Summary
Первичная клетки Сертоли необходимы для изучения семенников иммунной привилегией, передачу сигнала при воспалении или инфекции, и использования их иммунозащитную свойств. Здесь мы опишем протокол на основе ферментов для изоляции высокоочищенных первичной клетки Сертоли и перитубулярных клеток из семенников крыс.
Abstract
Семенников, и, в частности мужской гаметы, проблемы иммунной системы уникальным способом, потому что дифференцировать сперма сначала появляются во время полового созревания - более десяти лет после установления системной иммунной толерантности. Сперматогенного клетки экспрессируют ряд белков, которые можно рассматривать как несамостоятельного иммунной системой. Затем семенник должен иметь возможность устанавливать допуск к этим нео-антигенов, с одной стороны, но все еще быть в состоянии защитить себя от инфекций и развития опухоли, с другой стороны. Поэтому яичко является одним из немногих иммунопривилегированных сайтов в организме, которые переносят чужеродные антигены, не вызывая отрицательное воспалительный иммунный ответ. Клетки Сертоли играют ключевую роль для поддержания этой иммунной привилегированной среде яичек, а также продлить выживание cotransplanted клеток в чужой среде. Поэтому первичные клетки Сертоли являются важным инструментом для изучения иммунной привилегией яичка, которые не могут быть отправлены по электроннойasily заменен установленных клеточных линий или других клеточных моделей. Здесь мы представляем подробный и всесторонний протокол для выделения клеток Сертоли - и перитубулярных клеток при желании - с семенников крыс в течение одного дня.
Introduction
Семенники производят мужские гаметы и половые гормоны, т.е. андрогены. Орган состоит из двух отсеков. В интерстициального, что составляет около 10-12% от общего объема яичек 1, стероидогенез происходит внутри клеток Лейдига. Трубчатый отсека составляет около 60-80% от объема яичка 1 и содержит зародышевые клетки и двух типов соматических клеток - перитубулярных клеток и клеток Сертоли. Яичка делится перегородками соединительной ткани в 250-300 долек, каждая из которых содержит 1-3 высоко запутанные семенных канальцев. Эти канальцы окружены базальной мембраной, лист коллагена, и окружной слоем перитубулярных клеток (Рис. 1А)
Зародышевого эпителия находится на просвета стороне базальной мембраны. Клетки Сертоли большие удлиненные клетки, которые охватывают всю зародышевого эпителия от базальной мембраны к просвету. Они сильно Attболели в базальной мембране и образуют сплошной клеточный лист через базолатеральных организованных плотных контактов, что закупоривает зародышевого эпителия из интерстиций и представляет гематотестикулярного барьер. Клетки Сертоли видные цитоплазматические выступы и последствия, которые позволяют им получить в плотный морфологической и функциональной контакте с видовой конкретного, но постоянным числом половых клеток. Диплоидные зародышевые стволовые клетки пролиферируют и дифференцируются в сперматогонии.
Во время мейоза я недолго тетраплоидных сперматоциты создаются, которые развиваются дальше в четырех гаплоидных сперматид во мейоза II. Все зародышевые клетки соединены цитоплазматическими мостиками, так что они образуют сотовую сеть. Главное событие во время созревания сперматид является выдавливание большей части цитоплазмы, образуя остаточные органы, в процессе, называемом спермиогенез. Остаточные органы фагоцитированы клеток Сертоли. Поздние сперматиды затем выбрасывается впросвете канальцев и транспортируется в придатка для дальнейшего созревания. Клетки Сертоли и половые клетки появляются взаимно координировать сперматогенез топографически и функционально.
Подготовка индивидуальных яичек типов клеток началось почти столетие назад, когда маленькие кусочки яичка культивировали и типы клеток были определены микроскопии 2. Путем тщательного вскрытия трубочек после открытия белочную оболочку, используя остроконечный пинцет это было позже можно отделить трубчатые и интерстициальные отсеков 3. В 1975 валлийцы и Вибе представила лечение коллагеназы, чтобы освободить канальцы от присоединения интерстициальной ткани и лечение панкреатина для удаления наружного слоя клеток перитубулярных 4. С самого начала молодых неполовозрелых крыс (около 20 дней) были использованы при котором клетки Сертоли составляют значительную часть населения трубчатой клетки, потому что сперматогенез еще не начался. В этой возрастной Sert крысМасляные клетки перестают делиться, и плотные соединения между соседними клетками образуют так, что кровь-яичко барьер устанавливается 5.
Независимо от валлийцев и Вибе Dorrington др. Ввели сочетание трипсина и Дезоксирибонуклеаза последующим ингибитора трипсина soybeen и обработки коллагеназой, которая была опубликована в том же году 6. Обе группы также используется механическое усилие (рисунок переваренных трубчатые фрагменты повторно через иглу шприца или пипетки Пастера соответственно) с целью получения однородной суспензии клеток для обшивки, содержащий приблизительно 70% клетки Сертоли. После 3-х дней в культуре, с использованием среды, что является свободной от сыворотки, процент клеток Сертоли увеличивается до приблизительно 90%. Это может быть в значительной степени объясняется смерти загрязняющих зародышевые клетки. Остаточные перитубулярных клетки (ПТК), однако, оставаться прочно прикреплены с помощью их внеклеточного матрикса. PTCS, но не клетки Сертоли, как известно, производятфибронектин, которые могут служить в качестве маркерного белка для оценки загрязнения с ПТК. Поэтому, Tung др. полагали, что дополнительный лечение гиалуронидаза может улучшить чистоту фракции клеток Сертоли 7. Действительно, они могли бы показать, что дополнительная обработка смог уменьшить загрязнение PTCs примерно 20-кратное, который становится особенно очевидным, когда по сравнению содержащей сыворотку среда используется для культивирования очищенные клетки Сертоли. С тех пор улучшенной процедуры Tung др. стала доминирующей протокол и широко используется другими основными группами в области 8 (рис 1б).
