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Biology

संयंत्र छल्ली लिपिड पॉलिएस्टर monomers के अलगाव और compositional विश्लेषण

Published: November 22, 2015 doi: 10.3791/53386
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biology, Algoma University

Introduction

संवहनी पौधे संयंत्र के ऊतकों और बाहरी वातावरण के बीच निविड़ अंधकार बाधाओं के रूप में कार्य करते हैं कि बाह्य परतों पर भरोसा करते हैं। ये lipophilic सेल की दीवार से जुड़े संरचनाओं रोगजनक संक्रमण को प्रतिबंधित करने और में और संयंत्र के ऊतकों 1 से बाहर गैसों, पानी, और भंग पदार्थों के निष्क्रिय परिवहन को विनियमित। इस तरह की बाधाओं संयंत्र छल्ली, पौधों 2, और विभिन्न suberin युक्त प्रसार बाधाओं का एक अनोखा synapomorphic संरचना रहे हैं। छल्ली कोशिका दीवार 3-5 के बाह्य पक्ष पर एक pectinaceous परत के माध्यम से एपिडर्मल कोशिकाओं द्वारा संश्लेषित और उन्हें करने के लिए बाध्य एक oleophilic परत है। यह संयंत्र के ऊतकों और पर्यावरण के बीच एक महत्वपूर्ण इंटरफेस के रूप में कार्य कर रहा है, उच्च पौधों की प्राथमिक हवाई अंगों encases।

Cutin, छल्ली की संरचनात्मक मैट्रिक्स, और suberin विलायक निष्कर्षण मोम 2,4 के साथ जुड़े दो अघुलनशील Glycerolipid पॉलिस्टर्स हैं। ये polymeric एलipids संतृप्त और असंतृप्त वसा अम्ल डेरिवेटिव से बना है और दोनों संरचनात्मक और कार्यात्मक रूप से समान हैं। हालांकि, वे रासायनिक संरचना और बयान साइटों में विशेषता मतभेद से अलग पहचाना जाता है।

Suberin एक माध्यमिक दीवार बनाने के लिए कुछ बाहरी और आंतरिक ऊतकों की कोशिका दीवारों के अंदर स्थित एक स्निग्ध पॉलिएस्टर है। Suberized ऊतकों जड़ों की periderms, कंद और पेड़ की छाल, जड़ अंस्त्वच, बीज कोट परतें, और चंगा घाव 2 शामिल हैं। Cutin के विपरीत, suberin पॉलिएस्टर आम तौर पर एल्कोहल, संतृप्त और मोनो असंतृप्त dicarboxylic एसिड, और बहुत-लंबी श्रृंखला मोनोमर्स का एक बड़ा हिस्सा (C≥20) शामिल हैं।

Cutin संवहनी पौधे 6 में सबसे प्रचुर मात्रा में लिपिड पॉलिएस्टर है, और ग्लिसरॉल और ऐसे हाइड्रोक्सी और हाइड्रोक्सी epoxy प्रतिस्थापित फैटी एसिड के रूप में 4 C16-C18 interesterified फैटी एसिड डेरिवेटिव, से बना है। Cutin पॉलिमर की रचना करते समय0, 18-हाइड्रोक्सी 9,10-epoxy: 18: 0, और 18 9,10,18-trihydroxy: 0 फैटी एसिड tracheophyte प्रजातियों भर में बदलता है, सबसे प्रमुख प्राथमिक मोनोमर्स 16 16-dihydroxy, 10 हैं। 2 dicarboxylic एसिड 7.8: दिलचस्प है, एराबिडोप्सिस पत्ती और cutin स्टेम मुख्य रूप से 18 से बना है।

संयंत्र cuticles भी कई माइक्रोमीटर से 9 तक कुछ नैनोमीटर से लेकर मोटाई में काफी परिवर्तनशीलता प्रस्तुत करते हैं। छल्ली अलगाव विशेष रूप से इस तरह के Arabidopsis thaliana 8 में से उन लोगों के रूप में बहुत पतली पत्ती cuticles के लिए एक श्रमसाध्य और समय लेने कदम है, के बाद से, छल्ली अलगाव को बायपास करने वाले तरीकों का विकास और 7.8 मान्य किया गया है। यहाँ, हम सोडियम methoxide (NaOMe) -catalyzed depolymerization और बाद गैस क्रोमैटोग्राफी / मास स्पेक्ट्रोमेट्री (जीसी / एमएस) के विश्लेषण के द्वारा Arabidopsis thaliana पत्तियों में cutin की मोनोमर संरचना का अध्ययन करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन है। इस प्रोटोकॉल सह परख करने की क्रिया के लिए एक मजबूत तरीका प्रदान करता हैपूरे delipidated ऊतकों में संयंत्र लिपिड पॉलिस्टर्स MPOSITION, और पहले से सूचना दी प्रोटोकॉल 7,10,11 से अनुकूलित किया गया है। पूरे ऊतक के नमूने हैं homogenized पहली और विस्तृत रूप से चर्म संबंधी और epicuticular वैक्स, झिल्ली लिपिड, और triacylglycerols सहित विलायक निष्कर्षण लिपिड को हटाने, delipidated। सेल की दीवार समृद्ध अवशेषों तो सोडियम methoxide उत्प्रेरित methanolysis द्वारा उनके घटक मिथाइल एस्टर मोनोमर्स में depolymerized कर रहे हैं। फैटी एसिड मिथाइल एस्टर अम्लीकरण पर निकाली गई, और उनके इसी trimethylsilyl या एसिटाइल डेरिवेटिव प्राप्त करने के लिए derivatized कर रहे हैं। Derivatized अवशेषों अत्यधिक अस्थिर कर रहे हैं, और जीसी / एमएस विश्लेषण के दौरान उनकी संरचनात्मक रचना बदलने के बिना एक उचित तापमान पर एक गैस क्रोमैटोग्राफी स्तंभ से eluted जा सकता है।

Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल बोनावेंचर एट अल से अनुकूलित किया गया था। (2004), मोलिना एट अल। (2006), ली एट अल। (2013) 7,10,11। चरण 1-5 चित्रा 1 में संक्षेप हैं।

1. ऊतक Delipidation

नोट: हमेशा की तरह, क्लोरोफॉर्म के साथ सभी कांच के बने पदार्थ और टोपियां कुल्ला उपयोग करने से पहले, धूआं हुड के नीचे सूखी दे।

चेतावनी: ऊतक homogenization और धूआं हुड के तहत सभी विलायक हस्तांतरण चरणों को पूरा करें; हमेशा रसायनों के साथ सीधे संपर्क से बचने के लिए और प्रदूषण से नमूने की रक्षा के लिए प्रयोगशाला कोट, दस्ताने और छप सुरक्षा चश्मे पहनते हैं।

  1. पहले से गरम पानी से स्नान और 85 डिग्री सेल्सियस के लिए गर्मी ब्लॉक।
  2. Polytetrafluoroethylene (PTFE) -faced पेंच टोपी के साथ पूर्व तौला 20 मिमी x 125 मिमी ग्लास टेस्ट ट्यूब में प्रत्येक पत्ती के नमूने के लगभग 0.5 ग्राम वजन। नमूना प्रति चार प्रतिकृति को शामिल करें।
  3. एक Erlenmeyer फ्लास्क (लगभग 125 मिलीलीटर में 2-propanol प्लेस, samp के ग्राम प्रति 25 मिलीलीटरल)। 0.01% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए (भी butylated HYDROXYTOLUENE, BHT के रूप में जाना जाता है) 2,6-डाइ-tert-butyl-4-methylphenol जोड़ें (w / v)।
    नोट: मेथनॉल में शेयर समाधान (w / v) एक 5% से BHT जोड़ें (Bht असंतृप्त वसीय अम्लों के ऑक्सीकरण को कम करने में मदद करता है)।
  4. नहाने के पानी में 85 डिग्री सेल्सियस के लिए पहले से गरम 2-propanol समाधान।
  5. गर्मी ब्लॉक में 85 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए प्रत्येक नमूना ट्यूब और गर्मी के लिए 12 मिलीलीटर गर्म 2-propanol विलायक जोड़ें। यह कदम बाधित कोशिकाओं से जारी किया जा सकता है कि lipases निष्क्रिय।
  6. ट्यूबों के कमरे के तापमान को शांत और एक सजातीय निलंबन प्राप्त किया जाता है जब तक homogenizer के साथ अच्छी तरह से ऊतक पीस करते हैं।
  7. एक कक्षीय प्रकार के बरतन में नमूने रखें और 100 rpm और कमरे के तापमान पर 1-2 घंटे के लिए हिला।
  8. 800 XG पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  9. 2-propanol की एक समान मात्रा में जोड़ें और कमरे के तापमान पर 12 घंटे के लिए हिला।
  10. 800 XG पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  11. 12 मिलीलीटर सीएच जोड़ेंCL 3: सीएच 3 ओह (2: 1, वी / वी) (नमूना के ग्राम प्रति 25 मिलीलीटर) छाछ और 100 आरपीएम और कमरे के तापमान पर रात भर मिलाने के लिए।
  12. 800 XG पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  13. 12 मिलीलीटर CHCl 3 जोड़ें: सीएच 3 ओह (1: 2, वी / वी) अवशेषों और 100 आरपीएम और कमरे के तापमान पर रात भर मिलाने के लिए।
  14. 800 XG पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र और विलायक हटा दें।
  15. नमूने कमरे के तापमान पर रात भर धूआं हुड के तहत शुष्क करते हैं।
  16. छाछ हवा शुष्क और फिर निर्जल 2 CaCl या लगातार वजन (3-5 दिन) तक पहुँच जाता है Caso 4 पर एक निर्वात desiccator में जगह है।

2. depolymerization: सोडियम methoxide साथ Methanolysis (चित्रा 2)

सावधानी: - 2.4, 2.7-2.8, 2.10 - कदम 2.3 प्रदर्शन करना 2.15 और 2.17 - - 2.11, 2.13 धूआं हुड के तहत 2.18; हमेशा प्रयोगशाला कोट, दस्ताने और छप सुरक्षा चश्मे पहनते हैं।

