Introduction
צמחים עילאיים להסתמך על שכבות תאיים המתפקדות כמחסומים עמידים למים בין רקמות צמח והסביבה החיצונית. המבנים הקשורים קיר תא lipophilic אלה מגבילים את הזיהום פתוגניים ולהסדיר את התחבורה הפסיבית של גזים, מים, וחומרים מומסים ובמתוך רקמות צמח 1. מחסומים כאלה הם ציפורן הצמח, מבנה synapomorphic ייחודי לצמחים 2, ומחסומי דיפוזיה המכיל שַׁעֲמָן שונים. הציפורן היא שכבת oleophilic המסונתזת על ידי תאי האפידרמיס וחייבת אותם באמצעות שכבת pectinaceous בצד תאי של דופן התא 3-5. זה סוגר את האיברים אוויריים העיקריים של צמחים גבוהים יותר, המתפקד כממשק חיוני בין רקמות צמח והסביבה.
Cutin, המטריצה המבנית של הציפורן, ושַׁעֲמָן שני פוליאסטר glycerolipid מסיס הקשורים שעוות ממס נשלף 2,4. l פולימרים אלהipids מורכב של נגזרי חומצת שומן רוויים ובלתי רוויים והם גם מבני ותפקודי דומים. עם זאת, הם נבדלים על ידי הבדלים אופייניים באתרי הרכב ותצהיר כימיים.
שַׁעֲמָן הוא פוליאסטר אליפטי הממוקם בתוך קירות התא של רקמות פנימיות וחיצוניות מסוימות ויוצרות קיר המשני. רקמות Suberized כוללות periderms של שורשים, פקעות וקליפת עץ, endodermis שורש, שכבות מעיל זרע, ופצעים הגלידו 2. שלא כמו cutin, פוליאסטר שַׁעֲמָן בדרך כלל מכיל אלכוהול, רווי וחומצות dicarboxylic מונו-בלתי רווי, וחלק גדול ממונומרים מאוד ארוכת-שרשרת (C≥20).
Cutin הוא פוליאסטר שומנים הנפוץ ביותר בצמחים עילאיים 6, והוא מורכב מגליצרול ונגזרי חומצת שומן interesterified C16-C18, כגון חומצות שומן-אפוקסי הידרוקסי הידרוקסי והוחלף 4. בעוד ההרכב של פולימרים cutinמשתנה בין מיני tracheophyte, מונומרים העיקריים השולט ביותר הם 10, 16-dihydroxy 16: 0,-9,10-אפוקסי 18-הידרוקסי 18: 0, ו9,10,18-trihydroxy 18: 0 חומצות שומן. מעניין לציין, עלה ארבידופסיס ונובע cutin מורכב בעיקר של 18: 2 חומצת dicarboxylic 7,8.
שורש צמח גם להציג שונות ניכר בעובי, החל כמה ננומטרים לכמה מיקרומטרים 9. מאז בידוד ציפורן הוא צעד מייגע וגוזל זמן, במיוחד לעור קרני עלה דק מאוד כמו אלה של thaliana ארבידופסיס 8, שיטות העוקפות בידוד ציפורן פותחו ומאומתים 7,8. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט ללמוד הקומפוזיציה מונומר של cutin בעלי thaliana ארבידופסיס ידי methoxide נתרן (NaOMe) depolymerization -catalyzed וגז כרומטוגרפיה הבאה / ספקטרומטר מסה (GC / MS) ניתוח. פרוטוקול זה מציע שיטה חזקה למנסה לאמוד את שיתוףmposition של פוליאסטר שומנים צמח ברקמות delipidated כל, והותאם מפרוטוקולים שדווחו בעבר 7,10,11. דגימות רקמה שלמות הן ראשון הומוגני וממצה delipidated, הסרת שומני ממס לחילוץ כולל cuticular ושעוות epicuticular, שומני קרום, וtriacylglycerols. אז שאריות מועשרות קיר תא depolymerized למונומרים התיל אסטר המרכיבים אותן על ידי methanolysis-זרז methoxide נתרן. אסטרים מתיל חומצת שומן מופקים על החמצה, וderivatized להשיג נגזרי trimethylsilyl או אצטיל המקביל שלהם. שאריות derivatized תנודתיות מאוד, ויכולות להיות eluted מעמודת גז כרומטוגרפיה בטמפרטורה סבירה מבלי לשנות קונפורמציה המבנית שלהם במהלך ניתוח GC / MS.
Protocol
הערה: פרוטוקול זה הותאם מאל Bonaventure et. (2004), מולינה et al. (2006), לי ואח '. (2013) 7,10,11. צעדים 1-5 מסוכמים באיור 1.
Delipidation 1. רקמות
הערה: תמיד לשטוף את כל כלי הזכוכית וכובעים עם כלורופורם, ומאפשר לי יבש מתחת למכסת מנוע קטר, לפני השימוש.