Во время лечения коллагеназы большинство PTCs будут освобождены и могут быть выделены в параллель к клеткам Сертоли. В то время как ФТК энергично размножаться и не реагируют на фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), клетки Сертоли не претерпевают митоз больше и реагировать на ФСГ характерными морфологических измененийи увеличение циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) концентрации 9. Очень похожие ферментативные протоколы пищеварения может быть использован для выделения первичных клеток Сертоли из других животных, как человек 10, мыши 11,12 Сибирского хомяка 13 или Як 14. Для удаления больших количеств загрязняющих зародышевых клеток гипотонический шок может быть использован в конце процедуры выделения 15. Это позволяет также эффективную изоляцию клетки Сертоли из семенников взрослой крысы 16. Обогащенного клеточной суспензии из клеток Сертоли также может быть отделен от половых клетках путем посева суспензии на лектин блюд, покрытых дурман обыкновенный агглютининов 17. Только клетки Сертоли и несколько остаточные PTCs придерживаться лектиновых пластин.
Культуры Первичная клеток Сертоли, в основном из крысы, были использованы изначально для исследования реагирования на гормоны или создания клеточных линий, как на элементный литий мыши Сертолипе ТМ4 18. Эта клеточная линия не была исследована в более чем ста исследований до сегодняшнего дня. В поступательного подхода были использованы клетки Сертоли для иммуно-защиты совместно культивировали клетки и ткани, как в котрансплантация ксенофобов или аллогенных панкреатических островков для долгосрочного выживания трансплантата без системной иммуносупрессии 19. Изолированные клетки Сертоли были также использованы в экспериментах со-культуры для изучения эпителиально-мезенхимальные (клетки Сертоли - PTCc) и соматических зародышевых клеток (клетки Сертоли - зародышевых клеток) взаимодействий 20, 21. Недавно первичные клетки Сертоли были использованы для исследования экспрессии Toll-подобных рецепторов и секрецию провоспалительных цитокинов, а также сигнальной трансдукции каскады приводит к цитокинами экспрессию после инфицирования непатогенных и уропатогенных Е. палочка 22. Другие недавние исследования использовали клетки Сертоли для изучения яичек иммунную рrivilege 23 и продемонстрировал, что тестостерон предварительная обработка подавляет LPS-индуцированной воспалительной реакции 24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Утверждение 1. Животное этики
Эксперименты, описанные здесь, были проведены в соответствии с руководящими принципами Regierungspräsidium Гиссен, Германия, как местной власти и подтвердить немецкому Кодекса практики по уходу и использованию животных в экспериментальных целях (разрешение нет:. Г.И. 20/23 Nr A 31 / 2012).
2. Подготовка среду, фермент Solutions и животных
- Подготовьте 1% йода спирт путем растворения 1 г йода в 100 мл этанола.
- Подготовьте 2x 500 мл Dulbecco's фосфатно-солевом буферном (PBS) без Са 2+ и Mg 2+ дополняли друг с 7,5 мл D-глюкозы (100 г / л) и 5 мл 100x пенициллин / стрептомицин маточный раствор (15 мг / мл D -глюкозы, 50 ед / мл пенициллина и 50 мкг / мл стрептомицина окончательным).
- Дополнение 1x 500 мл института Roswell Park Memorial (RPMI) 1640 с 5 мл 100x пенициллин / стрептомицин маточный раствор (50 ед / мл пенициллина и 50 мкг / мл стрептомицина плавникаль).
- Приготовьте I раствор трипсина-ДНКазы (2,5 мг / мл трипсина и 10 мкг / мл ДНКазы I) путем добавления 25 мг трипсина и 0,1 мл ДНКазы I (1 мг / мл ДНКазы I) до 9,9 мл PBS.
- Растворите ингибитор трипсина 50 мг в 5 мл PBS для трипсина ингибитором раствора (10 мг / мл). Растворите ингибитор трипсина 25 мг в 10 мл PBS для раствора трипсина ингибитором B (2,5 мг / мл).
- Для решения коллагеназы-Гиалуронидаза-Дезоксирибонуклеаза I (ДНКазы I) растворить 10 мг коллагеназы А (1 мг / мл заключительный), 10 мг гиалуронидазы (1 мг / мл, конечная) и 0,1 мл ДНКазы I (1 мг / мл ДНКазы I) ( 10 мкг / мл, конечная) в 10 мл PBS.
- Приготовьте I раствор Гиалуронидаза-ДНКазы путем добавления 10 мг гиалуронидазы (1 мг / мл, конечная) и 0,1 мл раствора ДНКазы I (1 мг / мл) (10 мкг / мл, конечная) до 9,9 мл PBS.
- Заказ крыс линии Вистар по времени таким образом, что они являются 19 дней на день изоляции клеток Сертоли.
Примечание: Описанный протокол рассчитан на 10 крысах, но может быть модифицировано в течение минимум 5 и максимум 20 крыс.Объемы всех решений должны быть соответствующим образом скорректированы. - Подготовьте Нефть Красный O исходного раствора путем растворения 0,35 г масла Red O в 100 мл изопропанола. Перемешать O / N, процеживают через 0,2 мкм и хранить при комнатной температуре в течение до одного года.
