Summary
Primäre Sertoli-Zellen sind für das Studium Hoden-Immun-Privileg, Signaltransduktion während der Entzündung oder Infektion und Nutzung ihrer immun Eigenschaften erforderlich. Hier beschreiben wir ein Enzym-basiertes Protokoll für die Isolierung von hoch gereinigten primären Sertoli-Zellen und peritubulären Zellen aus Rattenhoden.
Abstract
Der Hoden, insbesondere der männlichen Gameten, fordert das Immunsystem in einer einzigartigen Art und Weise, weil differenziert Spermien zuerst zum Zeitpunkt der Pubertät erscheinen - mehr als zehn Jahre nach der Gründung der systemischen Immuntoleranz. Spermatogenen Zellen exprimieren eine Reihe von Proteinen, die vom Immunsystem als nicht-selbst gesehen werden. Der Hoden muss dann in der Lage sein, Toleranz auf der einen Seite auf diese Neo-Antigene herzustellen, aber immer noch selbst zu schützen können vor Infektionen und Tumorentwicklung auf der anderen Seite. Daher ist die Hoden eines der wenigen Immun privilegierten Stellen im Körper, die ohne evozieren eine schädliche entzündliche Immunantwort fremde Antigene tolerieren. Sertoli-Zellen spielen eine Schlüsselrolle für die Pflege dieser Immun privilegierten Umgebung der Hoden und auch das Überleben von cotransplanted Zellen in einer fremden Umgebung zu verlängern. Daher Primär sind Sertoli-Zellen ein wichtiges Instrument für die Immunprivileg des Hodens studieren, die nicht E sein kannasily von etablierten Zelllinien oder andere zelluläre Modelle ersetzt. Hier präsentieren wir eine detaillierte und umfassende Protokoll zur Isolierung von Sertoli-Zellen - und peritubulären Zellen, falls gewünscht - von der Ratte Hoden innerhalb eines einzigen Tages.
Introduction
Hoden produzieren männlichen Gameten und Sexualhormone, also Androgene. Die Orgel ist aus zwei Kammern besteht. In den Zwischenraum repräsentiert, dass etwa 10-12% der gesamten Hoden Band 1, Steroidbildung findet innerhalb der Leydigzellen. Die röhrenförmige Kammer entspricht etwa 60-80% des Hodenvolumen 1 und enthält Keimzellen und zwei Typen von somatischen Zellen - peritubulären Zellen und Sertoli-Zellen. Der Hoden wird durch Bindegewebssepten in 250-300 Läppchen unterteilt, die jeweils mit 1-3 stark gewundene Hodenkanälchen. Diese Röhren werden durch eine Basalmembran, ein Blatt von Kollagen eingeschlossen und einer umlaufenden Schicht aus peritubulären Zellen (1A).
Keimepithels auf der luminalen Seite der Basalmembran liegt. Sertoli-Zellen sind groß länglichen Zellen, die die gesamte Keimepithels von der Basalmembran zum Lumen erstrecken. Sie sind stark attschmerzte zu der Basalmembran und eine kontinuierliche Zell Blatt durch basolaterale organisiert tight junctions bilden, die das Keimepithel aus dem Interstitium verschließt und stellt die Blut-Hoden-Schranke. Sertoli-Zellen haben prominente zytoplasmatische Projektionen und Konsequenzen, die es ihnen ermöglichen, mit einer artspezifischen aber konstante Anzahl von Keimzellen in enge morphologische und funktionelle Verbindung zu setzen. Diploiden Keim Stammzellen vermehren und differenzieren sich in Spermatogonien.
Während der Meiose I kurzlebig tetraploiden Spermatozyten erzeugt werden, die wiederum in vier haploiden Spermatiden während der Meiose II entwickeln. Alle Keimzellen werden durch zytoplasmatische Brücken miteinander verbunden, so dass sie ein zellulares Netz bilden. Das Hauptereignis während der Reifung der Spermatiden ist die Extrusion von großen Teilen des Cytoplasmas, Bildung Restkörper in einem Verfahren Spermiogenese bezeichnet. Restkörper durch Sertoli Zellen phagozytiert. Später Spermatiden werden dann veröffentlicht inTubuluslumen und in den Nebenhoden zur weiteren Reifung gebracht. Spermatogenese topographisch und funktionell erscheinen Sertoli-Zellen und Keimzellen gegenseitig koordinieren.
Erstellung von individuellen Hodenzelltypen begann vor fast einem Jahrhundert als kleine Hodenstücke kultiviert wurden und Zelltypen durch Mikroskopie 2 identifiziert. Durch sorgfältige Präparation der Röhrchen nach der Tunica albuginea Öffnung mit feinen bestückten Zange war es später möglich Rohr und interstitielle Fächer 3 zu trennen. 1975 eingeführt Welsh und Wiebe eine Kollagenasebehandlung, um die Tubuli von anhaftenden Zwischengewebe und Pankreatin Behandlung zur Entfernung des äußeren peritubulären Zellschicht 4 zu befreien. Schon früh junge, unreife Ratten (ca. 20 Tage alt) hatte, in denen verwendet umfassen die Sertoli-Zellen einen großen Teil des rohrförmigen Zellpopulation weil Spermatogenese noch nicht begonnen hat. In diesem Alter Ratte SertOli Zellen aufhören zu unterteilen, und tight junctions zwischen benachbarten Zellen bilden, so daß die Blut-Hoden-Schranke 5 hergestellt ist.
