Summary
차 세르 톨리 (Sertoli) 세포는 면역 보호 특성의 염증이나 감염, 및 이용 기간 동안 고환 면역 특권, 신호 전달 연구가 필요합니다. 여기에서 우리는 고도로 정제 차 세르 톨리 (Sertoli) 세포와 쥐의 고환에서 세뇨관 세포의 분리를 위해 효소 기반의 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
분화는 정자 제 사춘기시 나타나는 때문에 정소, 특히 남성 생식에서 독특한 방식으로 면역계 도전 - 10 년 이상의 전신성 면역 관용의 확립 후. 정자 세포는 면역 체계에 의해 비 자동으로 알 수있는 단백질의 수를 표현한다. 정소는 한 손이 네오 항원 내성을 확립 여전히 한편 감염 및 종양 발생으로부터 자신을 보호 할 수 있어야한다. 따라서 고환은 유해한 염증 면역 반응을 불러 일으키는없이 외국 항원을 허용 몸에 약간의 면역 특권 사이트 중 하나입니다. 세르 톨리 세포 고환이 면역 특권 환경 유지에 중요한 역할을하며 외부 환경 cotransplanted 세포의 생존을 연장. 따라서 차 세르 톨리 (Sertoli) 세포는 전자가 될 수 없습니다 고환의 면역 특권을 연구하기위한 중요한 도구입니다asily 설립 세포주 또는 다른 세포 모델로 대체. 원하는 경우 세뇨관 세포 - - 쥐의 고환에서 하루 내에 여기에서 우리는 세르 톨리 (Sertoli) 세포의 분리에 대한 상세하고 포괄적 인 프로토콜을 제시한다.
Introduction
고환은 안드로겐을 즉 남성 생식 및 성 호르몬을 생산하고 있습니다. 기관은 두 개의 구획으로 구성되어있다. 간질 성 구획에서, 즉 스테로이드는 간질 세포 내에서 발생, 총 고환 볼륨 1의 10-12 %를 차지. 관형 구획 고환 부피의 약 1 60-80%를 나타내고, 생식 세포 및 체세포 두 종류 포함 - 세뇨관 세포와 버팀 세포. 정소는 각각 1-3 고도로 복잡한 정소 세관을 포함 250-300 소엽으로 결합 조직 중격에 의해 분할된다. 이 세관은 기초 막, 콜라겐 시트 및 세뇨관 세포의 원주 층 (그림 1A)에 의해 둘러싸인.
새싹 상피 세포가 기저막의 내강 측에 있습니다. 세르 톨리 세포 루멘 기저막에서 전체 종자 상피 걸쳐 큰 신장 세포이다. 그들은 강하게 아르 AT & T는기초 막에 아팠다과 간질에서 생식 상피를 폐색 및 혈액 - 고환 장벽을 나타내는 기저 조직 꽉 접합을 통해 지속적인 세포 시트를 형성한다. 세르 톨리 세포는 눈에 띄는 세포질 계획과 생식 세포의 종 특이하지만 상수와 꽉 형태 학적 및 기능적 접촉 얻을 할 수 있도록 파급 효과가있다. 배체 생식 줄기 세포는 증식과 정조 세포로 분화.
감수 분열 동안 나는 감수 분열 II 동안 추가로 네 개의 반수체 정자에 개발 생성 배체 정모 세포를 짧은 살았다. 그들이 셀룰러 망을 형성하도록 모든 생식 세포 세포질 브릿지로 연결된다. 정자 성숙 동안 주요 이벤트 spermiogenesis 불리는 과정에서 잔류 체를 형성 세포질의 대부분의 압출이다. 잔류 몸은 세르 톨리 (Sertoli) 세포에 의해 포식한다. 늦은 정자는 다음에 출시관 루멘은 더욱 성숙 부고환으로 이송. 세르 톨리 세포와 생식 세포 상호 지형적 기능적으로 정자를 조정하기 위해 나타납니다.
작은 고환 조각이 재배 및 세포 유형은 현미경 (2)에 의해 확인 된 경우 개별 고환 세포 유형의 준비는 거의 한 세기 전에 시작했다. 뾰족한 집게를 사용의 Tunica albuginea을 연 후 세관의주의 해부으로는 관과 간질 구획 (3)를 분리 이후 수 있었다. 1975 년 웨일스어 및 위브는 간질 조직과 외부 세뇨관 세포 층 (4)의 제거를위한 크레아틴 처리를 부착 세관을 확보하기 위해 콜라게나 제 처리를 도입했다. 초기 젊은 미성숙 래트에 대한 (오래된 약 20 일)이되는 사용되었던에서 정자가 아직 시작되지 않았으므로 세르 톨리 세포 튜브형 세포 집단의 많은 부분을 포함한다. 이 연령 쥐 르트에서OLI 세포는 분열을 중단하고, 혈액 - 고환 장벽 (5)를 설립되도록 인접 셀 간의 긴밀한 접합을 형성한다.
