Summary
Primaire Sertoli cellen nodig zijn voor het bestuderen van testis-immune privilege, signaaltransductie tijdens ontsteking of infectie, en het gebruik van hun immunobeschermende eigenschappen. Hier beschrijven we een enzym-gebaseerd protocol voor de isolatie van zeer zuivere primaire Sertoli cellen en peritubulaire cellen van ratten testes.
Abstract
De testis, en met name de mannelijke gameten, daagt het immuunsysteem op een unieke manier, omdat gedifferentieerd sperma eerst verschijnen op het moment van de puberteit - meer dan tien jaar na de oprichting van de systemische immunologische tolerantie. Spermatogenese cellen brengen een aantal eiwitten die kunnen worden beschouwd als niet-zelf door het immuunsysteem. De testis moet dan in staat zijn tolerantie vast te stellen die neo-antigenen enerzijds maar nog steeds in staat om zich tegen infecties en tumorontwikkeling anderzijds. Daarom is de testis is een van de weinige immune bevoorrechte plaatsen in het lichaam die vreemde antigenen tolereren zonder nadelig roepen inflammatoire immuunrespons. Sertoli cellen spelen een belangrijke rol voor het onderhoud van deze immuun bevoorrechte omgeving van de testis en ook de overleving van cotransplanted cellen te verlengen in een vreemde omgeving. Daarom primaire Sertoli cellen zijn een belangrijk instrument voor het bestuderen van het immuunsysteem voorrecht van de testis die niet kan worden easily vervangen door gevestigde cellijnen of andere cellulaire modellen. Hier presenteren we een gedetailleerde en uitgebreide protocol voor de isolatie van Sertoli cellen - en peritubulaire cellen indien gewenst - van rat testes binnen een enkele dag.
Introduction
Testikels produceren mannelijke gameten en geslachtshormonen, dat wil zeggen, androgenen. Het orgaan bestaat uit twee compartimenten. In de interstitiële compartiment, dat vertegenwoordigt ongeveer 10-12% van de totale testis volume 1, steroidogenesis plaatsvindt binnen de Leydigcellen. De buisvormige compartiment vertegenwoordigt ongeveer 60-80% van de testiculaire volume 1 en bevat kiemcellen en twee typen somatische cellen - peritubulaire cellen en Sertoli-cellen. De testis wordt gedeeld door bindweefsel septa in 250-300 lobben, elk met 1-3 zeer ingewikkelde testes. Deze buisjes worden omsloten door een basaal membraan, een vel collageen en een omtreks- laag peritubulaire cellen (Figuur 1A).
De kiemepitheel ligt aan de luminale zijde van het basale membraan. Sertoli cellen zijn grote langgerekte cellen die de gehele germinal epithelium van de basale membraan naar het lumen overspannen. Ze zijn sterk attdeed pijn aan de basale membraan en vormen een continue cellulaire vel door middel van basolaterale georganiseerd tight junctions dat de germinal epitheel afsluit van het interstitium en vertegenwoordigt de bloed-testis barrière. Sertoli cellen hebben prominente cytoplasmische projecties en vertakkingen die hen in staat stellen om in strakke morfologische en functionele contact met een soortspecifieke, maar constant aantal kiemcellen. Diploïde germinal stamcellen vermenigvuldigen en differentiëren tot spermatogonia.
Tijdens meiose I kortstondige tetraploïde spermatocyten worden gegenereerd die tijdens de meiose II verder in vier haploïde spermatiden ontwikkelen. Alle kiemcellen zijn verbonden door cytoplasmatische bruggen zodat zij een cellulair netwerk. De belangrijkste gebeurtenis tijdens rijping van spermatiden is de extrusie van grote delen van het cytoplasma, vorming resterende organen, in een proces genaamd spermiogenese. Resterende organen gefagocyteerd door Sertoli-cellen. Late spermatiden worden dan vrijgelaten inhet buisvormige lumen en getransporteerd naar de bijbal verdere rijping. Sertoli cellen en kiemcellen lijken onderling te coördineren spermatogenese topografisch en functioneel.
Voorbereiding van de individuele testis celtypen begon bijna een eeuw geleden, toen kleine testikels stukken werden geteeld en celtypen geïdentificeerd door microscopie 2. Door een zorgvuldige dissectie van de buisjes na opening van de tunica albuginea met behulp van fijne punt tang was het later mogelijk om tubulaire en interstitiële compartimenten 3 scheiden. In 1975 Welsh Wiebe introduceerde een collagenase behandeling om de tubuli te bevrijden hechten bindweefsel en pancreatine behandeling voor het verwijderen van de buitenste cellaag peritubulaire 4. Al vroeg jonge onvolwassen ratten (ongeveer 20 dagen oud) werden gebruikt waarbij de Sertoli cellen een groot deel van de buisvormige celpopulatie omdat spermatogenese nog niet begonnen. Op deze leeftijd rat SertOli cellen ophouden te verdelen, en strakke verbindingen tussen naburige cellen vormen zodat het bloed-testis barrière is vastgesteld 5.
