Summary
Primære Sertoliceller er nødvendige for at studere testis-immune privilegium, signaltransduktion under betændelse eller infektion, og udnyttelse af deres immunbeskyttende egenskaber. Her beskriver vi en enzym-baseret protokol til isolering af højtoprensede primære Sertoliceller og peritubulære celler fra rotte testikler.
Abstract
Testiklerne, og især den mandlige gamet, udfordrer immunsystemet på en unik måde, fordi differentieret sperm først vises på tidspunktet for puberteten - mere end ti år efter etableringen af systemiske immun tolerance. Spermatogene celler udtrykker en række proteiner, der kan ses som ikke-selv af immunsystemet. Testiklerne skal derefter kunne etablere tolerance over for disse neo-antigener på den ene side, men stadig være i stand til at beskytte sig mod infektioner og tumorudvikling på den anden side. Derfor testiklerne er en af et par immune privilegerede steder i kroppen, der tåler fremmede antigener uden at fremkalde en skadelig inflammatorisk immunrespons. Sertoli celler spiller en central rolle for vedligeholdelse af denne immune privilegeret miljø af testiklerne og også forlænge overlevelsen af cotransplanted celler i et fremmed miljø. Derfor primære Sertolicellerne er et vigtigt redskab til at studere immun privilegium testiklerne, der ikke kan være easily erstattet af etablerede cellelinjer eller andre cellulære modeller. Her præsenterer vi en detaljeret og omfattende protokol til isolering af Sertoliceller - og peritubulære celler hvis det ønskes - fra rotte testikler inden for en enkelt dag.
Introduction
Testiklerne producerer mandlige kønsceller og kønshormoner, dvs, androgener. Organet består af to rum. I det interstitielle rum, som repræsenterer omkring 10-12% af den samlede testikelkræft bind 1, steroidgenese foregår inden for Leydig-celler. Det rørformede kammer udgør ca. 60-80% af den testikel bind 1 og indeholder kimceller og to typer af somatiske celler - peritubulære celler og Sertoliceller. Testiklerne er delt af bindevæv septa i 250-300 lobules, hver indeholdende 1-3 stærkt snoede sædkanalerne. Disse tubuli er omgivet af en basalmembran, et ark af collagen, og et rundtgående lag af peritubulære celler (figur 1A).
Den germinale epitel er placeret på den luminale side af basalmembranen. Sertoliceller er store langstrakte celler, der spænder over hele germinale epitel fra basalmembranen til hulrummet. De er stærkt attgjorde ondt til basalmembranen og udgøre et sammenhængende cellulær ark gennem basolaterale organiserede tight junctions, der okkluderer germinale epitel fra interstitium og repræsenterer blod-testis-barrieren. Sertolicellerne har prominente cytoplasmatiske fremskrivninger og forgreninger, der sætter dem i stand til at komme ind i stramme morfologiske og funktionelle kontakt med en artsspecifik, men konstant antal kønsceller. Diploide germinale stamceller formering og differentiering til spermatogonier.
Under meiose I kortlivede tetraploide spermatocytter genereres der udvikler videre i fire haploide spermatider under meiose II. Alle kimceller er indbyrdes forbundet ved cytoplasmatiske broer således at de danner en cellulær net. Den væsentligste begivenhed under modning af spermatider er ekstrudering af store dele af cytoplasmaet, danner resterende organer, i en proces kaldet sædcelledannelse. Resterende organer fagocyteres af Sertoli celler. Sene spermatider derefter frigives tilde rørformede hulrum og transporteret ind bitestiklen for yderligere modning. Sertoliceller og kønsceller synes at gensidigt koordinere spermatogenesen topografisk og funktionelt.
Udarbejdelse af individuelle testikelkræft celletyper startede næsten et århundrede siden, da små testikel stykker blev dyrket og celletyper identificeres ved mikroskopi 2. Ved omhyggelig dissektion af tubuli efter åbning tunica albuginea med fint-tippes pincet var det senere muligt at adskille rørformet og interstitielle rum 3. I 1975 Welsh og Wiebe indført en kollagenase behandling for at befri tubuli i at hæfte interstitiel væv og en pancreatin behandling til fjernelse af det ydre peritubular cellelag 4. Fra tidligt på unge umodne rotter (ca. 20 dage gamle) var blevet anvendt, hvor Sertoli celler omfatter en stor del af den rørformede cellepopulation fordi spermatogenesen ikke er begyndt endnu. I denne alder rotte SertOLI celler ophører med at dele sig, og tætte forbindelser mellem naboceller danner så blod-testis-barrieren er etableret 5.
Uafhængigt af Welsh og Wiebe Dorrington et al. Indført en kombination af trypsin og deoxyribonuclease efterfulgt af soybeen trypsin inhibitor og collagenase behandling, der blev offentliggjort i samme år 6. Begge grupper anvendes også mekanisk kraft (tegning de spaltede rørformede fragmenter gentagne gange gennem en sprøjtenål eller en Pasteur pipette henholdsvis) for at frembringe en homogen cellesuspension til galvanisering, der indeholder ca. 70% Sertoliceller. Efter 3 dage i kultur, ved hjælp af et medium, der er serumfrit, procentdelen af Sertoli celler stiger til ca. 90%. Dette kunne især tilskrives en død kontaminerende kimceller. Resterende peritubulære celler (PTC), dog holde solidt fastgjort via deres ekstracellulære matrix. PTC'er, men ikke Sertoli celler, vides at producerefibronectin, der kan tjene som markør-protein til estimering kontaminering med PTC'er. Derfor Tung et al. ræsonnerede, at en yderligere hyaluronidase behandling kan forbedre renheden af Sertolicellen fraktion 7. Faktisk kunne de vise, at en yderligere behandling kunne reducere forurening med PTC'er ca. 20-fold, som bliver særlig tydeligt, når et serum-holdigt medium i sammenligning anvendes til dyrkning af oprensede Sertoliceller. Fra da af den forbedrede procedure for Tung et al. blev den fremherskende protokol og blev flittigt brugt af andre større grupper på området 8 (figur 1B).