- Подготовьте окрашивание раствора масла Красный O смешиванием 6 мл маточного раствора масла Красный вывода с 4 мл воды (3: 2). После 10-20 мин процеживают через 0,2 мкм. Использовать в течение следующих 2 ч.
- Подготовьте 4% (вес / объем) раствора формальдегида в вытяжном шкафу, добавив 4 г параформальдегида порошок (PFA) до 80 мл 1x PBS при перемешивании осторожно. Нагреть до ~ 60 ° С, добавить 1 мл 1 М NaOH и продолжают перемешивание до тех пор, параформальдегид не растворится. Дают раствору остыть до комнатной температуры, довести рН до 7,4 с помощью 1 М HCl и объем до 100 мл с 1x PBS. Фильтр решение (0,45 мкм) и использовать свежие или магазин в аликвотах при -20 ° С в течение нескольких месяцев.
Примечание: полимеризованных формальдегида (PFA) деполимеризующим мономерного формальдегида в воде. Этот процесскатализируется умеренном нагревании и слабощелочной рН. Подготовьте все решения ферментные свеже и фильтр стерилизуют (0,2 мкМ) их в день использования. Если другой производитель фермент (см Материалы / оборудование Стол) используется, тщательно отрегулировать его концентрации / активности.
В следующей методике А "пипетка" обозначает серологического пипетки.
3. Подготовка семенных канальцах
- Обезболить 10 самцов крыс линии Вистар по одному в эксикаторе с использованием СО 2 и скорости потока, что смещает, по меньшей мере 20% от объема камеры в минуту. Подождите, пока дыхание останавливается, тест анестезии, сжав ноги площадку, и, если нет реакции эвтаназии Каждой крысе путем смещения шейных позвонков. Слейте кровь секционирования яремную вену и сонную артерию (влагалище carotica) под проточной водой. Лечить живот протиранием 70% этанола.
- Использование щипцов поднимите кожу от брюшной муCles и вырезать в форме овала кожи лепесток, который, проходящий от лобкового симфиза к грудине (фиг.2А) и лоскут его вверх на груди. Затем захватить мышцы живота и сделать медиальной разрез от лобкового симфиза к грудине.
- Сожмите живота с большими пальцами от таза вверх, чтобы подтолкнуть яички из нижней части таза. Подберите придатка жировой ткани (рис 2B) щипцами для вытягивания яичка дальше. Вырезать семенного канатика (рис 2б), оставляя белочная оболочка цела, и собрать все яички в 20 мл PBS в 50 мл коническую трубку (рис 2С).
- После сбора всех семенники, лечит их добавлением равного объема (20 мл) 1% (вес / объем) йода в этаноле. Переверните пробирку дважды и сразу переливать супернатант. Быстро мыть яички дважды 25 мл PBS каждый (рис 2D).
- Перенесите яички в чашку Петри содержатьING 15 мл PBS (рис 2E). Возьмитесь каждого яичка крепко пинцетом на одном конце, сделайте небольшой надрез в белочной оболочке на противоположном конце, и выжать канальцы, используя закрытые ножниц лезвия как скребком.
Примечание: Трубки должны еще образуют компактный яичек-образный пучок только несколько канальцев, проходящий в растворе, с тем чтобы однородную ферментативного расщепления (рис 2F). - Перенесите де-капсулированных яички до 100 мл с завинчивающейся крышкой бутылки, содержащей 10 мл трипсина-ДНКазы I решение. Выполните пищеварение в встряхивании на водяной бане при 32 ° C (120 колеб / мин). После 4 мин оценить канальцев, с невооруженным глазом для дисперсии канальцев. После канальцы начинают расходиться в раствор, немедленно прекратить пищеварение. При необходимости, продолжить инкубацию в течение до 2 мин.
- Остановка трипсина пищеварения добавлением 5 мл раствора трипсина ингибитором А. Тщательно перемешать раствор с помощью пипетки вверх и вниз 3-4 разS с использованием 10 мл пипетки и перенести его на 50 мл коническую пробирку.
- Через 5 мин инкубации наблюдать канальцы разрешить путем единичной тяжести, тщательно удалить супернатант с помощью 10 мл пипетки с шага 3.6 и добавляют 10 мл раствора ингибитора трипсина B для того, чтобы полностью остановить трипсина пищеварение. Ресуспендируют канальцы с помощью пипетки вверх и вниз 2-3 раза.
- Для того чтобы удалить загрязняющие интерстициальные клетки мыть канальцев 9 раз с 25 мл PBS каждый. Ресуспендируют канальцы в каждой промывки с помощью 25 мл пипетки и позволить им поселиться на единицу тяжести в течение 10 мин. Всегда использовать тот же 25 мл пипетки в течение пипетки PBS, взмучивания и удаления супернатанта.
4. Удаление / Выделение перитубулярных клеток (ФТК)
- Перенесите все канальцы до 100 мл бутылку с завинчивающейся крышкой и добавьте I решение коллагеназы-Гиалуронидаза-ДНКазы (рис 3А). Выполнение пищеварение в течение 10 мин в встряхивании на водяной бане при 32 ° С (120 колебаний / мин),
- Внесите капли суспензии на предметное стекло и быстро проверить канальцы под инвертированным оптическим микроскопом для рутинного культивирования клеток в 100-кратном увеличении. Если пищеварение не развит достаточно продолжать инкубацию в течение еще 2 мин (не входит время, необходимое для проверки микроскопического).
