à bain d'eau, tourbillonner le flacon ou le procédé de réhydratation légère sont également applicables. - Transférer le récipient sous gaz inerte (argon) dans un bain à ultrasons et de traitement par ultrasons pendant 4 min à température ambiante.
Remarque: Les ondes de choc ultrasonores perturbent les liposomes, ce qui les rend unilamellaire. - Diviser la solution de LUVdans 1 ml aliquotes.
- 5 effectuer des cycles de congélation / décongélation par congélation de la solution LUV dans de l'azote liquide, suivie d'une décongélation à 40 ° C dans un bain d'eau.
Remarque: Ceci conduit à la rupture et le réarrangement spontané de liposomes individuels les uns avec les autres, conduisant à une augmentation de la taille. - Lors de la dernière étape magasin de congélation tous les échantillons à -80 ° C.
Remarque: Les LUV seront stables pendant au moins 6 mois.
2. Protein Reconstitution
- Décongeler 1 ml LUV aliquote sur la glace. Juste avant la reconstitution, extruder les liposomes 17x à travers une membrane filtrante en polycarbonate de 400 nm en utilisant une mini-extrudeuse.
Note: les agrégats lipidiques seront supprimés et la distribution finale de taille homogène est atteint. - Déstabilisent LUV par addition de 4% de Triton X-100 (v / v) à une concentration finale de 0,25% (v / v) et on incube pendant 5 minutes à 50 ° C.
Remarque: La quantité de liposomes utilisée dans cette étape dépend de la masse du purifié MscL G <sup> 22 C utilisé (voir étape 2.3). Purifier MscL G 22 C (dérivé de E. coli) , comme décrit en détail dans le 28. - Mélanger purifié MscL G 22 C et les liposomes détergents saturante à 01:20 (p / p) Taux et laisser incuber pendant 30 minutes supplémentaires à 50 ° C.
- Pour l'élimination du détergent ajouter bio-billes dans du tampon Tris (Tris 20 mM, NaCl 150 mM, pH 8,0; stérilisée par filtration) à la solution de protéine / liposomes, avec 16 mg (poids humide) Bio-beads par ml de détergent utilisé pour déstabiliser les liposomes l'étape 2.2.
- Effectuer la dépose de détergent pendant une nuit (16 heures) à 4 ° C sur une plaque tournante.
Remarque: Le mélange constant de la solution assure l'élimination optimale de détergent. - Après élimination du détergent protéoliposomes magasin à 4 ° C et à utiliser pour des expériences sur le même jour.
3. Dosage de l'activité
- Pendant la protéine reconstitution prendre une aliquote de 100 pi de un détergentsolution de protéoliposome déstabilisé après l'étape 2.3 de finition.
- Ajouter 1 volume de calcéine (30 mM) à la solution de protéine-liposome et incuber pendant 5 min supplémentaires à 50 ° C.
- Retirer le détergent de la solution comme décrit à l'étape 02.04 à 02.06.
- Après élimination du détergent en équilibre une colonne d'exclusion de taille (20 ml de volume de lit ou plus) avec du tampon Tris (3 x le volume du lit).
Remarque: protéoliposome séparation peut être effectuée à la température ambiante, mais en gardant toujours l'échantillon à 4 ° C est conseillée pour assurer la meilleure activité de la protéine après fractionnement. - protéoliposomes séparés de la calcéine libre en appliquant la totalité aliquote (200 pi) dans la colonne d'exclusion de taille. Laisser le mélange à tremper dans la colonne, suivie d'une élution des protéoliposomes de la colonne via l'application de la mémoire tampon en continu sur le dessus à l'aide de l'écoulement par gravité. Observer la calcéine contenant protéoliposomes comme une bande orange discrète à l'avant d'élution. Collecter des fractions de 500 & #181; l respectivement.
Remarque: calcéine colorant gratuit sera éluer après la fraction de protéoliposomes avec séparation complète. - Pipette 80 ul de chaque fraction sur une plaque de micro-puits pour fluorescent de lecture et d'identifier la fraction contenant la plus grande quantité de calcéine contenant protéoliposomes par émission de fluorescence. Détecter la fluorescence à 520 nm avec une excitation à 490 nm. Utiliser la fraction de protéoliposome avec le signal le plus élevé pour le dosage de l'activité suivante.
- Mélanger 20 pi de la fraction contenant protéoliposome avec du tampon Tris-980 pi dans 1 ml de fluorescence cuvette.