Under collagenasebehandling flertallet af PTC'er frigives og kan isoleres parallelt med Sertoliceller. Ud fra følgende betragtninger PTC'er kraftigt formere og reagerer ikke på follikelstimulerende hormon (FSH), behøver Sertoliceller ikke undergår mitose længere, og reagere på FSH ved karakteristiske morfologiske ændringerog en stigning i cyklisk adenosinmonophosphat (cAMP) koncentration 9. Meget lignende enzymatisk nedbrydning protokoller kan anvendes til isolering af primære Sertoliceller fra andre dyr som mennesket 10, muse 11,12, sibirisk hamster 13 eller yak 14. Til fjernelse af store mængder forurenende kønsceller en hypotonisk chok kan anvendes ved afslutningen af den isolation procedure 15. Dette muliggør også en effektiv isolering af Sertoliceller fra voksen rotte testikler 16. En beriget Sertolicellen suspension kan også separeres fra kimceller ved udpladning af suspensionen på lectin retter overtrukket med Datura stramonium agglutinin 17. Kun Sertoliceller og et par resterende PTC'er overholde lectin plader.
Primær Sertoli cellekulturer, hovedsageligt fra rotten, er oprindeligt brugt til undersøgelse lydhørhed over for hormoner eller oprettelse cellelinjer som muse Sertolicellen line TM4 18. Denne cellelinie er blevet undersøgt i mere end hundrede studier frem til i dag. I en translationel tilgang Sertoliceller er blevet brugt til immun-beskyttelse af co-dyrkede celler og væv som i co-transplantation af fremmedfjendske eller allogene pancreas-øer for langsigtet graftoverlevelse uden systemisk immunosuppression 19. Isolerede Sertoli-celler er også blevet anvendt i co-kultur eksperimenter til undersøgelse epitel-mesenkymale (Sertoliceller - PTCc) og somatisk-kønsceller (Sertoliceller - kimceller) interaktioner 20, 21. Senest primære Sertoliceller er blevet anvendt til undersøgelse af ekspression af Toll-lignende receptorer og sekretionen af proinflammatoriske cytokiner samt signaltransduktionsegenskaberne kaskader fører til cytokinekspression efter infektion med patogene og uropatogen E. coli 22. Andre nylige undersøgelser brugte Sertoliceller for at studere testikelkræft immun privilege 23 og viste, at testosteron-forbehandling undertrykker LPS-inducerede inflammatoriske respons 24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Dyreetiske Statement
Eksperimenter er beskrevet her, blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne i Regierungspräsidium Giessen, Tyskland, som den lokale myndighed og bekræft til den tyske adfærdskodeks for pasning og anvendelse af dyr til forsøg (Tilladelse nr.: GI 20/23 Nr A 31 / 2012).
2. Udarbejdelse af Medier, enzymløsninger og Dyr
- Forberede 1% jod alkohol ved at opløse 1 g iod i 100 ml ethanol.
- Forbered 2x 500 ml Dulbecco phosphatbufret saltvand (PBS) uden Ca2 + og Mg2 + suppleret med hver 7,5 ml D-glucose (100 g / L) og 5 ml 100x Penicillin / Streptomycin stamopløsning (15 mg / ml D glucose, 50 U / ml penicillin og 50 ug / ml streptomycin endelig).
- Supplement 1x 500 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium med 5 ml 100x Penicillin / Streptomycin stamopløsning (50 U / ml penicillin og 50 ug / ml streptomycin final).
- Forbered en Trypsin-DNase I-opløsning (2,5 mg / ml trypsin og 10 ug / ml DNase I) ved tilsætning af 25 mg trypsin og 0,1 ml DNase I (1 mg / ml DNase I) til 9,9 ml PBS.
- Opløs 50 mg Trypsininhibitor i 5 ml PBS i Trypsininhibitor En opløsning (10 mg / ml). Opløs 25 mg Trypsininhibitor i 10 ml PBS i Trypsininhibitor B-opløsning (2,5 mg / ml).
- For en Collagenase-hyaluronidase-Deoxyribonuklease I (DNase I) opløsning opløses 10 mg Collagenase A (1 mg / ml slut), 10 mg hyaluronidase (1 mg / ml endelig) og 0,1 ml DNase I (1 mg / ml DNase I) ( 10 ug / ml slut) i 10 ml PBS.
- Forbered en hyaluronidase-DNase I-opløsning ved tilsætning af 10 mg hyaluronidase (1 mg / ml endelig) og 0,1 ml DNase I-opløsningen (1 mg / ml) (10 ug / ml slut) til 9,9 ml PBS.
- Bestille Wistar-rotter til tiden, så de er 19 dage gamle på dagen for Sertolicellen isolation.
Bemærk: Den beskrevne protokol er beregnet til 10 rotter, men kan modificeres i mindst 5 og højst 20 rotter.De mængder af alle løsninger skal justeres i overensstemmelse hermed. - Forbered Oil Red O-stamopløsning ved at opløse 0,35 g Oil Red O i 100 ml isopropanol. Stir O / N, filtrer gennem 0,2 um og opbevares ved stuetemperatur i op til et år.