Примечание: На этом этапе все канальцы получить сокращен в длину и канальцев краев должна стать шероховатой (3В и С). Грубые края являются показателем для выпуска перитубулярных клеток. - Передача суспензии с переваренных канальцев к 50 мл коническую трубку с помощью 25 мл пипетки с шага 3.8. Вымойте бутылку 100 мл с 10 мл PBS и добавить его в канальцах в конической трубе. Разрешить переваренные канальцы могут разрешить путем единичной тяжести в течение 10 мин, и тщательно аспирата супернатант, содержащий ПТК, используя 25 мл пипетку снова, и передать его на новое коническую трубку. Для аспирации последние несколько миллилитров использовать 5 мл пипеткой в Ordeг, чтобы предотвратить любое унос канальцев.
- Добавить 20 мл RPMI 1640, дополненной 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (FBS), чтобы собранных супернатантов канальцев, перемешать и центрифуге при 300 мкг в течение 10 мин при комнатной температуре без использования перерыв.
- Осторожно декантируют супернатант и ресуспендируют гранулированные ПТК в 20 мл RPMI 1640, дополненной 10% инактивированной нагреванием FBS и семена 4 мл каждый на пяти Т75 колбы, содержащие 16 мл среды каждый. Инкубировать при 37 ° С в 5% СО 2 атмосферы (4А).
- На 3-й день культивирования Trypsinize на ПТК и разделить их 1: 2 на Т75 колбы, содержащие 16 мл RPMI 1640, дополненной 10% инактивированной нагреванием FBS каждый (урожайность 10 колб вообще) (фиг.4В). Продолжить инкубации при 37 ° С в 5% СО 2 атмосферы.
- На 5-й день культивирования Trypsinize на ПТК снова и пластинчатыми их на 6-луночных или 24-луночные планшеты в зависимости от эксперимента(Один T75 колбу на чашку). Эксперименты могут быть выполнены на 6-й день.
5. Выделение клеток Сертоли (СКС)
- Ресуспендируют устоявшиеся канальцы с шага 4.3 тщательно в 25 мл PBS с использованием 25 мл пипетки и позволить им поселиться на единицу тяжести в течение 12 мин. Используйте тот же 25 мл пипетки для пипетки PBS, рефиксацией канальцев и удаления супернатантов. Повторите промыть 3 раза (4 моет в общей сложности).
- После последнего мыть передать переваренных канальцев еще 100 мл с завинчивающейся крышкой флакон, содержащий раствор Гиалуронидаза-ДНКазы I. Выполните пищеварение в встряхивании на водяной бане при 32 ° C (120 колеб / мин).
- Через 5 мин проверьте канальцы снова оптического микроскопа обследовании у 100х, как описано в шаге 4.2.
Примечание: Короткие канальцы, трубчатые агрегаты и высвобожденные клетки должны быть видны (рис 3D).- Разрешить трубчатые агрегаты урегулировать в течение 10 мин, и аспирата супернатант насIng 25 мл пипетки. Мытье агрегатов 4 раза по 25 мл PBS и время седиментации 10 мин для каждой стадии промывки (Рис 3E).
- Добавьте 20 мл RPMI 1640 и передать суспензии 10 раз через иглу 18 G, установленной на 20 мл шприц. Избегайте пузырьков воздуха.
Примечание: Нельзя тянуть подвеску и выходить через иглу считается один проход. Разрушение и гомогенизация клеток гидродинамического сдвига является стандартным методом в подготовке клеток, которые имеют тенденцию к агрегации. Прохождение клеток через иглы для подкожных инъекций малого внутреннего диаметра вряд ли будет иметь влияние на их функциональных свойств 25. 5С и D показывает нормальную ультраструктуру очищенных клеток Сертоли на 4-й день культуры.- Внесите капли суспензии на предметное стекло и быстро проверить канальцы под инвертированным оптическим микроскопом для рутинного культивирования клеток на 10-кратным увеличением, если общregates все разошлись (рис 3F). Фильтр клеточной суспензии через клеточный фильтр 70 мкм, чтобы получить чистую одноклеточной суспензии в фильтрате.
- Центрифуга фильтрата на стадии 5.4 при 200 мкг в течение 10 мин при комнатной температуре без использования перерыв. Тщательно аспирата супернатант использованием 25 мл пипетки, и клетки вновь суспендируют Сертоли в 40 мл среды RPMI 1640 (без сыворотки).
- Смешайте 100 мкл клеточной суспензии с 100 мкл трипанового синевы и рассчитывать клетки с улучшенной камере Neubauer. Регулировка концентрации клеток до 3 × 10 6 клеток / мл в соответствии с результатом подсчета. Семенной 1 мл на лунку на 6-луночный планшет (= 1 день). Если окрашивание масляным красным O (шаг 6) планируется поместить покровное стекло в один или несколько скважин перед посевом клеток Сертоли.
Примечание: клетки Сертоли в суспензии урегулировать быстро, так что трубка должна быть кратко встряхивают каждый раз перед клеткой аликвоту берется с пипеткой. До 4-й день они твердо AttACH к субстрату. - Для того чтобы удалить зародышевые клетки плавающие или прилипшие на 4 день (фиг.4С) мыть каждую лунку 6-луночных планшетах, используемых для обшивки изолированных клетки Сертоли (шаг 5,6) с PBS (на фиг.4D). Аспирируйте среду, добавить 1-2 мл PBS в каждую лунку и встряхните 6-луночных горизонтально на столе энергично, но не пролив PBS. Повторите промыть 3 раза и выполняют ту же самую процедуру промывки на день 5 и 6 (фиг 4E).
