Protocol
Protokol, insan hasta malzemeden lenfoid hücrelerin izolasyonu açıklar ve bu nedenle etik onayı gerekiyor. Bu çalışmada yapılan çalışmalar Uppsala Etik Değerlendirme Kurulu (DNR. 2013/387) tarafından verildi.
İnsan Palatine Bademcikler dan Mononükleer Hücreleri (ÇUŞ) 1. İzolasyonu
UYARI: kan, doku veya vücut sıvıları gibi insan kaynaklı tüm elenmemiş malzeme potansiyel enfekte materyal olarak kabul edilmelidir. Bu nedenle, insan dokuları işlemek için önerilen biyogüvenlik uygulamaları takip edilmelidir.
Not: kontaminasyonunu önlemek için, her çözeltiler ve hücre kültürü ekipmanları steril olması gerekmektedir. Tüm tamponlar ve solüsyonlar önceden soğutulmuş ve buz üzerinde tutulmalıdır. Tonsil dokular ve izole hücreler tutulur ve buz üzerinde tutulmalıdır.
- Tonsillektomi veya tonsillotomy (Şekil 2) uygulanan hastalarda taze bademcikler edinin. Doku clum Plunge% 5 fetal sığır serumu (FBS), 10 mM Glutamin, 0,05 mg / gentamisin ve% 1 antibiyotik antimikotik karışımı ml (penisilin buz soğukluğunda steril Hanks ile dengelenmiş tuz çözeltisi (HBSS) ile dolu bir 50 ml'lik santrifüj tüpüne ps Streptomisin ve Amfoterisin B).
- Buz üzerinde her zaman batık bademcik dokusu örnekleri ile tüpleri tutun. En kısa sürede bademcik işlemek için çalışın, ve en geç cerrahi müdahaleden sonra 3 saat daha.
- Buz üzerinde 60 mm plastik hücre kültür plaka üzerinde bademcik yerleştirin ve HBSS ile nemlendirilmiş doku tutun. Bademcik yüzeyinden temiz bir forseps ile görünür kan pıhtılarını, yağlı ve bağ dokuları çıkarın.
- 5 ml HBSS içeren yeni 60 mm hücre kültürü plakası kullanın. Makas ve / veya bir neşter steril bir çifti kullanılarak 3-10 mm parçalara bademcik dokusu yığın kesin.
- HBSS 10 ml içeren yeni 60 mm hücre kültürü tabak hazırlayın ve HBSS çözeltisi içinde 100 mikron plastik hücre süzgeç yerleştirin.
- Diss aktarınSteril forseps ile hücre süzgecinden içine yansıtılmaktadır bademcik fragmanları. Plastik şırınga pistonu ucunu kullanarak, sorunsuz hücre süzgecinden doku parçaları sıkın. Bademcik fragmanları tamamen HBSS dalmış emin olun.
- Doku kalıntıları hücre süzgecinden atın ve bir 50 ml plastik bir santrifüj tüpüne 60 mm hücre kültür plakasından elde edilen hücre süspansiyonu aktarın. Adımlar 1.8 ve 1.9 ile devam ederken buz üzerinde tüp bırakın.
- Büyük bademcikler durumunda, boyutu 2 cm'den büyük (Şekil 2), süzgeç örgü tıkanmasını önlemek için iki hücre süzgeçler de bademcik parçaları sıkın.
- Hücre süspansiyonu 35 ml'lik nihai hacim elde edilir.
Not: Bu aşamada, dondurarak saklama (bakınız bölüm 2) hücre süspansiyonu hazırlamak mümkündür. - Yeni bir 50 ml santrifüj tüpüne Ficoll gibi yoğunluk gradyan çözeltisi 10 ml ekleyin. Yavaşça hücre Suspens bindirmeİyon yoğunluk gradyan çözeltisi üzerine (aşama 1,9). Hücre süspansiyonu ve yoğunluk dereceli çözeltisinin karıştırılması kaçının.