  1. 60 डिग्री सेल्सियस के लिए पहले से गरम गर्मी ब्लॉक।
  2. (आगे की गणना के लिए महत्वपूर्ण) शुष्क अवशेषों से युक्त टेस्ट ट्यूब वजन।
  3. प्रत्येक ट्यूब आंतरिक मानकों जोड़ें: 25 ωL मिथाइल heptadecanoate (1 मिलीग्राम / एमएल शेयर) और 25 μl ω-pentadecalactone (1 मिलीग्राम / एमएल शेयर)।
  4. प्रत्येक ट्यूब 0.9 मिलीलीटर मिथाइल एसीटेट, 1.5 मिलीग्राम सोडियम methoxide, और 3.6 मिलीलीटर मेथनॉल जोड़ें और उन्हें टोपी। वैकल्पिक रूप से, इन तीन अभिकर्मकों के साथ एक प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करने और प्रत्येक नमूने के 6 मिलीलीटर aliquots जोड़ें।
  5. 2 60 डिग्री सेल्सियस पर घंटे और समय समय पर 15 मिनट के अंतराल में भंवर के लिए गर्मी के नमूने हैं।
  6. नमूने कमरे के तापमान को ठंडा होने दें।
  7. फैटी एसिड मिथाइल एस्टर निकालने के लिए methylene dichloride (सीएच 2 सीएल 2) और हिमनदों एसिटिक एसिड के 1.5 मिलीलीटर के 10 मिलीलीटर जोड़ें।
  8. प्रत्येक ट्यूब और टोपी को भरने के लिए नमकीन घोल (0.5 एम NaCl) जोड़ें।
  9. 800 x जी पर 10 मिनट के लिए 1 मिनट और सेंट्रीफ्यूज के लिए भंवर नमूने हैं।
  10. पाली के साथ मध्यम आकार की नलियों को साफ करने के लिए (कम) जैविक चरण हस्तांतरण (16 x 125 मिमी ग्लास टेस्ट ट्यूबtetrafluoroethylene (PTFE) -faced पेंच टोपी)।
  11. प्रत्येक ट्यूब और टोपी को भरने के लिए नमकीन घोल (0.5 एम NaCl) जोड़ें।
  12. 800 x जी पर 10 मिनट के लिए 1 मिनट और सेंट्रीफ्यूज के लिए भंवर नमूने हैं।
  13. जलीय (ऊपरी) चरण निकालें और दोहराने 2.11-2.12 कदम।
  14. सभी जलीय (ऊपरी) चरण निकालें।
  15. 1 मिनट के लिए ट्यूब, और भंवर टोपी, विलायक करने के लिए निर्जल सोडियम सल्फेट (ना 2 अतः 4) जोड़ें; नमूने अब अगले दिन जब तक छोड़ा जा सकता है। इस बिंदु नमूने धूआं हुड के नीचे रात में छोड़ दिया जा सकता है।
  16. तल में ना 2 अतः 4 नमक संकुचित करने के लिए 800 XG पर 2 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
  17. एक छोटा गिलास डिस्पोजेबल ट्यूब (polytetrafluoroethylene के साथ 13 x 100 मिमी कांच टेस्ट ट्यूब (PTFE) -faced पेंच टोपी) के लिए जैविक चरण स्थानांतरण।
  18. नाइट्रोजन के तहत सूखापन के लिए विलायक लुप्त हो जाना और derivatization कदम पर आगे बढ़ें। तुरंत कार्रवाई नहीं करते हैं, तो दुकान -20 डिग्री सेल्सियस पर नमूने सुखाया (नमूने एक हो सकता हैLSO) वाष्पीकरण कदम से पहले संग्रहीत।

गैस क्रोमैटोग्राफी के लिए संजात के 3. तैयारी

चेतावनी: कदम 3.1.2 और 3.1.5 प्रदर्शन - एक धूआं हुड के तहत 3.1.8; हमेशा प्रयोगशाला कोट, दस्ताने और छप सुरक्षा चश्मे पहनते हैं।

  1. Trimethylsilyl डेरिवेटिव
    1. 100 डिग्री सेल्सियस के लिए पहले से गरम गर्मी ब्लॉक।
    2. प्रत्येक ट्यूब पिरिडीन के 100 μl और BSTFA (एन, ओ बीआईएस trimethylsilyl-trifluoroacetamide) के 100 μl जोड़ें और उन्हें टोपी।
    3. 10 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर हीट नमूने हैं।
    4. नमूने कमरे के तापमान को ठंडा होने दें।
    5. कमरे के तापमान पर नाइट्रोजन के तहत नमूने लुप्त हो जाना। नमूने के लिए गर्मी लागू करने से बचें, मोनोमर्स इस स्तर पर अत्यधिक अस्थिर कर रहे हैं।
    6. 1 (वी / वी) हेपटैन: टोल्यूनि 1 के 500 μl जोड़ें।
    7. 800 x जी पर 2 मिनट के लिए 1 मिनट और सेंट्रीफ्यूज के लिए भंवर नमूने हैं।
    8. जीसी शीशियों के लिए नमूने जोड़ें और जीसी / एमएस विश्लेषण करने के लिए आगे बढ़ें।
  2. एसिटाइलडेरिवेटिव
    नोट: एसिटिलीकरण के लिए, चरणों को संशोधित 3.1.1-3.1.3 ऊपर (वीडियो में दिखाया गया है) के रूप में निम्नानुसार; 3.1.4-3.1.8 वही कर रहे हैं कदम:
    1. 60 डिग्री सेल्सियस के लिए पहले से गरम गर्मी ब्लॉक।
    2. पिरिडीन के 100 μl और ट्यूबों के लिए एसिटिक एनहाइड्राइड के 100 μl (ओ एसी 2) जोड़ें।
    3. गर्मी के नमूने 60 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे।