זהירות: בצע הומוגניזציה רקמות וכל שלבי העברת הממס תחת מכסה המנוע קטר; תמיד לובשים מעיל, כפפות מעבדה ומשקפי בטיחות סנסציה כדי למנוע מגע ישיר עם כימיקלים וכדי להגן על הדגימות מזיהום.
- אמבטיה מחממים מים ולחסום חום עד 85 מעלות צלזיוס.
- שוקל כ 0.5 גרם של כל דגימת עלה לתוך צינורות 20 מ"מ-שקל מראש x 125 מ"מ מבחן זכוכית עם polytetrafluoroethylene פקקי הברגה (PTFE) -faced. כולל ארבעה חזרות לדגימה.
- מקום 2-propanol בארלנמייר (כ 125 מיליליטר, 25 מיליליטר לגרם של SAMPle). להוסיף 2,6-די-טרט-בוטיל-4-methylphenol (הידוע גם בhydroxytoluene butylated, BHT) לריכוז סופי של 0.01% (w / v).
הערה: הוסף BHT מ% 5 (w / v) פתרון מניות במתנול (BHT מסייע למזער חמצון של חומצות שומן בלתי רוויות). - פתרון מחממים 2-propanol עד 85 מעלות צלזיוס באמבט מים.
- להוסיף 12 מיליליטר ממס 2-propanol חם על צינור אחד מדגם וחום במשך 15 דקות על 85 מעלות צלזיוס בגוש חום. צעד זה מנטרל lipases שעשוי להשתחרר מהתאים שיבשו.
- בואו צינורות להתקרר לטמפרטורת חדר ולטחון רקמה ביסודיות עם homogenizer עד השעיה הומוגנית מתקבלת.
- מניחים את הדגימות בייקר מסלולית וללחוץ במשך 1-2 שעות ב 100 סל"ד וטמפרטורת חדר.
- צנטריפוגה למשך 10 דקות ב 800 XG ולהשליך supernatant.
- הוסף נפח שווה של 2-propanol ולנער במשך 12 שעות בטמפרטורת חדר.
- צנטריפוגה למשך 10 דקות ב 800 XG ולהשליך supernatant.
- להוסיף 12 מיליליטר CH3 Cl: CH 3 OH (2: 1, נ / V) לשאריות (25 מיליליטר לגרם של מדגם) ולנער לילה ב 100 סל"ד וטמפרטורת חדר.
- צנטריפוגה למשך 10 דקות ב 800 XG ולהשליך supernatant.
- להוסיף 12 מיליליטר CHCl 3: CH 3 OH (1: 2, נ / V) לשאריות ולנער לילה ב 100 סל"ד וטמפרטורת חדר.
- צנטריפוגה למשך 10 דקות ב 800 XG ולהסיר ממס.
- בואו דגימות יבשות מתחת למכסת מנוע קטר הלילה בטמפרטורת חדר.
- האוויר יבש השאריות ולאחר מכן למקם בייבוש ואקום מעל CaCl נטול מים 2 או 4 קאסו עד שהגיע למשקל קבוע (3-5 ימים).
2. Depolymerization: Methanolysis עם נתרן methoxide (איור 2)
זהירות: בצע צעדים 2.3-2.4, 2.7-2.8, 2.10-2.11, 2.13-2.15 ו2.17-2.18 מתחת למכסת מנוע קטר; תמיד לובשים מעיל, כפפות מעבדה ומשקפי בטיחות סנסציה.
- גוש חום מחממים עד 60 מעלות צלזיוס.
- לשקול מבחנות המכילות שאריות יבשות (חשובות לחישובים נוספים).
- להוסיף תקנים פנימיים על צינור אחד: 25 heptadecanoate ωL תיל (1 מ"ג / מיליליטר מניות) וω-pentadecalactone 25 μl (1 מ"ג / מיליליטר מניות).
- להוסיף 0.9 מיליליטר אצטט מתיל, 1.5 methoxide מיליליטר נתרן, ושל 3.6 מיליליטר מתנול על צינור אחד וכובעם. לחלופין, להכין תערובת תגובה עם שלושת ריאגנטים אלה ולהוסיף aliquots 6 מ"ל לכל דגימה.
- דגימות חום למשך 2 שעות ב 60 ° C ומערבולת מעת לעת במרווחים של 15 דקות.
- בואו דגימות להתקרר לטמפרטורת חדר.
- להוסיף 10 מיליליטר של dichloride תילן (CH 2 Cl 2) ושל 1.5 מיליליטר של חומצה אצטית קרחונית כדי לחלץ את אסטרים מתיל חומצת שומן.
- להוסיף תמיסת מלח (0.5 M NaCl) למלא כל צינור וכובע.
- דגימות מערבולת דקות 1 ו צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 800 x גרם.
- מעבירים את השלב האורגני (נמוך) כדי לנקות צינורות בגודל בינוניים (16 x 125 מבחנות זכוכית מ"מ עם פוליtetrafluoroethylene כובע בורג -faced (PTFE)).