Onafhankelijk van het Welsh en Wiebe Dorrington et al., Introduceerde een combinatie van trypsine en Deoxyribonuclease gevolgd door soybeen trypsine-remmer en collagenase behandeling die in hetzelfde jaar 6 werd gepubliceerd. Beide groepen ook mechanische kracht (trekken van het buisvormige gedigereerde fragmenten herhaaldelijk door een naald of een Pasteur pipet respectievelijk) om een homogene celsuspensie te plateren dat ongeveer 70% Sertoli cellen bevat te produceren. Na 3 dagen kweken met behulp van een medium dat serumvrij het percentage Sertoli-cellen verhoogt tot ongeveer 90%. Dit kan grotendeels worden toegeschreven aan de dood van verontreinigende kiemcellen. Peritubulaire resterende cellen (PTC), maar blijven stevig bevestigd via hun extracellulaire matrix. PTCs, maar niet Sertoli cellen, bekend producerenfibronectine dat als een marker eiwit kan dienen voor het schatten van verontreiniging met PTC's. Daarom Tung et al. gemotiveerd een extra hyaluronidase behandeling de zuiverheid van de Sertoli celfractie 7 kunnen verbeteren. Inderdaad konden aantonen dat een aanvullende behandeling kon verontreiniging met PTC ongeveer 20-voudig te verminderen, die vooral duidelijk wordt wanneer vergeleken een serumbevattend medium gebruikt wordt voor het kweken van gezuiverde Sertoli cellen. Van toen af aan de verbeterde werkwijze van Tung et al. werd de heersende protocol en is intensief gebruikt door andere grote groepen in het gebied 8 (figuur 1B).
Tijdens collagenase behandeling de meeste PTC vrij en kunnen parallel worden geïsoleerd om Sertoli cellen. Overwegende dat de PTC krachtig laten groeien en niet reageren op de follikel stimulerend hormoon (FSH), Sertoli cellen niet meer mitose ondergaan en te reageren op FSH door karakteristieke morfologische veranderingenen een verhoging van cyclisch adenosine monofosfaat (cAMP) concentratie 9. Vergelijkbaar enzymatische digestie protocollen kunnen worden gebruikt voor het isoleren van primaire Sertoli cellen van andere dieren zoals man 10, 11,12 muis, hamster Siberische 13 of 14 Jak. Voor het verwijderen van grote hoeveelheden contaminerende kiemcellen een hypotone schok worden gebruikt aan het einde van de isolatiewerkwijze 15. Dit maakt ook de efficiënte isolatie van Sertoli cellen uit volwassen ratten testes 16. Een verrijkte Sertoli cel suspensie kan ook uit kiemcellen worden gescheiden door plating de schorsing op lectine gerechten bedekt met Datura Stramonium agglutinine 17. Slechts Sertoli cellen en enkele resterende PTCs zich aan het lectine platen.
Primaire Sertoli celculturen, voornamelijk uit de rat, zijn in eerste instantie gebruikt voor het onderzoeken van respons op hormonen of oprichting van cellijnen, zoals de muis Sertoli cel line TM4 18. Deze cellijn werd onderzocht in meer dan honderd studies tot op heden. In een translationele benadering zijn Sertoli-cellen werden gebruikt voor immuno-bescherming van co-gekweekte cellen en weefsels, zoals in het co-transplantatie van vreemdelingenhaat of allogene pancreaseilandjes langdurige transplantaatoverleving zonder systemische immunosuppressie 19. Geïsoleerde Sertoli cellen zijn ook gebruikt in co-kweek-experimenten voor het bestuderen van epitheliale-mesenchymale (Sertoli cellen - PTCC) en somatische-kiemcellen (Sertoli cellen - kiemcellen) interacties 20, 21. Onlangs primaire Sertoli cellen zijn toegepast voor het onderzoeken van de expressie van Toll-achtige receptoren en de secretie van pro-inflammatoire cytokines en de signaaltransductie cascades die tot uitdrukking cytokine na infectie met pathogene en uropathogene E. 22 coli. Andere recente onderzoeken werden met behulp van Sertoli cellen voor het bestuderen van de testis immuun privilege 23 en aangetoond dat testosteron voorbehandeling onderdrukt de LPS-geïnduceerde ontstekingsreactie 24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Animal Ethics Verklaring
De experimenten die hier beschreven werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van het Regierungspräsidium Giessen, Duitsland, als de lokale overheid en bevestigen om het Duitse Code of Practice voor de zorg en het gebruik van dieren voor experimentele doeleinden (Toestemming nr.: GI 20/23 Nr A 31 / 2012).
2. Voorbereiding van de Media, Enzyme Solutions and Animals
- Bereid 1% jodium alcohol door het oplossen van 1 g jodium in 100 ml ethanol.
- Bereid 2x 500 ml Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) zonder Ca2 + en Mg2 + aangevuld met elk 7,5 ml D-glucose (100 g / l) en 5 ml 100X penicilline / streptomycine voorraadoplossing (15 mg / ml D glucose, 50 U / ml penicilline en 50 ug / ml streptomycine def).
- Supplement 1 x 500 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium met 5 ml 100x penicilline / streptomycine voorraadoplossing (50 U / ml penicilline en 50 ug / ml streptomycine final).
- Bereid een trypsine-oplossing DNase I (2,5 mg / ml trypsine en 10 ug / ml DNase I) door toevoeging van 25 mg trypsine en 0,1 ml DNase I (1 mg / ml DNase I) met 9,9 ml PBS.
- Los 50 mg Trypsine-remmer in 5 ml PBS trypsineremmer Een oplossing (10 mg / ml). Los 25 mg Trypsine-remmer in 10 ml PBS trypsineremmer B oplossing (2,5 mg / ml).
- Een Collagenase-hyaluronidase-Deoxyribonuclease I (DNase I) -oplossing los 10 mg collagenase A (1 mg / ml uiteindelijk), 10 mg hyaluronidase (1 mg / ml uiteindelijk) en 0,1 ml DNase I (1 mg / ml DNase I) ( 10 ug / ml uiteindelijk) in 10 ml PBS.
- Bereid een hyaluronidase-DNase I door toevoeging van 10 mg hyaluronidase (1 mg / ml uiteindelijk) en 0,1 ml DNase I-oplossing (1 mg / ml) (10 ug / ml eind) aan 9,9 ml PBS.
- Bestellen Wistar ratten tijd, zodat ze 19 dagen oud op de dag van Sertoli cell isolatie.