Not: yoğunluk gradyan çözeltisi, oda sıcaklığına kadar ılıtıldı gerekir. - Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 700 xg'de bir salıncak-out rotor hücre süspansiyonu santrifüjleyin. Degrade bozabilir hızlı frenleme olarak santrifüj fren işlevini etkinleştirmek etmeyin. Ayrıca, santrifüj mevcut olan en düşük ivme işlevini kullanın.
Not: Bu santrifüj aşamasından sonra, tüpün alt kısmında tortu bir ara yüzeyde kabarık beyaz tabaka ve kırmızı kan hücrelerinin (RBC), fibroblastlar ve hücre kalıntıları olarak ÇUŞ'larına dikkate alınmalıdır. - Dikkatlice 10 ml pipet kullanarak ÇUŞ'ları katmanı toplamak. Yeni bir 50 ml santrifüj tüpüne hücre süspansiyonu yerleştirin.
- Hücre süspansiyonuna buz soğukluğunda PBS 25 ml ilave edilir ve 4 ° C 'de dışarı salınan bir rotor 5 dakika boyunca 300 x g'de tüp spin.
- 25 ml'lik bir pipet kullanarak süpernatantıve hücre pelet yıkama adımı iki kez daha tekrarlayın. Son olarak, PBS, 15 ml hücre pelletini.
Not: Son yıkama aşamasından sonra, hücre süspansiyonu (bakınız bölüm 2) cryopreserve mümkündür. - Hemositometre hücre sayım bölmesi içinde hücre süspansiyonu 10 ul uygulayın ve bir mikroskop altında hücre sayısını. Hücreler uygun miktarda dağıtın (örneğin, 2-3 x 10 7) takip eden manyetik boncuk ayrılması için bir 15 ml'lik santrifüj tüpüne. Adım 3.2 kadar buz üzerinde bu kısım tutun.
Tonsil Hücre 2. Kryoprezervasyon
- Donma orta (% 90 FBS ve% 10 DMSO) hazırlayın ve buz üzerinde tutmak. Uzun süreli depolama için -20 ° C'de donma medyayı tutmak.
- Bir hemositometre hücre sayım odasını (adım 1.15) ile hücrelerin toplam sayısını belirler. İstenen donmuş hücre yoğunluğuna göre dondurma orta gerekli miktarını hesaplayın (örneğin, 10 7 hücres dondurma ortamı / ml).
- 5 dakika boyunca 300 x g'de hücre süspansiyonu santrifüjleyin. Hücre topaklarını bozmadan süpernatantı boşaltacaktır ve (aşama 2.1) buz gibi soğuk dondurma ortamı içinde hücre pelletini.
- Sıvı nitrojen içinde uzun süreli depolama için tasarlanmış steril şişelere hücre süspansiyonu 1 ml'lik numuneler koyun. Bir izopropanol odasında şişeleri dondurun ve -80 ° CO / N saklayın. Uzun süreli korunması için depolama tankı veya -140 ° C hücre dondurucu içeren bir sıvı azot içine şişeleri aktarın.
- Dondurulmuş hücreler şişeleri çözülme için, 37 ° C su banyosu içinde hızla onları sıcak. Çözülmüş hemen zaman (takviyeleri ile 1.1 adım a) önceden ısıtılmış HBSS 10 ml hücre süspansiyonu dispers 15 ml santrifüj tüpüne. (1.1 adım takviyeleri ile), 5 dakika boyunca 300 x g'de tüp Spin HBSS çıkarın ve HBSS, istenen hücre yoğunluğuna hücre pelletini.
Not: ÇUŞ af canlılığınıter çözme Ölü hücrelerin varlığı saflaştınldı B ve T lenfositleri nihai verim düşecektir, önem taşımaktadır.
Not: hücre izolasyon verimi azaltacaktır hücre canlılığı az% 80 daha sonra bizim deneyim göre.
Tonsil ÇUŞ'larının T Lenfosit Nüfus 3. Pozitif Seçimi
Not 1: Bu protokol, CD3 antikoru bağlanmış manyetik boncuklar kullanılarak Tonsiller çok uluslu insan CD3 + T lenfositlerinin pozitif seçimi dayanmaktadır. Taze (Bölüm 1) veya dondurulmuş (Bölüm 2) çok uluslu şirketler bu bölümü başlatmak mümkündür.