Примечание: На 4-й день клетки Сертоли были прочно прикреплены и показать булыжник как шаблон под перевернутой оптического микроскопа (рис 4C). Эксперименты могут быть выполнены из 7-й день года.- (Альтернатива для стадии 5.7) Для удаления плавающих и прилипшие зародышевые клетки выполняют гипотоническому Shock 3 дня после посева на 6-луночных планшетах. Удалить среду и добавить 1 мл 20 мМ Трис рН 7,5, взятые непосредственно из холодильника. Аспирируйте буфер Трис после 90 до 120 сек, но непозже. Вымойте клеток дважды PBS, и добавьте 2 мл RPMI 1640 (без сыворотки). Необязательно, проводят эксперименты на следующий день.
Примечание: Чем больше длительность гипотонического шока, тем больше зародышевые клетки могут быть удалены, но чем больше клетки Сертоли теряются, а также. Первой стирки PBS должна быть выполнена быстро, но осторожно, чтобы не сместить какие-либо клетки Сертоли. Непосредственно после гипотонической обработки многочисленные вакуоли разного размера могут наблюдаться в цитоплазме путем фазового контраста микроскопии. Вакуоли исчезают в течение нескольких часов после гипотоническому лечения.
- (Альтернатива для стадии 5.7) Для удаления плавающих и прилипшие зародышевые клетки выполняют гипотоническому Shock 3 дня после посева на 6-луночных планшетах. Удалить среду и добавить 1 мл 20 мМ Трис рН 7,5, взятые непосредственно из холодильника. Аспирируйте буфер Трис после 90 до 120 сек, но непозже. Вымойте клеток дважды PBS, и добавьте 2 мл RPMI 1640 (без сыворотки). Необязательно, проводят эксперименты на следующий день.
6. Масло Красный O Окрашивание
- Выполните все шаги при комнатной температуре. На день 7 мыть клетки Сертоли, выращенных на покровным стеклом (шаг 5,6) с PBS в два раза и закрепить их 10% -ным формалином в PBS. Через 10 мин заменить формалин свежим раствором, и продолжают фиксацию для другого 60 мин.
Примечание: Все растворы добавляются в лунку (и) с покровным стеклом и отсасывали перед следующей стадией. Аспирируйте формалин, мыть клетки дважды водой и добавить 60% изопропанола. Через 5 мин позволяют клеткам высохнуть в течение нескольких минут. - Добавьте 1 мл масла Красный O окрашивание раствора на лунку и инкубировать в течение 10 мин. Аспирируйте решение, и промыть клетки сразу 4 раза водой и смонтировать крышку скользит в глицерин-PBS (9: 1). Возьмите светлом поле изображения с обычной световой микроскопии (рис 4F).
7. Иммунофлуоресценции Окрашивание
- Промыть ПТК (с шага 4.5) или клетки Сертоли (из стадии 5.5), выращенных на покровным стеклом с PBS в два раза и закрепить их с помощью 4% PFA в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Инкубируйте с 5% БСА в PBS в течение 1 часа при комнатной температуре. Отменить решение BSA-PBS и добавить свежий раствор БСА-PBS, содержащий актина (гладкие мышцы) (для ПТК) или виментин (для клеток Сертоли) первичное антитело (разведение 1: 100 для обоих антител) и инкубировать при температуре 4 ° CO / N.
Примечание: Инкубация с BSA блоков неспецифического связывания первого антитела. - Промыть крышку скользит 3 раза в течение 5 мин в PBS-0,1% Твин 20 и инкубировать с зеленым флуоресцентным красителем-конъюгирован козьего анти-мышиного антитела (вторичного разбавления 1: 1000) при комнатной температуре в течение 1 ч в темноте.
- Промыть крышку скользит 3 раза в течение 5 мин в PBS-0,1% Твин 20 и смонтировать их в DAPI монтажной среды.
8. Анализ Ультраструктурный
- Промыть клетки Сертоли (от этапа 5.6), выращенные на 6 см клеточной культуральной пластины с PBS и исправить их в течение 2 ч при 4 ° С в смеси 2,5% глутаральдегида, 2,5% параформальдегида и 0,05% пикриновой кислоты в 67 мМ какодилатном буфере ( рН 7,4) в соответствии с Ито и Карновскому 26.
- Выполнение действий после фиксации в 1% осмия с последующим уплотнительным / N инкубации в 0,3% ацетата уранила, растворенного в 50 мМ малеат буфер (рН 5). Встраивание образцы в встраивание носители в соответствии со стандартными процедурами. Вырезать тонких срезов, контрастность их с цитратом свинца и исследовать с помощью электронного микроскопа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Описанная процедура позволяет выделить около 12 х 10 7 клеток Сертоли из семенников 10 крыс. 3 × 10 6 клетки высевают на лунку на 6-луночный планшет, так что от шести до семи 6-луночные планшеты для экспериментов доступны на день 7. Переваривание Трипсин-ДНКазы I является наиболее важным шагом в процессе выделения клеток Сертоли. Если пищеварение в этой точке продвигается слишком далеко, отношение зародышевых клеток / клетки Сертоли будет непропорционально возрастать до конца. В первый день 3-6 культуры важно тщательно смыть столько незакрепившихся или свободно прикрепленные зародышевые клетки, как это возможно. В качестве альтернативы обширных стирок в течение 4 дней зародышевые клетки могут быть удалены путем гипотонической обработки на 3 день 27. Преимущество этого способа состоит в том, что время клеточной культуре Сертоли сведено к минимуму, так что клеточные функции заданной Сертоли являются потенциально лучше сохранил, чем после длительного периода культуры.