Opmerking: De beschreven protocol is ontworpen voor 10 ratten, maar kan worden aangepast voor ten minste 5 en maximaal 20 ratten.De volumes van alle oplossingen moeten worden aangepast. - Bereid Oil Red O voorraad oplossing door het oplossen van 0,35 g Oil Red O in 100 ml isopropanol. Roer O / N, filteren door middel van 0,2 um en bewaar bij kamertemperatuur gedurende maximaal een jaar.
- Bereid Oil Red O kleuring oplossing door het mengen van 6 ml Oil Red O voorraad oplossing met 4 ml water (3: 2). Na 10-20 min filter door middel van 0,2 um. Gebruik in de komende 2 uur.
- Bereid een 4% (w / v) formaldehyde oplossing in een zuurkast door toevoeging van 4 g paraformaldehyde poeder (PFA) met 80 ml 1x PBS onder zacht roeren. Verwarm tot ~ 60 ° C, voeg 1 ml 1 M NaOH en blijf roeren totdat het paraformaldehyd opgelost. Laat de oplossing afkoelen tot kamertemperatuur, breng de pH op 7,4 met 1 M HCl en het volume op 100 ml met 1x PBS. Filtreer de oplossing (0,45 urn) en gebruiken verse of bewaar in monsters bij -20 ° C gedurende enkele maanden.
Opmerking: gepolymeriseerde formaldehyde (PFA) depolymeriseert aan monomeer formaldehyde in water. Deze werkwijze isgekatalyseerd door een lichte verwarming en een licht alkalische pH. Bereid alle enzymoplossingen vers en filter gesteriliseerd (0,2 uM) ze op de dag van gebruik. Als een andere fabrikant voor een enzym (zie Materialen / Apparatuur tabel) wordt gebruikt, nauwkeurig de concentratie / activiteit passen.
In het volgende protocol een "pipet" geeft een serologische pipet.
3. Voorbereiding van zaadkanaaltjes
- Verdoven 10 mannelijke Wistar-ratten één voor één in een exsiccator met behulp CO 2 en een stroomsnelheid die ten minste 20% van het kamervolume per minuut verplaatst. Wacht tot de ademhaling stopt, testen verdoving door knijpen in een voet pad, en als er geen reactie euthanaseren elke rat door cervicale dislocatie. Giet het bloed door het snijden halsader en halsslagader (de vagina carotica) onder stromend water. Ontsmet de buik door bestrijken met 70% ethanol.
- Met behulp van een tang til de huid van de buik muskelen en snijd een ovaal huid kwab die zich uitstrekt van de symfyse aan het borstbeen (Figuur 2A) en de klep naar boven op de borst. Vervolgens pak de buikspieren en maak een mediale incisie van de symfyse aan het borstbeen.
- Knijp de buik met de duimen van het bekken naar boven om de testes uit het kleine bekken duwen. Pluk de epididymis vet pad (figuur 2B) met een pincet voor verdere omhoog te trekken van de testis. Snijd de zaadstreng (Figuur 2B), het verlaten van de tunica albuginea intact, en verzamel alle testes in 20 ml PBS in een 50 ml conische buis (figuur 2C).
- Na alle testes, ontsmetten met een gelijk volume (20 ml) van 1% toevoeging (w / v) jood in ethanol. Keren de buis tweemaal en decanteer de bovenstaande vloeistof onmiddellijk. Snel was de testes tweemaal met 25 ml PBS per (figuur 2D).
- Breng de testes een petrischaal bevating 15 ml PBS (figuur 2E). Pak elke testis stevig door een tang aan de ene kant, maak een kleine incisie in de tunica albuginea aan de andere kant, en knijp de buisjes met gesloten schaarbladen als een scraping tool.
Opmerking: De buisjes moet nog steeds een compacte testikel-vormige bundel vormen met weinig buisjes zich in de oplossing om een homogene enzymatische digestie (Figuur 2F) mogelijk. - Breng de de-ingekapseld testes een 100 ml schroefdop fles met 10 ml trypsine-DNase I-oplossing. Voer de vertering in een schuddend waterbad bij 32 ° C (120 trillingen / min). Na 4 min evalueren tubuli met het blote oog voor verspreiding van tubuli. Zodra buisjes beginnen te verspreiden in de oplossing, stop de spijsvertering onmiddellijk. Eventueel verder incubatie gedurende maximaal 2 minuten.
- Stop trypsine digestie door het toevoegen van 5 ml trypsineremmer oplossing A. de oplossing goed mengen door en neer te pipetteren 3-4 keers met behulp van een 10 ml pipet en overgebracht naar een 50 ml conische buis.
- Na 5 min incubatie observeer de buisjes regelen door eenheid zwaartekracht, verwijder voorzichtig het supernatant met behulp van de 10 ml pipet uit stap 3.6 en voeg 10 ml trypsineremmer B oplossing om volledig te stoppen met trypsine spijsvertering. Resuspendeer de buisjes op en neer te pipetteren 2-3 keer.
- Teneinde verwijderen contaminerende interstitiële cellen was de tubuli 9 maal met 25 ml PBS per. Resuspendeer buisjes in elke wasbeurt met behulp van een 25 ml pipet en hen in staat stellen om zich te vestigen door de eenheid zwaartekracht gedurende 10 min. Gebruik altijd dezelfde 25 ml pipet voor pipetteren PBS, resuspensie en het verwijderen van de bovenstaande vloeistof.
4. Verwijdering / Isolatie van peritubulaire Cells (PTC)
- Breng alle buisjes in een 100 ml schroefdop fles en voeg de collagenase-hyaluronidase-DNase I-oplossing (figuur 3A). Voeren digereren gedurende 10 minuten in een schuddend waterbad bij 32 ° C (120 trillingen / min).