Not 2: 3 x 10 7 uluslu şirketler ile başlayın. Ayırma sütunları tıkayabilir ve bu izolasyon verimi azaltacaktır çünkü, bu hücre sayısı aşmayın. Daha fazla hücre ele alınacak olursa büyük sütunları kullanın. Bu protokolde kullanılan hacimleri deneysel hücrelerin bize sayısı için optimize edilmiştirBizim deneysel kurulum ed.
- Ayırma tamponu [PBS (pH 7.2),% 0.5 sığır serum albümini (BSA) ve 2 mM EDTA] hazırlayın. 4 ° C'da bir 0.45 um filtre ve mağaza boyunca ayırma tamponu filtre.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de ÇUŞ'ları süspansiyonu (basamak 1,14) dönerler. Buz soğukluğunda ayırma tamponu 240 ul ile sonuçlanan hücre pelletini (10 7 hücre başına 80 ul) yeniden süspanse edin. Steril 2 ml'lik bir tüp içine hücre süspansiyonu aktarın.
- Hücre çözeltisine, CD3 manyetik antikorun 20 ul ekle. Süspansiyon içinde bulunan hücrelerin durumda tutmak için sürekli hafifçe karıştırılarak, 4 ° C 'de 1 saat süre ile inkübe edin.
- Hücreleri yıkamak için 5 mi, buzla soğutulmuş ayırma tamponu ihtiva eden 15 ml'lik bir tüp içine hücre süspansiyonu her aktarın.
- Dışarı salınan bir rotor, 4 ° C 'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin tüp.
- Bu arada manyetik ayırıcı ve sütun kurdu. Stand manyetik ayırıcı takın ve Separ sütun yerator. Buz soğukluğunda ayırma tamponu 500 ul uygulayarak sütun yıkayın. Akışını atın.
- Sütunun altında yeni bir 15 ml toplama tüpü yerleştirin. Buz üzerinde toplama tüpü bulundurun.
- Pipet ile süpernatantı (adım 3.5) atın ve yavaşça 500 ul ayırma tampon içinde hücre pelletini. Önceden yıkanmış sütunun üstüne hücre süspansiyonu uygulayın ve içinden çalıştırın.
Not: Hücre kümeleri sütun yapışmasına neden olabilir ve bu şekilde akış hızını azaltabilir. Bu sorunu önlemek için, kolonun tepesinde bir 40 um plastik hücre süzgeci yerleştirin. Bu örgü sayesinde hücreleri Passing çok bu yöntemin etkinliğini artıracaktır. - Ayırma tamponu, 1.5 ml (10 7 hücreleri için 500 ul) ile sütun 4 kez yıkayın. Bir sonraki yıkama adımı uygulamadan önce (hiçbir sıvı sütununda dikkat edilmelidir) boş sütun rezervuar bekleyin.
Not: B lenfosit kısmıyla olarak kabul CD3 etiketsiz hücreleri elde, oldukları gibitoplama tüpüne yıkandı. - Yeni 15 ml toplama tüpüne ayırıcı ve yerden sütun çıkarın. Pipet kolonuna ayırma tamponu 2 mi. T lenfosit fraksiyonu olarak kabul edilmektedir olumlu seçilmiş T lenfositleri, Zehir sütununda verilen piston kullanma.
- Saflaştırılmış hücreler (adım 1.15) Gerekirse sayısını belirler. Hücre süspansiyonları, artık aşağı doğru deneyler için hazırdır.
İzole 4. Akım Sitometri Analizi Tonsil B ve T Lenfositler
DİKKAT: Paraformaldehit çözüm tahriş edici ve kanserojen olabilir. Çalışırken uygun koruyucu giysi, eldiven ve göz / yüz koruyucusu kullanın.
Not 1: Bu protokol (FACS) analizi Kontrol THP izole edilmiş B ve T hücrelerinin doğrudan boyanması için bir yöntemi tarif etmektedir. Bu adımın amacı popülasyonları af izole hücre saflığını değerlendirmek içinter CD3 manyetik antikor ayırma. Bu amaçla kurulan B ve T hücre belirteçleri için fluorofor konjuge monoklonal antikorlar CD20-FITC ve CD2-APC kullanılır. Ayrıca izotip kontrol antikorları dahil yüksek CD2 ve CD20 antikorlarının (adım 4.8) arasında spesifik olmayan bağlanma "arka plan" ayırt önerilir.