- Forbered Oil Red O-farvning opløsning ved at blande 6 ml Oil Red O stamopløsning med 4 ml vand (3: 2). Efter 10-20 min filtreres gennem 0,2 um. Brug inden for de næste 2 timer.
- Der fremstilles en 4% (vægt / volumen) formaldehydopløsning i et ventileret stinkskab ved tilsætning af 4 g paraformaldehyd pulver (PFA) til 80 ml 1x PBS under omrøring forsigtigt. Opvarm til ~ 60 ° C, tilsættes 1 ml 1 M NaOH og fortsæt omrøring indtil paraformaldehydet er opløst. Lad opløsningen afkøle til stuetemperatur, pH indstilles til 7,4 med 1 M HCI og volumenet til 100 ml med 1x PBS. Opløsningen filtreres (0,45 um) og bruge frisk eller opbevares i portioner ved -20 ° C i flere måneder.
Bemærk: Polymeriseret formaldehyd (PFA) depolymeriserer til monomert formaldehyd i vand. Denne proces erkatalyseret af moderat varme og et let basisk pH. Forbered alle enzymløsninger frisk og filter sterilisere (0,2 uM) dem på dagen for brug. Hvis en anden producent for et enzym (se Materialer / udstyr tabel) bruges, omhyggeligt justere sin koncentration / aktivitet.
I det følgende protokol en "pipette" står for en serologisk pipette.
3. Udarbejdelse af sædkanaler
- Bedøver 10 Wistar-hanrotter en efter en i en ekssikkator under anvendelse CO2 og en strømningshastighed, der forskyder mindst 20% af kammerets volumen per minut. Vent vejrtrækning stopper, test anæstesi ved at klemme en fod pad, og hvis der er nogen reaktion aflive hver rotte ved cervikal dislokation. Tøm blodet ved sektionering halsvene og halspulsåren (vagina carotica) under rindende vand. Desinficer maven ved aftørring med 70% ethanol.
- Ved anvendelse af pincetter løfte huden fra den abdominale MUScykler og skære en oval formet hud lap, der strækker sig fra skambenssammenføjning til sternum (figur 2A) og flap den opad på brystet. Næste, tag fat i mavemusklerne og gøre en medial snit fra skambenssammenføjning til brystbenet.
- Klem maven med tommelfingrene fra bækkenet opad for at skubbe testiklerne ud af de nedre bækken. Vælg den epididymal fedt pad (figur 2B) med pincet til at trække op testiklerne yderligere. Skær sædstrengen (figur 2B), hvilket efterlader tunica albuginea intakt, og indsamle alle testikler i 20 ml PBS i et 50 ml konisk rør (figur 2C).
- Efter opsamling alle testikler, desinficere dem ved tilsætning af et lige volumen (20 ml) på 1% (vægt / volumen) iod i ethanol. Vend røret to gange og dekanter supernatanten straks. Hurtigt vaske testiklerne to gange med 25 ml PBS hver (figur 2D).
- Overfør testiklerne til en petriskål indeholdering 15 ml PBS (figur 2E). Tag fat hver testikel fast ved pincet i den ene ende, lave et lille snit i tunica albuginea i den modsatte ende, og presse de tubuli hjælp lukkede saks klinger som et skrabende værktøj.
Bemærk: De tubuli skal stadig danne en kompakt testikel-formet bundt med kun et par tubuli strækker sig ind i opløsningen for at muliggøre homogen enzymatisk fordøjelse (figur 2F). - Overfør de-indkapslet testiklerne til en 100 ml skruelåg flaske indeholdende 10 ml Trypsin-DNase I-opløsning. Udfør fordøjelsen i et rystevandbad ved 32 ° C (120 svingninger / min). Efter 4 min evaluere tubuli med det blotte øje for dispersion af tubuli. Når tubuli begynder at spredes i løsningen, straks stoppe fordøjelsen. Hvis det er nødvendigt, fortsætte inkubation i op til 2 min.
- Stop trypsin fordøjelse ved tilsætning af 5 ml trypsin-inhibitor opløsning A. Bland opløsningen ved pipettering op og ned 3-4 tids ved hjælp af en 10 ml pipette og overføre det til en 50 ml konisk rør.
- Efter 5 minutters inkubation observere tubuliene afregne ved enhed tyngdekraften, fjern forsigtigt supernatanten ved hjælp af 10 ml pipette fra trin 3.6 og tilsættes 10 ml trypsininhibitor B-opløsning for fuldt ud at stoppe trypsin fordøjelse. Resuspendere tubuli ved pipettering op og ned 2-3 gange.
- For at fjerne kontaminerende interstitielle celler vaskes tubuliene 9 gange med 25 ml PBS hver. Resuspender tubuli i hver vask ved hjælp af en 25 ml pipette og give dem mulighed for at bosætte sig efter enhed tyngdekraft i 10 min. Brug altid den samme 25 ml pipette til pipettering PBS, resuspension og fjernelse af supernatanten.
4. Fjernelse / Isolering af peritubulære Cells (PTC)
- Overfør alle tubuli til en 100 ml skruelåg flaske og tilsæt Collagenase-hyaluronidase-DNase I-opløsning (figur 3A). Udfør fordøjelse i 10 minutter i et rystevandbad ved 32 ° C (120 svingninger / min).
- Pipette en dråbe af suspensionen på et objektglas og hurtigt kontrollere tubuli under et omvendt lysmikroskop for rutinemæssig cellekultur 100x forstørrelse. Hvis fordøjelsen er ikke avanceret nok fortsætte inkubation i yderligere 2 min (tæller ikke den nødvendige tid til den mikroskopiske check).