Unabhängig von Welsh und Wiebe Dorrington et al. Führte eine Kombination von Trypsin und Desoxyribonuklase durch soybeen Trypsin-Inhibitor und Collagenase-Behandlung anschließen, die im selben Jahr 6 veröffentlicht wurde. Beide Gruppen auch mechanische Kraft (Zeichnung der verdauten Rohrbruchstücke immer wieder durch eine Spritzennadel oder einer Pasteur-Pipette jeweils), um eine homogene Zellsuspension für die Beschichtung zu erzeugen, enthält etwa 70% Sertoli-Zellen verwendet. Nach 3 Tagen in Kultur unter Verwendung eines Mediums, das serumfrei ist, erhöht sich der Anteil der Sertoli-Zellen auf etwa 90%. Dies könnte zum größten Teil auf den Tod zugeschrieben Keimzellen kontaminieren. Rest peritubulären Zellen (PTC), jedoch bleiben fest über ihre extrazelluläre Matrix gebunden. PTCs, aber nicht Sertoli-Zellen, sind dafür bekannt, zu produzierenFibronektin, die als Markerprotein für die Schätzung Kontamination mit PTCs dienen kann. Daher Tung et al. begründete, dass eine zusätzliche Hyaluronidase Behandlung kann die Reinheit des 7-Fraktion Sertoli Zelle verbessern. Tatsächlich könnten sie zeigen, dass eine zusätzliche Behandlung zur Verringerung der Kontaminierung konnte durch PTCs etwa 20-fach, was besonders deutlich wird, wenn ein Vergleich in serumhaltigem Medium zur Kultivierung gereinigt Sertoli-Zellen verwendet wird. Von da an dem verbesserten Verfahren von Tung et al. wurde die vorherrschende Protokoll und wurde von anderen Hauptgruppen im Bereich 8 (1B) intensiv genutzt.
Während Kollagenasebehandlung die Mehrheit der PTCs freigegeben und kann parallel zu Sertoli-Zellen isoliert werden. Während energisch die PTCs vermehren und reagieren nicht auf Follikel-stimulierendes Hormon (FSH), Sertoli-Zellen durchlaufen nicht Mitose mehr und von charakteristischen morphologischen Veränderungen zu reagieren FSHund eine Zunahme in zyklischem Adenosinmonophosphat (cAMP) -Konzentration 9. Sehr ähnlich enzymatische Verdauung Protokolle können zur Isolierung von primären Sertoli-Zellen von anderen Tieren wie Menschen 10, Maus 11,12, Sibirische Hamster 13 oder Yak 14 verwendet werden. Für die Entfernung von großen Mengen an Keimzellen einen hypotonischen Schock verunreinigen können am Ende des Isolierungsprozedur 15 verwendet werden. Dies ermöglicht auch die effiziente Isolierung von Sertoli-Zellen aus erwachsenen Ratte 16 Hoden. Ein angereichert Sertoli Zellsuspension kann auch mit Stechapfel Agglutinin 17 beschichtet durch Plattierung der Suspension auf Lektin Gerichte aus Keimzellen getrennt werden. Nur Sertoli-Zellen und ein paar Rest PTCs sich an die Lektin-Platten.
Primäre Sertoli-Zellkulturen, vor allem aus der Ratte, wurden ursprünglich für die Untersuchung von Reaktionsfähigkeit auf Hormone oder Festlegung Zelllinien wie die Maus Sertoli Zellen Li verwendetne TM4 18. Diese Zelllinie wurde in mehr als hundert Studien bis heute untersucht. In einem translationalen Ansatz haben Sertoli-Zellen wurden für Immunschutz von Co-kultivierten Zellen und Geweben, wie in der co-Transplantation von allogenen oder xeno- Pankreasinseln für langfristige Überleben des Transplantats ohne systemische Immunsuppression 19 verwendet. Und somatische Keimzelle (Sertoli cells - Keimzellen) -Wechselwirkungen 20, 21 - isoliert Sertoli-Zellen wurden auch in Co-Kultur-Experimente zur Untersuchung der epithelial-mesenchymalen (PTCC Sertoli-Zellen) verwendet. Kürzlich primären Sertoli-Zellen wurden zur Untersuchung der Expression von Toll-like-Rezeptoren und die Sekretion von proinflammatorischen Zytokinen wie auch die Signalketten, die zu Cytokin-Expression nach Infektion mit nicht-pathogenen und uropathogene E. beschäftigt coli 22. Andere neuere Untersuchungen wurden mit Sertoli-Zellen für Hodenimmun p Studiumrivilege 23 und gezeigt, dass Testosteron-Vorbehandlung unterdrückt die LPS-induzierte Entzündungsreaktion 24.
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Protocol
1. Tierethikerklärung
Hier beschriebenen Experimente wurden für die Pflege und Verwendung von Tieren zu Versuchszwecken nach den Richtlinien des Regierungspräsidiums Gießen, Deutschland, als die Kommune und bestätigen, um den deutschen Code of Practice durchgeführt (Berechtigungs Nr.: GI 20/23 Nr A 31 / 2012).
2. Herstellung von Medien, Enzymlösungen und Tiere
- Bereiten 1% Jod Alkohol durch Auflösen von 1 g Jod in 100 ml Ethanol.
- Bereiten 2x 500 ml Dulbecco's phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) ohne Ca 2+ und Mg 2+ ergänzt jeweils mit 7,5 ml D-Glucose (100 g / l) und 5 ml 100x Penicillin / Streptomycin-Stammlösung (15 mg / ml D -Glucose, 50 U / ml Penicillin und 50 ug / ml Streptomycin final).