Not 2: Bu boyama zamanına kadar 4 ° C 'de bir% 1 paraformaldehid içinde karanlıkta (PFA) çözeltisi saflaştırılmış hücre fraksiyonları tutmak mümkündür (örneğin, ertesi gün).. Boyama ve FACS analizi arasında bir zaman boşluğu olduğu takdirde de aynı prosedür uygulanabilir. Her iki durumda da hücreler PBSA lekelenme veya FACS analizi öncesinde tamponu (PBS% 0.2 BSA ihtiva eden) ile düzgün yıkanmalıdır unutmayın.
- Adım 3.10 aşama 3.9 ve T lenfosit fraksiyonu, B lenfosit kısmını (önceki sütuna uygulamadan) aşama 1.15 den çok uluslu şirketler 6 x 10 6 hücre çıkar.
- Hücreyi Spindışarı salınan bir rotor kullanılarak 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de süspansiyonlar.
- Pipetle Süpernatantı ve buz gibi soğuk PBSA'da 1 ml ile bir kez hücre pelet yıkayın. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de hücre süspansiyonları dönerler. Pipetle Süpernatantı ve tekrar süspansiyon buz soğukluğunda PBSA tampon 600 ul hücre.
- FACS tüpün alt hücre süspansiyonu 100 ul ekle.
- PBS, her tüpe,% 10 ısı ile inaktive edilmiş insan serumu ihtiva eden 100 ul eklenir, iyice karıştırılır ve oda sıcaklığında ~ 1 dakika veya buz üzerinde 20 dakika inkübe edilir.
Not: B lenfositleri Fc reseptörleri taşıyan. Fc bloke etmek için saflaştırılmış hücre fraksiyonları% 10 ısı ile inaktive edilmiş insan serumu ile inkübe edilir reseptörleri. Insan serumu, 1 saat boyunca 56 ° C'de inkübe edilerek inaktive ısıdır. -20 ° C'de dondurulur, küçük kısımlar ve mağaza, ısı ile inaktive edilmiş serum bölün. - Bir sw 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj hücre süspansiyonuing-out rotor.
- Pipetle Süpernatantı ve 1 ml PBSA'da hücre pelet yıkayın. Santrifüj (4 ° C 'de 5 dakika süre ile 300 x g) tekrarlayın.
- Buz üzerinde, her bir tüpe 100 ul PBSA ekleyin. Üreticinin tavsiyesine göre, florofor konjuge monoklonal antikorun uygun miktarda ekleme (örneğin, anti-CD20 20 ul ve / veya albümin 100 ul anti-CD2 antikorlarının 5 ul). Not: FACS analizi için yeterli kontrol tüpleri atamak unutmayın. Bu protokol, aşağıdaki kontroller dahil edilmelidir: ayrı ayrı anti-CD2 ve anti-CD20 antikorlar ile boyandı 1) hücreler, ek olarak bireysel olarak, anti-CD2 ve anti-CD20 izotip kontrol antikorları ve 3) hücreleri ile boyanmış 2) hücreleri Antikorların.
- Kısaca tüp vorteks ve karanlıkta 4 ° C'de 30 dakika inkübe edilir.
- PBSA'da 2 kez yıkayın. Örnekler 1,% PFA çözeltisi 2 ml ilave edilir. Hücreler 4 ° C'de PFA çözeltide kalır edelim76; FACS analizi zaman kadar karanlıkta C.
- Hemen FACS makinesinde örnekleri çalıştırmadan önce, (4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g), albümin ile hücreler 2 kez yıkayın. 1 ml PBS ile yeniden süspanse Numuneler akış sitometresi üzerinde ayırma, ışıktan korunan, 4 ° C'de (ya da buz üzerinde) tutmak.
- Üretici sitometresi akışından protokolü aşağıdaki FACS sıralama yapın.