- להוסיף תמיסת מלח (0.5 M NaCl) למלא כל צינור וכובע.
- דגימות מערבולת דקות 1 ו צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 800 x גרם.
- הסר שלב המימי (עליון) וחזור על שלבים 2.11-2.12.
- הסר את כל השלב המימי (העליון).
- להוסיף סולפט נטול מים נתרן (Na 2 SO 4) לממס, מכסה את הצינורות, ומערבולת דקות 1; דגימות יכולות עכשיו להיות שנותרו עד היום הבא. בניתן להשאיר דגימות שלב זה הלילה מתחת למכסת מנוע קטר.
- צנטריפוגה למשך 2 דקות ב 800 XG קומפקטי מלח Na 2 SO 4 בתחתית.
- מעבירים את השלב האורגני לצינור חד פעמי זכוכית קטנה (13 x 100 מבחנות זכוכית מ"מ עם polytetrafluoroethylene (כובע בורג -faced PTFE)).
- להתאדות הממס ליובש תחת חנקן ולהמשיך לשלב derivatization. אם לא מעובד באופן מיידי, החנות התאדתה דגימות ב -20 ° C (דגימות יכולות להיותמאוחסן הסימפונית לפני שלב האידוי).
3. הכנה של נגזרים עבור גז כרומטוגרפיה
זהירות: בצע את השלבים 3.1.2 ו3.1.5 - 3.1.8 מתחת למכסת מנוע קטר; תמיד לובשים מעיל, כפפות מעבדה ומשקפי בטיחות סנסציה.
- נגזרי Trimethylsilyl
- גוש חום מחממים עד 100 מעלות צלזיוס.
- להוסיף של פירידין 100 μl ושל BSTFA (N, O Bis-trimethylsilyl-trifluoroacetamide) 100 μl לכל צינור ומכסה אותם.
- דגימות חום של 100 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
- בואו דגימות להתקרר לטמפרטורת חדר.
- להתאדות דגימות תחת חנקן בטמפרטורת חדר. הימנעו הפעלת חום לדגימות, מונומרים תנודתיות מאוד בשלב זה.
- הוסף 500 μl של 1: 1 (V / V) heptane: טולואן.
- דגימות מערבולת דקות 1 ו צנטריפוגות במשך 2 דקות ב 800 x גרם.
- להוסיף דוגמאות לבקבוקוני GC ולהמשיך GC ניתוח / MS.
- אצטילנגזרים
הערה: acetylation, לשנות צעדים 3.1.1-3.1.3 לעיל כדלקמן (לא מוצג בוידאו); צעדים 3.1.4-3.1.8 זהים:- גוש חום מחממים עד 60 מעלות צלזיוס.
- להוסיף של פירידין 100 μl ושל אנהידריד אצטית 100 μl (AC 2 O) לצינורות.
- דגימות חום שעה 1 ב 60 ° C.
4. GC / MS ניתוח
- השתמש בעמודת נימים HP-5 (30 0.25 מ"מ x 0.25 עובי MX מיקרומטר סרט) או (כלומר., Diphenyl 5%, polysiloxane דימתיל 95%) שווה ערך. תכנית GC עם זרימת ספק הליום גז שנקבעה ברמה של 1.5 מיליליטר / דקה וטמפרטורת תנור המתוכנת 150-300 מעלות צלזיוס ב 3 מעלות צלזיוס / דקה.
- השתמש בהזרקת פיצול (01:10 יחס פיצול) וספקטרומטר מסה מוגדר לסריקת מצב על 40-600 האמו (יינון השפעת אלקטרונים).
- צור טבלת רצף כוללים ממס (ריק), WT ומשכפל מוטציה, כל שיטת ניתוח cutin באמצעות מצויינים.
- ממס עומסובקבוקוני מדגם על הקרוסלה, להוסיף הקסאן לבקבוקוני שטיפה-מזרק בautosampler במידת צורך, ולהתחיל את הרצף. לאחר הרצף הושלם, סך עקבות chromatogram היון זמינות עבור כל הדגימות.
ניתוח נתונים 5.
- לזהות מונומרים פוליאסטר שומנים על ידי השוואת הספקטרום ההמוני של כל שיא לספקטרום מסה שפורסם או על ידי חיפוש בספרייה מסחרית אם זמין.
- לשיא כל שזוהה בchromatogram הנוכחי היון הכולל, להשתמש הפעמים השמירה שלהם כדי למצוא את האזורים על שולחן תוצאות האינטגרציה מGC התוכנה / MS (איור משלימה 1).
- לכל מונומר (עמודות א.ב.), להוסיף את אזור הערכים נמצאו בטבלת האינטגרציה (איור 1 נוסף, עמודת D) לעמודה המתאימה לכל לשכפל מדגם בטבלת Excel של מונומרים (קובץ נוסף 2, טורי CF), שהוא גיליון אלקטרוני לכמת ארבידופסיסנגזרי cutin TMSi. השתמש בקובץ נוסף 3 אם נגזרי acetylated מוכנים במקום.
