Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Isolering av Sertoli celler og Peritubular Celler fra Rat Testes

Published: February 8, 2016 doi: 10.3791/53389
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1
1Institut für Anatomie und Zellbiologie, Justus-Liebig-Universität Gießen, 2Institut für Zytobiologie und Zytopathologie, Philipps-Universität Marburg

Summary

Primær Sertolicellene er nødvendig for å studere testikkel-immun privilegium, signaltransduksjon under betennelse eller infeksjon, og utnyttelse av deres immunbeskyttende egenskaper. Her beskriver vi et enzymbasert protokoll for isolering av høy-rene primære Sertoli-celler og celler fra rotte peritubular testiklene.

Abstract

Testis, og i særdeleshet den mannlige kjønnsceller, utfordrer immunsystemet på en unik måte fordi differensiert sperm først vises ved pubertet - mer enn ti år etter etableringen av systemiske immuntoleranse. Spermatogenese celler uttrykker en rekke proteiner som kan bli sett på som er ikke-selv av immunsystemet. Testis må da være i stand til å etablere toleranse overfor disse neo-antigener på den ene side, men likevel være i stand til å beskytte seg mot infeksjoner og tumorutvikling på den annen side. Derfor testis er en av få immun privilegerte steder i kroppen som tåler fremmede antigener uten fremkaller en skadelig betennelsesimmunrespons. Sertoli-celler spiller en viktig rolle for opprettholdelse av denne immun privilegert miljø av testis og også forlenge overlevelse av cotransplanted celler i et fremmed miljø. Derfor primære Sertolicellene er et viktig verktøy for å studere immun privilegiet av testis som ikke kan være easily erstattet av etablerte cellelinjer eller andre cellemodeller. Her presenterer vi en detaljert og omfattende protokoll for isolering av Sertoli celler - og peritubular celler hvis ønskelig - fra rotte testes innenfor en enkelt dag.

Introduction

Testiklene produsere mannlige kjønnsceller og kjønnshormoner, dvs. androgener. Det organ er sammensatt av to avdelinger. I interstitiell rommet, som representerer ca 10-12% av total testikkelvolum 1, steroidogenesis skjer innenfor Leydigcellene. Den rørformede rommet representerer om lag 60-80% av testikkelvolum 1 og inneholder kjønnsceller og to typer somatiske celler - peritubular celler og Sertoli celler. Testis er delt av bindevev septa inn 250-300 lobules, som hver inneholder 1-3 svært convoluted sædkanaler. Disse rørelementene er omgitt av en basalmembran, et ark av kollagen, og en rundtgående lag av peritubular-celler (figur 1A).

Den germinal epitel er plassert på den luminale siden av basalmembranen. Sertoli-celler er store langstrakte celler som strekker seg over hele germinal epitel fra basalmembranen til lumen. De er sterkt attverket til basalmembranen og danner en kontinuerlig cellestruktur gjennom basolaterale organisert tett veikryss som tetter Germinal epitel fra interstitium og representerer blod-testikkelbarrieren. Sertolicellene har fremtredende cytoplasmatiske prognoser og konsekvenser som gjør dem i stand til å komme inn i tett morfologisk og funksjonell kontakt med en artsspesifikk, men konstant antall kjønnsceller. Diploide germinal stamceller spre og differensiere til spermatogonier.

Under meiose I kortvarig tetraploide spermatocytter genereres som utvikler videre inn i fire haploide spermatider under meiose II. Alle kjønnsceller er sammenkoblet ved cytoplasmatiske broer, slik at de danner en celledelt nett. Den hoved hendelse i løpet av modningen av spermatider er ekstrudering av store deler av cytoplasmaet, danner rest-legemer, i en prosess som kalles spermiogenesen. Resterende kropper er phagocytosed av Sertolicellene. Sene spermatider blir deretter sluppet utde rørformede lumen og transporteres inn i bitestikkelen for videre modning. Sertoli celler og kjønnsceller synes å gjensidig koordinere spermatogenesis topografisk og funksjonelt.