(фиг.5В). Поскольку перитубулярных клетки имеют сильную пролиферативный потенциал, клеток Сертоли культура должна быть выполнена в отсутствии сыворотки. В присутствии 10% сыворотки ФТК бы составляют примерно 20% от всех клеток после 6 дней культивирования тогда как его фракция может быть как ожидается, будет ниже 1% в отсутствие сыворотки 7. Практически все выделенные клетки Сертоли являются жизнеспособными о чем судили по окрашивания трипановым синим (не показан). Вокруг 7 день культивирования выделенные клетки Сертоли наименее загрязненных половых клеток и клеток перитубулярных (рисунок 4), так что эксперименты должны быть выполнены вокруг этого дня, если это возможно. Для хорошей воспроизводимостью важно повторить экспериментВсегда в тот же день культуры. Если трансфекции планируются они должны быть выполнены на день 4 или 5, и клеточные экстракты должны быть сделаны на день 5 или 6.
За не менее двух недель в бессывороточной условиях клетки Сертоли реагируют на ФСГ и производить больше андрогенов-связывающий белок, активатор плазминогена и трансферрин при лечении ФСГ. Для более длительного культуры требуется питательный слой перитубулярных клеток или сыворотке. После четырех недель культуры ухудшаться, и клетки отделяются от субстрата 7.
На 6-й день культивирования наиболее клеток Сертоли приобрели липидов капельки. В большинстве клеток одного большого вакуоль сформировала (5С и 5D). Нейтральное содержание липидов могут быть легко визуализированы с помощью масла Красный O окрашивания (рис 4F).
В дополнение к Сертоли чел Ls снятые ФТК можно культивировать, а (фиг.4А и 4В). ФТК от 10 яичек дают пять T75 колб, которые можно ожидать, чтобы сформировать сливающийся слой после 2 дней культуры. Как изолированных клетках Сертоли свежеизолированных PTCs загрязнены зародышевых клеток, которые могут быть в значительной степени удалены пассажей. Колбы расщепляются 1: 2 с помощью стандартной обработки трипсином, так что 10 флаконов будет конфлюэнтны на 5 день после выделения. Чистота изолированных PTCs является> 95% и может быть подтверждена с помощью альфа-актин гладких мышц иммунноокрашивания (рис 5А). С этого дня и далее ФТК может быть использован для проведения экспериментов. Один флакон достаточно приблизительно одного 6-луночный планшет, и лунки следует конфлюэнтны на следующий день. Клетки могут быть пассировать много раз, но эксперименты должны быть выполнены всегда в то же проход для того, чтобы убедиться, что клетки ведут себя воспроизводимым образом.
загрузить / 53389 / 53389fig1.jpg "/>
Рисунок 1. Морфология яичка и документооборота процедуры. (A) сектор в семенных канальцев с прилегающей интерстициальной ткани схематически показана. Семенных канальцах заключены в базальной мембране (БМ) и окружной слоем myoid перитубулярных клеток (ПТК). Зародышевого эпителия находится на просвета стороне базальной мембраны. Клетки Сертоли (SC), охватывающих весь зародышевого эпителия сильно привязаны к BM и соединены между собой посредством базолатеральных позиционируется окклюзии переходов, представляющих гематотестикулярного барьер (BTB). Их нерегулярное ядро (N) показывает один или несколько трещинные, как углубления и содержит ядрышко. Половые клетки (GC) в тесном контакте с СК на всех стадиях их развития. Интерстициальный отсека между канальцами содержит клетки Лейдига (LC) и иммунных клеток, таких как макрофаги (МФ), а также кровеносные сосуды (BV). фигураадаптировано из Fijak и Мейнхардт 28. (B) Процедура осуществления процедуры; цветовое кодирование, как в (А). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
Рисунок 2. Семенники из крыс линии Вистар, вырезают и декапсулируются. (А) в брюшную полость открыта через продольного разреза, как описано в тексте. Звездочка (*) указывает на epidydimal жировой ткани. (B) Семенники удаляют путем разрезания семенного канатика и (С), собранной в 50 мл коническую пробирку, содержащую 20 мл PBS. Когда все семенники были собраны они дезинфицируют в 20 мл 1% (масса / объем) йода в этаноле. Для удаления йода они быстро промывают два раза 25 млPBS друг. (D) Семенники после первой стирки PBS. (E) Семенники переносят в чашку Петри (справа), и семенные канальцы выдавливаются раскрытой белочной оболочки с помощью закрытых ножниц лезвия (слева), как описано в тексте. (F) декапсулируются яички еще образуют компактный яичек-образный массу с одиночными канальцы выпуклые. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
Рисунок 3. Выделение клеток Сертоли. (А) После удаления интерстициальных клеток трипсином-ДНКазы I пищеварения и стиральных 9x с PBS канальцев стать мобилизованы и выглядят чистыми. (Б) Во время коллагеназы-гиалуронидаза-ДНКазы I лечения перитубулярных клеткиы из слоя и зародышевых клеток наружных освобождаются. Трубки получить сокращен и получить грубый вид. (С) Трубчатые фрагменты после мытья 4x с PBS. Выпуски лечения (D) Гиалуронидаза-ДНКазы I остаточные перитубулярных клеток, а также половых клеток. Трубочки получить дополнительно сокращается, и трубчатые агрегаты образуют. (Е) Трубчатые агрегирует после мытья 4x с PBS. Клетки (F) Одноместный Сертоли производится путем пропускания агрегаты 10х через 18G иглы. Масштабные бары в (AE) = 200 мкм, в (F) = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