İzole Tonsil B ve T Lenfositlerindeki Adenovirüs DNA'nın 5. PCR Algılama
Not 1: adeno virüs hekson geni primerleri AdRJC1 (5'-GACATGACTTTCGAGGTCGATCCCATGGA-3 ') ve AdRJC2 (5'-CCGGCTGAGAAGGGTGTGCGCAGGTA-3'), 11. Bu primerler, 139 bp'lik bir amplikon üretir. Ev sahibi 18S rRNA gen primerler tp206 (5'-CCCCTCGATGCTCTTAGCTG-3 ') ve tp207 (5'-TCGTCTTCGAACCTCCGACT-3') ile tespit edilebilir. Beklenen Amplikon boyutu 300 bp olduğunu.
Not 2: Her PCRÇalışma bir negatif kontrol (damıtılmış H2O) ve insan adenovirüs tip 5 12 ile enfekte edilmiş insan B hücre çizgisi (BJAB) elde edilen bir DNA pozitif kontrolü içerir.
- Silika membran bazlı kolon arıtma yöntemi kullanılarak (en az 1 x 10 6 hücre, adım 3.11) DNA ayıklayın. Fenol ve guanidin izotiyosiyanat çözeltisi 13 kullanarak, RNA yı ekstrakte edin.
- 1x HF tamponu, deoksinükleotid trifosfat karışımı 0.2 mM (dNTP), 0.25, her bir primerden uM ve 20 ul bir toplam hacim içinde Yüksek Fidelity DNA polimeraz 1 U ihtiva eden bir reaksiyon karışımına, B ve T lenfositleri 100 ng DNA ekleyin.
- Aşağıdaki çevrim koşulları altında PCR amplifikasyonu yapın: 10 sn, 67 ° C (hekson) ya da 58 ° C (18S rRNA) 30 sn için ve 72 ° C sıcaklıkta 98 ° C 30 döngü, ardından 98 ° C'de 30 saniye denatürasyon, 30 sn. PCR reaksiyonu, 72 ° C'de 7 dakikalık son bir uzatma aşaması ile sona erdirildi.
- Elde edilen PCR amplif Ayrı1x TBE içinde% 1.5 agaroz jeli üzerinde ication ürünleri tampon ve nükleik asit boyası ile boyandı, beklenen şeritleri görselleştirmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
B ve T lenfositlerinin yüksek oranda saflaştırılmış alt popülasyonlannda tonsil uluslu şirketlerin sonuçların verimli bir ayırma. Bu B ve T lemfosit popülasyonları sırasıyla (Şekil 3A) tespit etmek için bir anti-CD20 ve anti-CD2 antikorları kullanılarak FACS analizi ile teyit edilmiştir. Bunun aksine, B ve T lenfosit alt (Şekil 3B) hem de bir hücre karışımı hücre fraksiyonlarında uluslu şirketlerin sonuçların etkisiz bir ayrılması.
İzole bademciği B ve T limfositleri (Şekil 3A), nükleik asit izolasyonu gibi alt analizler için yeterli kalitede. Mevcut protokolde, DNA ve RNA B ekstre edilmiş ve T limfositleri, adenovirüs DNA ve hücresel RNA saptanması için kullanılmaktadır. Sonuçlar tonsil T lenfositleri adenovirüs DNA'nın belirli algılamasını (Şekil 4) gösterir. Tonsiller, B ve T lenfositlerden da izole RNA downstrea için yeterli kalite ve miktar olduğu m uygulamalar (Şekil 5).