4. जीसी / एमएस विश्लेषण

  1. एक एचपी-5 केशिका स्तंभ (30 एमएक्स 0.25 मिमी x 0.25 माइक्रोन मोटाई फिल्म) या समकक्ष (यानी।, 5% diphenyl, 95% डाइमिथाइल polysiloxane) का प्रयोग करें। कार्यक्रम 3 डिग्री सेल्सियस / मिनट पर 300 डिग्री सेल्सियस के लिए 150 से प्रोग्राम किया हीलियम वाहक गैस 1.5 मिलीग्राम / मिनट पर सेट प्रवाह और ओवन के तापमान के साथ जीसी।
  2. 40-600 एएमयू (इलेक्ट्रॉन प्रभाव आयनीकरण) पर मोड स्कैन करने के लिए विभाजन इंजेक्शन (विभाजन अनुपात 1:10) और सेट मास स्पेक्ट्रोमीटर का प्रयोग करें।
  3. विलायक (खाली), गुम्मट और उत्परिवर्ती प्रतिकृति, प्रत्येक का उपयोग कर संकेत cutin विश्लेषण विधि सहित एक दृश्य तालिका बनाएँ।
  4. लोड विलायकऔर हिंडोला पर नमूना शीशियों, यदि आवश्यक हो तो autosampler में सिरिंज-rinsing शीशियों के लिए हेक्सेन जोड़ने के लिए, और क्रम शुरू। श्रृंखला की समाप्ति के बाद, कुल आयन वर्णलेख निशान सभी नमूनों के लिए उपलब्ध हैं।

5. डेटा विश्लेषण

  1. प्रकाशित जन स्पेक्ट्रा के लिए प्रत्येक चोटी के जन स्पेक्ट्रम की तुलना द्वारा या यदि उपलब्ध हो एक वाणिज्यिक पुस्तकालय खोज से लिपिड पॉलिएस्टर मोनोमर्स पहचानें।
  2. कुल वर्तमान आयन वर्णलेख में प्रत्येक की पहचान शिखर के लिए, जीसी / एमएस सॉफ्टवेयर (पूरक चित्रा 1) से एकीकरण परिणाम तालिका क्षेत्रों खोजने के लिए अपने-अपने अवधारण समय का उपयोग करें।
  3. प्रत्येक मोनोमर (स्तंभों एबी) के लिए है, जो monomers के Excel तालिका (पूरक फ़ाइल 2, कॉलम सीएफ) में नमूना दोहराने हर के लिए इसी स्तंभ के लिए एकीकरण तालिका (पूरक चित्रा 1, स्तंभ डी) में पाया क्षेत्र मूल्यों को जोड़ने एक स्प्रेडशीट एराबिडोप्सिस यों कीcutin TMSI डेरिवेटिव। Acetylated डेरिवेटिव बजाय तैयार कर रहे हैं, तो पूरक फ़ाइल 3 का प्रयोग करें।
  4. आईएस कॉलम (एच) के लिए आंतरिक मानकों (है) के क्षेत्रों में जोड़े। मोनोमर तालिका में मात्रा का ठहराव (बैंगनी-धूसरित कोशिकाओं के लिए है के रूप में 0 फेम (IS1); पूरक: उन लोगों के, अर्थात् फैटी एसिड मिथाइल एस्टर derivatized नहीं कर रहे हैं कि मोनोमर्स (fames), और dicarboxylic एसिड डाइमिथाइल एस्टर (डीसीए DMEs) के लिए, 17 का उपयोग फ़ाइलें 2/3)। प्राथमिक एल्कोहल, ferulic एसिड और ω हाइड्रोक्सी एसिड, सहित hydroxylated मोनोमर्स, 15 का उपयोग करें: यौगिक मात्रा का ठहराव के लिए पसंद की है के रूप में 0 से 15 हाइड्रोक्सी फेम (IS2) (मोनोमर तालिका में हरे-shadded कोशिकाओं, 2/3 पूरक फ़ाइलें) ।
  5. प्रत्येक के लिए सूखी पत्ती वजन जोड़ें स्तंभों को दोहराने कुल्हाड़ी-बीए (पूरक फ़ाइल 2) या AQ-एटी (पूरक फ़ाइल 3); वैकल्पिक रूप से, की प्रति इकाई मोनोमर भार व्यक्त करने के लिए सतह क्षेत्रों की गणना और मोनोमर मेज पर क्षेत्र मूल्यों को जोड़ने के पत्ते स्कैनसतह क्षेत्र।

Representative Results

। इस पांडुलिपि में वर्णित प्रोटोकॉल 1 चित्रा गैर cutin लिपिड 10 के योगदान को कम करने, (।, cutin या suberin यानी) लिपिड पॉलिएस्टर मोनोमर्स का निर्धारण करने के लिए स्थापित कुल मिलाकर 8 के बीच लेता है, जो परख के एक सिंहावलोकन प्रस्तुत है - 10 दिन (जीसी डेटा प्राप्त करने के लिए प्रारंभिक ऊतक कटाई से), सूखे के लिए अनुमति दी जाती है कि कितने समय तक नमूनों पर निर्भर करता है।