- Mesurer l'émission de fluorescence à 520 nm (excitation 490 nm) en utilisant un spectrofluorimètre. Enregistrez pendant 1 min, puis ajouter 25 ul de MTSET ([2- (triméthylammonium) éthyl] méthanethiosulfonate) à partir d'une solution mère (160 mM) et bien mélanger. Continuez à l'enregistrement au cours du mélange. Toujours préparer la solution mère frais directement avant utilisation.
Remarque: Une fois résolu dans un tampon MTSET hydrolysers dans les 30 min et seront non réactif. MTSET peut être pesé et conservé aliquote de poudre sèche à -20 ° C jusqu'à utilisation.
Remarque: Une fois activé , le canal C MscL G 22 ouvre et libère la calcéine piégée, conduisant à une diminution de la concentration locale de la calcéine efflux lorsque les protéoliposomes et dequenching subséquente du colorant, ce qui entraîne une augmentation de l'émission de fluorescence. - Après l'émission de fluorescence a de nouveau atteint un plateau stable solubiliser les liposomes par addition de 50 ul de Triton X-100 (4% v / v).
Remarque: Idéalement aucune augmentation de fluorescence en outre peut être observée, ce qui implique la protéine active dans tous les liposomes.
4. Distribution de la taille Mesure de LUV utilisation du suivi des Nano-particules
- A noter que seuls les échantillons minimales du liposome ou protéoliposome solution sont nécessaires pour l'analyse de la distribution de taille en utilisant le système de suivi des nanoparticules. Diluer une solution de liposomes de 5 mg / ml Concentration des lipides 1: 5000 (v / v) dans un tampon (Tris 20 mM, NaCl 150 mM, pH 8,0; stérilisée par filtration) pour l'analyse à un volume final de 1 ml. Filtrez tous les tampons utilisés pour la dilution et la préparation de LUV avant et la reconstitution en utilisant une membrane de 0,2 um pour éliminer les particules en suspension, comme la poussière qui perturberait les mesures de distribution de la taille.
- Laver le débit-chambre avec de l'eau ultra-pure.
- Utiliser les marqueurs de surface pour focaliser le faisceau lumineux. Injecter environ 300 pi de l'échantillon de liposome dilué et fermer immédiatement la vanne de sortie pour arrêter l'écoulement à l'intérieur de la chambre d'écoulement, sans introduire de bulles d'air.
- Réglez les paramètres de mise au point et la caméra obturateur / gain pour assurer signal de diffusion adéquate de l'échantillon pour la détection.
Remarque: 20 - 80 signaux doivent être clairement visibles dans le champ de vision. Prévenir la surpopulation (> 80 signaux) que le logiciel ne sera pas en mesure de suivre les signaux individuels lorsque les chevauchements. - Allez à la "Capture" screen. Réglez le contrôle de la température à 25 ° C et la durée de capture à 90 secondes en utilisant les commandes du logiciel. Appuyez sur "Record" pour commencer l'enregistrement d'une série temporelle.
Remarque: À la fin de la série de temps une nouvelle fenêtre ouvre. - Enregistrer la série temporelle dans le format donné (* .avi). Pour des raisons pratiques lors de l'analyse des lots enregistrer tous les fichiers dans un seul dossier.
- Ouvrez la vanne de sortie et d'injecter encore 300 ul dans la chambre d'écoulement. Fermer le robinet et répétez les étapes de 4,3 à 4,6 fois.
- Après avoir terminé tous les essais sur les échantillons de lavage de la chambre d'écoulement avec 5 ml d'eau ultra-pure. Allez à l'écran "Pre-Process". Réglez la température des paramètres d'étalonnage = 25 ° C et la viscosité = 0,91 pour le tampon Tris utilisé dans ce protocole.
- Ouvrez la fenêtre de traitement par lots et de charger les séries chronologiques enregistrées (Advanced / Batch Process / File Set 1-3). Appuyez sur "GO" pour commencer l'analyse de la distribution de la taille.
Remarque: les automati logiciels d'analysetiquement suit les particules individuelles et calcule leur diamètre en fonction de leur comportement de déplacement en utilisant les paramètres définis à l'étape 4.8.
Remarque: L'analyse de la distribution de taille résultante enregistre automatiquement dans le même dossier que les fichiers de séries chronologiques. - En outre créer un fichier de rapport pour résumer les résultats (Export / Créer un rapport PDF).
5. Support Chip Préparation
- Peser 1,0 g de MDX4 qualité médicale base élastomère et 0,1 g agent de MDX4 de durcissement dans un tube de 50 ml de réaction. Mélanger les soigneusement avec une barre de verre.
- Mettre le tube dans un dessiccateur pendant 1 heure pour dégazer l'adhésif. utiliser ensuite dans un délai de 30 min pour la puce de collage, comme l'adhésif durcir et être trop difficile de travailler avec.