Şekil tonsil lenfosit izolasyon prosedürü 1. Genel Bakış. Bademcik işlenecek ve tonsil ÇUŞ'ları yoğunluk gradyanlı santrifugasyon sureti ile bir hücre süspansiyonu izole edilir. B ve T lenfositleri, insan CD3 antikoru ile, manyetik T lenfosit fraksiyonunun pozitif seçimi ile alt-popülasyonlar halinde saflaştırılır. Bu saflaştırma adım izole edilmiş hücre fraksiyonları değerlendirmek mümkün kılar; bazı viral türler alt popülasyonlar herhangi içinde zenginleştirilmiş örneğin, belirlemek için. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
jpg "/>
Şekil 2. Cerrahi palatin bademcikler kaldırıldı. Tonsillektomi (solda) ve tonsillotomy (sağda) ile çıkarıldı Bademcik. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Zenginleştirilmiş hücre fraksiyonlarının Şekil 3. Temsilcisi FACS sonuçları. (A) İleri Tonsiller çok uluslu şirketler, T lenfosit ve atık fraksiyonları yan scatter plot gösteren B (CD20) ve T (CD2) lenfosit popülasyonlarının vs. Zenginleştirilmiş hücre fraksiyonlarında T ve B lenfositlerinin saflığı% 90'dan fazla olan. B hücreleri, toplam atık hücrelerin% 92'sini oluşturan bu yana, bu fraksiyon B lenfosit subpopülasyonu olarak adlandırılır. (B) FACS araziler B ve T hücre subp verimsiz ayrılmasını gösterenbağlı kolon ve yetersiz yıkama aşamaları uygulanan çok uluslu şirketlerin olmayan iyileştirilmiş bir numaraya opulations. / CD20 - - Kenara manyetik aktive hücre optimizasyonu sıralama için ihtiyaçtan, CD2 yüksek arkaplan var. Hücreler, FACS boyama iyi optimize olmadığını gösteren bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Tonsil lenfosit fraksiyonlarda adenovirüs DNA Şekil 4. PCR tespiti. Toplam DNA, B elde edilir ve T limfositleri gören bir hastanın bademcik ameliyatı sol ve sağ tonsillerinden izole edilmiştir. Son nokta, PCR saflaştırılmış DNA 100 ng gerçekleştirilir. Şerit 1: Sol bademcik B lenfosit fraksiyonu (B); şerit 2: lef T lenfosit fraksiyonu (T)t bademcik; kuşak 3: sağ bademcik B lenfosit fraksiyonu (B); şerit 4: Sağ bademcik T lenfosit fraksiyonu (T). Adenovirüs (Ad), DNA izole edilmiş T lenfosit fraksiyonunda yalnızca tespit edilebilir. Bir iç kontrol olarak Hücresel 18S rRNA gen eylemler DNA aynı miktarda tüm örneklerde PCR reaksiyonu için kullanılan göstermek için. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
İzole B ve T hücre alt elde Şekil 5. Yüksek kaliteli RNA. Izole edilmiş, B ve T lenfositleri elde toplam sitoplazmik RNA, bir% 1 agaroz jeli üzerinde ayrıldı. Şerit 1: Sol bademcik B lenfosit fraksiyonu (B); şerit 2: Sol bademcik T lenfosit fraksiyonu (T); kuşak 3: sağ bademcik B lenfosit fraksiyonu (B); şerit 4:Sağ bademcik T lenfosit fraksiyonu (T). 28S rRNA Göç desen, 18S rRNA ve küçük RNA belirtilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokolün sonucunu etkileyen en önemli faktörlerden biri başlangıç malzemesi olarak taze tonsil malzeme kullanılmasıdır. Bu nedenle, bademcik örnekleri ameliyat sonrası 3 saat içinde işlenmelidir. Bademcikler yetişkinler hem de çocuklar elde edilebilir. Çocuklar bademcik malzeme nedeniyle bademcik (tonsillotomy) kısmi cerrahi olarak çıkarılması genellikle küçüktür. Bu nedenle, çok uluslu sayısı az tonsillektomi örneklerinde (1 x 10 8 -2 x 10 9) karşılaştırılır tonsillotomy örneklerinde (1 x 10 7 -1 x 10 8) elde. Ancak, hücre izolasyon işlemi ne olursa olsun, cerrahinin aynı olacaktır.