- הוסף את תחומי הסטנדרטים הפנימיים (IS) לעמודות (HK). לאלו מונומרים שאינם derivatized, אסטרים מתיל כלומר חומצות שומן (ג'יימס), ואסטרים דימתיל חומצת dicarboxylic (DCA DMEs), להשתמש 17: 0 תהילה (IS1) כלכימות (תאים מוצלים סגולים בטבלת מונומר; נוסף קבצי 2/3). למונומרים hydroxylated, כוללים אלכוהול ראשוני, חומצת ferulic וחומצות ω-הידרוקסי, להשתמש 15: 0 FAME 15 הידרוקסי-(IS2) כבחירה לכימות מתחם (תאים-shadded ירוקים בטבלת מונומר; משלימה קבצי 2/3) .
- להוסיף משקל עלה יבש לכל לשכפל לעמודות AX-תואר ראשון (קובץ נוסף 2) או AQ-AT (קובץ נוסף 3); לחלופין, לסרוק עלים לחשב שטח פנים ולהוסיף ערכי שטח לשולחן מונומר להביע המון מונומר ליחידהשטח פנים.
Representative Results
הפרוטוקול המתואר בכתב היד הזה הוא להגדיר כדי לקבוע מונומרים פוליאסטר שומנים, צמצום התרומות של שומנים שאינם cutin 10 איור 1 מציג סקירה של assay, שלגמרי לוקח בין 8 (כלומר, cutin או שַׁעֲמָן.) -. 10 ימים (מקצירת רקמה ראשונית לקבלת נתונים GC), תלוי כמה זמן דגימות להתייבש.
Methanolysis נבחר-זרז הבסיס (איור 2) השיטה לdepolymerize פוליאסטר קבלה תוקף בעבר לזרעי ארבידופסיס, המכילים שני cutin ושַׁעֲמָן. רקמות ראשונות הומוגני וממצות delipidated כדי להסיר שומני ממס שניתן להפיק. תשואת השאריות לאחר חילוץ, כאחוז ממשקל הטרי ראשוני, היא בדרך כלל 6% לא thaliana Col-0 עלים. שאריות מועשרות קיר תא מיובשות בייבוש ואקום ולאחר מכן depolymerized למונומרים התיל אסטר המרכיבים אותן על ידיזרז-בסיס transmethylation. דגירה של שעות נבחרה כזמן הקריטי הנדרש לdepolymerization והתאוששות של רכיבי פוליאסטר שומנים נכונים. פעמים דגירה כבר הביאו לעלייה בחומצות 2-הידרוקסי; אלה שעלולים לנבוע מsphingolipids קרום 10.
Chromatogram טיפוסי אם cutin עלה סוג בר ארבידופסיס מוצג באיור 3, לנגזרי O -TMSi אתר (איור 3 א) ונגזרי -acetyl O (איור 3). שיא כל זוהה על ידי השוואה לספקטרום המוני מהספרות 7,8 ומאגר נתונים ציבורי 12 פרוטוקול וידאו .our מראה כיצד להכין נגזרי TMSi, אבל לחלופין ניתן acetylated דגימות לderivatize קבוצות הידרוקסיל. נגזרי Silylated טובים למטרות זיהוי משום שהם נותנים ספקטרום המוני אבחון. עם זאת, נגזרי acetylated הם יציבים יותר ואלטרנטיבה טובה לsilylationמונומרים פעם זוהו 10. (איור נוסף כדי לעזור ליישם פרוטוקול זה במעבדות שרק לי GC מצמידים את גלאי יינון להבה (FID), GC / FID עקבות מתאים לנגזרי acetylated של מונומרים cutin עלה WT ולסדרת הומולוג של סטנדרטים תיל אסטר חומצת שומן מוצג גם 4).
שיטה זו היא איכותית ומזהה הבדלים כמותיים בין דגימות, ומכאן הערך שלה עבור ניתוח שעבר מוטציה. הכמויות של מונומרים פרט נקבעות תוך שימוש בשיטה סטנדרטית הפנימית של כימות, המאפשרת השוואות של שפע מונומר בין דגימות. יובהר, עם זאת, כי גודל השיא (סה"כ ספירת יון) עלול שלא לשקף יחסים הטוחנות של מונומרים בפוליאסטר. אנו כוללים שולחנות עריכה של מונומרים לחשב כמויות מונומר בcutin עלה ארבידופסיס כאסטרים של חומצות שומן מתיל ונגזרי TMSi (קובץ נוסף 1), או אס נגזרי Tyl (קובץ נוסף 2) של אלכוהול. לוחות אלה ייתכן שיהיו צורך מותאם אם דגימות שחולצו מאיברים שונים או מיני צמחים.