- Pendant élastomère dégazage (étape 5.1) nettoyer une lame de verre objectif à fond avec du chloroforme pour éliminer toute contamination avant le collage de la puce. Rincer la lame avec 5 ml de chloroforme en utilisant une seringue en verre. Recueillir lechloroforme dans un récipient en dessous positionné. Après le lavage laisser glisser sec.
Remarque: Effectuez cette étape sous une hotte. Alternative au chloroforme, d'autres solvants organiques tels que l'acétone peut également être utilisé. - Déposez une petite quantité de matériau de collage sur la vitre du couvercle à l'aide d'une pointe de pipette (pointes de cristal pour pipettes 10 pi). Rappelez-vous que les puces ont pour entrer dans le support de diapositives 8 chambre plus tard et doivent être placés sur la diapositive en conséquence.
- Retirez délicatement une puce à la fois de la carte de tranche en utilisant de fines pinces de pointe et de déposer la puce sur la goutte de colle sur le couvercle en verre. Assurez-vous que le côté revêtu de la puce orientée vers le haut.
- Poussez délicatement la puce sur le verre de couverture avec le dos d'un contondants pincettes PE. Pour veiller à ce que la colle est distribuée uniformément sous la puce, glisser délicatement la puce avant et en arrière. ÉTAPE CRITIQUE: Veiller à ce que les bulles d'air sont piégés sous la puce, comme il va perturber l'imagerie optiquedes cavités de puces plus tard. Assurez-vous également qu'aucun matériau adhésif contamine la surface de la puce.
- Dessécher le verre de couverture finie pendant 2 heures à 65 ° C dans un séchoir de l'armoire.
Nota: Les puces sont encore revêtus d'une couche protectrice provenant de leur fabrication qui doit être enlevé. - Pour retirer la couche de protection, effectuer une étape séquentielle de lavage au solvant. Lors de la cuisson des copeaux, préchauffer un bain d'eau à 54 ° C.
- Placez 3 béchers en verre dans le bain d'eau, deux d'entre eux remplis avec de l'isopropanol et un rempli avec de l'acétone.
- Insérez le couvercle en verre de la puce dans un porte-lame et le plonger dans le premier isopropanol plat rempli pendant 10 min. Ensuite les transférer à la boîte remplie d'acétone, incuber à nouveau pendant 10 minutes avant de le transférer à l'étape de lavage final au deuxième plat de l'isopropanol et on incube encore 10 min.
- Retirez le support de diapositives de la vaisselle et laver soigneusement abondamment avec Ultrapure l'eau, suivie d'un séchage des copeaux avec un léger courant d'azote gazeux.
- Décollage la feuille de stratification du collant-slide 8 puits et mettez-le en arrière sur le banc. Prenez soigneusement la lamelle et appuyez doucement sur le collant-slide avec les puces face aux puits. Laissez le fini support de puce reste pendant quelques minutes avant de l'utiliser.
6. Assay Préparation
Remarque: les puces Nanopore collés à un verre de couverture et séparés par un collant-slide 8 puits possèdent l'avantage, que plusieurs puces peuvent être traitées dans un seul essai expérimental, avec des puces étant complètement séparés les uns des autres.
- Après la préparation du support de puce, rincer chaque puce avec de l'éthanol pur et sécher avec de l'azote gazeux, pour éliminer toutes les impuretés comme la poussière.
- Nettoyer la surface de la puce avec de l'air, l'oxygène ou le plasma d'azote. En fonction du type de nettoyage plasma périodes de temps varient: effectuer un traitement par plasma d'oxygène pendant 1 min, l'air et nitrogen plasma pendant 5 min à 0,3 mbar à réglage de puissance de 80% (milieu de puissance RF ou élevé).
- Après le nettoyage de plasma incuber les puces dans l'éthanol pur pendant 10-15 min pour assurer la cavité de mouillage.
- éthanol d'échange par étapes pour le tampon par addition de 400 ul de tampon Tris (Tris 20 mM, NaCl 150 mM, pH 8,0; stérilisée par filtration), suivie par le mélange de la solution sans introduire de bulles d'air et l'élimination ultérieure de 400 pi. Répéter cette procédure 12 fois, pour assurer l'élimination de l'éthanol.