Utarbeidelse av individuelle testikkelcelletyper startet nesten et århundre siden, da små testikler stykker ble dyrket og celletyper identifisert ved mikroskopi to. Ved forsiktig disseksjon av tubuli etter åpning av tunica albuginea å bruke fin-tipped tang var det senere mulig å skille rørformet og interstitiell avdelinger 3. I 1975 Welsh og Wiebe innført en kollagenase behandling for å frigjøre rørelementene fra å feste seg interstitielle vev og en pankreatin behandling for fjernelse av det ytre cellelaget peritubular 4. Fra tidlig på unge umodne rotter (ca. 20 dager gamle) ble brukt i hvilken Sertoli-cellene utgjør en stor del av den rørformede cellepopulasjon fordi spermatogenesen ikke har begynt enda. I denne alderen rotte SertOLI cellene slutter å dele seg, og tett veikryss mellom naboceller dannes slik at blod-testikkelbarrieren er etablert fem.

Uavhengig av walisisk og Wiebe Dorrington et al. Innført en kombinasjon av trypsin og deoksyribonuklease fulgt av soybeen trypsin inhibitor og collagenase behandling som ble utgitt samme år 6. Begge gruppene også brukes mekaniske kraft (tegning fordøyd rørformede fragmentene gjentatte ganger gjennom en sprøytenål ​​eller en Pasteur pipette henholdsvis) for å fremstille en homogen cellesuspensjon for plettering som inneholder omtrent 70% Sertoli-celler. Etter 3 dager i kultur, ved hjelp av et medium som er serumfritt, øker prosentandelen av Sertoli-celler til omtrent 90%. Dette kan i stor grad tilskrives døden av forurensende kjønnsceller. Rester peritubular celler (PTCs), men holde fast festet via sin ekstracellulære matrise. PTCs, men ikke Sertoli-celler, er kjent for å produserefibronektin som kan tjene som en markør protein for å estimere forurensning med PTCs. Derfor Tung et al. begrunnet at en ytterligere hyaluronidase behandling kan forbedre renheten av Sertoli-cellefraksjonen 7. Faktisk kan de vise at en ytterligere behandling var i stand til å redusere forurensning av PTCs tilnærmet 20 ganger, noe som blir særlig tydelig når sammenlignet et serumholdig medium benyttes for dyrking av renset Sertoli-celler. Fra da av den forbedrede prosedyren for Tung et al. ble den rådende protokollen og er mye brukt av andre hovedgrupper i felt 8 (figur 1B).

Under kollagenase behandling flertallet av PTCs blir frigjort og kan isoleres i parallell med Sertoli-celler. Mens PTCs kraftig spre og ikke svare på follikkelstimulerende hormon (FSH), trenger Sertolicellene ikke gjennomgå mitose lenger og svare på FSH ved karakteristiske morfologiske endringerog en økning i (cAMP) konsentrasjon 9 cyklisk adenosinmonofosfat. Svært like enzymatiske fordøyelse protokoller kan anvendes for isolering av primære Sertoli-celler fra andre dyr, som menneske 10, mus 11,12, sibirsk hamster 13 eller 14 jak. For fjerning av store mengder forurensende bakterieceller en hypotonisk sjokk kan anvendes ved enden av isoleringsprosedyren 15. Dette gir også en effektiv isolering av Sertoli celler fra voksne rotte testiklene 16. En beriket Sertoli cellesuspensjon kan også skilles fra kjønnsceller ved plating suspensjonen på lektin retter belagt med Datura stramonium agglutinin 17. Bare Sertoli celler og noen få rest PTCs følge de lektin platene.

Primær Sertoli cellekulturer, hovedsakelig fra rotte, har vært brukt i første omgang for å undersøke respons på hormoner eller etablere cellelinjer som muse Sertoli celle line TM4 18. Denne cellelinjen har blitt undersøkt i mer enn hundre studier til i dag. I en translasjonell tilnærming Sertolicellene har blitt utnyttet for immuno-beskyttelse av co-dyrkede celler og vev som i co-transplantasjon av xeno- eller allogene bukspyttkjerteløyer for langsiktig pode overlevelse uten systemisk immunsuppresjon 19. Isolerte Sertoli celler er også brukt i co-kultur eksperimenter for å studere epiteliale-mesenchymale (Sertolicellene - PTCC) og somatisk-bakterie celle (Sertolicellene - kjønnsceller) interaksjoner 20, 21. Nylig primære Sertoli-celler er blitt anvendt for å undersøke ekspresjon av Toll-lignende reseptorer og sekresjon av proinflammatoriske cytokiner, så vel som signaloverførings kaskader som fører til cytokinproduksjon uttrykket etter infeksjon med ikke-patogen og uropathogenic E. coli 22. Andre nyere undersøkelser brukte Sertolicellene for å studere testikkelimmun privilege 23 og vist at testosteron forbehandling undertrykker LPS-indusert betennelsesreaksjon 24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. dyreetikk Statement

Eksperimentene beskrevet her ble utført i henhold til retningslinjene for Regierungspräsidium Giessen, Tyskland, som kommunen og bekrefter den tyske anbefalingen for omsorg og bruk av dyr for eksperimentelle formål (Tillatelse nr.: GI 20/23 Antall A 31 / 2012).