웨일스어 및 위브 Dorrington 외.의 독립은 트립신의 조합을 소개하고, 같은 해 6 년에 출판되었다 soybeen 트립신 억제제와 콜라게나 제 처리하여 디옥시리보 뉴 클레아. 두 그룹은 약 70 %의 Sertoli 세포를 포함 도금 균질 세포 현탁액을 제조하기 위해 (주사기 바늘 또는 각각 파스퇴르 피펫을 통하여 반복해서 분해 관형 단편 드로잉) 기계적 힘을 사용했다. 혈청이없는 배지를 사용하여 배양 3 일 후, 세르 톨리 (Sertoli) 세포의 비율은 약 90 %로 증가한다. 이것은 주로 생식 세포 오염의 죽음에 기인 할 수있다. 잔류 세뇨관 세포 (PTCS)은, 그러나, 그들의 세포 외 기질 단단히 통해 부착있어. PTCS 아니지만 세르 톨리 (Sertoli) 세포를 생성하는 것으로 알려진PTCS 오염을 추정하기위한 마커 단백질로서 작용할 수 피브로넥틴. 따라서, 오동 나무 등. 추가 히알루 처리 세르 톨리 세포 분획 (7)의 순도를 개선시킬 수 있음을 추론. 실제로 이들은 추가적인 처리에 비해 혈청 함유 배지 정제 세르 톨리 (Sertoli) 세포 배양에 사용되는 경우에 특히 분명하게되는 약 20 배 PTCS에 의한 오염을 줄일 수있는 것을 표시 할 수있다. 그때부터 오동 나무 등의 등의 개선 된 절차에. 일반적인 프로토콜되었고 광범위 필드 8 (그림 1B)의 다른 주요 그룹에 의해 사용되었다.
콜라게나 제 처리 중에 PTCS의 대부분이 해제되고 버팀 세포에 병렬로 분리 될 수있다. PTCS가 적극적으로 증식과 난포 자극 호르몬 (FSH)이 응답하지 않는 반면, 세르 톨리 (Sertoli) 세포는 더 이상 분열을 겪게 및 특성 형태 학적 변화에 의해 FSH에 반응하지 않는및 환상 아데노신 모노 포스페이트 (cAMP) 농도 9 증가한다. 매우 유사한 효소 소화 프로토콜 남자 10, 11, 12, 마우스, 햄스터 시베리아 13 야크 (14)와 같은 다른 동물 차 세르 톨리 세포의 분리를 위해 사용될 수있다. 생식 세포를 저장성 충격 오염 다량 제거하기위한 분리 절차 (15)의 단부에 사용될 수있다. 성인 쥐 16 고환에서 이것은 또한 세르 톨리 (Sertoli) 세포의 효율적인 분리를 허용한다. 농축 버팀 세포 현탁액은 계시 가시 독말풀과 응집소 17 렉틴 코팅 접시에 현탁액을 도금함으로써 세균 세포로부터 분리 될 수있다. 만 세르 톨리 (Sertoli) 세포와 약간의 잔류 PTCS는 렉틴 판에 부착.
기본 버팀 세포 배양 주로 쥐에서 마우스 세르 톨리 (Sertoli) 세포 리튬 등 세포주 호르몬 반응성을 조사하거나 설정하기위한 초기 사용되고네브라스카 TM4 18. 이 세포주는 지금까지 이상 백 연구에서 조사되었다. 병진 접근법에서 세르 톨리 세포 면역 조직 (19)없이 공 배양 세포 및 장기 이식 생존 동종 또는 이종의 췌장의 공동 이식에서와 같은 조직의 면역 보호에 이용되고있다. 체세포 - 생식 세포 (세르 톨리 (Sertoli) 세포 - 생식 세포) (20)의 상호 작용 21 - 격리 버팀 세포는 상피 간엽 (PTCc 세르 톨리 (Sertoli) 세포) 공부 공동 배양 실험에 사용되었다. 최근 주 버팀 세포 비병원성과 uropathogenic E. 감염 다음 식 사이토 카인 선도 수신자 같은 수용체의 발현 및 염증성 사이토 카인의 분비뿐만 아니라 신호 전달 캐스케이드 조사에 이용되고 대장균 22. 다른 최근 조사는 고환 면역 쪽을 공부 세르 톨리 (Sertoli) 세포를 사용 하였다rivilege (23)과 테스토스테론 전처리가 LPS에 의한 염증 반응 (24)을 억제 것을 보여 주었다.
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Protocol
1. 동물 윤리 정책
여기에 설명 된 실험은 지방 자치 단체로, Regierungspräsidium 기센, 독일의 지침에 따라 수행 및 실험 목적에 대한 관리 및 동물의 사용을위한 연습의 독일 코드 (권한 없음을 확인했다 :. GI 23분의 20 수 (Nr) (31) / 2012).
미디어, 효소 솔루션 및 동물 2. 준비
- 100 ml의 에탄올에 요오드 1g을 용해시켜 1 % 요오드 알코올을 준비한다.
- 배 500 ml의 Dulbecco's 인산 완충 식염수 7.5 ML의 D-포도당 (100g / L) 및 5 ml의 100 배 페니실린 / 스트렙토 마이신 원액 (15 ㎎ / ㎖ D 각 보충 칼슘없이 (PBS) 2+ 및 마그네슘 2+ 준비 글루코스 공수, 50 U / ㎖ 페니실린 및 50 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신 최종).
- 500 ml의 로스웰 파크 메모리얼 연구소 (RPMI) 5 ml의 100 배 페니실린 / 스트렙토 마이신 주식 솔루션 (50 U / ㎖ 페니실린 및 50 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신 지느러미와 1640 배지 1 배 (부록)AL).