Remarque: L'éthanol serait nocif pour les liposomes et les bicouches lipidiques en suspension. - Tampon Tris dopant (Tris 20 mM, NaCl 150 mM, pH 8,0; stérilisée par filtration) avec 5 mM de CaCl2 et 1 uM Oy647 colorant. Retirez complètement le tampon de lavage de la puce et ajouter immédiatement le tampon dopé à la puce. Note: Chips seront recouverts d'une couche tampon mince après le retrait du tampon de lavage, de sorte que la puce ne sont pas en contact direct avec l'air, assurant un mouillage constant des cavités et la surface de la puce.
- Ajouter 1 mg / ml ou LUV PROTEO-LUV dans du tampon Tris (Tris 20 mM, NaCl 150 mM, pH 8,0; stérilisée par filtration) à chaque puits.
Remarque: Le volume final dans chaque puits est de 300 ul. Examiner les additions ultérieures du colorant de commande et le modificateur MTSET chimique lors de l'addition de tampon Tris dopé. - Pour lipides formation bicouche des pores transmembranaires sur la surface de la puce incuber la puce pendant 1 heure à température ambiante avec la solution de liposome. Ensuite , lavez chaque puce avec 4x 400 pi de tampon Tris Ca 2 + -free.
- Ajouter le colorant témoin à chaque puits, à une concentration finale de 5 uM. Les puces sont maintenant prêts pour le dosage de la translocation.
7. Essai de configuration
- Monter le support de puce au microscope à épifluorescence (objectif de l'air 20X, longue distance de travail). Focus sur le rebord de la puce nanopore pour trouver plus facilement le plan focal des micro-cavités. Une fois que les cavités sont en discussion scanner le réseau de nanopores pour une région eau affiche ratio le plus élevé d'étanchéité.
Note: Chaque microscope à épifluorescence inversé peut être utilisé pour effectuer des dosages de la puce. Selon le grossissement de l'objectif (20X - 60X de) le nombre de cavités dosées variera, avec jusqu'à 9.000 cavités dans un seul champ de vision avec un grossissement de 20x. objectifs d'air avec une longue distance de travail sont préférables. L'utilisation de inversées confocale microscopes à balayage laser (CLSM) est également possible, mais l'acquisition de l'image peut être le facteur limitant en raison de la faible profondeur de mise au point. - Optimiser l'éclairage de la puce.
Remarque: Veiller à ce que les deux canaux de colorant ne dépassent pas la valeur maximale de l'échelle de gris, que les changements ne peuvent pas être respectées. Pour les expériences d'exportation ajuster l'illumination du colorant transloqué à 90% de la capacité maximale du signal. Réglez le colorant de contrôle dans des cavités ouvertes à 80-90% de la capacité maximale du signal pour détecter clairement toute étanchéité de la membrane qui fuit. - Une fois que tous les canaux sont ajustés commencer la série chronologique. Prenez des images toutes les 10-20 seC pendant 90 min.
Note: Ceci est suffisant pour suivre également des événements spécifiques et non spécifiques efflux. - Initialize efflux du substrat fluorescent par l'addition de cysteine spécifique, le composé chargé positivement MTSET à une concentration finale de 3 mM. Prévoyez au moins 5 min de l'expérience de l'exécution avant l'addition MTSET pour pouvoir plus tard établir un signal fluorescent stable de base avant de canaliser l'ouverture. Toujours préparer une solution MTSET frais directement avant l'utilisation.
Analyse 8. Données
- Ouvrez le temps l'image de la série pile avec une version standard de ImageJ (Fichier / Importer / séquence d'images).
- Si les canaux fluorescents sont empilés, diviser les canaux en piles individuelles pour chaque canal (image / Piles / Stack Images).
- Dupliquer la première image du canal de substrat de translocation pour le retour sur investissement (régions d'intérêt) identification (image / Dupliquer).
- Convertir l'image en une image binaire (image / Ajuster / Seuil). Assurerque l'algorithme utilisé représente des signaux pour toutes les cavités scellées sans chevauchement pixilation.
- définir automatiquement des régions d'intérêt avec l'outil d'analyse de particules (Analyse / Analyse des particules). Définir une taille de particule minimale définie, pour éviter le bruit des particules. Cochez les options «exclure sur les bords" et "inclure des trous". Assurez-vous que ROIs résultant reflètent le modèle de réseau de microcavité. ROIs intercalée sont des artefacts, donc les supprimer. Enregistrer la liste de retour sur investissement.
Remarque: le paramètre de mesure doit être réglé sur "zone" avant l'analyse des particules (Analyse / Set Mesures / Zone) - Ouvrez le plug-in Series Analyzer Time (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/time-series.html), qui redimensionne automatiquement toutes les ROIs à la même taille. Re-taille tout de ROIs existant à une largeur / hauteur de pixels 6x6 et forme ovale (série analyseur Minuteur / AutoROIProperties). Cochez l'option «Redimensionner ROIS existante". Enregistrer la liste de ROI redimensionnée résultant.