Bemærk: Under dette trin alle tubuli bliver forkortet i længde og tubulære kanter bør blive ru (figur 3B og C). Uslebne kanter er vejledende for frigivelse af peritubulære celler. - Overfør suspensionen med spaltede tubuli til en 50 ml konisk rør ved anvendelse af 25 ml pipette fra trin 3.8. Vask 100 ml flaske med 10 ml PBS og føje den til tubuli i den koniske rør. Lad de fordøjede tubuli at bosætte efter enhed tyngdekraft i 10 min, og omhyggeligt aspireres supernatanten, der indeholder de PTC'er, ved hjælp af 25 ml pipette igen, og overføre det til en ny konisk rør. For aspiration af de sidste par milliliter bruger en 5 ml pipette i order for at forhindre enhver overførsel af tubuli.
- Tilsæt 20 ml RPMI 1640-medium suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS) til de indsamlede tubulære supernatanterne, blandes og centrifugeres ved 300 xg i 10 minutter ved stuetemperatur uden at bruge pausen.
- dekanteres omhyggeligt supernatanten og resuspender pelleterede PTC'er i 20 ml RPMI 1640-medium suppleret med 10% varmeinaktiveret FBS og frø 4 ml hver på fem T75 kolber indeholdende 16 ml medium hver. Der inkuberes ved 37 ° C i 5% CO2-atmosfære (figur 4A).
- På den 3. dag af kulturen Trypsinisér de PTC'er og opdele dem 1: 2 på T75-kolber indeholdende 16 ml RPMI 1640-medium suppleret med 10% varmeinaktiveret FBS hver (udbytter 10 kolber sammen) (figur 4B). Fortsæt inkubation ved 37 ° C i 5% CO2-atmosfære.
- På den 5. dag af kulturen Trypsinisér de PTC'er igen og pladen dem på 6-brønds eller plader med 24 brønde afhængigt af forsøget(En T75 kolbe pr plade). Eksperimenter kan udføres på dag 6.
5. Isolering af Sertoliceller (SC'er)
- Resuspender de bosatte tubuli fra trin 4.3 grundigt i 25 ml PBS ved hjælp af en 25 ml pipette og give dem mulighed for at bosætte sig efter enhed tyngdekraft i 12 min. Brug samme 25 ml pipette til pipettering PBS, resuspension af tubuli og fjernelse af supernatanter. Gentag vask 3 gange (4 vaske i alt).
- Efter den sidste vask overføre de fordøjede tubuli til en anden 100 ml skruelåg flaske indeholdende hyaluronidase-DNase I-opløsning. Udfør fordøjelsen i et rystevandbad ved 32 ° C (120 svingninger / min).
- Efter 5 min kontrollere tubuli igen ved lysmikroskopisk inspektion på 100X forstørrelse som beskrevet i trin 4.2.
Bemærk: Korte tubuli, rørformede aggregater og frigivet celler skal være synlig (figur 3D).- Tillad de rørformede aggregater nøjes med 10 min, og aspireres supernatanten osing en 25 ml pipette. Wash aggregater 4 gange ved anvendelse af 25 ml PBS og en sedimentation tid på 10 min for hver vask trin (figur 3E).
- Der tilsættes 20 ml RPMI 1640 medium og passere suspensionen 10 gange gennem en 18 G nål monteret på en 20 ml sprøjte. Undgå luftbobler.
Bemærk: Trække suspensionen ind og ud gennem nålen betragtes som én arbejdsgang. Forstyrrelsen og homogenisering af celler ved hydrodynamisk klipning er en standardteknik til fremstilling af celler, der har tendens til at aggregere. Den passerer af celler gennem en kanyle af små indvendig diameter er usandsynligt, at have en indvirkning på deres funktionelle egenskaber 25. 5C og D viser den normale ultrastruktur af rensede Sertoliceller på dag 4 i kultur.- Pipette en dråbe af suspensionen på et objektglas og hurtigt kontrollere tubuli under et omvendt lysmikroskop for rutinemæssig cellekultur 10X forstørrelse, hvis aggRegates er alle dispergeret (figur 3F). Filtrer cellesuspensionen gennem en 70 um cellefilter for at opnå en ren enkelt cellesuspension i filtratet.
- Centrifugeres filtratet i trin 5.4 ved 200 xg i 10 minutter ved stuetemperatur uden at bruge pausen. aspirere omhyggeligt supernatanten under anvendelse af en 25 ml pipette, og resuspender Sertolicellerne i 40 ml RPMI 1640 medium (serumfrit).
- Bland 100 gl cellesuspension med 100 pi trypanblåt farvestof og tælle cellerne med et Neubauer Forbedret kammer. Juster cellekoncentrationen til 3 x 10 6 celler / ml i overensstemmelse med resultatet tælling. Seed 1 ml per brønd på en 6-brønds plade (= dag 1). Hvis der planlægges et Oil Red O-farvning (trin 6) sætte en dækglas i en eller nogle få brønde før såning Sertoliceller.
Bemærk: Sertoli celler i suspension afvikle hurtigt, således at røret bør kort rystes hver gang før en celle alikvot tages sammen med pipetten. Indtil dag 4 de fast attACH til underlaget. - For at fjerne flydende eller adhærerende kimceller på dag 4 (figur 4C) vask hver brønd i 6-brønds plader, der anvendes til udpladning isolerede Sertoli-celler (trin 5.6) med PBS (figur 4D). Aspirer medium, tilsættes 1-2 ml PBS til hver brønd og ryste de 6-brønds plader horisontalt på et bord energisk men uden at spilde PBS. Gentag vask 3 gange og udføre den samme vaskeprocedure på dag 5 og 6 (figur 4E).