- 트립신 - DNase의 I 솔루션을 준비 (2.5 밀리그램 / 트립신 및 10 μg의 / ㎖의 DNase I ㎖) 25 mg의 트립신 0.1 ml의 DNase를 추가하여 I 9.9 ml의 PBS (1 ㎎ / ㎖의 DNase I).
- 용액 (10 ㎎ / ㎖) 억제제 트립신 5 ml의 PBS에서 50 mg의 트립신 억제제를 녹인다. 트립신 저해제 B 용액 10 ml의 PBS (2.5 ㎎ / ㎖)에 25 mg의 트립신 억제제를 녹인다.
- 콜라게나 히알루로 - 데 옥시 리보 뉴 클레아 제 I (DNase를 I) 용액 (1 ㎎ / ㎖ 최종) 10mg을 콜라게나 제, 10 mg의 히알루 (1 밀리그램 / 최종 ml) 및 0.1 ml의 DNase를 용해 I (1 ㎎ / ㎖의 DNase I) ( 10 μg의 10 ml의 PBS에서) 마지막 / ㎖.
- 9.9 ml의 PBS에 10 mg의 히알루로니다 제 (1 밀리그램 / 최종 ㎖) 및 0.1 ml의 DNase의의 I 용액 (1 ㎎ / ㎖) (10 μg의 최종 / ㎖)을 추가하여 히알루-의 DNase I 솔루션을 준비합니다.
- 그들이 세르 톨리 (Sertoli) 세포 분리의 날 19 일 이전되도록 시간을 위 스타 쥐를 주문하십시오.
참고 : 10 기재 프로토콜 래트 위해 설계되지만 5 최소 20 래트의 최대 변형 될 수있다.모든 용액의 부피는 이에 따라 조정되어야한다. - 100 ml의 이소프로판올에 0.35 g 오일 레드 O 용해시켜 오일 레드 O 원액을 준비한다. 볶음 O는 / N은 최대 일년 동안 실온에서 0.2 μm의 저장소를 통해 필터링합니다.
- 4 ㎖의 물을 6 ml의 오일 레드 O 원액을 혼합하여 오일 레드 O 염색 용액을 제조 하였다 (3 : 2). 0.2 μm의를 통해 10 ~ 20 분 필터 후. 다음 2 시간 이내에 사용하십시오.
- 4 % 준비 부드럽게 교반하면서 1X PBS 80 ml의 4g 파라 포름 알데히드 분말 (PFA)를 추가하여 환기 후드에 포름 알데히드 용액 (/ V w). 열 ~ 60 ° C는 1 M의 NaOH를 가하여 1 및 파라 포름 알데히드가 용해 될 때까지 교반을 계속한다. 용액을 실온으로 냉각 한 M HCl로 pH를 7.4로 1X PBS와 함께 100 ㎖로 볼륨을 조절 보자. 용액 (0.45 μm의) 필터 및 몇 달 동안 -20 ° C에서 분취 신선한 또는 저장소를 사용합니다.
참고 : 중합 된 포름 알데히드 (PFA)는 물에 단량체 포름 알데히드에 해중합. 이 프로세스는적당한 난방과 약 알칼리성의 pH에 의해 촉매. 갓 모든 효소액을 제조하고 사용하는 필터의 날 (0.2 μM)을 살균. 효소에 대해 서로 다른 제조 업체 (자료 참조 / 장비 표)의 경우주의 깊게 농도 / 활동을 조정, 사용됩니다.
다음 프로토콜에서 "피펫"는 혈청 학적 피펫을 의미합니다.
정액을 운반하는 세관 3. 준비
- CO 2하여 데시 분당 챔버 체적의 적어도 20 % 변위 유량 10 수컷 위 스타 래트를 하나씩 마취. 발 패드를 압박하여 호흡이 정지 될 때까지, 테스트 마취를 기다린가있는 경우에는 반응은 자궁 전위에 의해 각각의 쥐를 안락사 없습니다. 흐르는 물에서 경정맥과 경동맥 (질 carotica)을 절편하여 혈액을 배출합니다. 70 % 에탄올로 닦아 복부를 소독.
- 사용 포셉은 복부 뮤스으로부터 피부를 들어 올려사이클 사용은 흉골 (그림 2A)에 치골로부터 연장되는 타원형 모양의 피부 로브를 잘라 그것을 가슴에 위로 플랩. 다음으로, 복부 근육을 잡아 흉골에 치골에서 내측 절개를합니다.
- 위쪽 아래쪽 골반에서 고환을 밀어하기 위해 골반에서 엄지 손가락으로 복부를 꽉. 또한 고환을 인상하기위한 집게로 부고환 지방 패드 (그림 2B)를 선택합니다. 의 Tunica albuginea은 그대로두고, 정액 코드 (그림 2B)를 절단하고, 50 ML 원뿔 튜브 (그림 2C)에 20 ml의 PBS의 모든 고환를 수집합니다.
- 모든 정소를 수집 한 후, 에탄올 중 요오드 (/ V W) 1 %의 동일 부피 (20 ml)에 추가하여 소독. 두 번 튜브를 반전 즉시 뜨는을 가만히 따르다. 빨리 25 ml의 PBS 각 (그림 2D)로 두 번 고환을 씻는다.