- Ouvrez le gestionnaire de ROI(Analyse / Outils / Gestionnaire de ROI) et charger la liste de ROI redimensionnée pour chaque canal de la série chronologique (ROI Manger / Plus / Open). ROI sera superposée. Pour analyser le changement de signal pour chaque ROI démarrer l'outil de mesure multi (gestionnaire de ROI / Plus / Multi Measure), sélectionnez "Mesurer toutes les tranches" et "Une ligne par tranche" et commencer la mesure à plusieurs.
Remarque: le paramètre de mesure doit être réglé sur "valeur moyenne grise» pour cette étape (Analyse / Mesures Set / Valeur moyenne gris) - Enregistrez la table résultant, ce qui donne la valeur de gris moyenne pour chaque ROI * .txt ou * .xls.
- Importez l'analyse de retour sur investissement de chaque canal d'imagerie en NanoCalcFX via l'option "Importer un fichier". Set "Utiliser la première ligne pour nommer série". Définissez la taille de l'étape entre les images en fonction des périodes d'acquisition d'images de séries temporelles et choisissez la colonne correspondante et séparateur décimal.
- Utilisez l'option "feuille multiple" pour corréler automatiquement les graphiques de la personne fluocanaux rescentes.
Remarque: Les événements peuvent maintenant être analysées et classées en utilisant les informations fournies par l'information spectrale 3 couleurs. - Adapter les courbes sélectionnées en utilisant l'en construction fonction d'ajustement (en option) en forme.
Remarque: L'efflux et l'afflux équation mise en œuvre est adaptée pour tous les événements de diffusion axée monoexponentielles et les limites d'ajustement peuvent être réglés. Les constantes de vitesse obtenus peuvent être tracés à l'aide de l'outil d'histogramme ou exportés pour affiner davantage de données.
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Representative Results
Les membranes de pores transmembranaires peuvent être facilement créées sur la surface de la puce de nanostructures d'une manière auto-assemblée. Toutefois, le processus sous-jacent est toujours délicate et influencée par de nombreux paramètres tels que la taille des liposomes, monodispersité de la population de liposomes, lamellarité, lipides et sel concentration et de surface chimique propriétés. La plupart de ces paramètres ont été soigneusement caractérisés et normalisés dans le protocole ci-dessus. D'autres paramètres ne devrait cependant être vérifiés lors de chaque nouvelle préparation, afin d'assurer une expérience réussie. Ceux - ci sont la distribution de la taille des liposomes et de la population dispersité (fig. 2 A). Pour optimiser la formation d'une membrane poreuse transmembranaire et afin d'éviter l'intrusion de liposomes dans les tailles de liposomes cavité espace bien au-dessus du diamètre de pores sont une nécessité. En outre, les préparations de liposomes ont été montrés monodispersées pour donner des résultats optimaux dans la membrane d'étalement et fusisur. Une autre étape cruciale qui doit être vérifié pour chaque préparation est l'activité des protéines après reconstitution. En utilisant un dosage par fluorescence dequenching pour les liposomes reconstitués avec MscL G 22 C, l' ouverture du canal peut être surveillée par spectroscopie de fluorescence, ce qui donne un rapport des liposomes portant des actifs MscL G 22 protéine C (fig. 2 B).
Une fois que se propager à la surface de la puce, soluté translocation d'une cible fluorescente par MscL G 22 C lors de l' activation du ligand peut être suivie (fig. 3 B). MscL G 22 canaux d' ingénierie C sont fermés dans leur état par défaut, piégeant petites molécules fluorescentes à l' intérieur de l'espace de la cavité. Par addition du modulateur MTSET chimique des charges positives sont introduits dans la région de rétrécissement del'MscL G 22 C pore, poussant ouverte par répulsion électrostatique. Le fluorophore piégé avant soustrait l'espace de la cavité pour atteindre la diffusion équilibre. La diminution subséquente de la fluorescence à l'intérieur de l'espace de cavité peut être surveillée. Ce procédé est très reproductible, ce qui entraîne une population homogène d'événements d'efflux (fig. 3 C). Les courbes d'efflux résultantes se regroupent en deux populations distinctes, ce qui démontre la capacité du test à discriminer entre les événements de translocation mono et multicanaux (Fig. 3 D). En outre, le système est capable de suivre jusqu'à trois colorants spectralement bien séparés en parallèle et en temps réel, ce qui permet d'enregistrer des projections de haute teneur et de discrimination précise et objective entre les résultats positifs et négatifs positifs, faux. Dans cette étude, 9.046 cavités scellées ont été analysés, dont 8% affiché efflcomportement ux. Déploiement des fluorescents différents canaux de lecture, les événements peuvent être discriminés en événements monoexponentielles efflux, cinétique complexe, les intrusions lipidiques et les ruptures de la membrane (Fig. 3 E). Seuls les événements qui affichent des signaux stables pour le soluté de contrôle et le colorant de membrane sont considérées pour l'analyse finale. cinétique complexe représentent des événements efflux avec des signaux de commande instables et sont par conséquent omis. intrusions lipidiques et les ruptures de la membrane sont des événements qui se produisent intrinsèquement artefacts en utilisant des systèmes bicouches lipidiques pores transmembranaires. Ils peuvent être mis au rebut en utilisant les signaux de commande de colorant tel que mentionné ci - dessus (fig. 4).