Bemærk: På dag 4 Sertolicellerne fast har vedhæftet og vise en brosten mønster under den omvendte lysmikroskop (figur 4C). Eksperimenter kan udføres fra dag 7 og frem.- (Alternativ til trin 5.7) Til fjernelse af flydende og adhærente kimceller udføre en hypotonisk chok 3 dage efter podning på 6-brønds plader. Fjern mediet og tilsæt 1 ml 20 mM Tris pH 7,5 taget direkte ud af køleskabet. Aspirer Tris-buffer efter 90 til 120 sek, men ikkesenere. Vask cellerne to gange med PBS, og der tilsættes 2 ml RPMI 1640-medium (serum-frit). Eventuelt udføre eksperimenter næste dag.
Bemærk: Jo længere varighed hypotonisk chok er de mere kimceller kan fjernes, men de mere Sertolicellerne gå tabt samt. Den første PBS vask bør udføres hurtigt, men med omhu for ikke at forskyde nogen Sertoliceller. Direkte efter kan observeres hypotonisk behandling talrige vakuoler af forskellig størrelse i cytoplasmaet ved fasekontrastmikroskopi. Vakuoler forsvinder inden for få timer efter hypotonisk behandling.
- (Alternativ til trin 5.7) Til fjernelse af flydende og adhærente kimceller udføre en hypotonisk chok 3 dage efter podning på 6-brønds plader. Fjern mediet og tilsæt 1 ml 20 mM Tris pH 7,5 taget direkte ud af køleskabet. Aspirer Tris-buffer efter 90 til 120 sek, men ikkesenere. Vask cellerne to gange med PBS, og der tilsættes 2 ml RPMI 1640-medium (serum-frit). Eventuelt udføre eksperimenter næste dag.
6. Oil Red O-farvning
- Udfør alle trin på RT. På dag 7 wash Sertoliceller dyrket på en dækglas (trin 5.6) med PBS to gange og løse dem med 10% formalin i PBS. Efter 10 minutter erstatte formalin med frisk opløsning, og fortsætte fiksering i yderligere 60 min.
Bemærk: Alle opløsninger tilsættes til brønden (r) med dækglas og opsuget før næste trin. Aspirer formalin, vaskes celler med vand to gange og tilsæt 60% isopropanol. Efter 5 min tillader celler til lufttørre i et par minutter. - Tilsæt 1 ml Oil Red O-farvning opløsning per brønd og inkuberes i 10 min. Aspirer opløsningen, og vask cellerne straks 4 gange med vand og montere dækglas i glycerol-PBS (9: 1). Tag lyse felt billeder med en rutinemæssig lysmikroskop (figur 4F).
7. Immunfluorescensfarvning
- Vask PTC'er (fra trin 4.5) eller Sertoliceller (fra trin 5.5) dyrkes på et dækglas med PBS to gange og løse dem med 4% PFA i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Inkuber med 5% BSA i PBS i 1 time ved stuetemperatur. Kassér BSA-PBS-opløsning, og der tilsættes frisk BSA-PBS-opløsning indeholdende actin (glat muskulatur) (for PTC) eller vimentin (for Sertoliceller) primært antistof (fortynding 1: 100 for begge antistoffer) og inkuberes ved 4 ° CO / N.
Bemærk: Inkubation med BSA blokerer ikke-specifik binding af det primære antistof. - Vask dækglas 3 gange i 5 minutter i PBS-0,1% Tween 20 og inkuberes med grønt-fluorescerende farvestof konjugeret ged anti-mus sekundært antistof (fortynding 1: 1000) ved stuetemperatur i 1 time i mørke.
- Vask dækglas 3 gange i 5 minutter i PBS-0,1% Tween 20 og montere dem i DAPI mounting medium.
8. Ultrastrukturel Analyse
- Wash Sertoli-celler (fra trin 5.6) af arten på en 6 cm cellekultur plade med PBS og fikseres i 2 timer ved 4 ° C i en blanding af 2,5% glutaraldehyd, 2,5% paraformaldehyd og 0,05% picrinsyre i 67 mM cacodylatbuffer ( pH 7,4) ifølge Ito og Karnovsky 26.
- Udførelse af post-fiksering i 1% osmiumtetroxid efterfulgt af en O / N inkubation i 0,3% uranylacetat opløst i 50 mM maleat-puffer (pH 5). Indlejre prøver i indstøbningsmedier ifølge standardprocedurer. Skær tynde snit, kontrast dem med bly citrat og undersøge med et elektronmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den beskrevne procedure tillader isolering af det ca. 12 x 10 7 Sertoli celler fra 10 rotte testikler. 3 x 10 6 celler udplades per brønd på en 6-brønds plade, således at seks til syv plader med 6 brønde er tilgængelige for eksperimenter på dag 7. Den trypsin-DNase I fordøjelsen er den mest kritiske trin under Sertolicellen isolation. Hvis fordøjelse på dette tidspunkt skrider for langt, er forholdet mellem kønsceller / Sertoliceller vil uforholdsmæssigt stige frem til udgangen. Under dag 3-6 af kultur er det vigtigt nøje at vaske væk så mange ikke-klæbende eller løst fæstnet kimceller som muligt. Som et alternativ til omfattende vaskninger over 4 dage kimceller kan fjernes ved hypotonisk behandling på dag 3 27. En fordel ved denne fremgangsmåde er, at tidspunktet for Sertolicellen kultur holdes på et minimum, således at Sertoli cellespecifikke funktioner er potentielt bedre bevaret end efter en længere periode med kultur.