2. Utarbeidelse av Media, enzym Solutions og Dyr

  1. Fremstille 1% jod alkoholen ved å oppløse 1 g jod i 100 ml etanol.
  2. Forbered 2x 500 ml Dulbecco's fosfatbufret saltvann (PBS) uten Ca2 + og Mg2 + supplert hver med 7,5 ml D-glukose (100 g / l) og 5 ml 100 x penicillin / streptomycin stamoppløsning (15 mg / ml D -glukose, 50 U / ml penicillin og 50 ug / ml streptomycin endelig).
  3. Supplement 1 x 500 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium med 5 ml 100 x penicillin / streptomycin stamløsning (50 U / ml penicillin og 50 ug / ml streptomycin finnenal).
  4. Fremstille en Trypsin-DNase I-løsning (2,5 mg / ml trypsin og 10 ug / ml DNase I) ved tilsetning av 25 mg trypsin og 0,1 ml DNase I (1 mg / ml DNase I) til 9,9 ml PBS.
  5. Oppløs 50 mg trypsin inhibitor i 5 ml PBS for Trypsin-inhibitor En oppløsning (10 mg / ml). Oppløs 25 mg trypsin inhibitor i 10 ml PBS for Trypsin-inhibitor B-oppløsning (2,5 mg / ml).
  6. For en Kollagenase-Hyaluronidase-deoksyribonuklease I (DNase I) oppløsning oppløses 10 mg Kollagenase A (1 mg / ml sluttkonsentrasjon), 10 mg Hyaluronidase (1 mg / ml sluttkonsentrasjon) og 0,1 ml DNase I (1 mg / ml DNase I) ( 10 ug / ml endelig) i 10 ml PBS.
  7. Fremstille en Hyaluronidase-DNase I-løsning ved tilsetning av 10 mg Hyaluronidase (1 mg / ml sluttkonsentrasjon) og 0,1 ml DNase-løsning (1 mg / ml) (10 ug / ml endelig) til 9,9 ml PBS.
  8. Rekkefølgen Wistar-rotter i tide, slik at de er 19 dager gamle på dagen av Sertoli-celle isolasjon.
    Merk: Den beskrevne protokoll er beregnet for 10 rotter, men kan modifiseres i minst 5 og høyst 20 rotter.Volumene av alle løsningene må justeres tilsvarende.
  9. Forbered Oil Red O stamløsningen ved å oppløse 0,35 g Oil Red O i 100 ml isopropanol. Rør O / N, filtreres gjennom 0,2 mikrometer og oppbevares ved romtemperatur i opptil ett år.
  10. Forbered Oil Red O farging oppløsning ved blanding av 6 ml Oil Red O stamløsning med 4 ml vann (3: 2). Etter 10-20 min filter gjennom 0,2 mikrometer. Bruk i løpet av neste 2 timer.
  11. Fremstille en 4% (vekt / volum) oppløsning av formaldehyd i en ventilert hette ved tilsetning av 4 g para-formaldehyd pulver (PFA) til 80 ml av 1 x PBS under omrøring forsiktig. Oppvarm til ~ 60 ° C, tilsett 1 ml av 1 M NaOH og fortsett omrøring inntil paraformaldehydet er oppløst. La oppløsningen avkjøles til romtemperatur, justere pH til 7,4 med 1 M HCl og volumet til 100 ml med 1 x PBS. Filtrer løsningen (0,45 um) og bruke friskt eller lagret i alikvoter ved -20 ° C i flere måneder.
    Merk: Polymerisert formaldehyd (PFA) depolymerizes til monomere formaldehyd i vann. Denne prosessen erkatalysert av moderat oppvarming, og en svakt alkalisk pH-verdi. Forbered alle enzymløsninger fersk og filter sterilisere (0,2 mm) dem på dagen av bruk. Hvis en annen produsent for et enzym (se Materialer / utstyr tabell) brukes, justere sin konsentrasjon / aktiviteten nøye.
    I det følgende protokoll et "pipette" står for en serologisk pipette.