- 포함 페트리 접시에 고환 이동15 ml에 보내고 PBS (그림 2E). 한 끝에 집게로 단단히 각각의 고환을 잡고 반대쪽 끝에서의 Tunica albuginea에 작은 절개를하고, 스크래핑 도구로 폐쇄 가위 블레이드를 사용하여 세관을 짠다.
참고 : 세관은 여전히 몇 세관이 균일 효소 소화 (그림 2 층)를 활성화하기 위해 솔루션으로 연장 컴팩트 고환 모양의 다발을 형성한다. - 10 ㎖의 트립신-의 DNase I 솔루션을 포함하는 100 ㎖ 스크류 캡 병에 드 캡슐화 고환을 전송합니다. 32 ° C (120 진동 / 분)에 떨고 물 목욕 소화를 수행합니다. 4 분 후에는 세관의 분산 육안으로 세관을 평가합니다. 세관은 용액에 분산 시작하면, 즉시 소화를 중지합니다. 필요한 경우, 최대 2 분 동안 배양을 계속합니다.
- 다운 3-4 시간까지 철저히 피펫으로 용액을 혼합 트립신 억제제 A. 용액 5 ㎖를 첨가하여 트립신 소화 중지10 ㎖ 피펫을 사용하여 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 옮긴다이야.
- 배양 5 분 후 세관 신중 단계 3.6에서 10 ㎖ 피펫을 이용하여 상층 액을 제거하고 충분히 트립신 분해를 중지하기 위해 트립신 억제제 B 용액 10 ㎖를 추가 유닛 중력에 의해 침전 관찰한다. 아래로 2-3 시간을 피펫 팅에 의해 세관을 재현 탁.
- 오염 제거하기 위해 간질 세포를 25 ml의 PBS 각각 세관 9 번 씻는다. 25 ML의 피펫을 사용하여 각 세척에 세관을 재현 탁하고 10 분 단위 중력에 의해 정착 할 수 있습니다. 항상 PBS, 부유하고, 상등액의 제거를 피펫 팅에 대해 동일한 25 ML의 피펫을 사용합니다.
세뇨관 세포의 4. 제거 / 분리 (PTCS)
- 100 ㎖ 스크류 캡 병에 모든 세관을 전송하고 콜라게나 제 히알루-의 DNase I 솔루션 (그림 3A)를 추가합니다. (120 진동 / 분) 32 ° C에서 진탕 수조에서 10 분 동안 소화를 수행.
- 피펫 유리 슬라이드에 정지 한 방울 빠르게는 100 배 배율에서 일상적인 세포 배양을위한 반전 된 광학 현미경 하에서 세관을 확인합니다. 소화 고급이 아닌 경우 충분히 (현미경 검사에 필요한 시간을 계산에 포함되지 않습니다) 추가 2 분 동안 배양을 계속합니다.
참고 :이 단계에서는 모든 세관 (그림 3b 및 C) 거친이되어야 길이와 세관 가장자리에 단축 얻을. 거친 가장자리는 세뇨관 세포의 릴리스를 표시합니다. - 단계 3.8에서 25 ml를 피펫을 사용하여 50 ML 원뿔 튜브에 소화 세관과 정지를 전송합니다. 10 ml의 PBS와 100ml의 병을 세척하고 원뿔 튜브에 세관에 추가합니다. 다시 25 ml를 피펫을 사용하여, PTCS를 포함, 소화 세관은 상층 액을 10 분 단위 중력에 의해 정착 조심스럽게 대기음 할 수 있도록 허용하고 새 원뿔 튜브로 전송할 수 있습니다. 지난 몇 밀리리터의 포부를 들어 순으로 하였다 5 ml를 피펫을 사용r은 세관의 이월을 방지합니다.
- 수집 된 세관 상청액을 20㎖ RPMI를 10 % 열 - 불 활성화 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충 1640 추가 브레이크를 사용하지 않고, RT에서 10 분 동안 300 XG에 혼합하고 원심 분리기.
- 조심스럽게 뜨는을 가만히 따르다 16 ml의 매체 각을 포함하는 다섯 T75 플라스크에 RPMI 20 ml의 10 % 열 - 불 활성화 FBS로 보충 1640 배지 및 씨앗 4 ml의 각 펠렛 PTCS를 재현 탁. CO 2 분위기 (그림 4A) 5 %에서 37 ° C에서 품어.
- 문화의 3 번째 날에 PTCS를를 Trypsinize 그들에게 1 분할 : 10 % 열 - 불 활성화 FBS로 보충 된 16 ml의 RPMI 1640 배지를 포함 T75 플라스크에 2 각 (수율 10 플라스크 모두) (그림 4B). CO 2 분위기 5 %에서 37 ° C에서 배양을 계속합니다.
- 문화의 5 번째 날에 다시 PTCS를를 Trypsinize 및 실험에 따라 6 자 또는 24 웰 플레이트에 그들을 판(접시 당 하나의 T75 플라스크). 실험 6 일째에 수행 될 수있다.
세르 톨리 (Sertoli) 세포의 5 단열 (희주)
- 25 ML의 피펫을 사용하여 철저하게 PBS의 25 ml의 단계 4.3에서 정착 세관을 재현 탁하고 12 분 단위 중력에 의해 정착 할 수 있습니다. 피펫 PBS, 세관 및 상층 액을 제거의 재 부유에 대해 동일한 25 ML의 피펫을 사용합니다. 세탁 3 번 (총 4 세척)를 반복합니다.