(figur 5B). Fordi peritubulære celler har en stærk proliferativ potentiale, Sertolicellen kultur skal udføres i fravær af serum. I nærvær af 10% ville serum PTC'er udgør ca. 20% af alle celler efter 6 dages dyrkning henviser kan forventes sin fraktion at være under 1% i fravær af serum 7. Stort set alle isolerede Sertoli-celler er levedygtige som bedømt ved trypanblåt-farvning (ikke vist). Omkring dag 7 af kultur de isolerede Sertoli celler mindst kontamineret med kimceller og peritubulære celler (figur 4), således at der skal udføres eksperimenter omkring denne dag, hvis muligt. For god reproducerbarhed er det vigtigt at gentage eksperimentets altid på samme dag af kultur. Hvis der planlægges transfektioner de skal udføres på dag 4 eller 5, og celleekstrakter bør foretages på dag 5 eller 6.
Over mindst to uger i serumfrie betingelser Sertoliceller reagerer på FSH og producerer mere androgen-bindende protein, plasminogenaktivator og transferrin ved FSH-behandling. Ved længere kultur kræves et fødelag af peritubulære celler eller serum. Efter fire uger kulturer forringes, og cellerne løsnes fra undergrunden 7.
På dag 6 i kultur mest Sertolicellerne har erhvervet lipid dråber. I de fleste celler en enkelt stor vacuole har dannet (figur 5C og 5D). Det neutrale lipid indhold kan let visualiseres ved Oil Red O-farvning (figur 4F).
Foruden Sertoli cel ls de fjernede PTC'er kan dyrkes samt (figur 4A og 4B). PTC'er fra 10 testikler giver fem T75 kolber, der kan forventes at danne et sammenflydende lag efter 2 dages kultur. Ligesom isolerede Sertoliceller frisk isolerede PTC'er er forurenet med kimceller, som kan stort set fjernes ved passage. Kolber er opdelt 1: 2 ved standard trypsinisering så 10 kolber vil blive sammenflydende på dag 5 efter isolering. Renhed af isolerede PTC'er er> 95% og kan bekræftes ved anvendelse af α-glatmuskelactin immunolabeling (figur 5A). Fra denne dag og fremefter PTC'er kan anvendes til eksperimenter. En kolbe er tilstrækkeligt til ca. en plade med 6 brønde, og brøndene bør konfluente den næste dag. Celler kan passeres mange gange, men bør udføres eksperimenter altid på samme passage for at sikre, at celler opfører sig på en reproducerbar måde.
upload / 53389 / 53389fig1.jpg "/>
Figur 1. Morfologi af testiklerne og workflow af proceduren. (A) En sektor af en sædkanalerne med tilstødende interstitiel væv er vist skematisk. Sædkanaler er omgivet af en basalmembran (BM) og en rundtgående lag af myoid peritubulære celler (PTC). Den germinale epitel er placeret på den luminale side af basalmembranen. Sertoli-celler (SC), der spænder over hele germinale epitel er stærkt knyttet til BM og forbundet med hinanden via basolaterale placeret okkluderende junctions repræsenterer blod-testis-barrieren (BTB). Deres uregelmæssig kerne (N) viser en eller flere fissure-lignende fordybninger og indeholder et kernelegeme. Kønsceller (GC) er i intim kontakt med SCs i alle faser af deres udvikling. Det interstitielle rum mellem tubuli indeholder Leydig celler (LC) og immunceller såsom makrofager (MO) samt blodkar (BV). Figurtilpasset fra Fijak og Meinhardt 28. (B) Workflow af proceduren; farvekodning er ligesom i (A). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Testes fra Wistar-rotter udskæres og Decapsulated. (A) peritonealhulen åbnes gennem et langsgående snit som beskrevet i teksten. En stjerne (*) angiver epidydimal fedt pad. (B) Testes fjernes ved at skære sædstrengen og (C) opsamles i en 50 ml konisk rør indeholdende 20 ml PBS. Når alle testikler er blevet indsamlet de desinficeres i 20 ml 1% (vægt / volumen) iod i ethanol. Til fjernelse af iodet de er hurtigt vasket to gange med 25 mlPBS hver. (D) Testes efter første PBS vask. (E) Testes overføres til en petriskål (til højre), og sædkanaler presses ud af den åbnede tunica albuginea ved hjælp af lukkede sakseblade (til venstre) som beskrevet i teksten. (F) De Decapsulated testikler stadig danne en kompakt testikel-formet masse med enkelte tubuli udstående. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Isolering af Sertoliceller. (A) Efter fjernelse af interstitielle celler ved trypsin-DNase I fordøjelse og vask 9x med PBS tubuli bliver mobiliseret og se ren. (B) I collagenase-hyaluronidase-DNase I-behandling peritubular celles fra det ydre lag og kimceller frigives. Tubuliene får afkortet og opnå et groft udseende. (C) rørformede fragmenter efter vask 4x med PBS. (D) Hyaluronidase-DNase I behandling frigiver resterende peritubulære celler samt kim celler. Tubuli bliver yderligere forkortet, og rørformede aggregater dannes. (E) Tubular aggregater efter vask 4x med PBS. (F) Single Sertoli celler produceres ved at passere aggregaterne 10x gennem en 18G nål. Scale barer i (AE) = 200 um, i (F) = 50 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Kultur af peritubulære celler (AB) og Sertoliceller (CF) og fjernelse af SNAVSET ing kimceller. (A) Resuspenderede PTC'er fra trin 4.5 blev podet umiddelbart og fotograferet den næste dag. (B) efter spaltning