- Supplement 1x 500 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-Medium mit 5 ml 100x Penicillin / Streptomycin-Stammlösung (50 U / ml Penicillin und 50 ug / ml Streptomycin final).
- Vorbereiten eines Trypsin-DNase I-Lösung (2,5 mg / ml Trypsin und 10 ug / ml DNase I) durch Zugabe von 25 mg Trypsin und 0,1 ml DNase I (1 mg / ml DNase I) auf 9,9 ml PBS.
- Man löst 50 mg Trypsin-Inhibitor in 5 ml PBS für Trypsin Inhibitor eine Lösung (10 mg / ml). Man löst 25 mg Trypsin-Inhibitor in 10 ml PBS für Trypsin Inhibitor B-Lösung (2,5 mg / ml).
- Für eine Collagenase-Hyaluronidase-Deoxyribonuclease I (DNase I) Lösung 10 mg Collagenase A (1 mg / ml final) aufzulösen, 10 mg Hyaluronidase (1 mg / ml final) und 0,1 ml DNase I (1 mg / ml DNase I) ( 10 ug / ml final) in 10 ml PBS.
- Vorbereiten eines Hyaluronidase-DNase I-Lösung durch Zugabe von 10 mg Hyaluronidase (1 mg / ml final) und 0,1 ml DNase I-Lösung (1 mg / ml) (10 & mgr; g / ml final) auf 9,9 ml PBS.
- Bestellen Wistar-Ratten auf Zeit, so dass sie 19 Tage alt am Tag der Sertoli Zellisolierung sind.
Hinweis: Das beschriebene Protokoll für 10 Ratten entwickelt, kann aber für mindestens 5 und maximal 20 Ratten modifiziert werden.Die Volumina aller Lösungen müssen entsprechend angepasst werden. - Bereiten Oil Red O-Stammlösung 0,35 g Oil Red O in 100 ml Isopropanol durch Auflösen. Stir O / N, filtriert durch 0,2 um und lagern bei RT für bis zu einem Jahr.
- Bereiten Oil Red O Färbung Lösung durch Mischen von 6 ml Oil Red O-Stammlösung mit 4 ml Wasser (3: 2). Nach 10-20 min Filter durch 0,2 & mgr; m. Verwenden Sie innerhalb der nächsten 2 Stunden.
- Vorbereiten eines 4% (w / v) Formaldehyd-Lösung in einem belüfteten Haube durch Zugabe von 4 g Paraformaldehyd-Pulver (PFA) zu 80 ml 1x PBS unter leichtem Rühren. Wärme auf ~ 60 ° C, 1 ml 1 M NaOH und weiter gerührt, bis der Paraformaldehyd gelöst ist. den pH-Wert auf 7,4 mit 1 M HCl und das Volumen auf 100 ml mit 1 x PBS lassen die Lösung abgekühlt auf RT, einzustellen. Die Lösung wird filtriert (0,45 & mgr; m) und verwenden frisch oder lagern bei -20 ° C für mehrere Monate.
Hinweis: polymerisiertem Formaldehyd (PFA) depolymerisiert zu monomeren Formaldehyd in Wasser. Dieser Prozess istkatalysiert durch moderate Erwärmung und einem leicht alkalischen pH-Wert. Bereiten Sie alle Enzymlösungen frisch und Filter sterilisieren (0,2 uM) sie am Tag der Nutzung. Wenn eines anderen Herstellers für ein Enzym (Materials sehen / Ausrüstung Tabelle) verwendet wird, sorgfältig seine Konzentration / Aktivität einzustellen.
In dem folgenden Protokoll ein "Pipette" steht für eine serologische Pipette.
3. Herstellung von Hodenkanälchen
- Anesthetize 10 männliche Wistar Ratten einzeln in einem Exsikkator mit CO 2 und einer Fließgeschwindigkeit, die mindestens 20% des Kammervolumens pro Minute versetzt. Warten Sie, bis Atemstillstand Test Anästhesie durch einen Fuß-Pad quetschen, und wenn es keine Reaktion, jede Ratte durch Genickbruch einschläfern. Lassen Sie das Blut durch Halsschlagader Schneiden und Halsschlagader (Vagina carotica) unter fließendem Wasser. Desinfizieren Sie den Bauch nach mit 70% Ethanol abwischen.
- Mit einer Pinzette heben Sie die Haut von der Bauch muszeuge und geschnitten, um eine ovale Hautlappen aus, die von der Symphyse bis zum Brustbein (2A) und die Klappe nach oben auf die Brust erweitert. Als nächstes die Bauchmuskeln zu packen und eine mediale Inzision von der Symphyse bis zum Brustbein machen.
- Drücken Sie den Bauch mit den Daumen von Becken nach oben, um die Hoden aus dem unteren Becken zu schieben. Suchen Sie sich die Nebenhodenfettpolster (2B) mit einer Pinzette zum Herausziehen der Hoden weiter nach oben. Schneiden Sie den Samenstrang (2B), die Tunica albuginea intakt bleibt, und sammeln Sie alle Hoden in 20 ml PBS in einem 50 ml konischen Röhrchen (2C).
- Nachdem alle Hoden sammeln, desinfizieren sie durch ein gleiches Volumen (20 ml) von 1% Zugabe (w / v) Jod in Ethanol. Kehren Sie die Röhrchen zweimal und dekantieren sofort den Überstand. Schnell die Hoden waschen zweimal mit 25 ml PBS jeder (2D).