- 마지막 세척 다른 100 ㎖로 소화 세관을 전송 한 후 히알루-의 DNase I 솔루션을 포함하는 병 캡 나사. 32 ° C (120 진동 / 분)에 떨고 물 목욕 소화를 수행합니다.
- 단계 4.2에 설명 된대로 5 분 후에 100 배 배율의 광학 현미경 검사를 통해서 다시 세관을 확인합니다.
참고 : 짧은 세관, 관 집계 및 발표 세포 (그림 3D) 볼 수 있어야합니다.- 관 집계가 10 분 동안 정착 허용, 우리를 뜨는을 대기음25 ml를 피펫을 보내고. 워시 25 ㎖ PBS, 각 세척 단계 (도 3e)에 대한 10 분의 침강 시간을 이용하여 4 회 집계.
- RPMI 1640 배지 20 ㎖를 추가하고 20 ML의 주사기에 장착 된 18 G 바늘을 통해 정지 10 번을 전달합니다. 공기 방울을 피하십시오.
참고 :에 바늘이 하나의 패스로 간주됩니다 통해 정지를 당기는. 유체 역학적 전단력에 의한 세포의 파괴 및 균질화가 응집하는 경향이 세포의 제조에 표준 기술이다. 작은 내경의 피하 주사 바늘을 통해 세포의 통과는 25.도 5C 및 D는 배양 4 일째 정제 세르 톨리 세포의 일반적인 미세 구조를 도시 기능적 특성에 영향을 미칠 가능성이있다.- 피펫 AGG이 경우 10X 배율 루틴 세포 배양을위한 광 역 현미경 세관을 확인 신속 유리 슬라이드 및 현탁액 드롭regates 모든 (그림 3 층) 분산된다. 여액 순수한 단일 세포 현탁액을 수득하기 위해 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 필터.
- 브레이크를 사용하지 않고 실온에서 10 분 동안 200 XG에 단계 5.4의 여과 액을 원심 분리기. 조심스럽게 (40)의 세르 톨리 (Sertoli) 세포를 25 ml를 피펫을 사용하여 뜨는을 대기음, 그리고 재현 탁 ml의 RPMI 1640 배지 (혈청).
- 트리 판 블루 얼룩 100 ㎕ 100 ㎕의 세포 현탁액을 혼합하고 노이 바 우어 개선 챔버와 세포를 계산합니다. 계산 결과에 따라, 3 × 106 세포 / ml의 세포 농도를 조정한다. 시드 6 웰 플레이트 (= 1 일)에 웰 당 1 ml의. 오일 레드 O 염색 (6 단계)이 계획되어있는 경우 하나에 커버 슬립을 넣어 또는 세르 톨리 (Sertoli) 세포를 파종하기 전에 몇 우물.
참고 : 튜브 간단히 셀 나누어지는이 피펫을 촬영하기 전에 때마다 흔들리는해야합니다 있도록 서스펜션의 세르 톨리 (Sertoli) 세포가 빠르게 정착. 4 일 그들은 단단히 AT & T까지기질에 ACH. - 4 일째에 떠 또는 접착 생식 세포를 제거하기 위해 (도 4C)은 절연 버팀 세포 PBS (도 4D)로한다 (단계 5.6)을 도금에 사용 된 6 웰 플레이트의 각 웰을 세척한다. , 매체를 기음 각 웰에 PBS의 1-2 ml에 추가하고 적극적으로 테이블에 있지만 PBS를 유출하지 않고 수평으로 6 웰 플레이트를 흔들. 세척을 3 회 반복 한 후, 5 일, 6 (도 4E)에 동일한 세정 절차를 수행한다.
4 일 세르 톨리 (Sertoli) 세포가 완전히 첨부에와 반전 광학 현미경 (그림 4C)에서 패턴처럼 조약돌을 보여 주. 실험은 7 일 이후에서 수행 될 수있다.- 부착 생식 세포 6 웰 플레이트에 파종 후 3 일 저장성 충격을 수행 부동 및 제거 용 (단계 5.7의 대체). 매체를 제거하고 냉장고에서 직접 찍은 20 mM 트리스 pH가 7.5 1 ㎖를 추가합니다. 90 초 120에 있지만 이후 트리스 버퍼를 대기음후에. PBS로 두 번 세포를 세척하고 RPMI 1640 배지 (혈청) 2 ㎖를 추가합니다. 선택적으로, 다음날 실험을 수행합니다.
주 : 저 삼투압 충격 긴 기간보다 생식 세포를 제거 할 수 있지만 더 세르 톨리 (Sertoli) 세포뿐만 아니라 분실. 제 PBS 세척 임의의 Sertoli 세포를 대체하지 않도록 빠르게 있지만,주의하여주십시오. 직접 다른 크기의 저장성 치료 수많은 공포는 위상차 현미경에 의해 세포질에서 관찰 할 수 있습니다 후. 액포는 저장성 치료 후 몇 시간 내에 사라집니다.