ארבידופסיס תאליה na קולומביה כדוגמא, יש לנו ניתחתי (Col-0) עלים סוג בר ושני אללים null-המוטציה אפיינו בעבר את של גן CYP86A2 / ATT1, att1-1 (m-1) וatt1-2 (m-2 ) 13,14. monooxygenases ציטוכרום P450 של תת-משפחת CYP86A לקודד ω-oxydases המשוער ולהשתתף שבַׁעֲמָן וביוסינתזה מונומר cutin. התוצאות שלנו (איור 4) להפגין ירידה משמעותית בעומסים של שלושה מונומרים שומנים גדולים בעלי המוטציה בהשוואה לעלי WT. עולה בקנה אחד עם התפקוד של האנזים שחזה, 16: 0, 18: 2, 18 ו: 1 dicarboxylates הושפע במיוחד במוטציות att1.
"Src =" / קבצים / ftp_upload / 53,386 / /> 53386fig1.jpg "
איור 1. סקירה כללית של ניתוח פוליאסטר השומנים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. מנגנון של תגובת transmethylation זרז-NaOMe. אניוני methoxide nucleophilic לתקוף את הפחמן cabonyl של פוליאסטר שומנים כדי ליצור יציב tetrahedral ביניים (א), שמנתק קלות לאסטרים מתיל חומצת השומן ואניוני alkoxide (B). alkoxides אלה הם בסיסי המצומד, ומגיב עם מתנול, התחדשות אניוני methoxide catalytically הפעיל, ובכך לשמר את תגובות נוספות depolymerization (C). אם מים נמצאים במערכת, שהיא תגיב עם methoxide נתרן כדי ליצור סודיום הידרוקסיד, בסיס חזק שאופן בלתי הפיך hydrolyses אסטרים לייצר חומצות שומן חופשיות בלתי רצויות. מתיל אצטט נוסף כ-15 שיתוף הממס להסיר כמויות קטנות של נתרן הידרוקסידי בתוך המערכת (ד '). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. Chromatogram הנציג הכולל יון של מונומרים cutin עלה thaliana ארבידופסיס wild-type. (א) אתר O -trimethylsilyl (TMSi) ו- (ב) נגזרי הידרוקסיל אצטט. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. הרכב Cutin מונומר של WT thaliana ארבידופסיס ושני אללים המוטציה null של גן CYP86A2. (מוטציה-1 = att1-1; מוטציה-2 = att1-2) ברים שגיאה מייצגים סטיית התקן של הממוצע (n = 4) . מעובד מתוך 13, באישור © לקוול ההוצאה לאור (2007). לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור נוסף טבלת 1. שיא תוצאות האינטגרציה מGC התוכנה / MS. פסגות המתאימות מונומרים מזוהים וסטנדרטים פנימיים מזוהות על ידי retenti בזמן (העמודה C) וערכי אזור הם נספר בטור ד 'אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
קובץ 2. טבלה נוספת של מונומרים ארבידופסיס cutin (נגזרי אתר trimethylsilyl של אסטרים תיל חומצת שומן הידרוקסי). אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
קובץ 3. לוח נוסף של מונומרים ארבידופסיס cutin (נגזרי -acetyl O של אסטרים תיל חומצת שומן הידרוקסי).com / קבצים / ftp_upload / 53,386 "target =" / Supplemental_File_3_Cutin_template_Acetylated_derivatives.xlsx _ blank "> אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
GC איור 4. נוסף / עקבות FID של (AB) תיל אסטר חומצת שומן (תהילה) סטנדרטים מדד שימור (פסגות מסומנות עם כל אורך שרשרת FAME רווי); ו- (ג) acetylated א מונומרים cutin עלה WT thaliana. מספרים בשיא מתאים ל: 16: 0 תהילה (1), ferulate (2), 18: 3 תהילה (3), 18: 1/18: 2 FAMEs (4), 18: 0 תהילה (5), sinapate (6 ), 16: 0 DCA (7), 16-OH 16: 0 תהילה (8), 18: 2 DCA (9), 18: 1 DCA (10) 18: 0 DCA (11), 18-OH 18: 2 תהילה (12), 18 18-OH: FAME 1 (13), 20: 0 תהילה (14), 10,16-diOH 16: 0 תהילה (15), 24: 0 תהילה (16). DCA: אסתר דימתיל חומצת dicarboxylic; תהילה: תיל אסטר חומצת שומן; IS1: תקן פנימי 1, 17: 0 תהילה; IS2: רח הפנימיandard 2, 15-OH 15: 0 תהילה. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
Discussion
שלא כמו biopolymers האחר כגון דנ"א וחלבונים, השומנים פוליאסטר צמח אינו עשוי מתבנית. במקום זאת, יצירותיהם תלויות בספציפית של האנזימים הנמצאים ברקמות שהופכות את הפולימרים תאיים אלה. ככזה, אנליזות כימיות של מרכיב רכיבים קריטיים להבין הרכב פוליאסטר שומנים.