3. Utarbeidelse av sædkanaler

  1. Bedøve 10 Wistar hannrotter en etter en i en eksikator ved hjelp av CO 2 og en strømningshastighet som fortrenger i det minste 20% av kammervolumet per minutt. Vent til åndedrettsstans, test anestesi ved å klemme en matte, og hvis det ikke er noen reaksjon avlive hver rotte ved halshugging. Drenere blod ved seksjonering halsvenen og halspulsåren (skjeden carotica) under rennende vann. Desinfiser magen ved å tørke med 70% etanol.
  2. Bruk pinsett løfte huden fra buk mussykluser og kutte ut en oval hud lapp som strekker seg fra symfyseprovokasjonstester til sternum (figur 2A) og flakser den oppover mot brystet. Neste, ta tak i magemusklene og gjøre en medial snitt fra symfyseprovokasjonstester til brystbenet.
    1. Klem magen med tommelen fra bekken oppover for å presse testiklene ut av de nedre bekkenet. Plukk epididymal fett puten (figur 2B) med tang for å trekke opp testis videre. Kutt sædlederen (figur 2B), forlater tunica albuginea intakt, og samle alle testiklene i 20 ml PBS i en 50 ml konisk rør (figur 2C).
  3. Etter å samle alle prøvene, desinfisere dem ved tilsetning av et like stort volum (20 ml) av 1% (w / v) jod i etanol. Snu røret to ganger, og dekanter supernatanten umiddelbart. Vaske raskt testiklene to ganger med 25 ml PBS hver (figur 2D).
  4. Overfør testiklene til en petriskål inneholdeing 15 ml PBS (figur 2E). Gripe hver testis fast ved tang ved den ene ende, lage et lite snitt inn i tunica albuginea ved den motsatte ende, og presse ut rørelementene ved hjelp av lukkede saksebladene som et skrapeverktøy.
    Merk: tubules bør likevel danne et kompakt, testikkel-formet bunt med bare et par rørelementene strekker seg inn i løsningen for å muliggjøre homogen enzymatisk fordøyelse (figur 2F).
  5. Overfør de-kapslet testiklene til en 100 ml skrulokk flaske som inneholder 10 ml Trypsin-DNase løsning. Utfør fordøyelse i et ristende vannbad ved 32 ° C (120 svingninger / min). Etter 4 min evaluere tubuli med det blotte øye for dispergering av tubuli. Når rørelementene begynner å dispergere inn i løsningen, stoppe fordøyelsen umiddelbart. Hvis det er nødvendig, fortsetter inkubasjon i opptil 2 min.
  6. Stoppe trypsin fordøyelse ved å tilsette 5 ml trypsin-inhibitor oppløsning A. Bland oppløsningen ved å pipettere opp og ned 3-4 tidss ved anvendelse av en 10 ml pipette og overføre den til et 50 ml konisk rør.
  7. Etter 5 min av inkubasjon observere tubuli løse ved enhet gravitasjon, fjern forsiktig supernatanten ved hjelp av 10 ml pipette fra trinn 3,6 og tilsett 10 ml trypsin inhibitor B løsning for å fullstendig stoppe trypsin fordøyelsen. Resuspender rørelementene ved å pipettere opp og ned 2-3 ganger.
  8. For å fjerne forurensende interstitielle celler vaske tubuli 9 ganger med 25 ml PBS hver. Suspender tubuli i hver vask ved hjelp av en 25 ml pipette og tillate dem å løse ved enhet tyngdekraften for 10 min. Bruk alltid det samme 25 ml pipette for pipettering PBS, resuspensjon og fjerning av supernatanten.