Yöntemi sıralama manyetik aktive hücresinden elde edilen hücre alt saflığını maksimize bazı optimizasyon gerektirir. CD3 manyetik antikorla miktarı ve inkübasyon süresi ve kolona uygulanır ÇUŞ'ların sayısı tercih edilmelidir başlıca faktörlerdirimized. Çok fazla hücre uygulanması kolon ve hücre alt verimsiz zenginleşme tıkanma neden olur. Bu protokolün optimizasyonu sırasında, ayırma kolonu üzerinde fazla 3 x 10 7 ÇUŞ'larına uygulanması kolon ve daha sonra saf hücre fraksiyonları (Şekil 3B) bir tıkanma yol açtığı görülmüştür. Bu nedenle, 3 x 10 7 çok uluslu başlayarak DNA ve RNA ekstraksiyonu için yeterli kalite ve miktar ile iyice zenginleştirilmiş lenfosit kısımları vermektedir (Şekil 4 ve 5). İzole B ve T lenfositlerinin nihai sayısı sırasıyla, 1-2 x 10 7 ve 5-7 x 10 6 olması beklenmektedir. Bu nedenle, 3 x 10 7 MNH için, CD3 manyetik antikorun 20 ul kullanımı başarılı B ve T lemfosit ayırma (Şekil 3A) için optimum olduğu görülmektedir.
Bir önceki raporda B ve T lenfositler, diğer ise sırasıyla% 60-70 ve tonsiller ÇUŞ'ların% 30-40 içermesi kurmuşturmakrofajlar gibi hücre tipleri, doğal öldürücü hücreler ve dendritik hücreler tonsiller ÇUŞ'ların 14 1-8% oluşturuyor. FACS tekniği (Şekil 3A) B ve T lenfositlerinin immün gösterildiği gibi benzer hücre oranları eden izolasyon protokolü ile elde edildi.
Yıkama adımların sayısı ve yıkama tamponu hacmi iyi bir sonuç için kritik parametrelerdir. Bu duruma göre, aşırı yıkama yetersiz yıkama T hücre fraksiyonunun saflığı azaltır, oysa, CD3 manyetik antikoru ilişkili T hücreleri, içten akışta sonuna kadar olmasına neden olacaktır.
Protokolde kritik adımlar doku tipi ve beklenen aşağı analizler için optimize edilmiş bir kez, bu yöntem, basit, verimli, kolay ve zaman tasarrufu olduğunu. Bununla birlikte, bu yöntemin bir sınırlama tonsilla büyük ölçekli arıtma kısıtlayabilir ticari manyetik-ilintili hücre sıralama reaktifleri nispeten yüksek maliyet,r, B ve T limfositleri.
Özetle, bu protokol, palatin tonsillerinden B ve T alt-popülasyonunu elde etmek için bir strateji sağlar ve dalak, timus, lenf düğümleri ve kan gibi diğer dokuların hücre fraksiyonları izole etmek için de değiştirilebilir. Bu İleride tonsillar T hücre fraksiyonu spesifik olarak (Şekil 4), bir adenovirüs enfeksiyonunun tespit göstermek için bu yöntemi uygulanır. Böylece, bu protokol evsahibi-patojen etkileşimlerinin, T hücresi sitotoksisitesi, T hücre aktivasyonu, hücre sinyal ve B ve T-hücresi yüzey markör ifade ile ilgili çalışmalar dahil olmak üzere, geniş bir uygulama-alanı için yararlı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hanks balanced salt solution (HBSS) | Gibco | 14175-053 | Contains 5% fetal bovine serum (FBS), 10 mM Glutamine, 0.05 mg/ml Gentamicin and 1% Antibiotic-Antimycotic mix |
| Freezing medium | 90% FBS and 10% DMSO | ||
| MACS buffer | PBS (pH 7.2), 0.5% BSA and 2mM EDTA | ||
| PBSA | PBS containing 0.2% BSA | ||
| PFA | PBS containing 1% paraformaldehyde (PFA). Make fresh. PFA is suspected carcinogen. Wear gloves and goggles. | ||
| Antibiotic-Antimycotic mix | Gibco | 15240-062 | |
| 60 mm Petridish | Nunc | 150326 | |
| Dissecting foreceps | Fisher Scientific | 1381241 | |
| Straight iris scissors | Fisher Scientific | 12912055 | |
| disposable scalpels | Swann-Morton | REF 0501 | |
| 100 μm plastic cell strainer | Corning Life Sciences | 352360 | |
| 40 μm plastic cell strainers | Corning Life Sciences | 352340 | |
| 2 ml plastic syringe | BD Biosciences | 300185 | |
| 15 ml conical centrifuge tubes | SARSTEDT | 62554502 | |