שיטות כימיות לדבוק אג"ח אסתר כוללות סבון, hydrogenolysis, transmethylation-זרז חומצה, ו- זרז בסיס transmethylation 2. לכל אחד מהם יתרונות וחסרונות. סבון מייצר חומצות שומן חופשיות הידרוקסי שיכול לעבור תגובות המשניות. Hydrogenolysis עם ליתיום אלומיניום הידריד (4 LiAlH) 16 שמש במשך ניתוח cutin 7. Hydrogenolysis מפחית פחמנים פונקציונליות לאלכוהול והמבנים המקוריים צריכים להסיק על ידי deuteriolysis עם deuteride אלומיניום ליתיום (LiAlD 4).חסרון של גישה זו הוא הדרישה של GC / MS ברזולוציה גבוהה כדי להשוות את מידת deuteriation של polyols השומן שהושג לעשות משימות של המבנים שלהם. transesterification זרז-חומצה עם trifluoride ורון methanolic (BF 3) כבר בשימוש תכוף בdepolymerizations cutin ושַׁעֲמָן 8,17,18, אבל יש מגיב חיי מדף מוגבלים ועשוי להציג את החפצים בשל תופעות תגובות 15. חומצה גופרתית methanolic גם תשואות אסטרים מתיל של מונומרים אבל עם פרופורציות גדולות יותר של חומצות שומן 2-הידרוקסי, אשר ככל הנראה לא רכיבי פוליאסטר השומנים נכונים, בהשוואה לשיטות אחרות 10.
שיטת transesterification הזרז-NaOMe המתוארת בפרוטוקול זה מייצרת אסטרים מתיל חומצת השומן שderivatized על ידי silylation של קבוצות הידרוקסיל, מתן ספקטרום מסה אופייני לזיהוי, או על ידי acetylation לספק נגזרים יציבים יותר של קבוצות הידרוקסיל FOכימות r. חסרון אחד של שיטה זו הוא שהידרוליזה מתחרה עם transesterification כאשר המים נמצאים בתגובה. מים מגיבים עם NaOMe (הזרז) ומייצרים NaOH, אשר בתורו hydrolyses אסטרים מתיל חומצת שומן להניב חומצות חופשיות (איור 2 ד). זה צד תגובה רצויה משום ששתי פסגות תהיה נוכחת לכל חומצת שומן: תיל אסטר ונגזר אסתר TMSi, ובכך מסבכים את הניתוח. שימוש בחומרים כימיים נטול מים והוספה מתיל אצטט כשיתוף ממס להתחרות עם סבון הם צעדים חיוניים ובכך למנוע הידרוליזה (איור 2 ד).
Cutin ושַׁעֲמָן מכילים בין גליצרול 1 ו -26% 4. עם זאת, מונומר זה לא יזוהה על ידי תנאי הניסוי מתוארים בפרוטוקול זה. גליצרול הוא הידרופילי מאוד, ובניגוד למונומרים התיל אסטר חומצת שומן, יבוטל במהלך שלבי ממס השטיפה מימיים. מגבלה זו גםpplies לשיטות אחרות cutin depolymerization, אבל גליצרול ניתן לקבוע בשכבה המימית המתקבלת לאחר transesterification באמצעות שיטה האנזימטית. לחלופין, ניתן לכמת באמצעות תנאים מתונים יותר (לדוגמא., 0.05 M NaOMe) ללא מיצוי במים נוסף כדי לזהות את כל מונומרים, כולל גליצרול 19,20 .Although שימושי לצורך כימות גליצרול, תנאים קלים בדרך כלל לתת depolymerization שלם של cutin ו שַׁעֲמָן.
אם GC מצמידים את גלאי יינון להבה (FID) זמין, ניתן לנתח את כל משכפל במכשיר זה למטרות כמותי, אחרי פסגות של מדגם מייצג זוהו על ידי GC / MS. לחלופין, ניתן לזהות מונומרים בGC / עקבות FID אם ידועים מדדי שימורם. יש גלאי יינון הלהבה גבוהה במיוחד רגישות ומגוון רחב של מידתיות, שהוא קריטי לכימות של רכיבי מדגם גדולים והקטניםבריצות יחידה. בנוסף, הוא חזק וקל לתחזוקה ותפעול 15.