Figure 2. Répartition des tailles de protéoliposomes et la fonction MscL. A) Vésicules étaient analyz ed par analyse de suivi nano-particules. Des échantillons de LUV ont été examinés avant (trace noire) et après reconstitution du MscL G 22 C (trace rouge). Après la préparation LUV, une taille moyenne de 214 ± 70 nm soit obtenue. La taille est réduite lors de la reconstitution, ce qui entraîne des protéoliposomes de 158 ± 60 nm dans l' activité de taille. B) MscL a été validée après reconstitution par un essai d'efflux. 28 auto-trempé calcéine est libérée de protéoliposomes par l' ouverture MTSET à médiation par le canal MscL, conduisant à dequenching du fluorophore (rouge) et une augmentation rapide de l'intensité de fluorescence. Liposomes sans protéines ne présentent pas de tels efflux, plus de MTSET même après plusieurs (noir). Solubilisation subséquente de détergent introduite (TX-100), des liposomes libère tous encapsulé précédemment colorant. Ce chiffre a été réutilisé avec l' autorisation de 21.et = "_ blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
La figure 3. Ligand-dépendants soluté translocation par MscL au niveau d'une seule molécule. A) Engineered MscL G 22 C canaux sont fermés dans leur état par défaut. Petits solutés tels qu'un fluorophore ne parviennent pas à passer ni à travers le canal, ni la double couche lipidique. Après addition de MTSET, une cysteine unique conçue de chacun MscL G 22 C protomère se modifie, en introduisant de multiples charges positives dans la partie de rétrécissement du canal du complexe pentamère. Le 22 C canal MscL G est poussé ouverte par répulsion de charge et le colorant piégé peut diffuser hors de la cavité, ce qui conduit à une diminution de l'intensité de fluorescence. B) Timoi des traces de MscL G 22 C ouverture lors de l' addition de MTSET. Protéoliposomes contenant fonctionnellement reconstitué MscL G 22 C ont été répartis sur la surface de la puce. Oy647 (rouge) a été piégé à l'intérieur des cavités comme substrat de translocation. OregonGreen Dextran (70 kDa, vert) a été ajouté en tant que substrat imperméable canal de commande pour contrôler la spécificité de substrat de l'événement de transport ainsi que l'intégrité de la membrane au cours de l'expérience. LUV ont été complétées par DOPE ATTO 390 (% 0,1 mol; violet) pour vérifier la contamination des lipides à l' intérieur des cavités. Ajout de MTSET (3 mM final) à t = 0 sec ouvre le canal, conduisant à Oy647 efflux des cavités, enregistrées via la fluorescence de lecture. C) Aléatoirement ramassé MscL G 22 courbes C efflux démontrent les événements efflux typiques. D) Taux constantes pour les événements de translocation (n = 242) en deux clusters population gaussiennes, ce qui démontre que les événements de transport mono et multi-canaux peuvent être discriminées. E) criblage à haut contenu et l' analyse statistique des 9,046 cavités à puce scellés par triple-couleur en temps réel de lecture. 8% de toutes les cavités de puces analysées montrent des événements efflux exponentielles. En raison de décodage spectrale (rouge: translocation soluté; vert: le contrôle soluté; violette: lipides), les événements efflux, cinétique complexe, les intrusions de lipides, et les ruptures de la membrane pourrait être discriminé, éliminant ainsi les faux positifs. Ce chiffre a été réutilisé avec l' autorisation de 21. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
La figure 4. Classes d'événements distingués par la détection de trois couleurs. soluté Translocated (rouge), control soluté (vert) et un colorant lipidique (violet) peuvent être spectralement discriminées permettant la sélection de données non biaisée. A) cavités scellées hébergeant aucune protéine de membrane montrent pas d' événements de flux dans les conditions expérimentales décrites pour le canal MscL enregistrement (voir Fig. 3A) . L'affichage fluorescent est stable pour tous les canaux. B) Ill définies bicouches lipidiques en suspension sont capables d'ingérer les résultats cavité. C) Membrane de rupture en discontinu bicouche lipidique couvrant les fissures nanopore. De ce fait, l'espace de la cavité est plus séparé du compartiment tampon. des colorants piégées (rouge) échappent à la cavité sur le gradient de concentration. Le soluté de contrôle (vert), auparavant incapables de passer à travers la membrane, pénètre dans la cavité. D) Exemple pour un événement lipidique d'intrusion. Tandis que le signal fluorescent du colorant des lipides (violet) augmente en raison de la membrane d'envahir l'espace de la cavité, le soluté de translocation est pushed hors de la cavité (rouge), conduisant à une diminution du signal fluorescent. Le nanopore est bloqué par la double couche lipidique, ce qui empêche le passage du substrat de commande (vert). E) pendant la rupture de la membrane, le soluté de transport fermée échappe rapidement à partir de la cavité (rouge), tandis que les solutés de contrôle diffuse dans (vert). Ce chiffre a été réutilisé avec l' autorisation de 21. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