- Pipet een druppel van de suspensie op een glasplaatje en snel de buisjes onder een omgekeerde lichtmicroscoop voor routine celcultuur bij 100x vergroting. Als de spijsvertering is niet ver genoeg gevorderd blijven incubatie voor een extra 2 min (tellen niet mee de tijd die nodig is voor de microscopische controle).
Opmerking: Tijdens deze stap krijgen alle buisjes ingekort in lengte en buisjes randen moeten ruw worden (Figuur 3B en C). Ruwe randen zijn indicatief voor de vrijlating van peritubulaire cellen. - Breng de suspensie met gedigereerd tubules een 50 ml conische buis met de 25 ml pipet uit stap 3,8. Was de fles van 100 ml met 10 ml PBS en voeg deze toe aan de buisjes in de conische buis. Laat de gedigereerde tubuli bezinken door zwaartekracht eenheid 10 min en voorzichtig zuig de supernatant met het PTC, met de 25 ml pipet weer, en overgebracht naar een nieuwe conische buis. Aspiratie van de laatste paar milliliters gebruik maken van een 5 ml pipet in order om eventuele overdracht van buisjes te voorkomen.
- Voeg 20 ml RPMI 1640 medium aangevuld met 10% hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS) aan de verzamelde supernatanten tubulus, mengen en centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur zonder de onderbreking.
- decanteren voorzichtig het supernatant en resuspendeer de gepelleteerde PTC in 20 ml RPMI 1640 medium aangevuld met 10% hitte-geïnactiveerd FBS en zaden 4 ml elk vijf T75 kolven die 16 ml medium per. Incubeer bij 37 ° C in 5% CO2 atmosfeer (Figuur 4A).
- Op de 3e dag van cultuur trypsinize de PTC en ze splitsen 1: 2 op T75 flessen met 16 ml RPMI 1640 medium aangevuld met 10% hitte-geïnactiveerd FBS elk (opbrengst 10 flessen totaal) (figuur 4B). Verder incubatie bij 37 ° C in 5% CO2 atmosfeer.
- Op de 5e dag van kweken trypsinize de PTC steeds plaat ze op 6-well of 24-well platen, afhankelijk van het experiment(Een T75 kolf per plaat). Experimenten kunnen worden uitgevoerd op dag 6.
5. Isolatie van Sertoli cellen (SC)
- Resuspendeer vaste buisjes van 4,3 stap grondig in 25 ml PBS met behulp van een 25 ml pipet en laten bezinken door zwaartekracht eenheid 12 min. Gebruik dezelfde 25 ml pipet voor pipetteren PBS, resuspensie van buisjes en verwijdering van supernatanten. Herhaal de wasbeurt 3 keer (4 wassingen in totaal).
- Na de laatste wasbeurt de verteerde buisjes dragen aan een andere 100 ml schroefdop fles met de hyaluronidase-DNase I-oplossing. Voer de vertering in een schuddend waterbad bij 32 ° C (120 trillingen / min).
- Na 5 min controleer de buisjes weer door het licht microscopisch inzage bij 100X vergroting zoals beschreven in stap 4.2.
Opmerking: Kort buisjes, buisvormige aggregaten en vrijgegeven cellen moeten zichtbaar zijn (Figuur 3D).- Laat het buisvormige aggregaten regelen voor 10 min, en zuig het supernatant onsing een 25 ml pipet. Wassen aggregaten 4 maal gebruik 25 ml PBS en sedimentatie tijd van 10 minuten per wasstap (figuur 3E).
- Voeg 20 ml van RPMI 1640 medium en laat de suspensie 10 keer door een 18 G naald bevestigd aan een 20 ml spuit. Vermijd luchtbellen.
Opmerking: Het trekken van de suspensie in en uit door de naald wordt beschouwd als één gang. De verstoring en homogenisatie van cellen door hydrodynamische afschuifkrachten is een standaardtechniek voor het bereiden van cellen die de neiging hebben te aggregeren. Het doorgeven van de cellen door middel van een injectienaald van kleine binnendiameter is het onwaarschijnlijk dat een impact hebben op hun functionele eigenschappen 25. Figuur 5C en D toont de normale ultrastructuur van gezuiverd Sertoli cellen op dag 4 van de cultuur.- Pipet een druppel van de suspensie op een glasplaatje en snel de buisjes onder een omgekeerde lichtmicroscoop voor routine celcultuur bij 10x vergroting als de aggRegates zijn allemaal verspreid (figuur 3F). Filter de celsuspensie door een 70 um cel zeef om een pure enkelvoudige celsuspensie in het filtraat te verkrijgen.
- Centrifugeer het filtraat van stap 5,4 bij 200 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur zonder de onderbreking. Zorgvuldig aspireren de supernatant met behulp van een 25 ml pipet en resuspendeer de Sertoli cellen in 40 ml RPMI 1640 medium (serumvrij).
- Meng 100 pi celsuspensie met 100 pi van trypan Blue Stain en te tellen cellen met een Neubauer Betere kamer. Stel de celconcentratie tot 3 x 10 6 cellen / ml afhankelijk van het telresultaat. Zaad 1 ml per putje op een plaat met 6 putjes (dag = 1). Als een Oil Red O kleuring (stap 6) gepland zet een deksel slip in één of een paar putten voor het zaaien Sertoli cellen.
Opmerking: Sertoli cellen in suspensie vestigen snel, zodat de buis kort moet worden geschud elke keer voordat een cel monster is genomen met het pipet. Tot en met dag 4 ze stevig attACH aan de ondergrond. - Om zwevende of aanhangende kiemcellen verwijderd op dag 4 (Figuur 4C) wassen elk putje van de 6-well platen voor plateren geïsoleerde Sertoli cellen (stap 5,6) met PBS (figuur 4D). Zuig het medium, voeg 1-2 ml PBS aan elk putje en schud de 6-well platen horizontaal op een tafel krachtig zonder morsen PBS. Herhaal het wassen 3 keer en dezelfde wasprocedure op dag 5 en 6 (Figuur 4E).