הפרוטוקול המתואר מאפשר הבידוד, זיהוי, וכימות אמין ושחזור של מונומרים פוליאסטר שומנים צמחיים, המאפשר אפיון הכימי של מוטציות שונות בהרכב של מונומרים פוליאסטר שומנים אחד או יותר. ההליך הוא מדרגי, זה יכול להתאים בקלות לעבד כמויות קטנות וכמות גדולות של חומרים צמחיים שונים, כוללים שורשים, זרעים, עלים, גבעולים ופרחים. נתוני רפאים המוניים של מונומרים פוליאסטר שומנים ממינים רבים שפורסמו לדוגמא., 21-26 ומהווים משאבים יקרי ערך כדי לזהות מונומרים ידועים מתי התאמת פרוטוקול זה לרקמות ו / או מינים אחרים. שיטה זו ישימה לחקירות של ביוסינתזה, רגולציה, וההפצה של פוליאסטר שומנים בצמחים גבוהים יותר.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| 2-propanol | Fisher Scientific | BPA451-4 | Solvent for delipidation |
| Anhydrous sodium sulfate | Fisher Scientific | S421500 | |
| Acetic anhydride | Sigma Aldrich | 320102 | Derivatization agent |
| BSTFA (N,O-bis(trimethylsilyl)-trifluoroacetamide) | Sigma-Aldrich | 15222 | Derivatization agent |
| Butylated hydroxytoluene (BHT) | Sigma-Aldrich | 101162 | Antioxidant |
| Calcium chloride, anhydrous | Fisher Scientific | C614-3 | Desiccation agent |
| Calcium suflate, anhydrous (DRIERITE- 8 MESH with indicator) | Acros Organics | 219090020 | Desiccation agent |
| Chloroform (Trichloromethane) | Fisher Scientific | C6074 | Organic solvent |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | BP2401212 | Acidification agent |
| Helium carrier gas, compressed | Air Liquide | ALPHAGAZ1-UN1046 | Carrier gas, GC/MS |
| Heptane | Fisher Scientific | H3501 | Organic solvent |
| Hexanes | Fisher Scientific | H3024 | Organic solvent |
| Methanol | Fisher Scientific | A4124 | Organic solvent, transmethylation reactive |
| Methyl acetate | Sigma-Aldrich | 296996 | Organic solvent |
| Methyl heptadecanoate | Sigma-Aldrich | H4515 | Internal standard (1mg/mL stock) |
| Methylene dichloride (Dichloromethane) | Fisher Scientific | D374 | Organic solvent |
| Nitrogen, compressed | Air Liquide | ALPHAGAZ1-UN1044 | Carrier gas, GC-FID |
| Pentadecanolactone | Fluka | 76530 | Internal standard (1 mg/ml stock) |
| Pyridine | Sigma-Aldrich | 270970 | Co-solvent for derivatization |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358212 | Saline solution |
| Sodium methoxide (25wt.%) | Sigma-Aldrich | 156256 | Nucleophile |
| Toluene | FIsher Scientific | T2904 | Organic solvent |
| Plant Growth Supplies | |||
| Pro-Mix PGX | Premier Tech Horticulture Ltd | Pro-Mix PGX is recommended to grow Arabidopsis plants (Eddy, R. and Hahn, D.T., 2012,http://docs.lib.purdue.edu/pmag/2) Purdue Methods for Arabidopsis Growth. |
|
| PermaNest Humidity Dome | Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN | GD2211-24 | |
| Perma-Nest Plant Trays (22x11in) | Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN | N/A | |
| Square greenhouse pots, 3.5 inch | Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN | P86 | |
| General Purpose Plant Fertilizer, Plant-Prod 20-20-20 | Premier Tech Home and Garden In., Brantford, ON | N/A | |
| Glassware | |||
| 13 x 100 mm glass test tube with Teflon-faced screw cap | Kimble Chase Life Science and Research Products LLC | 45066A-13100 | |
| 16 x 125 mm glass test tube with Teflon-faced screw cap | Kimble Chase Life Science and Research Products LLC | 45066A-16125 | |
| 20 x 125 mm glass test tubes with Teflon-faced screw cap | Kimble Chase Life Science and Research Products LLC | 45066A-20125 | |
| GC vial caps | National Scientific | C400051A | |
| GC vial microinserts | National Scientific | C4011631 | |
| GC vials | National Scientific | C40001 | |
| Disposable pasteur pipets | Fisher Scientific | 1367820B | |
| Flasks | Fisher Scientific | ||
| Equipment | |||
| Allegra X15R centrifuge | Beckman Coulter | ||
| Analytic balance | Fisher Scientific | ||
| Belly dancer | A shaker can be used for this purpose if Belly Dancer not available | ||
| DB-5 Capillary GC column | J&W Scientific, CA, USA; | 30 m x 0.25 mm x 0.25 μm film thickness | |
| Desiccator | |||
| Isotemp 202 water bath | Fisher Scientific | ||
| ISQ LT single quadupole mass spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Heat block | Fisher Scientific | ||
| Nitrogen evaporator | |||
| Polytron homogenizer | Birkmann | ||
| Trace 1300 gas chromatograph | Thermo Scientific | ||
| Two-stage regulator | Air Liquide | Q1-318B-580 | |
| Vacuum desiccator | Fisher Scientific | ||
| Vortex mixer | Fisher Scientific |
References
- Kolattukudy, P. Biopolyester membranes of plants: cutin and suberin. Science. 208 (4447), 990-1000 (1980).
- Kolattukudy, P. E. Polyesters in higher plants. Adv. Biochem. Eng. Biot. 71, 1-49 (2001).