4. Fjerning / Isolering av Peritubular Cells (PTCs)

  1. Overfør alle tubuli til en 100 ml skrukork flasken og tilsett Collage-Hyaluronidase-DNase løsning (figur 3A). Utføre fordøyelse i 10 minutter i et ristende vannbad ved 32 ° C (120 svingninger / min).
  2. Pipetter en dråpe av suspensjonen på en glassplate og raskt å kontrollere rørelementene i henhold til et invertert mikroskop lys for rutinemessig cellekultur ved 100x forstørrelse. Hvis fordøyelsen er ikke avansert nok fortsette inkubasjon i ytterligere 2 min (teller ikke tiden som er nødvendig for mikroskopisk sjekk).
    Merk: I løpet av dette trinnet alle rørelementene forkortes i lengde og tubulære kantene skal bli ru (figur 3B og C). Grove kanter er veiledende for utgivelsen av peritubular celler.
  3. Overfør suspensjonen med fordøyd rørelementer til et 50 ml konisk rør ved hjelp av 25 ml pipette fra trinn 3.8. Vask 100 ml flaske med 10 ml PBS og legge den til tubuli i konisk tube. Tillat fordøyd tubuli å slå seg ned ved tyngdekraften enhet i 10 minutter, og omhyggelig aspirer supernatanten som inneholder de PTCs, ved hjelp av 25 ml pipette igjen, og overføre den til en ny konisk rør. For aspirasjon av de siste par milliliter bruke en 5 ml pipette i order for å forhindre carry-over av tubuli.
  4. Tilsett 20 ml RPMI 1640 medium supplert med 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum (FBS) til de innsamlede tubulære supernatantene, bland og sentrifuger ved 300 xg i 10 min ved romtemperatur uten bruk av pausen.
  5. Dekanter supernatanten forsiktig og resuspender pelle PTCs i 20 ml RPMI 1640 medium supplert med 10% varme-inaktivert FBS og frø 4 ml hver på fem T75-kolber inneholdende 16 ml medium hver. Inkuber ved 37 ° C i 5% CO2 atmosfære (figur 4A).
  6. På den 3. dag med kultur trypsineres de PTCs og dele dem 1: 2 på T75 flasker inneholdende 16 ml RPMI 1640 medium supplert med 10% varme-inaktivert FBS hver (utbytte 10 kolber helt) (figur 4B). Fortsett inkubering ved 37 ° C i 5% CO2 atmosfære.
  7. På den 5. dag med kultur trypsineres de PTCs igjen og plate dem på seks-brønns eller 24-brønners plater avhengig av eksperimentet(En T75 kolbe per plate). Eksperimenter kan utføres på dag 6.