Рисунок 4. Культура перитубулярных клеток (АВ) и клетки Сертоли (CF) и удаление contaminat ING зародышевые клетки. (A) Ресуспендированные ФТК от этапа 4.5 высевали сразу и сфотографировали на следующий день. (Б) После разделения на 3-й день заражения половых клеток уменьшается. (C) На 4-й день клетки Сертоли показана типичная булыжником, как образец. Плавающие и придерживаясь зародышевые клетки видны до мытья с PBS. (D) То же хорошо после мытья 3x с PBS. Количество загрязняющих зародышевых клеток уменьшается. Стиральная трижды PBS повторяется на 5-й день и 6. (Е) на 6 день культуры практически все половые клетки были удалены. Клетки Сертоли сформировали уникальный глядя клеточный слой, и большинство клеток приобрели один большой вакуоль. Красный O окрашивание (F) Нефть показывает, что эти вакуоли липидные капли, содержащие в основном нейтральные липиды. Масштабные бары в (AD) = 200 мкм, в (Е) = 50 мкм и в (F) = 25 мкм..jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
Рисунок 5. Иммунофлуоресценции окрашивание. Окрашивание очищенных первичных перитубулярных клеток с актином (гладких мышц) антител (а) и клеток Сертоли с виментина антитела (B). Нет загрязняющие клетки не видны в обоих полях зрения. Измерительная линейка в (А) и (В) = 10 мкм. (С) и (D) Электронно-микроскопические снимки клеток Сертоли после 4 дней в культуре. (C) Обратите внимание на тесные контакты соседних клеток (стрелки), что приводит к булыжной, как шаблон, как показано на фиг.4С. Один капель липидов (L) наблюдается в цитоплазме каждой клетки. (D) Наиболее обильные органеллы митохондрии (М) и аппарат Гольджи (G).Ядро (N) содержит ядрышко (NC) и показывает типичную фиссур, как отступ. Масштабная линейка в (С) = 1 мкм, а в (D) = 0,25 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Гвидо Верховена, а Людо Deboel, Левен, которые были чрезвычайно полезны в создании изоляции первичных клеток Сертоли в лаборатории Meinhardt в Гессене. Моника Fijak, Гиссен, признается за помощь в рисунке 1а и советы. Исследования были поддержаны Немецкого исследовательского через грант BH 93 / 1-1 (СО) и финансирование Международного научно-исследовательский выпускник колледжа JLU Гиссен (Германия) / Университет Монаша (Мельбурн, Австралия) ГРК 1871 (СО). Была также получена из гранта земли Гессен в рамках программы "Ланды-наступательных цур Entwicklung Wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz" (LOEWE) под названием "Männliche Infertilität бай Infektion & Entzündung" (MIBIE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Actin (smooth muscle) antibody clone 1A4 | Dako | M0851 | Monoclonal mouse anti human antibody. Use 1:100 dilution for immunofluorescence. |
| Albumin bovine fraction V Standard grade, lyophilized |
Serva | 11930.04 | Filter (0.45 µm) BSA solutions used for immunofluorescence. |
| Corning Cell Strainers 70 µm | Corning | 431751 | White color |
| Collagenase A from Clostridium histolyticum | Roche | 10103586001 | |
| DAPI mountant ProLong Gold Antifade | Life technologies | P-36931 | |
| D-glucose | Sigma | G8644 | 100 g/L |
| Dulbecco´s PBS without Ca2+/Mg2+ | Gibco | 14190-094 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Electron microscope | Zeiss | EM 109S | |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axioplan 2 | |
| Hyaluronidase from bovine testis | Sigma | H3506 | |
| Inverted light microscope | Olympus | CKX41 | Routine cell culture microscope |
| Mouse IgG / IgM (H+L) polyclonal secondary Antibody |
Life technologies | A-10684 | Alexa Fluor 488 conjugate |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | Has replaced Sudan III and Sudan IV because of brighter color. |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Penicillin (5,000 U/ml)/ Streptomycin (5,000 µg/ml) |
Gibco | 15070-063 | 100x solution |
| RPMI-1640 | Gibco | 21875-034 | Contains 300 mg/L L-glutamine |
| Trypsin from porcine pancreas | Sigma | T5266 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin inhibitor from soybean | Sigma | T6522 | The Sigma product is considerably cheaper than the previously used BPTI (Aprotinin) from Roche. |
| Vimentin antibody (V9) | Sigma | V6630 | Monoclonal mouse anti pig vimentin antibody. Use 1:100 dilution for immunofluorescence. |
| Wistar WU rats | Charles River | Should be 19 days old on day of experiment. |
References
- Andrology. Male Reproductive Health and Dysfunction. Nieschlag, E., Behre, H., Nieschlag, S. , 3rd ed, Springer. (2010).
- Esaki, S. Über Kulturen des Hodengewebes der Säugetiere und über die Natur des interstitiellen Hodengewebes und der Zwischenzellen. Z. Mikrosk. Anat. Forsch. 15, 368-404 (1928).
- Hall, P. F., Irby, D. C., De Kretser, D. M. Conversion of cholesterol to androgens by rat testes: comparison of interstitial cells and seminiferous tubules. Endocrinology. 84, 488-496 (1969).
- Welsh, M. J., Wiebe, J. P. Rat sertoli cells: a rapid method for obtaining viable cells. Endocrinology. 96, 618-624 (1975).
- Vitale, R., Fawcett, D. W., Dym, M. The normal development of the blood-testis barrier and the effects of clomiphene and estrogen treatment. Anat. Rec. 176, 331-344 (1973).
- Dorrington, J. H., Roller, N. F., Fritz, I. B. Effects of follicle-stimulating hormone on cultures of Sertoli cell preparations. Mol. Cell. Endocrinol. 3, 57-70 (1975).