La technique présentée ici permet une analyse très parallèle de transport des protéines de la membrane. des systèmes protéiques de la membrane reconstituée peuvent être directement appliquées sur la biopuce, ce qui rend l'adaptation de la théorie, chaque transporteur membranaire ou canaux possibles. l'analyse de transport est seulement limité par la mise en place d'un système de lecture fluorescente, soit par changement direct de fluorescence (translocation des fluorophores ou des substrats marqués par fluorescence) ou le changement indirect de fluorescence (des colorants sensibles au pH, les réactions enzymatiques secondaires). Ce dernier, cependant doivent encore être mis en place.
Caractérisation fonctionnelle des canaux membranaires ou transporteurs sur le niveau de protéine unique est l'objectif principal de cette technique. En combinaison avec un microscope automatisé, la mise en place des applications de criblage pour des effecteurs de protéine est également possible. L'installation d'essai permet l'enregistrement en parallèle jusqu'à 8 puces, avec plusieurs points d'analyse sur chaque puce. En raison de la séparation complète des puces, il est vraiment parallèle, permettant de multiples répétitions expérimentales y compris les contrôles en un seul essai expérimental, une fois que les conditions ont été établies.
Les étapes critiques au cours de la mise en place d'une expérience sont la préparation de vésicules réellement unilamellaires, la reconstitution active de la protéine de choix, d'étalement efficacité des protéoliposomes sur la surface de la puce et la capacité de rétention de la double couche lipidique en suspension vers les substrats utilisés dans le dosage.
Tandis que la préparation de vésicules unilamellaires est d'une importance fondamentale pour cette analyse afin d'éviter la mise en place de feuilles de membrane multilamellaires sur la surface de la puce pendant suspension formation de bicouches lipidiques, il est assez facile d'assurer unilamellarity des vésicules par traitement aux ultrasons les liposomes pendant la préparation.
L'application directe de protéoliposomes est la grande avancée de la méthode presenteré. Contrairement aux approches précédentes protéines plus complexes et médicalement pertinents peuvent maintenant être ciblés, ce qui nécessite bien sûr la mise en place préalable d'un protocole de reconstitution produisant une protéine fonctionnelle de choix dans LUV. En outre, les protéines membranaires possédant de grands domaines extra-membranaires diminuent la formation de SSM appropriées. Ceci doit être optimisé pour chaque nouvelle protéine, par exemple en faisant varier la concentration de CaCl 2.
Le ratio de la reconstitution de la protéine d'intérêt doit être choisi avec soin. L'analyse des événements de protéines est désirée et réalisable en utilisant la technique présenté ici. La quantité de protéine reconstitué ne doit donc pas dépasser 1-2 unités protéiques fonctionnels par des pores transmembranaires pièce de membrane en supposant une reconstitution idéale et que la protéine membranaire est stochastiquement réparti entre les deux couches. En outre, la directivité de la protéine après reconstitution doit également être gardé à l'esprit, comme il l'a not soit égale entre les deux directivités.
Enfin, une fois toutes ces questions sont soigneusement contrôlés et optimisés, aucun des substrats utilisés peut afficher toute perméabilité de la membrane non spécifique de la membrane des pores transmembranaires. fluorophores chargés positivement, comme la plupart des colorants à base de rhodamine dans le régime spectral rouge ont tendance à surmonter rapidement la barrière de la membrane. interactions hydrophobes fortes peuvent également conduire à un attachement non spécifique à la bicouche lipidique. Les deux propriétés ne sont pas souhaitées.