- Übertragen Sie die Hoden in eine Petrischale enthaltening 15 ml PBS (2E). Fassen Sie jeden Hoden fest mit einer Zange an einem Ende einen kleinen Schnitt in der Tunica albuginea am entgegengesetzten Ende zu machen, und drücken Sie die Röhrchen mit geschlossenen Scherenblätter als Schaber.
Anmerkung: Die Röhrchen noch eine kompakte Hoden förmigen Bündel mit nur wenigen Tubuli sich in die Lösung, um sein sollten homogene enzymatische Verdauung (2F) zu ermöglichen. - Übertragen Sie die de-verkapselte Hoden auf eine 100 ml Flasche mit Schraubverschluss mit 10 ml Trypsin-DNase I-Lösung. Führen Sie die Verdauung in einem geschüttelten Wasserbad bei 32 ° C (120 Schwingungen / min). Nach 4 bewerten min die Tubuli mit dem bloßen Auge für Dispersion von Tubuli. Sobald Tubuli in die Lösung zu dispergieren beginnen, sofort die Verdauung zu stoppen. Falls erforderlich, weiterhin Inkubation für 2 min.
- Stopp Trypsinverdaus durch Zugabe von 5 ml Trypsininhibitorlösung A. Sie die Lösung gut mischen durch Auf-und Abpipettieren 3-4 Mals eine 10 ml Pipette und es zu einem 50 ml konischen Röhrchen übertragen.
- Nach 5 Minuten Inkubation beobachten die Röhrchen durch die Einheit der Schwerkraft absetzen, den Überstand vorsichtig entfernen, indem das 10 ml-Pipette aus Schritt 3.6 verwendet und 10 ml B-Lösung Trypsin-Hemmstoff, um Trypsinverdaus vollständig stoppen hinzuzufügen. Resuspendieren der Tubuli durch Auf- und Abpipettieren 2-3 mal.
- Um waschen jeweils die Tubuli 9 mal mit 25 ml PBS interstitiellen Zellen zu entfernen, zu kontaminieren. Resuspendieren Kanälchen in jedem Waschen durch eine 25 ml Pipette und lassen sie für 10 Minuten mit dem Gerät Schwerkraft absetzen. Verwenden Sie immer die gleichen 25 ml Pipette zum Pipettieren PBS, Aufwirbelung und Entfernung des Überstandes.
4. Ausbau / Isolierung von peritubulären Cells (PTC)
- Übertragen Sie alle Röhrchen in einen 100 ml Flasche mit Schraubverschluss und fügen Sie den Collagenase-Hyaluronidase-DNase I-Lösung (3A). Führen Verdauung für 10 Minuten in einem Schüttelwasserbad bei 32 ° C (120 Schwingungen / min).
- Pipette ein Tropfen der Suspension auf einen Glasobjektträger und schnell die Tubuli unter einem inversen Lichtmikroskop für Routine-Zellkultur bei 100-facher Vergrößerung prüfen. Wenn die Verdauung für weitere 2 min nicht fortgeschritten genug, um weiterhin Inkubation (nicht die Zeit für die mikroskopische Kontrolle benötigt zählen).
Hinweis: Bei diesem Schritt werden alle Tubuli verkürzen sich in Länge und Röhrchens Kanten sollten rau werden (3B und C). Ecken und Kanten sind für die Freisetzung von peritubulären Zellen indikativ. - Übertragen Sie die Suspension mit verdaut Tubuli zu einem 50 ml konischen Röhrchen, die 25 ml Pipette aus Schritt 3.8 verwenden. Waschen Sie die 100-ml-Flasche mit 10 ml PBS und fügen Sie ihn in der konischen Röhre zu den Tubuli. Lassen Sie die verdaut Tubuli durch Einheit Schwerkraft für 10 Minuten absetzen, und saugen Sie den Überstand vorsichtig, die PTCs enthält, mit dem 25-ml-Pipette wieder, und überträgt es auf eine neue konische Röhrchen. Zum Absaugen der letzten Milliliter mit einem 5-ml-Pipette in order jede Übertragung von Tubuli zu verhindern.
- 20 ml RPMI 1640-Medium, ergänzt mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS) zu den gesammelten Überständen Röhrchen, mischen und Zentrifugieren bei 300 xg für 10 min bei RT ohne die Unterbrechung mit.
- Überstand vorsichtig dekantieren und die pelletierten PTCs in 20 ml RPMI 1640-Medium mit 10% hitzeinaktiviertem FBS und Samen 4 ml jeweils auf fünf T75-Kolben, die 16 ml Medium jedes ergänzt resuspendieren. Inkubieren bei 37 ° C in 5% CO 2 -Atmosphäre (4A).
- Am 3. Tag der Kultur trypsinize die PTCs und teilen Sie sie 1: 2 am T75-Kolben mit 16 ml RPMI 1640-Medium mit 10% hitzeinaktiviertem FBS jeweils (Ausbeute 10 Flaschen insgesamt) (4B). Weiter Inkubation bei 37 ° C in 5% CO 2 -Atmosphäre.
- Am 5. Tag der Kultur trypsinize die PTCs wieder und platten sie auf 6-Loch-oder 24-Well-Platten je nach Experiment(Eine T75-Flasche pro Platte). Experimente können am Tag 6 durchgeführt werden.