Opmerking: Op dag 4 Sertoli cellen stevig hebben gehecht en tonen een geplaveide achtig patroon onder de omgekeerde lichtmicroscoop (Figuur 4C). Experimenten kunnen worden uitgevoerd vanaf dag 7 en later.- (Alternatief voor stap 5,7) Voor het verwijderen van drijvende en hechtende kiemcellen uitvoeren van een hypotone shock 3 dagen na het zaaien op 6-putjesplaten. Verwijder het medium en voeg 1 ml van 20 mM Tris pH 7,5 direct uit de koelkast genomen. Zuig de Tris buffer na 90 tot 120 seconden, maar nietlater. Was de cellen tweemaal met PBS en voeg 2 ml RPMI 1640 medium (serumvrij). Eventueel voeren experimenten de volgende dag.
Opmerking: Hoe langer de duur van de hypotone schok des kiemcellen kan worden verwijderd, maar het meer Sertoli cellen word ook verloren. De eerste PBS wasbeurt moet snel, maar met zorg worden uitgevoerd om eventuele Sertoli cellen niet te verdringen. Direct na hypotone behandeling veel vacuolen van verschillende afmetingen kan worden waargenomen in het cytoplasma door fasecontrast microscopie. Vacuolen verdwijnen binnen een paar uur na hypotone behandeling.
- (Alternatief voor stap 5,7) Voor het verwijderen van drijvende en hechtende kiemcellen uitvoeren van een hypotone shock 3 dagen na het zaaien op 6-putjesplaten. Verwijder het medium en voeg 1 ml van 20 mM Tris pH 7,5 direct uit de koelkast genomen. Zuig de Tris buffer na 90 tot 120 seconden, maar nietlater. Was de cellen tweemaal met PBS en voeg 2 ml RPMI 1640 medium (serumvrij). Eventueel voeren experimenten de volgende dag.
6. Oil Red O kleuring
- Voer alle stappen bij kamertemperatuur. Op dag 7 wash Sertoli cellen gekweekt op een cover slip (stap 5.6) met PBS twee keer en zet ze vast met 10% formaline in PBS. Na 10 min formaline vervangen door verse oplossing en verder bevestiging voor een 60 min.
Let op: Alle oplossingen zijn toegevoegd aan de put (s) met een deksel slip en opgezogen voor de volgende stap. Aspireren formaline, twee keer wassen cellen met water en voeg 60% isopropanol. Na 5 minuten laat cellen drogen gedurende enkele minuten. - Voeg 1 ml Oil Red O kleuroplossing per putje en incubeer gedurende 10 minuten. Zuig de oplossing en wassen cellen direct 4 maal met water en zet dekglaasjes in glycerol-PBS (9: 1). Neem heldere veld beelden met een routine lichtmicroscoop (figuur 4F).
7. immunofluorescentiekleuring
- Was PTCs (van stap 4,5) of Sertoli cellen (uit stap 5,5) gekweekt op een dekglaasje met PBS tweemaal en monteren met 4% PFA gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Incubeer met 5% BSA in PBS gedurende 1 uur bij KT. Gooi de BSA-PBS-oplossing en voeg verse BSA-PBS-oplossing die actine (gladde spier) (voor PTC's) of vimentine (voor Sertoli-cellen) primaire antilichaam (verdunning 1: 100 voor beide antilichamen) en incuberen bij 4 ° CO / N.
Noot: Incubatie met BSA blokken aspecifieke binding van het primaire antilichaam. - Wassen dekglaasjes 3 maal gedurende 5 min in PBS-0,1% Tween 20 en incubeer met groene fluorescerende kleurstof geconjugeerd geit anti-muis secundair antilichaam (verdunning 1: 1000) bij kamertemperatuur gedurende 1 uur in het donker.
- Wassen dekglaasjes 3 maal gedurende 5 min in PBS-0,1% Tween 20 en zet ze in DAPI fixeermiddel.
8. ultrastructurele analyse
- Wassen Sertoli cellen (uit stap 5,6) gekweekt op een 6 cm celkweek plaat met PBS en los deze gedurende 2 uur bij 4 ° C in een mengsel van 2,5% glutaaraldehyde, 2,5% paraformaldehyde en 0,05% picrinezuur in 67 mM cacodylaat buffer ( pH 7,4) volgens Ito en Karnovsky 26.
- Post-fixatie in 1% osmiumtetroxide, gevolgd door een O / N incubatie in 0,3% uranyl acetaat opgelost in 50 mM maleaat buffer (pH 5). Insluiten monsters inbedden media volgens standaard procedures. Snijd dunne secties, contrasteren met lood citraat en onderzoek met een elektronenmicroscoop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De beschreven werkwijze maakt isolatie van ongeveer 12 x 10 7 Sertoli cellen uit 10 ratten testes. 3 x 10 6 cellen per putje op een plaat met 6 putjes zodat zes tot zeven 6-well platen zijn voor experimenten op dag 7. Het trypsine-digestie DNase I is de meest cruciale stap in Sertoli cell isolatie. Als digestie op dit punt te ver vordert, de verhouding van kiemcellen / Sertoli cellen disproportioneel verhogen tot het einde. Gedurende dag 3-6 van de cultuur is het belangrijk om afstand talrijke niet-aanhangende of losjes gebonden kiemcellen zorgvuldig wassen mogelijk. Als alternatief voor uitgebreide wassingen dan 4 dagen kiemcellen kan worden verwijderd door hypotonische behandeling op dag 3 27. Een voordeel van deze methode is dat de tijd van Sertoli celkweek tot een minimum wordt gehouden zodat Sertoli cel-specifieke functies zijn potentieel beter behield dan na een lange periode van kweek.