चयनित आधार उत्प्रेरित methanolysis (चित्रा 2) पॉलिस्टर्स depolymerize करने के लिए विधि पहले cutin और suberin दोनों होते हैं, जो Arabidopsis बीज, के लिए मान्य किया गया था। ऊतकों पहले homogenized और विस्तृत रूप से विलायक निष्कर्षण लिपिड को दूर करने के delipidated कर रहे हैं। निकासी के बाद छाछ उपज, प्रारंभिक ताजा वजन के प्रतिशत के रूप में, ए के लिए आम तौर पर 6% है thaliana कर्नल -0 पत्ते। सेल की दीवार समृद्ध अवशेषों एक निर्वात desiccator में सूखे और फिर से उनके घटक मिथाइल एस्टर मोनोमर्स में depolymerized रहे हैंआधार उत्प्रेरित transmethylation। दो घंटे ऊष्मायन उचित depolymerization और लिपिड पॉलिएस्टर घटकों की वसूली के लिए आवश्यक महत्वपूर्ण समय के रूप में चुना गया था। अब ऊष्मायन समय 2-हाइड्रोक्सी एसिड में वृद्धि हुई; इन संभावित झिल्ली sphingolipids 10 से निकाले जाते हैं।

हे -TMSi ईथर डेरिवेटिव (चित्रा 3) और हे -acetyl डेरिवेटिव (चित्रा 3 बी) के लिए एराबिडोप्सिस जंगली प्रकार पत्ती के cutin 3 चित्र में दिखाया गया है कि अगर एक ठेठ वर्णलेख। प्रत्येक चोटी साहित्य 7,8 और 12 हमारे वीडियो प्रोटोकॉल TMSI डेरिवेटिव तैयार करने के लिए कैसे पता चलता है एक सार्वजनिक डेटाबेस से जन स्पेक्ट्रा की तुलना द्वारा की पहचान की थी, लेकिन नमूने वैकल्पिक हाइड्रॉक्सिल समूहों derivatize को acetylated जा सकता है। वे नैदानिक ​​जन स्पेक्ट्रा दे क्योंकि Silylated डेरिवेटिव पहचान प्रयोजनों के लिए अच्छे हैं। हालांकि, acetylated डेरिवेटिव और अधिक स्थिर हैं और एक अच्छा विकल्प silylation कोएक बार मोनोमर्स 10 पहचान की गई है। केवल जीसी लौ आयनीकरण डिटेक्टर (खूंटी) के लिए मिलकर किया है कि प्रयोगशालाओं में इस प्रोटोकॉल लागू करने में मदद करने के लिए, जीसी / खूंटी गुम्मट पत्ती के cutin monomers के और फैटी एसिड मिथाइल एस्टर मानकों का एक homolog श्रृंखला के लिए acetylated डेरिवेटिव के लिए इसी भी दिखाए जाते हैं निशान (पूरक चित्रा 4)।

इस विधि को गुणात्मक है और नमूने के बीच मात्रात्मक मतभेद, उत्परिवर्ती विश्लेषण के लिए इसलिए इसकी कीमत का पता लगाता है। व्यक्तिगत मोनोमर्स की मात्रा में नमूने के बीच मोनोमर बहुतायत की तुलना सक्षम करने, मात्रा का ठहराव के आंतरिक मानक पद्धति का उपयोग निर्धारित कर रहे हैं। यह शिखर आकार (कुल आयन मायने रखता है) पॉलिएस्टर में मोनोमर्स की दाढ़ अनुपात प्रतिबिंबित नहीं कर सकते हैं, हालांकि, स्पष्ट किया जाना चाहिए। हम फैटी एसिड मिथाइल एस्टर और TMSI डेरिवेटिव (पूरक फ़ाइल 1), या इक्का के रूप में एराबिडोप्सिस पत्ती के cutin में मोनोमर मात्रा की गणना करने के लिए monomers के संपादन योग्य टेबल सहित रहे हैं एल्कोहल की tyl डेरिवेटिव (पूरक फ़ाइल 2)। इन तालिकाओं के नमूने विभिन्न अंगों या पौधों की प्रजातियों से निकाले जाते हैं, तो अनुकूलित किया जाना पड़ सकता है।

एक उदाहरण के रूप में, हम का विश्लेषण किया है एराबिडोप्सिस थालिया ना कोलंबिया (कर्नल-0) जंगली प्रकार के पत्ते और CYP86A2 / ATT1 जीन, att1-1 (एम 1) और att1-2 के दो पहले से विशेषता अशक्त-उत्परिवर्ती alleles (एम -2 ) 13,14। CYP86A उपप्रजाति की साइटोक्रोम P450 monooxygenases ख्यात ω-oxydases सांकेतिक शब्दों में बदलना और suberin और cutin मोनोमर जैवसंश्लेषण में भाग लेते हैं। हमारे परिणाम (चित्रा 4) गुम्मट पत्तियों की तुलना में उत्परिवर्ती पत्तियों में तीन प्रमुख लिपिड मोनोमर्स के भार में महत्वपूर्ण कटौती प्रदर्शित करता है। 0, 18: 2, और 18: एंजाइम की भविष्यवाणी समारोह, 16 के साथ लगातार एक dicarboxylates विशेष att1 म्यूटेंट में प्रभावित हो रहे हैं।