- Tung, P. S., Skinner, M. K., Fritz, I. B. Fibronectin synthesis is a marker for peritubular cell contaminants in Sertoli cell-enriched cultures. Biol. Reprod. 30, 199-211 (1984).
- Verhoeven, G., Cailleau, J. Testicular peritubular cells secrete a protein under androgen control that inhibits induction of aromatase activity in Sertoli cells. Endocrinology. 123, 2100-2110 (1988).
- Tung, P. S., Dorrington, J. H., Fritz, I. B. Structural changes induced by follicle-stimulating hormone or dibutyryl cyclic AMP on presumptive Sertoli cells in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 72, 1838-1842 (1975).
- Teng, Y., et al. Isolation and culture of adult Sertoli cells and their effects on the function of co-cultured allogeneic islets in vitro. Chin. Med. J. (Engl.). 118, 1857-1862 (2005).
- Kohno, S., Ziparo, E., Marek, L. F., Tung, K. S. Murine Sertoli cells: major histocompatibility antigens and glycoconjugates. J. Reprod. Immunol. 5, 339-350 (1983).
- Dufour, J. M., et al. Sertoli cell line lacks the immunoprotective properties associated with primary Sertoli cells. Cell Transplant. 17, 525-534 (2008).
- Majumdar, S. S., Tsuruta, J., Griswold, M. D., Bartke, A. Isolation and culture of Sertoli cells from the testes of adult Siberian hamsters: analysis of proteins synthesized and secreted by Sertoli cells cultured from hamsters raised in a long or a short photoperiod. Biol. Reprod. 52, 658-666 (1995).
- Zhang, H., Liu, B., Qiu, Y., Fan, J., Yu, S. Pure cultures and characterization of yak Sertoli cells. Tissue Cell. 45, 414-420 (2013).
- Ziparo, E., Geremia, R., Russo, M. A., Stefanini, M. Surface interaction in vitro between Sertoli cells and germ cells at different stages of spermatogenesis. Am. J. Anat. 159, 385-388 (1980).
- Anway, M. D., Folmer, J., Wright, W. W., Zirkin, B. R. Isolation of Sertoli cells from adult rat testes: an approach to ex vivo studies of Sertoli cell function. Biol. Reprod. 68, 996-1002 (2003).
- Scarpino, S., et al. A rapid method of Sertoli cell isolation by DSA lectin, allowing mitotic analyses. Mol. Cell. Endocrinol. 146, 121-127 (1998).
- Mather, J. P. Establishment and characterization of two distinct mouse testicular epithelial cell lines. Biol. Reprod. 23, 243-252 (1980).
- Korbutt, G. S., Elliott, J. F., Rajotte, R. V. Cotransplantation of allogeneic islets with allogeneic testicular cell aggregates allows long-term graft survival without systemic immunosuppression. Diabetes. 46, 317-322 (1997).
- Fritz, I. B. Somatic cell-germ cell relationships in mammalian testes during development and spermatogenesis. Ciba Found. Symp. 182, 271-281 (1994).
- Whaley, P. D., Chaudhary, J., Cupp, A., Skinner, M. K. Role of specific response elements of the c-fos promoter and involvement of intermediate transcription factor(s) in the induction of Sertoli cell differentiation (transferrin promoter activation) by the testicular paracrine factor PModS. Endocrinology. 136, 3046-3053 (1995).
- Bhushan, S., et al. Uropathogenic Escherichia coli block MyD88-dependent and activate MyD88-independent signaling pathways in rat testicular cells. J. Immunol. 180, 5537-5547 (2008).
- Meinhardt, A., Hedger, M. P. Immunological, paracrine and endocrine aspects of testicular immune privilege. Mol. Cell. Endocrinol. 335, 60-68 (2011).
- Fijak, M., et al. Influence of Testosterone on Inflammatory Response in Testicular Cells and Expression of Transcription Factor Foxp3 in T Cells. Am. J. Reprod. Immunol. , 12-25 (2015).
- Mamidi, M. K., et al. Impact of passing mesenchymal stem cells through smaller bore size needles for subsequent use in patients for clinical or cosmetic indications. J. Transl. Med. 10, 229 (2012).
- Ito, S., Karnovsky, M. J. Formaldehyde-glutaraldehyde fixatives containing trinitro compounds. J. Cell. Biol. 39, 168-169 (1968).
- Galdieri, M., Ziparo, E., Palombi, F., Russo, M. A., Stefanini, M. Pure Sertoli cell cultures: a new model for the study of somatic-germ cell interactions. J. Androl. 5, 249-254 (1981).
- Fijak, M., Meinhardt, A. The testis in immune privilege. Immunol. Rev. 213, 66-81 (2006).
- Jegou, B. The Sertoli cell in vivo and in vitro. Cell Biol. Toxicol. 8, 49-54 (1992).
- Pineau, C., Le Magueresse, B., Courtens, J. L., Jegou, B. Study in vitro the phagocytic function of Sertoli cells in the rat. Cell Tissue Res. 264, 589-598 (1991).
- Ren, Y., Savill, J. Apoptosis: the importance of being eaten. Cell Death Differ. 5, 563-568 (1998).
- Ducray, A., et al. Establishment of a mouse Sertoli cell line producing rat androgen-binding protein (ABP). Steroids. 63, 285-287 (1998).
- Konrad, L., et al. Rat Sertoli cells express epithelial but also mesenchymal genes after immortalization with SV40. Biochim. Biophys. Acta. 1722, 6-14 (2005).