(Figuur 5B). Omdat peritubulaire cellen een sterk proliferatief potentieel Sertoli celkweek moet worden uitgevoerd in afwezigheid van serum. In de aanwezigheid van 10% serum PTC zou ongeveer 20% van alle cellen vormen na 6 dagen kweken terwijl de fractie kan worden verwacht dan 1% in de afwezigheid van serum 7. Vrijwel alle geïsoleerd Sertoli cellen levensvatbaar zoals beoordeeld door trypan blauw kleuring (niet getoond). Rond dag 7 van de cultuur de geïsoleerde Sertoli cellen minste verontreinigd met kiemcellen en peritubulaire cellen (figuur 4), zodat experimenten worden uitgevoerd rond heden indien mogelijk. Voor goede reproduceerbaarheid is het belangrijk experiment herhalenis altijd op dezelfde dag van de cultuur. Als transfecties gepland uitgevoerd moeten worden op dag 4 of 5, en celextracten worden gemaakt op dag 5 of 6.
Over ten minste twee weken in serumvrije omstandigheden Sertoli cellen reageren op FSH en produceren meer androgeen-bindend eiwit, plasminogeen activator en transferrine op FSH behandeling. Voor langere cultuur een feeder-laag van peritubulaire cellen of serum is verplicht. Na vier weken culturen verslechteren en cellen los van de ondergrond 7.
Op dag 6 van de cultuur meeste Sertoli cellen zijn vetdruppels verworven. In de meeste cellen een grote vacuole gevormd (Figuur 5C en 5D). De neutrale vetgehalte kan eenvoudig worden gevisualiseerd door Oil Red O kleuring (Figuur 4F).
Naast Sertoli cel Is de verwijderde PTC kan ook worden gekweekt (Figuur 4A en 4B). PTCs van 10 testes op vijf T75 kolven te verwachten een confluente laag na 2 dagen kweken vormen. Net als geïsoleerde Sertoli cellen vers geïsoleerde PTC's zijn besmet met kiemcellen die grotendeels door de passage kan worden verwijderd. Kolven worden gesplitst 1: 2 door middel van standaard behandeling met trypsine zodat 10 kolven worden confluent op dag 5 na isolatie. Zuiverheid van geïsoleerde PTC is> 95% en kan worden bevestigd met α-gladde spier actine immunokleuring (Figuur 5A). Ingang van heden PTC kan worden gebruikt voor experimenten. Een fles is voldoende voor ongeveer een 6-well plaat, en putjes de volgende dag confluent. Cellen kunnen vele malen worden gepasseerd, maar experimenten moet altijd worden uitgevoerd op hetzelfde punt om ervoor te zorgen dat cellen zich op een reproduceerbare wijze.
uploaden / 53389 / 53389fig1.jpg "/>
Figuur 1. Morfologie van de testis en workflow van de procedure. (A) een sector van een seminiferous met aangrenzende bindweefsel is schematisch weergegeven. Testes worden omsloten door een basaal membraan (BM) en een rondlopende laag myoid peritubulaire cellen (PTC). De kiemepitheel ligt aan de luminale zijde van het basale membraan. Sertoli cellen (SC), verspreid over de hele kiemepitheel zijn sterk gehecht aan de BM en met elkaar verbonden via basolaterale gepositioneerd occludensverbindingen die de bloed-testis barrière (BTB). Hun onregelmatige nucleus (N) toont één of meer spleet-achtige inkepingen en bevat een nucleolus. Kiemcellen (GC) zijn in nauw contact met SC's in alle stadia van hun ontwikkeling. De interstitiële compartiment tussen de tubules bevat Leydig cellen (LC) en immuun cellen zoals macrofagen (MO) en bloedvaten (BV). Figuuraangepast van Fijak en Meinhardt 28. (B) Workflow van de procedure; kleurcodering is zoals in (A). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Testes van Wistar ratten werden uitgesneden en ontkapseld. (A) De buikholte wordt geopend door middel van een longitudinale snede in de tekst. Een sterretje (*) geeft de epidydimal vet pad. (B) testes verwijderd door snijden van de Zaadstreng en (C) verzameld in een 50 ml conische buis met 20 ml PBS. Wanneer alle testes werden verzameld zij ontsmet 20 ml 1% (w / v) jood in ethanol. Voor het verwijderen van de jodium zij snel tweemaal met 25 mlPBS elk. (D) Testikels na de eerste PBS wassen. (E) Testes overgebracht naar een petrischaal (rechts) en testes zijn uit de geopende tunica albuginea geperst bij gesloten schaarbladen (aan de linkerkant) zoals beschreven in de tekst. (F) De decapsulated testes vormen nog steeds een compact testikel-vormige massa met enkele buisjes uitsteekt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Isolatie van Sertoli cellen. (A) Na verwijdering van interstitiële cellen door trypsine-DNase I spijsvertering en wassen 9x met PBS buisjes worden gemobiliseerd en schoon uit. (B) Tijdens collagenase-hyaluronidase-DNase I behandeling peritubulaire cels van de buitenlaag en kiemcellen vrijkomen. De buisjes krijgen ingekort en het verkrijgen van een ruw uiterlijk. (C) Tubular fragmenten na wassen 4x met PBS. (D) hyaluronidase-DNase I behandeling releases residuele peritubulaire cellen en kiemcellen. Buisjes krijgen verder verkort, en tubulaire aggregaten te vormen. (E) tubulaire aggregaten na wassen 4x met PBS. (F) Single Sertoli cellen worden geproduceerd door het passeren van de aggregaten 10x via een 18G naald. Schaal bars in (AE) = 200 urn, in (F) = 50 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Culture van peritubulaire cellen (AB) en Sertoli cellen (CF) en verwijdering van