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चित्रा लिपिड पॉलिएस्टर विश्लेषण के 1. अवलोकन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा NaOMe उत्प्रेरित transmethylation प्रतिक्रिया 2. तंत्र। न्युक्लेओफ़िलिक methoxide anions आसानी से फैटी एसिड मिथाइल एस्टर और alkoxide anions (बी) में विघटित होकर जो एक अस्थिर टेट्राहेड्रल मध्यवर्ती (ए), फार्म के लिए लिपिड पॉलिस्टर्स cabonyl कार्बन हमला। ये alkoxides संयुग्म कुर्सियां ​​हैं, और इस तरह अतिरिक्त depolymerization प्रतिक्रियाओं (सी) को बनाए रखने, catalytically सक्रिय methoxide anions regenerating, मेथनॉल के साथ प्रतिक्रिया। पानी में मौजूद है, तोप्रणाली है, यह सोडियम हाइड्रोक्साइड, अचल अवांछनीय मुक्त फैटी एसिड का उत्पादन करने के लिए एस्टर hydrolyses कि एक मजबूत आधार के रूप में करने के लिए सोडियम methoxide के साथ प्रतिक्रिया होगी। मिथाइल एसीटेट। प्रणाली (डी) के भीतर सोडियम हाइड्रॉक्साइड की थोड़ी मात्रा निकालने के लिए एक सह-विलायक 15 के रूप में जोड़ा गया है यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3। जंगली प्रकार Arabidopsis thaliana पत्ती के cutin monomers के प्रतिनिधि कुल आयन वर्णलेख। (ए) हे -trimethylsilyl (TMSI) आकाश और (बी) एसीटेट हाइड्रॉक्सिल डेरिवेटिव। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा Arabidopsis thaliana गुम्मट 4. cutin मोनोमर संरचना और CYP86A2 जीन की दो अशक्त उत्परिवर्ती alleles। (उत्परिवर्ती से 1 = att1-1; उत्परिवर्ती से 2 = att1-2) त्रुटि सलाखों (एन = 4) मतलब की मानक विचलन का प्रतिनिधित्व । © ब्लैकवेल प्रकाशन (2007) की अनुमति के साथ, 13 से अनुकूलित। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 1
जीसी / एमएस सॉफ्टवेयर से पूरक चित्रा 1. पीक एकीकरण परिणाम तालिका। पहचान monomers और आंतरिक मानकों के लिए इसी चोटियों उनकी retenti से पहचाने जाते हैं समय (स्तंभ सी) और क्षेत्र मूल्यों कॉलम में सारणीबद्ध रहे हैं पर डी इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
एराबिडोप्सिस cutin मोनोमर्स (हाइड्रोक्सी फैटी एसिड मिथाइल एस्टर की trimethylsilyl ईथर डेरिवेटिव) का पूरक फ़ाइल 2. टेबल। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
एराबिडोप्सिस cutin मोनोमर्स (हाइड्रोक्सी फैटी एसिड मिथाइल एस्टर की हे -acetyl डेरिवेटिव) का पूरक फ़ाइल 3. टेबल।कॉम / फ़ाइलें / ftp_upload / 53,386 / Supplemental_File_3_Cutin_template_Acetylated_derivatives.xlsx "लक्ष्य =" _blank "> इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
पूरक चित्रा 4. जीसी / के खूंटी निशान (एबी) फैटी एसिड मिथाइल एस्टर (प्रसिद्धि) प्रतिधारण सूचकांक मानकों (चोटियों प्रत्येक संतृप्त प्रसिद्धि श्रृंखला लंबाई के साथ चिह्नित कर रहे हैं); और (सी) ए acetylated thaliana गुम्मट पत्ती के cutin मोनोमर्स। 16: 0 फेम (1), ferulate (2), 18: 3 फेम (3), 18: 1/18: 2 fames (4), 18 (5), sinapate 0 प्रसिद्धि (6 चोटी पर संख्या के अनुरूप ), 16: 0 डीसीए (7), 16-ओह 16: 0 फेम (8), 18: 2 डीसीए (9), 18: 1 डीसीए (10) 18: 0 डीसीए (11), 18-ओह 18: 2 फेम (12), 18-ओह 18: 1 फेम (13), 20: 0 फेम (14), 10,16-diOH 16: 0 फेम (15), 24: 0 फेम (16)। डीसीए: dicarboxylic एसिड डाइमिथाइल एस्टर; फेम: फैटी एसिड मिथाइल एस्टर; IS1: आंतरिक मानक 1, 17: 0 प्रसिद्धि; IS2: आंतरिक सेंटandard 2, 15, ओह 15: 0 प्रसिद्धि। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

इस तरह के डीएनए और प्रोटीन के रूप में अन्य biopolymers के विपरीत, संयंत्र लिपिड पॉलिस्टर्स एक टेम्पलेट से नहीं बने हैं। इसके बजाय, उनकी रचनाओं इन बाह्य पॉलिमर बनाने कि ऊतकों में मौजूद एंजाइम की विशिष्टता पर निर्भर करते हैं। इस तरह, रासायनिक घटक के विश्लेषण के रूप में घटकों लिपिड पॉलिएस्टर संरचना को समझने के लिए महत्वपूर्ण हैं।