på dag 3 kontaminering med kimceller reduceres. (C) På dag 4 Sertolicellerne viser en typisk brosten-lignende mønster. Flydende og vedhængende kønsceller er synlige før vask med PBS. (D) Det samme brønd efter vask 3 x med PBS. Antallet af kontaminerende kimceller reduceres. Vask tre gange med PBS gentages på dag 5 og 6. (E) På dag 6 i kultur næsten alle kimceller er blevet fjernet. Sertoliceller har dannet et unikt leder cellelag, og de fleste celler har erhvervet en enkelt stor vacuole. (F) Oil red O-farvning viser, at disse vakuoler er lipiddråber indeholdende stort set neutrale lipider. Scale barer i (AD) = 200 um, i (E) = 50 um og i (F) = 25 um..jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Immunofluorescens-farvning. Farvning af oprensede primære peritubulære celler med actin (glat muskulatur) antistof (A) og af Sertoli celler med vimentin antistof (B). Ingen kontaminerende celler er synlige i begge synsfelter. Scale bar in (A) og (B) = 10 um. (C) og (D) elektronmikroskopisk billeder af Sertoli celler efter 4 dage i kultur. (C) Bemærk den tætte kontakt af tilstødende celler (pilespidser), der fører til brosten-lignende mønster som vist i figur 4C. En enkelt lipid dråbe (L) er observeret i cytoplasmaet i hver celle. (D) mest rigelige organeller er mitochondrier (M) og Golgi-apparatet (G).Kernen (N) indeholder en kernelegeme (NC) og viser den typiske fissur indtrykning. Scale bar i (C) = 1 um og i (D) = 0,25 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Guido Verhoeven og Ludo Deboel, Leuven, som var yderst hjælpsomme i oprettelse isolering af primære Sertolicellerne i Meinhardt laboratorium i Giessen. Monika Fijak, Gießen, er anerkendt for hendes hjælp med figur 1A og rådgivning. Undersøgelser blev støttet af Deutsche Forschungsgemeinschaft gennem tilskud BH 93 / 1-1 (SB) og finansiering af International Research Graduate College JLU Gießen (Tyskland) / Monash University (Melbourne, Australien) GRK 1871 (SB). Der blev også opnået fra et tilskud af staten Hessen i programmet "Landes-Offensive zur Entwicklung Wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz" (LOEWE) kaldet "Männliche Infertilität bei Infektion & Entzündung" (MIBIE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Actin (smooth muscle) antibody clone 1A4 | Dako | M0851 | Monoclonal mouse anti human antibody. Use 1:100 dilution for immunofluorescence. |
| Albumin bovine fraction V Standard grade, lyophilized |
Serva | 11930.04 | Filter (0.45 µm) BSA solutions used for immunofluorescence. |
| Corning Cell Strainers 70 µm | Corning | 431751 | White color |
| Collagenase A from Clostridium histolyticum | Roche | 10103586001 | |
| DAPI mountant ProLong Gold Antifade | Life technologies | P-36931 | |
| D-glucose | Sigma | G8644 | 100 g/L |
| Dulbecco´s PBS without Ca2+/Mg2+ | Gibco | 14190-094 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Electron microscope | Zeiss | EM 109S | |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axioplan 2 | |
| Hyaluronidase from bovine testis | Sigma | H3506 | |
| Inverted light microscope | Olympus | CKX41 | Routine cell culture microscope |
| Mouse IgG / IgM (H+L) polyclonal secondary Antibody |
Life technologies | A-10684 | Alexa Fluor 488 conjugate |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | Has replaced Sudan III and Sudan IV because of brighter color. |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Penicillin (5,000 U/ml)/ Streptomycin (5,000 µg/ml) |
Gibco | 15070-063 | 100x solution |
| RPMI-1640 | Gibco | 21875-034 | Contains 300 mg/L L-glutamine |
| Trypsin from porcine pancreas | Sigma | T5266 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin inhibitor from soybean | Sigma | T6522 | The Sigma product is considerably cheaper than the previously used BPTI (Aprotinin) from Roche. |
| Vimentin antibody (V9) | Sigma | V6630 | Monoclonal mouse anti pig vimentin antibody. Use 1:100 dilution for immunofluorescence. |
| Wistar WU rats | Charles River | Should be 19 days old on day of experiment. |
References
- Andrology. Male Reproductive Health and Dysfunction. Nieschlag, E., Behre, H., Nieschlag, S. , 3rd ed, Springer. (2010).
- Esaki, S. Über Kulturen des Hodengewebes der Säugetiere und über die Natur des interstitiellen Hodengewebes und der Zwischenzellen. Z. Mikrosk. Anat. Forsch. 15, 368-404 (1928).
- Hall, P. F., Irby, D. C., De Kretser, D. M. Conversion of cholesterol to androgens by rat testes: comparison of interstitial cells and seminiferous tubules. Endocrinology. 84, 488-496 (1969).
- Welsh, M. J., Wiebe, J. P. Rat sertoli cells: a rapid method for obtaining viable cells. Endocrinology. 96, 618-624 (1975).
- Vitale, R., Fawcett, D. W., Dym, M. The normal development of the blood-testis barrier and the effects of clomiphene and estrogen treatment. Anat. Rec. 176, 331-344 (1973).
- Dorrington, J. H., Roller, N. F., Fritz, I. B. Effects of follicle-stimulating hormone on cultures of Sertoli cell preparations. Mol. Cell. Endocrinol. 3, 57-70 (1975).