- Yeats, T. H., Rose, J. K. C. The formation and function of plant cuticles. Plant Physiol. 163 (1), 5-20 (2013).
- Pollard, M., Beisson, F., Li, Y., Ohlrogge, J. B. Building lipid barriers: biosynthesis of cutin and suberin. Trends Plant Sci. 13 (5), 236-246 (2008).
- Beisson, F., Li-Beisson, Y., Pollard, M. Solving the puzzles of cutin and suberin polymer biosynthesis. Curr. Opin. Plant Biol. 15 (3), 329-337 (2012).
- Heredia, A. Biophysical and biochemical characteristics of cutin, a plant barrier biopolymer. Biochim. Biophys. Acta. 1620 (1-3), 1-7 (2003).
- Bonaventure, G., Beisson, F., Ohlrogge, J., Pollard, M. Analysis of the aliphatic monomer composition of polyesters associated with Arabidopsis epidermis: occurrence of octadeca-cis-6, cis-9-diene-1, 18-dioate as the major component. Plant J. 40 (6), 920-930 (2004).
- Franke, R., et al. Apoplastic polyesters in Arabidopsis surface tissues - A typical suberin and a particular cutin. Phytochemistry. 66 (22), 2643-2658 (2005).
- Vogg, G., et al. Tomato fruit cuticular waxes and their effects on transpiration barrier properties: functional characterization of a mutant deficient in a very-long-chain fatty acid -ketoacyl-CoA synthase. J. Exp. Bot. 55 (401), 1401-1410 (2004).
- Molina, I., Bonaventure, G., Ohlrogge, J., Pollard, M. The lipid polyester composition of Arabidopsis thaliana and Brassica napus seeds. Phytochemistry. 67 (23), 2597-2610 (2006).
- Li-Beisson, Y., et al. Acyl-lipid metabolism. The Arabidopsis Book. 11, e0161 (2013).
- Christie, W. W. Mass Spectrometry of Fatty Acid Derivatives. , LipidHome. Available from: http://www.lipidhome.co.uk/ms/masspec.html (2015).
- Molina, I., Ohlrogge, J. B., Pollard, M. Deposition and localization of lipid polyester in developing seeds of Brassica napus and Arabidopsis thaliana. Plant J. 53 (3), 437-449 (2008).
- Xiao, F., et al. Arabidopsis CYP86A2 represses Pseudomonas syringae type III genes and is required for cuticle development. EMBO J. 23 (14), 2903-2913 (2004).
- Christie, W. W., Han, X. Lipid Analysis - Isolation, Separation, Identification and Lipidomic Analysis. , 4th edition, Oily Press. Bridgwater, U.K. 446 (2010).
- Walton, T. J., Kolattukudy, P. E. Determination of the structures of cutin monomers by a novel depolymerization procedure and combined gas chromatography and mass spectrometry. Biochemistry. 11 (10), 1885-1896 (1972).
- Matzke, K., Riederer, M. A comparative study into the chemical constitution of cutins and suberins from Picea abies (L.) Karst., Quercus robur L., and Fagus sylvatica L. Planta. 185 (2), 233-245 (1991).
- Riederer, M., Schönherr, J. Quantitative gas chromatographic analysis of methyl esters of hydroxy fatty acids derived from plant cutin. J. Chromatogr. 360, 151-161 (1986).
- Moire, L., Schmutz, A., Buchala, A., Yan, B., Stark, R., Ryser, U. Glycerol Is a Suberin Monomer. New Experimental Evidence for an Old Hypothesis. Plant Physiol. 119 (3), 1137-1146 (1999).
- Graça, J., Schreiber, L., Rodrigues, J., Pereira, H. Glycerol and glyceryl esters of omega-hydroxyacids in cutins. Phytochemistry. 61 (2), 205-215 (2002).
- Eglinton, G., Hunneman, D. H. Gas chromatographic-mass spectrometric studies of long chain hydroxy acids-I: The constituent cutin acids of apple cuticle. Phytochemistry. 7 (2), 313-322 (1968).
- Espelie, K. E., Köller, W., Kolattukudy, P. E. 9,16-dihydroxy-10-oxo-hexadecanoic acid, a novel component in citrus cutin. Chem. Phys. Lipids. 32 (1), 13-26 (1983).
- Holloway, P. J. Intracuticular lipids of spinach leaves. Phytochemistry. 13 (10), 2201-2207 (1974).
- Holloway, P. J., Deas, A. H. B. Epoxyoctadecanoic acids in plant cutins and suberins. Phytochemistry. 12 (7), 1721-1735 (1973).
- Holloway, P. J. The chemical constitution of plant cutins. Cutler, D. F., Alvin, K. L., Price, C. E. , Academic Press. London. 45-85 (1982).
- Croteau, R., Fagerson, I. S. The constituent cutin acids of cranberry cuticle. Phytochemistry. 11 (1), 353-363 (1972).