L'étude des canaux ioniques de manière qualitative est également imaginable. Dépistage des effecteurs de canaux en utilisant un binaire Oui / Non lecture pourrait être considérée en utilisant des colorants sensibles aux ions. Le plus grand obstacle ici serait la mise en place d'une bicouche lipidique au moins partiellement ionique retenue. Cela pourrait être réalisable uniquement par l'intermédiaire d'une modification de surface de la puce nanopore.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| [2-(Trimethylammonium)ethyl] methanethiosulfonate |
Toronto Research Chemicals Inc. | T792900 | MTSET; hydrolized by water. Keep as dry pouder aliquot at -80 °C. Use immediately (30 minutes) after solubilization in buffer. |
| 1 ml gas-tight syringe | Hamilton | #1001 | |
| 10 ml round flask | Schott Duran | ||
| 2.7 mm glas beads | Roth | N032.1 | |
| 2-Propanole | Roth | 9866.5 | |
| 30 cm Luer-Lock Extension Tube | Sarstedt | 744304 | |
| Acetone | Roth | 5025.5 | |
| Bio-Beads SM-2 Adsorbent | Bio-Rad | 152-3920 | need to be activated before first use |
| CaCl2 Dihydrat | Roth | HN04.3 | |
| Calcein | Sigma | C0875 | store dark at -20 °C |
| Chloroform reagent grade | VWR Chemicals | 22711324 | |
| DOPEATTO390 | ATTO-TEC | AD 390-165 | store dark at -20 °C |
| Ethanol absolute | Sigma-Aldrich | 32205 | |
| Injekt Single-use syringe | Braun | 460 60 51V | |
| Injekt-F single-use syringe | Braun | 91 66 017V | |
| Keck clips | Schott | KC29 | |
| L-α-Phosphatidylcholine, 20% (Soy) | Avanti Polar Lipids | 5416016 | store under inert gas at -20 °C |
| NaCl 99.5% p.a. | Roth | 3957.2 | |
| Nanopore E100 wafer/chips | Micromotive (Mainz/Germany) | available on request | |
| Nucleopore Track-Etch Membrane 0.4 µm | Whatman | 800282 | |
| Oregon Green Dextran 488 (70 kDa) | life Technologies | D-7173 | store dark at -20 °C |
| Oy647 | Luminartis (Münster/Germany) | OY-647-T-1mg | store dark at -20 °C |
| Rotilabo-syringe filtration, unsterile, pore-size 0.22 µm | Roth | P 818.1 | |
| Sephadex G-50 | Sigma-Aldrich | G5080 | column material for size exclusion chromatography |
| Silastic MDX4-4210 | Dow Corning | curing agent for chip fixation onto cover glass support | |
| sticky-Slide 8-well | ibidi | 80828 | multi-well chamber for the mounting onto glass slides (chip holder) |
| Three-way stopcock blue | Sarstedt | 744410001 | |
| Tris Pufferan 99.9% Ultra Quality | Roth | 5429.2 | |
| Triton-X 100 | Roth | 6683.1 | |
| Whatman 0.2 µm cellulose nitrate membrane filter | Roth | NH69.1 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Büchi 461 water bath | Büchi | ||
| Büchi Rotavapor RE 111 | Büchi | ||
| Cary Eclipse Fluorescence Spectrophtometer | Varian | ||
| LiposoFast Mini Extruder | Avestin | ||
| Membrane pump | Vaccubrand | 15430 | |
| Nanosight Nanoparticle Tracking Microscope | Malvern / Nanosight | LM 14C | |
| NyONE microscope | Synentec | available on request | |
| Pump control | Vaccubrand | CVC 2II | |
| Sonicator bath Sonorex RK100H | Brandelin electronic | 31200001107477 | |
| Vaccum pump RC5 | Vaccubrand | 1805400204 | |
| Water bath W13 | Haake | 002-9910 | |
| Plasma Cleaner PDC-37G | Harrick Plasma | PDC-37G | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| ImageJ | Open Source | http://imagej.nih.gov/ij/ | scientific image processing software |
| NanoCalcFX | Freeware | http://sourceforge.net/projects/nanocalc/ | data analysis/evaluation software for massive transport kinetic datasets |
| NTA 2.3 Analytical Software | Nanosight | data acquisition and analysis software for nanoparticle tracking microscope | |
| NTA 2.3 Temperature Comms | Nanosight | temperature controle software for nanoparticle tracking microscope |
References
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