5. Isolierung von Sertoli-Zellen (SCs)
- Resuspendieren der siedelt Tubuli aus Schritt 4.3 gründlich in 25 ml PBS durch eine 25 ml Pipette und lassen sie für 12 min mit dem Gerät Schwerkraft absetzen. Verwenden Sie die gleiche 25 ml Pipette zum Pipettieren PBS, Aufwirbelung von Tubuli und das Entfernen von Überständen. Wiederholen Sie die Wäsche 3-mal (4 wäscht insgesamt).
- Nach dem letzten Wasch die verdaut Tubuli zu weiteren 100 ml Flasche mit Schraubverschluss, die das Hyaluronidase-DNase I-Lösung übertragen. Führen Sie die Verdauung in einem geschüttelten Wasserbad bei 32 ° C (120 Schwingungen / min).
- Nach 5 Minuten noch einmal überprüfen die Tubuli durch lichtmikroskopische Prüfung bei 100-facher Vergrößerung in Schritt 4.2 beschrieben.
Hinweis: Kurze Röhren, röhrenförmige Aggregate und freigesetzten Zellen sichtbar sein soll (3D).- Lassen Sie die Rohr Aggregate für 10 Minuten absetzen, und den Überstand aspirieren unsing eine 25 ml Pipette. Waschaggregate 4 mal 25 ml PBS und einer Sedimentationszeit von 10 min für jeden Waschschritt (3E).
- In 20 ml RPMI 1640-Medium, und übergeben Sie die Suspension 10-mal durch eine 18 G-Nadel an einer Spritze 20 ml montiert. Vermeiden Sie Luftblasen.
Hinweis: Ziehen der Suspension in und durch die Nadel als einem Durchgang betrachtet wird. Die Unterbrechung und Homogenisierung von Zellen durch hydrodynamische Scher ist eine Standardtechnik bei der Herstellung von Zellen, die zur Aggregation neigen. Die Weitergabe von Zellen durch eine Injektionsnadel von kleinen Innendurchmesser ist unwahrscheinlich, einen Einfluss auf ihre funktionellen Eigenschaften zu haben 25. 5C und D die normale Ultrastruktur von gereinigtem Sertoli-Zellen an Tag 4 der Kultur zeigt.- Pipette ein Tropfen der Suspension auf einen Glasobjektträger und lassen schnell die Tubuli unter einem umgekehrten Lichtmikroskop für Routine-Zellkultur bei 10-facher Vergrößerung, wenn die aggRegates sind alle (3F) dispergiert. Filtern der Zellsuspension durch ein 70 & mgr; m Zellsieb, um eine reine Einzelzellsuspension in dem Filtrat zu erhalten.
- Zentrifuge das Filtrat aus Schritt 5.4 bei 200 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur ohne die Pause verwenden. Überstand vorsichtig absaugen, eine 25 ml-Pipette und die Sertoli-Zellen in 40 ml RPMI 1640-Medium (Serum-freien) resuspendieren.
- Mischen Sie 100 ul Zellsuspension mit 100 ul Trypanblau Stain und zählen Zellen mit einer Neubauer Improved Kammer. Stellen Sie die Zellkonzentration auf 3 x 10 6 Zellen / ml nach dem Zählergebnis. Seed 1 ml pro Vertiefung auf einer Platte mit 6 Vertiefungen (= 1 Tag). Wenn ein Oil Red-O-Färbung (Schritt 6) ist geplant, legte ein Deckglas in einem oder wenigen Brunnen vor Sertoli-Zellen Aussaat.
Anmerkung: Sertoli Zellen in Suspension absetzen schnell, so daß das Rohr kurz jedes Mal, bevor ein Aliquot Zell geschüttelt werden mit der Pipette entnommen. Bis Tag 4 sie fest attACH dem Substrat. - Um schwimmenden oder haftenden Keimzellen an Tag 4 (4C) waschen jede Vertiefung der 6-Well-Platten für die Beschichtung isoliert Sertoli-Zellen (Schritt 5.6) mit PBS (4D) verwendet zu entfernen. Saugen Sie das Medium, fügen Sie 1-2 ml PBS in jede Vertiefung und schütteln Sie die 6-Well-Platten horizontal auf einem Tisch kräftig, aber ohne PBS verschütten. Wiederholen Sie die 3 x waschen und führen die gleiche Waschverfahren am Tag 5 und 6 (4E).
Hinweis: Am Tag 4 Sertoli-Zellen fest angebracht sind und zeigen eine Kopfsteinpflaster wie Muster unter dem umgekehrten Lichtmikroskop (4C). Experimente können von Tag 7 weiter durchgeführt werden.- (Alternative für Schritt 5.7) Für die Entfernung von schwimmenden und haftende Keimzellen führen eine hypotonischen Schock 3 Tage nach der auf 6-Well-Platten Aussaat. Entfernen Sie das Medium und 1 ml 20 mM Tris pH 7,5 direkt aus dem Kühlschrank genommen. Absaugen Tris-Puffer nach 90 bis 120 sec, jedoch nichtspäter. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS und 2 ml RPMI 1640-Medium (Serum-frei). Optional führen am nächsten Tag Experimente.
Hinweis: Je länger die Dauer des hypotonischen Schock ist die weitere Keimzellen aber je mehr Sertoli-Zellen entfernt werden kann und verloren gehen. Der erste PBS waschen sollte schnell, aber mit Sorgfalt erfolgen, um keine Sertoli-Zellen zu verdrängen. Direkt nach dem hypotonischer Behandlung zahlreicher Vakuolen unterschiedlicher Größe im Cytoplasma durch Phasenkontrastmikroskopie beobachtet werden. Vakuolen verschwinden innerhalb von ein paar Stunden nach der hypotonischer Behandlung.