contaminat ing kiemcellen. (A) Geresuspendeerde PTCs uit stap 4.5 werden onmiddellijk gezaaid en fotografeerde de volgende dag. (B) Na splitsing op dag 3 besmetting geslachtscellen verminderd. (C) Op dag 4 Sertoli cellen een typisch geplaveide patroon. Drijvende en het daaraan vastzittende kiemcellen zijn zichtbaar voor het wassen met PBS. (D) Dezelfde ver na wassen 3x met PBS. Het aantal contaminerende kiemcellen verminderd. Driemaal wassen met PBS werd herhaald op dag 5 en 6 (E) Op dag 6 van de kweek vrijwel alle kiemcellen zijn verwijderd. Sertoli cellen unique zoek cellaag gevormd, en de meeste cellen een grote vacuole verkregen. (F) Olie rode O kleuring toont aan dat deze vacuolen zijn vetdruppels die grotendeels neutraal lipiden. Schaalbalken in (AD) = 200 urn, in (E) = 50 urn en met (F) = 25 pm..jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Immunofluorescentiekleuring. Kleuring gezuiverd peritubulaire primaire cellen met actine (gladde spier) antilichaam (A) en Sertoli-cellen met vimentine antilichaam (B). Geen vervuilende cellen zichtbaar zijn beide gezichtsvelden in. Schaalbalk in (A) en (B) = 10 urn. (C) en (D) Electronenmicroscopische Foto Sertoli cellen na 4 dagen in kweek. (C) Opmerking het nauwe contact van aangrenzende cellen (pijlpunten) die leidt naar de geplaveide-achtig patroon zoals getoond in figuur 4C. Eén druppel lipide (L) wordt waargenomen in het cytoplasma van elke cel. (D) Het meest overvloedige organellen mitochondria (M) en het Golgi-apparaat (G).De nucleus (N) bevat een nucleolus (NC) en toont de typische spleet-achtige inspringen. Schaal bar in (C) = 1 pm en in (D) = 0,25 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen graag bedanken Guido Verhoeven en Ludo Deboel, Leuven, die was zeer behulpzaam bij het vaststellen van de isolatie van primaire Sertoli cellen in het lab Meinhardt in Giessen waren. Monika Fijak, Gießen, is erkend voor haar hulp met figuur 1A en advies. Studies werden ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft door middel van subsidie BH 93 / 1-1 (SB) en de financiering van het International Research Graduate College JLU Gießen (Duitsland) / Monash University (Melbourne, Australië) GRK 1871 (SB). Ondersteuning werd ook verkregen uit een subsidie van de staat van Hessen binnen het programma "Landes-Offensive zur Entwicklung wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz" (LOEWE) genaamd "männliche Infertilität bei Infektion & Entzündung" (MIBIE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Actin (smooth muscle) antibody clone 1A4 | Dako | M0851 | Monoclonal mouse anti human antibody. Use 1:100 dilution for immunofluorescence. |
| Albumin bovine fraction V Standard grade, lyophilized |
Serva | 11930.04 | Filter (0.45 µm) BSA solutions used for immunofluorescence. |
| Corning Cell Strainers 70 µm | Corning | 431751 | White color |
| Collagenase A from Clostridium histolyticum | Roche | 10103586001 | |
| DAPI mountant ProLong Gold Antifade | Life technologies | P-36931 | |
| D-glucose | Sigma | G8644 | 100 g/L |
| Dulbecco´s PBS without Ca2+/Mg2+ | Gibco | 14190-094 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Electron microscope | Zeiss | EM 109S | |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axioplan 2 | |
| Hyaluronidase from bovine testis | Sigma | H3506 | |
| Inverted light microscope | Olympus | CKX41 | Routine cell culture microscope |
| Mouse IgG / IgM (H+L) polyclonal secondary Antibody |
Life technologies | A-10684 | Alexa Fluor 488 conjugate |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | Has replaced Sudan III and Sudan IV because of brighter color. |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Penicillin (5,000 U/ml)/ Streptomycin (5,000 µg/ml) |
Gibco | 15070-063 | 100x solution |
| RPMI-1640 | Gibco | 21875-034 | Contains 300 mg/L L-glutamine |
| Trypsin from porcine pancreas | Sigma | T5266 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin inhibitor from soybean | Sigma | T6522 | The Sigma product is considerably cheaper than the previously used BPTI (Aprotinin) from Roche. |
| Vimentin antibody (V9) | Sigma | V6630 | Monoclonal mouse anti pig vimentin antibody. Use 1:100 dilution for immunofluorescence. |
| Wistar WU rats | Charles River | Should be 19 days old on day of experiment. |
References
- Andrology. Male Reproductive Health and Dysfunction. Nieschlag, E., Behre, H., Nieschlag, S. , 3rd ed, Springer. (2010).
- Esaki, S. Über Kulturen des Hodengewebes der Säugetiere und über die Natur des interstitiellen Hodengewebes und der Zwischenzellen. Z. Mikrosk. Anat. Forsch. 15, 368-404 (1928).
- Hall, P. F., Irby, D. C., De Kretser, D. M. Conversion of cholesterol to androgens by rat testes: comparison of interstitial cells and seminiferous tubules. Endocrinology. 84, 488-496 (1969).
- Welsh, M. J., Wiebe, J. P. Rat sertoli cells: a rapid method for obtaining viable cells. Endocrinology. 96, 618-624 (1975).
- Vitale, R., Fawcett, D. W., Dym, M. The normal development of the blood-testis barrier and the effects of clomiphene and estrogen treatment. Anat. Rec. 176, 331-344 (1973).