- 부착 생식 세포 6 웰 플레이트에 파종 후 3 일 저장성 충격을 수행 부동 및 제거 용 (단계 5.7의 대체). 매체를 제거하고 냉장고에서 직접 찍은 20 mM 트리스 pH가 7.5 1 ㎖를 추가합니다. 90 초 120에 있지만 이후 트리스 버퍼를 대기음후에. PBS로 두 번 세포를 세척하고 RPMI 1640 배지 (혈청) 2 ㎖를 추가합니다. 선택적으로, 다음날 실험을 수행합니다.
6. 오일 레드 O 염색법
- 실온에서 모든 단계를 수행합니다. 7 일 워시 세르 톨리 (Sertoli) 세포는 PBS로 두 번 커버 슬립 (단계 5.6)에서 성장하고 PBS 중 10 % 포르말린을 고정한다. 10 분 후 신선한 솔루션으로 포르말린을 대체하고, 또 다른 60 분 동안 고정을 계속합니다.
주 : 모든 용액은 커버 슬립 웰 (들)에 첨가하고, 다음 단계 이전에 흡입된다. 대기음 포르말린, 물 세포를 두 번 세척하고 60 % 이소프로판올을 추가합니다. 5 분 후 몇 분 동안 공기 건조에 세포를 할 수 있습니다. - 물론 당 1 ml의 오일 레드 O 염색 솔루션을 추가하고 10 분 동안 품어. 용액을 흡인시키고, 물로 즉시 세포를 네 번 세척하고 마운트 커버 글리세롤 PBS에서 슬립 (9 : 1). 일상적인 광학 현미경 (그림 4 층) 밝은 필드 이미지를 가져 가라.
7. 면역 형광 염색법
- 두 번 PBS와 커버 슬립 성장 (단계 5.5)에서 세르 톨리 (Sertoli) 세포 (4.5 단계에서) PTCS를 세척하고 실온에서 10 분 동안 4 % PFA로 고정합니다.
- RT에서 1 시간 동안 PBS 중 5 % BSA와 인큐베이션. BSA-PBS 용액을 취소하고 신선한 BSA-PBS의 (PTCS에 대한) 액틴 (평활근)을 함유 용액 또는 멘틴 (세르 톨리 (Sertoli) 세포) 차 항체 (희석 1 : 100 두 항체)를 추가하고 4 ° CO / N에 품어.
주 : 차 항체의 비특이적 결합을 차단 BSA와 인큐베이션. - 워시 커버 PBS-0.1 % 트윈 20에서 5 분 동안 3 번 미끄러 녹색 형광 염료를 결합 염소 항 마우스 이차 항체 (희석 1 : 1,000)와 함께 품어 어둠 속에서 1 시간 동안 실온에서.
- 워시 커버 PBS-0.1 % 트윈 20에서 5 분 동안 3 번 미끄러 져 DAPI 장착 매체를 탑재합니다.
8. 미세 구조 분석
- PBS로 6cm 세포 배양 접시에 성장한다 (단계 5.6)에서 워시 세르 톨리 (Sertoli) 세포 (67 밀리미터 cacodylate 완충액 중 2.5 % 글루 타르 알데히드, 2.5 % 파라 포름 알데히드 0.05 % 피크르산의 혼합물을 4 ℃에서 2 시간 동안 이들을 해결 이토와 Karnovsky (26)에 따라 pH를 7.4).
- 50mM의 말레 에이트 완충액 (pH 5)에 용해 된 0.3 % 우라 닐 아세테이트에서 O / N 항온 처리 한 다음, 1 % 산화 오스뮴으로 사후 고정을 수행한다. 표준 절차에 따라 미디어를 포함에 포함 된 샘플. 얇은 부분을 잘라 리드 시트 레이트로 대조 및 전자 현미경으로 검사합니다.
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Representative Results
설명 절차는 10 쥐의 고환에서 약 12 × 10 7 세르 톨리 (Sertoli) 세포의 분리를 할 수 있습니다. 6-7 6 웰 플레이트 하루 7. 실험에 사용할 수 있는지 트립신-DNase의 I 소화가 세르 톨리 (Sertoli) 세포 분리시 가장 중요한 단계는 그래서 3 × 10 6 세포를 6 웰 플레이트에 잘 당 도금. 이 시점에서 분해가 지나치게 진행되면, 생식 세포의 비율 / 세르 톨리 (Sertoli) 세포 불균형 단부까지 증가한다. 문화의 날 3-6시 신중 가능한 비 접착 거리만큼 또는 느슨하게 부착 된 생식 세포를 세척하는 것이 중요합니다. 사일 통해 광범위한 세정액에 대한 대안으로서 세균 세포를 3 일 27 저장성 처리에 의해 제거 될 수있다.이 방법의 장점은 세르 톨리 (Sertoli) 세포의 특정 기능을 잠재적으로 더되도록 세르 톨리 (Sertoli) 세포 배양의 시간은 최소로 유지된다는 것이다 문화의 장기간 후에보다 유지했다.