- (Alternative für Schritt 5.7) Für die Entfernung von schwimmenden und haftende Keimzellen führen eine hypotonischen Schock 3 Tage nach der auf 6-Well-Platten Aussaat. Entfernen Sie das Medium und 1 ml 20 mM Tris pH 7,5 direkt aus dem Kühlschrank genommen. Absaugen Tris-Puffer nach 90 bis 120 sec, jedoch nichtspäter. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS und 2 ml RPMI 1640-Medium (Serum-frei). Optional führen am nächsten Tag Experimente.
6. Oil Red O Färbung
- Führen Sie alle Schritte bei Raumtemperatur. Am Tag 7 Wasch Sertoli-Zellen auf einem Deckglas (Schritt 5.6) mit PBS zweimal und fixieren Sie diese mit 10% Formalin in PBS gewachsen. Nach 10 Minuten Formalin mit frischer Lösung ersetzen und weiterhin Fixierung für weitere 60 min.
Anmerkung: Alle Lösungen werden hinzugefügt, um die (S) mit einem Deckglas und vor dem nächsten Schritt abgesaugt. Saugen Formalin, waschen Sie die Zellen zweimal mit Wasser und 60% Isopropanol hinzu. Nach 5 min erlauben Zellen an der Luft trocknen für ein paar Minuten. - 1 ml Oil Red O Färbung Lösung pro Vertiefung und Inkubation für 10 min. Saugen Sie die Lösung, und waschen Sie die Zellen sofort 4-mal mit Wasser und montieren Deckgläser in Glycerin-PBS (9: 1). Nehmen Sie Hellfeld-Bilder mit einer Routine Lichtmikroskop (4F).
7. Immunfluoreszenzfärbung
- Waschen Sie PTCs (aus Schritt 4.5) oder Sertoli-Zellen (aus Schritt 5.5) auf einem Deckgläschen gewachsen zweimal mit PBS und fixieren Sie diese mit 4% PFA für 10 min bei RT.
- Inkubieren mit 5% BSA in PBS für 1 h bei RT. Entsorgen Sie die BSA-PBS-Lösung und fügen frische BSA-PBS-Lösung Aktin (glatte Muskulatur) enthält (PTC) oder Vimentin (für Sertoli-Zellen) primärer Antikörper (Verdünnung 1: 100 für beide Antikörper) und Inkubation bei 4 ° CO / N.
Anmerkung: Die Inkubation mit BSA blockiert unspezifischen Bindung des primären Antikörpers. - Wash Deckgläser 3-mal für 5 min in PBS-0,1% Tween 20 und Inkubation mit grün-fluoreszierenden Farbstoff konjugiertem Ziege anti-Maus Sekundär-Antikörper (Verdünnung 1: 1000) bei RT für 1 h in der Dunkelheit.
- Wash Deckgläschen 3 mal 5 min in PBS-0,1% Tween 20 und montieren sie in DAPI Eindeckmediums.
8. Ultrastrukturelle Analyse
- Wash Sertoli-Zellen (aus Stufe 5.6) mit PBS auf eine 6 cm Zellkulturplatte gezüchtet und in einer Mischung aus 2,5% Glutaraldehyd, 2,5% Paraformaldehyd und 0,05% Pikrinsäure in 67 mM Cacodylat-Puffer bei 4 ° C für 2 h FIX ( pH 7,4) nach Ito und Karnovsky 26.
- Führen Postfixierung in 1% Osmiumtetroxid, gefolgt von einer O / N Inkubation in 0,3% Uranylacetat in 50 mM gelöst Maleat-Puffer (pH 5). Einbetten Proben Medien nach Standardverfahren in einzubetten. Schneiden Sie dünne Schnitte, kontrastieren sie mit Bleizitrat und untersuchen mit einem Elektronenmikroskop.
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Representative Results
Das beschriebene Verfahren ermöglicht die Isolierung von ca. 12 x 10 7 Sertoli-Zellen aus 10 Ratte Hoden. SO 3 x 10 6 Zellen pro Vertiefung auf einer Platte mit 6 Vertiefungen plattiert, dass sechs bis sieben Platten mit 6 Vertiefungen für Experimente zur Verfügung stehen 7. Die Trypsin-DNase I-Verdau der wichtigste Schritt bei der Sertoli Zellisolierung ist. Wenn Verdauung an dieser Stelle zu weit voran, erhöht sich das Verhältnis von Keimzellen / Sertoli Zellen proportional bis zum Ende. Während Tag 3-6 der Kultur ist es wichtig, sich sorgfältig zu waschen, so viele nicht-haftende oder lose Keimzellen wie möglich angebracht. Als Alternative zu umfangreichen Wasch über 4 Tage Keimzellen können durch hypotonische Behandlung an Tag 3 27 entfernt werden. Ein Vorteil dieses Verfahrens ist, dass die Zeit der Sertoli-Zellkultur auf ein Minimum reduziert wird, so dass Sertoli zellspezifischen Funktionen sind potentiell bessere erhalten als nach einer längeren Zeit der Kultur.