- Dorrington, J. H., Roller, N. F., Fritz, I. B. Effects of follicle-stimulating hormone on cultures of Sertoli cell preparations. Mol. Cell. Endocrinol. 3, 57-70 (1975).
- Tung, P. S., Skinner, M. K., Fritz, I. B. Fibronectin synthesis is a marker for peritubular cell contaminants in Sertoli cell-enriched cultures. Biol. Reprod. 30, 199-211 (1984).
- Verhoeven, G., Cailleau, J. Testicular peritubular cells secrete a protein under androgen control that inhibits induction of aromatase activity in Sertoli cells. Endocrinology. 123, 2100-2110 (1988).
- Tung, P. S., Dorrington, J. H., Fritz, I. B. Structural changes induced by follicle-stimulating hormone or dibutyryl cyclic AMP on presumptive Sertoli cells in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 72, 1838-1842 (1975).
- Teng, Y., et al. Isolation and culture of adult Sertoli cells and their effects on the function of co-cultured allogeneic islets in vitro. Chin. Med. J. (Engl.). 118, 1857-1862 (2005).
- Kohno, S., Ziparo, E., Marek, L. F., Tung, K. S. Murine Sertoli cells: major histocompatibility antigens and glycoconjugates. J. Reprod. Immunol. 5, 339-350 (1983).
- Dufour, J. M., et al. Sertoli cell line lacks the immunoprotective properties associated with primary Sertoli cells. Cell Transplant. 17, 525-534 (2008).
- Majumdar, S. S., Tsuruta, J., Griswold, M. D., Bartke, A. Isolation and culture of Sertoli cells from the testes of adult Siberian hamsters: analysis of proteins synthesized and secreted by Sertoli cells cultured from hamsters raised in a long or a short photoperiod. Biol. Reprod. 52, 658-666 (1995).
- Zhang, H., Liu, B., Qiu, Y., Fan, J., Yu, S. Pure cultures and characterization of yak Sertoli cells. Tissue Cell. 45, 414-420 (2013).
- Ziparo, E., Geremia, R., Russo, M. A., Stefanini, M. Surface interaction in vitro between Sertoli cells and germ cells at different stages of spermatogenesis. Am. J. Anat. 159, 385-388 (1980).
- Anway, M. D., Folmer, J., Wright, W. W., Zirkin, B. R. Isolation of Sertoli cells from adult rat testes: an approach to ex vivo studies of Sertoli cell function. Biol. Reprod. 68, 996-1002 (2003).
- Scarpino, S., et al. A rapid method of Sertoli cell isolation by DSA lectin, allowing mitotic analyses. Mol. Cell. Endocrinol. 146, 121-127 (1998).
- Mather, J. P. Establishment and characterization of two distinct mouse testicular epithelial cell lines. Biol. Reprod. 23, 243-252 (1980).
- Korbutt, G. S., Elliott, J. F., Rajotte, R. V. Cotransplantation of allogeneic islets with allogeneic testicular cell aggregates allows long-term graft survival without systemic immunosuppression. Diabetes. 46, 317-322 (1997).
- Fritz, I. B. Somatic cell-germ cell relationships in mammalian testes during development and spermatogenesis. Ciba Found. Symp. 182, 271-281 (1994).
- Whaley, P. D., Chaudhary, J., Cupp, A., Skinner, M. K. Role of specific response elements of the c-fos promoter and involvement of intermediate transcription factor(s) in the induction of Sertoli cell differentiation (transferrin promoter activation) by the testicular paracrine factor PModS. Endocrinology. 136, 3046-3053 (1995).
- Bhushan, S., et al. Uropathogenic Escherichia coli block MyD88-dependent and activate MyD88-independent signaling pathways in rat testicular cells. J. Immunol. 180, 5537-5547 (2008).
- Meinhardt, A., Hedger, M. P. Immunological, paracrine and endocrine aspects of testicular immune privilege. Mol. Cell. Endocrinol. 335, 60-68 (2011).
- Fijak, M., et al. Influence of Testosterone on Inflammatory Response in Testicular Cells and Expression of Transcription Factor Foxp3 in T Cells. Am. J. Reprod. Immunol. , 12-25 (2015).
- Mamidi, M. K., et al. Impact of passing mesenchymal stem cells through smaller bore size needles for subsequent use in patients for clinical or cosmetic indications. J. Transl. Med. 10, 229 (2012).
- Ito, S., Karnovsky, M. J. Formaldehyde-glutaraldehyde fixatives containing trinitro compounds. J. Cell. Biol. 39, 168-169 (1968).
- Galdieri, M., Ziparo, E., Palombi, F., Russo, M. A., Stefanini, M. Pure Sertoli cell cultures: a new model for the study of somatic-germ cell interactions. J. Androl. 5, 249-254 (1981).
- Fijak, M., Meinhardt, A. The testis in immune privilege. Immunol. Rev. 213, 66-81 (2006).
- Jegou, B. The Sertoli cell in vivo and in vitro. Cell Biol. Toxicol. 8, 49-54 (1992).
- Pineau, C., Le Magueresse, B., Courtens, J. L., Jegou, B. Study in vitro the phagocytic function of Sertoli cells in the rat. Cell Tissue Res. 264, 589-598 (1991).
- Ren, Y., Savill, J. Apoptosis: the importance of being eaten. Cell Death Differ. 5, 563-568 (1998).
- Ducray, A., et al. Establishment of a mouse Sertoli cell line producing rat androgen-binding protein (ABP). Steroids. 63, 285-287 (1998).
- Konrad, L., et al. Rat Sertoli cells express epithelial but also mesenchymal genes after immortalization with SV40. Biochim. Biophys. Acta. 1722, 6-14 (2005).