(도 5b)에 의해 설명 될 수> 95 %이다. 세뇨관 세포는 강력한 증식 잠재력을 갖고 있기 때문에, 세르 톨리 (Sertoli) 세포 배양은 혈청의 부재 하에서 수행되어야한다. 그 분획 7 혈청의 부재하에 1 % 이하로 예상 될 수있는 반면, 10 %의 존재하에 혈청 PTCS 배양 6 일 후 전체 세포의 약 20 %를 구성한다. 트립 판 블루 염색법에 의해 판단 사실상 모든 격리 버팀 세포 생존 (도시 생략). 가능하면 실험이 일경 수행되어야되도록 배양 7 일째 주변 절연 버팀 세포 적어도 세균 세포 세뇨관 세포 (도 4)에 의해 오염된다. 좋은 재현성을 위해 실험을 반복하는 것이 중요하다문화의 같은 날에 항상에요. 형질을 계획하는 경우 이들은 하루 4-5에서 수행되어야하고, 세포 추출물을 5 일 또는 6 일에 이루어져야한다.
무 혈청 조건 세르 톨리 (Sertoli) 세포에서 적어도 2 주 동안 FSH에 응답하고보다 안드로겐 결합 단백질, 플라스 미노 겐 활성제 및 트랜스페린 FSH 처리시에 생성한다. 더 이상 문화 세뇨관 세포 또는 혈청의 세포층이 필요합니다. 사주 후 문화 저하 및 세포 기질 (7)에서 분리합니다.
문화 대부분의 세르 톨리 (Sertoli) 세포의 날 (6)에 지질 방울을 획득했다. 세포의 대부분에서 하나의 큰 공포 (그림 5C 및 5D)을 형성하고있다. 중성 지질 함량 용이 오일 레드 O 염색법 (도 4F)에 의해 시각화 될 수있다.
버팀 CEL 이외에 LS PTCS 제거는 (도 4a 및도 4b)과 배양 될 수있다. 10 고환에서 PTCS 배양 2 일 후에 합류 층을 형성 할 것으로 예상 될 수있는 다섯 T75 플라스크를 얻었다. 절연 버팀 세포 같이 갓 절연 PTCS 크게 계대에 의해 제거 될 수 생식 세포에 의해 오염된다. 10 플라스크가 차단 후 5 일째에 컨 플루 언트 될 수 있도록 표준 트립신에 의해 2 : 술병은 1 분할됩니다. 절연 PTCS의 순도는> 95 %이고, α-평활근 액틴 immunolabeling (도 5a)를 사용하여 확인할 수있다. 이 날부터는 PTCS 실험에 사용될 수있다. 한 플라스크를 약 6 웰 플레이트에 충분하고, 웰 다음날 컨 플루 언트한다. 세포를 여러번 계대 배양 할 수 있지만, 실험에서 세포를 재현 가능한 방식으로 작동하는지 확인하기 위하여 동일한 통로에서 항상 수행되어야한다.
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프로 시저의 고환 및 워크 플로우 그림 1. 형태론. (A)에 인접 간질 조직과 세 정관의 섹터는 개략적으로 표시됩니다. 정액 세관은 기초 막 (BM) 및 myoid 세뇨관 세포 (PTC)의 원주 층에 의해 둘러싸인. 새싹 상피 세포가 기저막의 내강 측에 있습니다. 본원 전체에 걸쳐 상피 세르 톨리 세포 (SC)를 강하게 BM 부착 및 혈액 - 고환 장벽 (BTB)를 나타내는 기저 위치 흡장 접합부를 통해 상호 접속된다. 그들의 불규칙한 핵 (N)은 하나 이상의 균열과 같은 들여 쓰기를 표시하고 핵소체가 포함되어 있습니다. 생식 세포 (GC)은 그 개발의 모든 단계에서 희주에 밀착된다. 세관 사이의 간질 함 간질 세포 (LC)과 면역 세포 등 대 식세포 (MΦ을)와 같은뿐만 아니라 혈관 (BV)가 포함되어 있습니다. 그림Fijak과 마인 하르트 (28)에서 적응. 절차 (B) 흐름; (A).에 같은 색상 코드는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
본문에 기재된 바와 같이도 2의 Wistar 래트에서 고환을 절제하고이 디 캡슐화된다. (A) 복강는 세로 절개를 통해 개방된다. 별표 (*) epidydimal 지방 패드를 나타냅니다. (B) 고환 20 ml의 PBS를 함유하는 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 수집 정삭 및 (C)을 절단하여 제거한다. 정소 모두가 수집 된 때 그들은 1 % 에탄올 (w / v)의 요오드를 20㎖의 소독된다. 요오드 제거 그들이 신속 25 ㎖로 2 회 세척PBS 각. 첫 번째 PBS 세척 후 (D) 고환. 본문에 기재된 바와 같이 (E) 고환 (오른쪽) 페트리 접시에 전송되고, 정소 세관은 (좌측) 폐쇄 가위의 블레이드에 의해 개방 외막 albuginea에서 압착된다. (F) 캡슐화가 고환은 여전히 하나의 세관이 돌출와 소형 고환 모양의 덩어리를 형성한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
세르 톨리 (Sertoli) 세포의 그림 3. 분리. (A) PBS의 세관과 트립신 - DNase의 I 소화 세척 9 배에 의한 간질 세포의 제거 후에는 동원되고 깨끗한 봐. 세포 세뇨관 콜라게나 제 히알루-의 DNase I 처리 중 (B)외부 층과 배아 세포에서의이 해제됩니다. 세관 단축하고 거친 모양을 얻을 얻을. (C) PBS로 세척 4 배 후 관상 조각. (D) 히알루-의 DNase I 처리 출시 잔류 세뇨관 세포뿐만 아니라 생식 세포를. 세관은 더 단축 취득 및 관상 집계 형성한다. (E)는 관형 PBS로 세척 후 4X 집계. (F) 싱글 세르 톨리 (Sertoli) 세포는 18G 바늘을 통해 집계 10 배를 전달하여 생성된다. (AE)에 스케일 바는 200 μm의, (F) = 50 μm의 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 세뇨관 세포의 문화 (AB)와 세르 톨리 (Sertoli) 세포 (CF)와 contaminat 제거 보내고 생식 세포. (A) 단계 4.5에 재현 탁 PTCS 즉시 시딩 다음날 촬영 하였다. 세균 세포를 3 일째에 오염 분할 후 (B)이 감소된다. 4 일 세르 톨리 세포 (C)는 전형적인 조약돌 모양 패턴을 도시한다. 플로팅 및 부착 생식 세포는 PBS로 세척 전에 볼 수 있습니다. (D) PBS로 3 회 세척 한 후 같은 잘. 오염 생식 세포의 수가 감소된다. 회 PBS로 세척 거의 모든 생식 세포가 제거 된 배양 6 일째에 5 일 및 6 (E)에 반복된다. 