(5B) gezeigt werden. Da peritubulären Zellen eine starke proliferative Potenzial hat Sertoli-Zellkultur in Abwesenheit von Serum durchgeführt werden. In Gegenwart von 10% Serum PTCs würde etwa 20% aller Zellen nach 6 Tagen der Kultur dar, während sein Bruch erwartet werden kann 7 unter 1% in Abwesenheit von Serum zu sein. Praktisch alle isoliert Sertoli Zellen lebensfähig sind, wie durch Trypan-Blau-Färbung beurteilt (nicht gezeigt). Um Tag 7 der Kultur werden die isolierten Zellen Sertoli dest mit Keimzellen kontaminiert und peritubulären Zellen (Figur 4), so dass Versuche, um dieses Tag, wenn möglich durchgeführt werden sollte. Für eine gute Reproduzierbarkeit ist es wichtig, Experiment zu wiederholenist immer am selben Tag der Kultur. Wenn Transfektionen geplant werden, sollten sie am Tag durchgeführt werden, 4 oder 5, und Zellextrakte sollte am Tag 5 oder 6 hergestellt werden.
Über mindestens zwei Wochen in serumfreien Bedingungen Sertoli-Zellen reagieren auf FSH und produzieren mehr Androgen-bindenden Protein, Plasminogen-Aktivator und Transferrin auf FSH-Behandlung. Für mehr Kultur eine Feeder-Schicht von peritubulären Zellen oder Serum erforderlich. Nach vier Wochen Kulturen verschlechtern, und die Zellen lösen sich von der Unterlage 7.
Am Tag 6 der Kultur meisten Sertoli Zellen Lipidtröpfchen erworben. In der Mehrzahl der Zellen hat eine einzige große Vakuole gebildet (5C und 5D). Die neutrale Lipidgehalt kann leicht durch Oil Red O Färbung (4F) visualisiert werden.
Neben Sertoli cel ls die entfernten PTCs können auch (4A und 4B) kultiviert werden. PTCs 10 Hoden ergeben fünf T75-Kolben, die erwartet werden kann, nach 2 Tagen Kultur eine konfluente Schicht zu bilden. Wie isoliert Sertoli-Zellen frisch isolierte PTCs werden von Keimzellen kontaminiert, die weitgehend durch Passagierung entfernt werden kann. 2 durch Standard Trypsinierung so dass 10-Kolben wird am Tag 5 nach der Isolierung konfluent werden: Die Kolben werden 1 geteilt. Reinheit der isolierten PTCs ist> 95% und können mit α-smooth muscle actin Immunmarkierung (5A) bestätigt werden. Von diesem Tag an PTC für Experimente verwendet werden. Ein Kolben ist ausreichend für ungefähr eine 6-Well-Platte, und die Vertiefungen sollten am nächsten Tag konfluent werden. Zellen können oft passagiert werden, aber Experimente sollten immer an derselben Stelle, um sicherzustellen, durchgeführt werden, dass die Zellen in einer reproduzierbaren Art und Weise verhalten.
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Abbildung 1. Morphologie der Hoden und Arbeitsablauf des Verfahrens. (A) eines Sektors eines Tubulus mit benachbarten Zwischengewebe schematisch dargestellt. Hodenkanälchen werden durch eine Basalmembran (BM) und eine umlaufende Schicht aus myoid peritubulären Zellen (PTC) eingeschlossen. Keimepithels auf der luminalen Seite der Basalmembran liegt. Sertoli-Zellen (SC) werden die gesamte Keimepithels Spanning stark an das BM befestigt und über basolateralen positioniert okkludierende Gänge, die die Blut-Hoden-Schranke (BTB) miteinander verbunden sind. Deren unregelmäßige Kern (N) zeigt einen oder mehrere rissartigen Vertiefungen und enthält eine Kernkörperchen. Keimzellen (GC) in innigem Kontakt mit SCs in allen Stadien ihrer Entwicklung. Die Zwischenraum zwischen den Röhren enthält Leydig-Zellen (LC) und Immunzellen wie Makrophagen (M & PHgr;) sowie Blutgefäße (BV). Zahlangepasst von Fijak und Meinhardt 28. (B) Arbeitsablauf des Verfahrens; Farbkodierung ist wie in (A). Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Testes von Wistar-Ratten herausgeschnitten und entkapselt. (A) Die Bauchhöhle wird durch einen Längsschnitt geöffnet, wie im Text beschrieben. Ein Stern (*) zeigt die epidydimal Fettpolster. (B) Testes werden entfernt, indem das Samenstrang Schneiden und (C) in einem 50 ml konischen Röhrchen 20 ml PBS enthielt. Wenn alle Hoden gesammelt wurden, werden sie in 20 ml von 1% (w / v) Iod in Ethanol desinfiziert. Zur Entfernung des Jods sind sie schnell zweimal mit 25 ml gewaschenPBS jeder. (D) Hoden beim ersten Waschen PBS. (E) Testes werden in eine Petrischale (rechts) überführt und Hodenkanälchen sind aus der geöffneten Tunica albuginea mittels geschlossenen Scherenblätter (links) gequetscht, wie im Text beschrieben. (F) Die nebennierenlosen Hoden noch eine kompakte Hoden förmigen Masse bilden, mit einzelnen Röhrchen vorsteht. Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Isolierung von Sertoli-Zellen. (A) Nach dem Entfernen der interstitiellen Zellen durch Trypsin-DNase I Verdauung und Waschen 9x mit PBS Tubuli werden mobilisiert und sauber aussehen. (B) Während Collagenase-Hyaluronidase-DNase I-Behandlung peritubulären Zelles von der Außenschicht und Keimzellen freigesetzt. Die Tubuli erhalten verkürzt und eine grobe Aussehen erhalten. (C) Tubular Fragmente nach dem Waschen 4x mit PBS. (D) Hyaluronidase-DNase I-Behandlung Mitteilungen Rest peritubulären Zellen sowie Keimzellen. Tubuli gehen weiter verkürzt, und schlauchförmige Aggregate bilden. (E) Rohraggregate nach 4x Waschen mit PBS. (F) Einzel Sertoli-Zellen werden, indem die Aggregate 10x durch eine 18G Nadel erzeugt. Maßstabsbalken in (AE) = 200 & mgr; m in (F) = 50 & mgr; m. Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Kultur von peritubulären Zellen (AB) und Sertoli-Zellen (CF) und Entfernung von VERSCHMUTZ ing Keimzellen. (A) Resuspendierte PTCs aus Schritt 4.5 wurden sofort ausgesät und am nächsten Tag fotografiert. (B) Nach der Trennung am Tag 3 Kontamination mit Keimzellen reduziert wird. (C) Am Tag 4 Sertoli-Zellen zeigen eine typische Kopfsteinpflaster-ähnliches Muster. Schwimmendes und Einhaltung Keimzellen sind vor dem Waschen mit PBS. (D) Das gleiche auch nach 3x Waschen mit PBS. Die Anzahl der kontaminierenden Keimzellen reduziert. Waschen dreimal mit PBS wird wiederholt am Tag 5 und 6 (E) Am Tag 6 der Kultur praktisch alle Keimzellen entfernt worden sind. Sertoli-Zellen haben eine einzigartige schauZellSchicht gebildet, und die meisten Zellen einen einzigen großen Vakuole erworben. (F) Öl rot-O-Färbung zeigt, dass diese Vakuolen Lipidtröpfchen enthalten, sind weitgehend neutralen Lipiden. Maßstabsbalken in (AD) = 200 & mgr; in (E) = 50 & mgr; m und in (f) = 25 um..jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. Immunfluoreszenzfärbung. Färbung von gereinigten Primär peritubulären Zellen mit Actin (glatter Muskel) Antikörper (A) und von Sertoli-Zellen mit Vimentin-Antikörper (B). Keine kontaminierenden Zellen sind in beiden Sichtfeldern. Balken in (A) und (B) = 10 & mgr; m. (C) und (D) Elektronenmikroskopische Bilder von Sertoli-Zellen nach 4 Tagen in Kultur. (C) Man beachte die engen Kontakt benachbarter Zellen (Pfeilspitzen), die mit dem Kopfsteinartiges Muster führt wie in 4C zu sehen. Eine einzelne Lipidtröpfchen (L) wird in das Zytoplasma jeder Zelle beobachtet. (D) häufigste Organellen sind Mitochondrien (M) und dem Golgi-Apparat (G).Der Kern (N) enthält eine Kernkörperchen (Nc) und zeigt die typische rissartige Vertiefung. Maßstabsbalken in (C) = 1 & mgr; m und in (D) = 0,25 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die Autoren möchten Guido Verhoeven und Ludo Deboel, Leuven, die bei der Festlegung der Isolierung von primären Sertoli-Zellen in der Meinhardt-Labor in Gießen waren sehr hilfsbereit zu danken. Monika Fijak, Gießen, ist bekannt für ihre Hilfe bei der 1A und Beratung anerkannt. Die Studien wurden von der Deutschen Forschungsgemeinschaft durch Erteilung BH 93 / 1-1 (SB) und die Finanzierung des International Research Graduiertenkolleg JLU Gießen (Deutschland) / Monash University (Melbourne, Australien) GRK 1871 (SB) unterstützt. Unterstützung wurde auch aus einem Zuschuss des Landes Hessen im Rahmen des Programms "Landes-Offensive zur Entwicklung Wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz" (LOEWE) namens "Männliche Infertilität bei Infektion und Entzündung" (MIBIE) erhalten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Actin (smooth muscle) antibody clone 1A4 | Dako | M0851 | Monoclonal mouse anti human antibody. Use 1:100 dilution for immunofluorescence. |
| Albumin bovine fraction V Standard grade, lyophilized |
Serva | 11930.04 | Filter (0.45 µm) BSA solutions used for immunofluorescence. |
| Corning Cell Strainers 70 µm | Corning | 431751 | White color |
| Collagenase A from Clostridium histolyticum | Roche | 10103586001 | |
| DAPI mountant ProLong Gold Antifade | Life technologies | P-36931 | |
| D-glucose | Sigma | G8644 | 100 g/L |
| Dulbecco´s PBS without Ca2+/Mg2+ | Gibco | 14190-094 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Electron microscope | Zeiss | EM 109S | |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axioplan 2 | |
| Hyaluronidase from bovine testis | Sigma | H3506 | |
| Inverted light microscope | Olympus | CKX41 | Routine cell culture microscope |
| Mouse IgG / IgM (H+L) polyclonal secondary Antibody |
Life technologies | A-10684 | Alexa Fluor 488 conjugate |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | Has replaced Sudan III and Sudan IV because of brighter color. |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Penicillin (5,000 U/ml)/ Streptomycin (5,000 µg/ml) |
Gibco | 15070-063 | 100x solution |
| RPMI-1640 | Gibco | 21875-034 | Contains 300 mg/L L-glutamine |
| Trypsin from porcine pancreas | Sigma | T5266 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin inhibitor from soybean | Sigma | T6522 | The Sigma product is considerably cheaper than the previously used BPTI (Aprotinin) from Roche. |
| Vimentin antibody (V9) | Sigma | V6630 | Monoclonal mouse anti pig vimentin antibody. Use 1:100 dilution for immunofluorescence. |
| Wistar WU rats | Charles River | Should be 19 days old on day of experiment. |
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