एस्टर बांड फोड़ना रासायनिक विधियों साबुन बनाने का काम, hydrogenolysis, एसिड उत्प्रेरित transmethylation, और आधार उत्प्रेरित transmethylation 2 शामिल हैं। उनमें से प्रत्येक फायदे और नुकसान है। साबुन बनाने का काम माध्यमिक प्रतिक्रियाओं से गुजरना कर सकते हैं कि मुक्त फैटी हाइड्रोक्सी एसिड पैदा करता है। लिथियम एल्यूमीनियम हाइड्राइड साथ Hydrogenolysis (LiAlH 4) 16 cutin विश्लेषण 7 के लिए इस्तेमाल किया गया है। Hydrogenolysis एल्कोहल को क्रियाशील कार्बन कम करता है और मूल संरचनाओं लिथियम एल्यूमीनियम deuteride (LiAlD 4) के साथ deuteriolysis से अनुमान लगाया जा करने की जरूरत है।इस दृष्टिकोण का नुकसान उनके ढांचे का कार्य करने के लिए प्राप्त फैटी polyols के deuteriation की डिग्री की तुलना करने के लिए उच्च संकल्प जीसी / एमएस की आवश्यकता है। Methanolic बोरान trifluoride (बीएफ 3) के साथ एसिड उत्प्रेरित transesterification अक्सर cutin और suberin depolymerizations 8,17,18 में इस्तेमाल किया गया है, लेकिन अभिकर्मक एक सीमित शैल्फ जीवन है और प्रतिक्रियाओं 15 पक्ष की वजह से कलाकृतियों को पेश हो सकता। Methanolic सल्फ्यूरिक एसिड भी अन्य तरीकों 10 की तुलना में, मोनोमर्स की लेकिन शायद सच लिपिड पॉलिएस्टर घटक नहीं हैं, जो 2-हाइड्रोक्सी फैटी एसिड का बड़ा अनुपात, साथ मिथाइल एस्टर अर्जित करता है।

इस प्रोटोकॉल में वर्णित NaOMe उत्प्रेरित transesterification विधि पहचान के लिए विशेषता जन स्पेक्ट्रा प्रदान करने, हाइड्रॉक्सिल समूहों के silylation द्वारा derivatized कर रहे हैं कि फैटी एसिड मिथाइल एस्टर पैदा करता है, या एसिटिलीकरण द्वारा लिए हाइड्रॉक्सिल समूहों के अधिक स्थिर डेरिवेटिव प्रदान करने के लिएआर मात्रा। इस तकनीक का एक दोष यह है कि पानी की प्रतिक्रिया में मौजूद है जब हाइड्रोलिसिस transesterification के साथ प्रतिस्पर्धा है। जल NaOMe (उत्प्रेरक) के साथ प्रतिक्रिया करता है और बदले में मुक्त एसिड (चित्रा 2 डी) उपज के लिए फैटी एसिड मिथाइल एस्टर hydrolyses जो NaOH, पैदा करता है। इस प्रकार के विश्लेषण उलझी एक मिथाइल एस्टर और एक TMSI एस्टर व्युत्पन्न: दो चोटियों प्रत्येक फैटी एसिड के लिए उपस्थित होना होगा क्योंकि यह एक अवांछनीय पक्ष की प्रतिक्रिया है। निर्जल अभिकर्मकों का उपयोग और साबुन बनाने का काम के साथ प्रतिस्पर्धा करने के लिए एक सह विलायक के रूप में मिथाइल एसीटेट जोड़ने हाइड्रोलिसिस (चित्रा 2 डी) को रोकने के लिए इस प्रकार महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं।

Cutin और suberin 1 और 26% ग्लिसरॉल 4 के बीच होते हैं। हालांकि, इस मोनोमर इस प्रोटोकॉल में वर्णित प्रयोगात्मक शर्तों से पता नहीं होगा। ग्लिसरॉल फैटी एसिड मिथाइल एस्टर मोनोमर्स के विपरीत, जलीय विलायक वाशिंग चरणों के दौरान ही समाप्त हो जाएगी, अत्यधिक हाइड्रोफिलिक है और। इस सीमा को भी एकअन्य cutin depolymerization तरीकों, लेकिन ग्लिसरॉल को pplies एक enzymatic विधि का उपयोग transesterification के बाद प्राप्त जलीय परत में निर्धारित किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, यह मामूली शर्तों का उपयोग मात्रा निर्धारित किया जा सकता है (उदाहरण के लिए।, 0.05 एम NaOMe) आगे पानी निकासी के बिना सभी मोनोमर्स पता लगाने के लिए, ग्लिसरॉल मात्रा का ठहराव के प्रयोजन के लिए .Although उपयोगी ग्लिसरॉल 19,20 सहित हल्के शर्तों आमतौर पर cutin की अधूरी depolymerization देने के लिए और suberin।

एक लौ आयनीकरण डिटेक्टर (खूंटी) के लिए मिलकर एक जीसी उपलब्ध है, तो एक प्रतिनिधि नमूने की चोटियों जीसी / एमएस द्वारा पहचान की गई है, के बाद सभी प्रतिकृति, मात्रात्मक प्रयोजनों के लिए इस यंत्र में विश्लेषण किया जा सकता है। उनके बनाए रखने के सूचकांकों में जाना जाता है, तो वैकल्पिक रूप से, जीसी / खूंटी निशान में मोनोमर्स पहचाना जा सकता है। लौ आयनीकरण डिटेक्टर बड़ी और छोटी नमूना घटकों की मात्रा का ठहराव के लिए महत्वपूर्ण है, जो विशेष रूप से उच्च संवेदनशीलता और समानता का एक व्यापक रेंज है,एकल रन में। इसके अलावा, यह मजबूत करने और बनाए रखने और 15 आसान काम है।