세르 톨리 세포 고유 찾고 전지 층을 형성하고, 대부분의 셀은 하나의 큰 액포를 획득. (F) 오일 레드 O 염색이 액포 크게 중성 지질을 함유하는 지질 소적 것을 보여준다. (F) (AD) = 200 μm의, (E) = 50 μm의와의 스케일 바는 25 μm의 =..JPG "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. 면역 형광 염색법. 액틴 (평활근) 항체 (A)와 정제 차 세뇨관 세포의 염색 및 vimentin에 항체 (B)와 세르 톨리 (Sertoli) 세포. 아니 오염 세포는보기의 두 필드에 표시되지 않습니다. (A)와 (B)의 스케일 바는 10 μm의 =. (C)와 문화 4 일 후에 세르 톨리 (Sertoli) 세포의 (D) 전자 현미경 사진. (C)도 4c에서 볼 수 있듯이 조약돌 모양의 패턴에 이르게 인접 셀 (화살촉)의 밀착을합니다. 단일 지질 (L)는 각 셀의 세포질에서 관찰된다. (D) 가장 풍부한 세포 소기관이 미토콘드리아 (M)와 골지체 (G)입니다.핵 (N)는 핵소체 (NC)를 포함하고 전형적인 균열과 같은 들여 쓰기를 보여줍니다. 스케일 (C) = 1 ㎛의 바에서 (D) = 0.25 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Disclosures
저자는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
저자는 기센의 마인 하르트 실험실에서 차 세르 톨리 (Sertoli) 세포의 분리를 확립 매우 도움이되었다 귀도 베르 호벤과 루 Deboel, 루벤을, 감사의 말씀을 전합니다. 모니카 Fijak, 기센은 그림 1A와 조언으로 그녀의 도움을 인정 받고 있습니다. 연구는 국제 연구 대학원 대학 JLU 기센 (독일) / 모나 쉬 대학 (호주 멜버른) GRK 1871 (SB)의 보조금 BH 93 / 1-1 (SB)와 자금 조달을 통해 독일 연구 협회에 의해 지원되었다. 지원은 "Männliche Infertilität BEI Infektion & Entzündung"(MIBIE)라는 프로그램 "랜디스 - 공격 주르 ENTWICKLUNG Wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz"(LOEWE) 내에서 헤센의 국가의 보조금로부터 얻은 것입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Actin (smooth muscle) antibody clone 1A4 | Dako | M0851 | Monoclonal mouse anti human antibody. Use 1:100 dilution for immunofluorescence. |
| Albumin bovine fraction V Standard grade, lyophilized |
Serva | 11930.04 | Filter (0.45 µm) BSA solutions used for immunofluorescence. |
| Corning Cell Strainers 70 µm | Corning | 431751 | White color |
| Collagenase A from Clostridium histolyticum | Roche | 10103586001 | |
| DAPI mountant ProLong Gold Antifade | Life technologies | P-36931 | |
| D-glucose | Sigma | G8644 | 100 g/L |
| Dulbecco´s PBS without Ca2+/Mg2+ | Gibco | 14190-094 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Electron microscope | Zeiss | EM 109S | |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axioplan 2 | |
| Hyaluronidase from bovine testis | Sigma | H3506 | |
| Inverted light microscope | Olympus | CKX41 | Routine cell culture microscope |
| Mouse IgG / IgM (H+L) polyclonal secondary Antibody |
Life technologies | A-10684 | Alexa Fluor 488 conjugate |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | Has replaced Sudan III and Sudan IV because of brighter color. |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Penicillin (5,000 U/ml)/ Streptomycin (5,000 µg/ml) |
Gibco | 15070-063 | 100x solution |
| RPMI-1640 | Gibco | 21875-034 | Contains 300 mg/L L-glutamine |
| Trypsin from porcine pancreas | Sigma | T5266 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin inhibitor from soybean | Sigma | T6522 | The Sigma product is considerably cheaper than the previously used BPTI (Aprotinin) from Roche. |
| Vimentin antibody (V9) | Sigma | V6630 | Monoclonal mouse anti pig vimentin antibody. Use 1:100 dilution for immunofluorescence. |
| Wistar WU rats | Charles River | Should be 19 days old on day of experiment. |
References
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