- Tung, P. S., Skinner, M. K., Fritz, I. B. Fibronectin synthesis is a marker for peritubular cell contaminants in Sertoli cell-enriched cultures. Biol. Reprod. 30, 199-211 (1984).
- Verhoeven, G., Cailleau, J. Testicular peritubular cells secrete a protein under androgen control that inhibits induction of aromatase activity in Sertoli cells. Endocrinology. 123, 2100-2110 (1988).
- Tung, P. S., Dorrington, J. H., Fritz, I. B. Structural changes induced by follicle-stimulating hormone or dibutyryl cyclic AMP on presumptive Sertoli cells in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 72, 1838-1842 (1975).
- Teng, Y., et al. Isolation and culture of adult Sertoli cells and their effects on the function of co-cultured allogeneic islets in vitro. Chin. Med. J. (Engl.). 118, 1857-1862 (2005).
- Kohno, S., Ziparo, E., Marek, L. F., Tung, K. S. Murine Sertoli cells: major histocompatibility antigens and glycoconjugates. J. Reprod. Immunol. 5, 339-350 (1983).
- Dufour, J. M., et al. Sertoli cell line lacks the immunoprotective properties associated with primary Sertoli cells. Cell Transplant. 17, 525-534 (2008).
- Majumdar, S. S., Tsuruta, J., Griswold, M. D., Bartke, A. Isolation and culture of Sertoli cells from the testes of adult Siberian hamsters: analysis of proteins synthesized and secreted by Sertoli cells cultured from hamsters raised in a long or a short photoperiod. Biol. Reprod. 52, 658-666 (1995).
- Zhang, H., Liu, B., Qiu, Y., Fan, J., Yu, S. Pure cultures and characterization of yak Sertoli cells. Tissue Cell. 45, 414-420 (2013).
- Ziparo, E., Geremia, R., Russo, M. A., Stefanini, M. Surface interaction in vitro between Sertoli cells and germ cells at different stages of spermatogenesis. Am. J. Anat. 159, 385-388 (1980).
- Anway, M. D., Folmer, J., Wright, W. W., Zirkin, B. R. Isolation of Sertoli cells from adult rat testes: an approach to ex vivo studies of Sertoli cell function. Biol. Reprod. 68, 996-1002 (2003).
- Scarpino, S., et al. A rapid method of Sertoli cell isolation by DSA lectin, allowing mitotic analyses. Mol. Cell. Endocrinol. 146, 121-127 (1998).
- Mather, J. P. Establishment and characterization of two distinct mouse testicular epithelial cell lines. Biol. Reprod. 23, 243-252 (1980).
- Korbutt, G. S., Elliott, J. F., Rajotte, R. V. Cotransplantation of allogeneic islets with allogeneic testicular cell aggregates allows long-term graft survival without systemic immunosuppression. Diabetes. 46, 317-322 (1997).
- Fritz, I. B. Somatic cell-germ cell relationships in mammalian testes during development and spermatogenesis. Ciba Found. Symp. 182, 271-281 (1994).
- Whaley, P. D., Chaudhary, J., Cupp, A., Skinner, M. K. Role of specific response elements of the c-fos promoter and involvement of intermediate transcription factor(s) in the induction of Sertoli cell differentiation (transferrin promoter activation) by the testicular paracrine factor PModS. Endocrinology. 136, 3046-3053 (1995).
- Bhushan, S., et al. Uropathogenic Escherichia coli block MyD88-dependent and activate MyD88-independent signaling pathways in rat testicular cells. J. Immunol. 180, 5537-5547 (2008).
- Meinhardt, A., Hedger, M. P. Immunological, paracrine and endocrine aspects of testicular immune privilege. Mol. Cell. Endocrinol. 335, 60-68 (2011).
- Fijak, M., et al. Influence of Testosterone on Inflammatory Response in Testicular Cells and Expression of Transcription Factor Foxp3 in T Cells. Am. J. Reprod. Immunol. , 12-25 (2015).
- Mamidi, M. K., et al. Impact of passing mesenchymal stem cells through smaller bore size needles for subsequent use in patients for clinical or cosmetic indications. J. Transl. Med. 10, 229 (2012).
- Ito, S., Karnovsky, M. J. Formaldehyde-glutaraldehyde fixatives containing trinitro compounds. J. Cell. Biol. 39, 168-169 (1968).
- Galdieri, M., Ziparo, E., Palombi, F., Russo, M. A., Stefanini, M. Pure Sertoli cell cultures: a new model for the study of somatic-germ cell interactions. J. Androl. 5, 249-254 (1981).
- Fijak, M., Meinhardt, A. The testis in immune privilege. Immunol. Rev. 213, 66-81 (2006).
- Jegou, B. The Sertoli cell in vivo and in vitro. Cell Biol. Toxicol. 8, 49-54 (1992).
- Pineau, C., Le Magueresse, B., Courtens, J. L., Jegou, B. Study in vitro the phagocytic function of Sertoli cells in the rat. Cell Tissue Res. 264, 589-598 (1991).
- Ren, Y., Savill, J. Apoptosis: the importance of being eaten. Cell Death Differ. 5, 563-568 (1998).
- Ducray, A., et al. Establishment of a mouse Sertoli cell line producing rat androgen-binding protein (ABP). Steroids. 63, 285-287 (1998).
- Konrad, L., et al. Rat Sertoli cells express epithelial but also mesenchymal genes after immortalization with SV40. Biochim. Biophys. Acta. 1722, 6-14 (2005).