वर्णित प्रोटोकॉल एक या एक से अधिक लिपिड पॉलिएस्टर मोनोमर्स की संरचना में अलग है कि म्यूटेंट के रासायनिक लक्षण वर्णन अनुमति देता है, संयंत्र लिपिड पॉलिएस्टर monomers के विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत अलगाव, पहचान, और मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है। प्रक्रिया यह आसानी से जड़ें, बीज, पत्ते, तने और फूल सहित विभिन्न संयंत्र सामग्री के छोटे और थोक दोनों मात्रा पर कार्रवाई करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता, स्केलेबल है। कई प्रजातियों से लिपिड पॉलिएस्टर monomers के मास वर्णक्रमीय डेटा, 21-26। उदाहरण के लिए प्रकाशित और अन्य ऊतकों और / या प्रजातियों के लिए इस प्रोटोकॉल के अनुकूल ढालने जब ​​अज्ञात मोनोमर्स की पहचान के लिए बहुमूल्य संसाधनों का गठन कर दिया गया है। इस विधि उच्च पौधों में लिपिड पॉलिस्टर्स जैवसंश्लेषण, विनियमन, और वितरण की जांच के लिए लागू है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
2-propanol Fisher Scientific BPA451-4 Solvent for delipidation
Anhydrous sodium sulfate Fisher Scientific S421500
Acetic anhydride Sigma Aldrich 320102 Derivatization agent
BSTFA (N,O-bis(trimethylsilyl)-trifluoroacetamide) Sigma-Aldrich 15222 Derivatization agent
Butylated hydroxytoluene (BHT) Sigma-Aldrich 101162 Antioxidant
Calcium chloride, anhydrous Fisher Scientific C614-3 Desiccation agent
Calcium suflate, anhydrous (DRIERITE- 8 MESH with indicator) Acros Organics 219090020 Desiccation agent
Chloroform (Trichloromethane) Fisher Scientific C6074 Organic solvent
Glacial acetic acid Fisher Scientific BP2401212 Acidification agent
Helium carrier gas, compressed Air Liquide ALPHAGAZ1-UN1046 Carrier gas, GC/MS
Heptane Fisher Scientific H3501 Organic solvent
Hexanes Fisher Scientific H3024 Organic solvent
Methanol Fisher Scientific A4124 Organic solvent, transmethylation reactive
Methyl acetate Sigma-Aldrich 296996 Organic solvent
Methyl heptadecanoate Sigma-Aldrich H4515 Internal standard (1mg/mL stock)
Methylene dichloride (Dichloromethane) Fisher Scientific D374 Organic solvent
Nitrogen, compressed Air Liquide ALPHAGAZ1-UN1044 Carrier gas, GC-FID
Pentadecanolactone Fluka 76530 Internal standard (1 mg/ml stock)
Pyridine Sigma-Aldrich 270970 Co-solvent for derivatization
Sodium chloride Fisher Scientific BP358212 Saline solution
Sodium methoxide (25wt.%) Sigma-Aldrich 156256 Nucleophile
Toluene FIsher Scientific T2904 Organic solvent
Plant Growth Supplies
Pro-Mix PGX Premier Tech Horticulture Ltd Pro-Mix PGX is recommended to grow Arabidopsis plants (Eddy, R. and Hahn, D.T., 2012,http://docs.lib.purdue.edu/pmag/2)
Purdue Methods for Arabidopsis Growth. 
PermaNest Humidity Dome  Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN  GD2211-24
Perma-Nest Plant Trays (22x11in) Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN  N/A
Square greenhouse pots, 3.5 inch  Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN  P86
General Purpose Plant Fertilizer, Plant-Prod 20-20-20 Premier Tech Home and Garden In., Brantford, ON N/A
Glassware
13 x 100 mm glass test tube with Teflon-faced screw cap Kimble Chase Life Science and Research Products LLC 45066A-13100
16 x 125 mm glass test tube with Teflon-faced screw cap Kimble Chase Life Science and Research Products LLC 45066A-16125
20 x 125 mm glass test tubes with Teflon-faced screw cap Kimble Chase Life Science and Research Products LLC 45066A-20125
GC vial caps National Scientific C400051A
GC vial microinserts National Scientific C4011631
GC vials National Scientific C40001
Disposable pasteur pipets Fisher Scientific 1367820B
Flasks Fisher Scientific
Equipment
Allegra X15R centrifuge Beckman Coulter
Analytic balance Fisher Scientific
Belly dancer A shaker can be used for this purpose if Belly Dancer not available
DB-5 Capillary GC column J&W Scientific, CA, USA;  30 m x 0.25 mm x 0.25 μm film thickness
Desiccator
Isotemp 202 water bath Fisher Scientific
ISQ LT single quadupole mass spectrometer Thermo Scientific
Heat block Fisher Scientific
Nitrogen evaporator
Polytron homogenizer Birkmann
Trace 1300 gas chromatograph Thermo Scientific
Two-stage regulator Air Liquide Q1-318B-580
Vacuum desiccator Fisher Scientific
Vortex mixer Fisher Scientific

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References

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प्लांट बायोलॉजी अंक 105, लिपिड पॉलिएस्टर छल्ली cutin स्निग्ध मोनोमर्स म्यूटेंट suberin गैस क्रोमैटोग्राफी / मास स्पेक्ट्रोमेट्री
संयंत्र छल्ली लिपिड पॉलिएस्टर monomers के अलगाव और compositional विश्लेषण
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Jenkin, S., Molina, I. Isolation and … More

Jenkin, S., Molina, I. Isolation and Compositional Analysis of Plant Cuticle Lipid Polyester Monomers. J. Vis. Exp. (105), e53386, doi:10.3791/53386 (2015).

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