| 50 ml conical centrifuge tubes | SARSTEDT | 62547254 | |
| Low-speed centrifuge with fixed-angle or swinging-bucket rotor | Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R | ||
| Ficoll–Hypaque | Sigma-Aldrich | F5415-50ML | Ficoll solution |
| Fetal calf serum | Biological industries | 040071A | |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | SIGMA | D2650-5X5ML | |
| MACS MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| MACS human CD3 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-092-881 | |
| MACS separator (Octo MACS) | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Merck Millipore | 1120180100 | |
| EDTA | AnalaR NORMAPUR | 20302.293 | |
| CD2 conjugated to allophycocyanin (CD2-APC) | BD Biosciences | 560642 | |
| CD20 conjugated to fluorescein isothiocyanate (CD20-FITC) | BD Biosciences | 556632 | |
| Human serum | Rockland Immunochemicals | D119-0100 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Scientific | F-530L | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352003 | |
| Cryotube | SARSTEDT | 72379 | |
| BD LSRII flowcytometer | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva 4.1 software | BD Biosciences | ||
| Nucleospin Blood | Macherey-Nagel | 740951.50 | DNA isolation kit |
| TRIzol reagent | Life technologies | 15596 | RNA isolation reagent |
| Hemocytometer | The Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | 0610030 | cell counter device |
| GelRed | Biotium | 41003 | Nucleic acid gel stain |
References
- Nave, H., Gebert, A., Pabst, R. Morphology and immunology of the human palatine tonsil. Anat Embryol (Berl). 204, 367-373 (2001).
- Perry, M., Whyte, A. Immunology of the tonsils. Immunology today. 19, 414-421 (1998).
- Alkhalaf, M. A., Guiver, M., Cooper, R. J. Prevalence and quantitation of adenovirus DNA from human tonsil and adenoid tissues. J Med Virol. 85, 1947-1954 (2013).
- Brandtzaeg, P., Halstensen, T. S. Immunology and immunopathology of tonsils. Adv Otorhinolaryngol. 47, 64-75 (1992).
- Imai, S., et al. Epstein-Barr virus (EBV)-carrying and -expressing T-cell lines established from severe chronic active EBV infection. Blood. 87, 1446-1457 (1996).
- Veen, J., Lambriex, M. Relationship of adenovirus to lymphocytes in naturally infected human tonsils and adenoids. Infect Immun. 7, 604-609 (1973).
- Friedman, M., Wilson, M., Lin, H. C., Chang, H. W. Updated systematic review of tonsillectomy and adenoidectomy for treatment of pediatric obstructive sleep apnea/hypopnea syndrome. Otolaryngol Head Neck Surg. 140, 800-808 (2009).
- Garnett, C. T., et al. Latent species C adenoviruses in human tonsil tissues. J Virol. 83, 2417-2428 (2009).
- Garnett, C. T., Erdman, D., Xu, W., Gooding, L. R. Prevalence and quantitation of species C adenovirus DNA in human mucosal lymphocytes. J Virol. 76, 10608-10616 (2002).
- Perez, M. E., Billordo, L. A., Baz, P., Fainboim, L., Arana, E. Human memory B cells isolated from blood and tonsils are functionally distinctive. Immunol Cell Biol. 92, 882-887 (2014).
- Cooper, R. J., Yeo, A. C., Bailey, A. S., Tullo, A. B. Adenovirus polymerase chain reaction assay for rapid diagnosis of conjunctivitis. Invest Ophthalmol Vis Sci. 40, 90-95 (1999).
- Zhang, Y., Huang, W., Ornelles, D. A., Gooding, L. R. Modeling adenovirus latency in human lymphocyte cell lines. J Virol. 84, 8799-8810 (2010).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. biochem. 162, 156-159 (1987).
- Watanabe, T., Yoshizaki, K., Yagura, T., Yamamura, Y. In vitro antibody formation by human tonsil lymphocytes. J Immunol. 113, 608-616 (1974).