5. Isolering av Sertoli celler (SCS)

  1. Resuspender bosatte tubuli fra trinn 4,3 grundig i 25 ml PBS ved hjelp av en 25 ml pipette og tillate dem å løse ved enhet tyngdekraften for 12 min. Bruk samme 25 ml pipette for pipettering PBS, oppvirvling av tubuli og fjerning av supernatanter. Gjenta vaske 3 ganger (4 vasker i totalt).
  2. Etter den siste vaskingen overføre fordøyd rørelementer til en annen 100 ml flaske med skrukork inneholdende Hyaluronidase-DNase I-løsning. Utfør fordøyelse i et ristende vannbad ved 32 ° C (120 svingninger / min).
  3. Etter 5 min kontrollere rørelementene på nytt ved hjelp av lys mikroskopisk undersøkelse med 100 x forstørrelse som beskrevet i trinn 4.2.
    Merk: Korte tubuli, rørformede aggregater og frigjorte celler skal være synlig (Figur 3D).
    1. La de rørformede aggregater bosette i 10 min, og aspirer supernatanten ossing en 25 ml pipette. Vask aggregater 4 ganger med 25 ml PBS og en sedimente tid på 10 min for hvert vasketrinn (figur 3E).
  4. Tilsett 20 ml RPMI 1640 medium og passerer suspensjonen 10 ganger gjennom en 18 G nål er montert på en 20 ml sprøyte. Unngå luftbobler.
    Merk: Trekke suspensjon inn og ut gjennom nålen er regnet som en pasning. Avbrytelsen og homogenisering av celler ved hydrodynamiske skjærpåvirkning er en standardteknikk ved fremstillingen av celler som har en tendens til å aggregere. Bestått av celler gjennom en kanyle for liten indre diameter er usannsynlig å ha en innvirkning på deres funksjonelle egenskaper 25. Figur 5C og D viser normal ultrastructure av renset Sertolicellene på dag 4 av kultur.
    1. Pipetter en dråpe av suspensjonen på en glassplate og raskt sjekke tubuli under en invertert lysmikroskop for rutinemessig cellekultur på 10X forstørrelse hvis aggRegates er alle spredt (figur 3F). Filtrer cellesuspensjonen gjennom et 70 mikrometer celle sil for å oppnå en ren enkel cellesuspensjon i filtratet.
  5. Sentrifuger filtratet fra trinn 5.4 ved 200 xg i 10 min ved romtemperatur uten bruk av pausen. aspirer nøye supernatanten ved bruk av en 25 ml pipette, og resuspender Sertoli-celler i 40 ml RPMI 1640 medium (serumfritt).
  6. Bland 100 mL cellesuspensjon med 100 ul trypanblått Stain og telle celler med en Neubauer Forbedret kammer. Juster cellekonsentrasjonen til 3 x 10 6 celler / ml i henhold til telleresultatet. Seed 1 ml per brønn på en seks-brønns plate (= dag 1). Hvis et olje Red O farging (trinn 6) er planlagt å sette et dekkglass på en eller noen få brønner før såing av Sertoli-celler.
    Merk: Sertoli-celler i suspensjon avgjøre raskt slik at røret skal bli kort rystes hver gang før en celle aliquot tas med pipetten. Inntil dag 4 de fast attav ACH til underlaget.
  7. For å fjerne flytende eller heftende bakterieceller på dag 4 (figur 4C) vask hver brønn i 6-brønns plater som benyttes for plating isolerte Sertoli-celler (trinn 5.6) med PBS (figur 4D). Aspirer medium, tilsett 1-2 ml PBS til hver brønn, og rist i 6-brønns plater horisontalt på et bord kraftig, men uten å søle PBS. Gjenta vask 3 ganger, og utfører den samme vaskeprosedyren på dag 5 og 6 (figur 4E).
    Merk: På dag 4 Sertolicellene har godt festet og viser en brostein som mønster under invertert lysmikroskop (Figur 4C). Eksperimenter kan utføres fra dag 7 og utover.
    1. (Alternativ til trinn 5.7) For fjerning av flytende og adherente kimceller utføre en hypotonisk sjokk 3 dager etter utsåing på 6-brønners plater. Fjern medium og tilsett 1 ml 20 mM Tris pH 7,5 tatt direkte ut av kjøleskapet. Aspirer Tris-buffer etter 90 til 120 sekunder, men ikkeseinere. Vask cellene to ganger med PBS, og tilsett 2 ml RPMI 1640 medium (serum-free). Eventuelt utføre eksperimenter neste dag.
      Merk: Jo lengre varighet av hypotonisk sjokk er jo flere kjønnscellene kan fjernes, men jo flere Sertoli-cellene tapt i tillegg. Den første PBS vaske bør utføres raskt, men med stor omhu for ikke å fortrenge noen Sertoli-celler. Direkte etter hypoton behandling mange vakuoler i forskjellige størrelser kan observeres i cytoplasmaet ved fasekontrastmikroskopi. Vakuoler forsvinne innen noen få timer etter hypoton behandling.

6. Olje Red O Farging

  1. Utfør alle trinnene på RT. På dag 7 vask Sertoli-celler dyrket på et dekkglass (trinn 5.6) to ganger med PBS og feste dem med 10% formalin i PBS. Etter 10 min erstatte formalin med frisk løsning, og fortsette fiksering for en annen 60 min.
    Merk: Alle løsninger ble tilsatt til brønnen (e) med et dekkglass og aspirert før neste trinn. Sug formalin, vaske cellene med vann to ganger og tilsett 60% isopropanol. Etter 5 min tillate celler lufttørke i noen minutter.
  2. Tilsett 1 ml Oil Red O fargeløsning per brønn og inkuber i 10 min. Aspirer løsning, og vaske cellene umiddelbart 4 ganger med vann og monter dekkglassene i glycerol-PBS (9: 1). Ta lyse felt bilder med en rutine lysmikroskop (figur 4F).

7. immunfluorescens Farging

  1. Vask PTCs (fra trinn 4.5) eller Sertoli-celler (fra trinn 5.5) dyrket på et dekkglass med PBS to ganger og feste dem med 4% PFA i 10 minutter ved RT.
  2. Inkuber med 5% BSA i PBS i 1 time ved RT. Kast BSA-PBS løsning og legge frisk BSA-PBS løsning som inneholder aktin (glatt muskulatur) (for PTCs) eller vimentin (for Sertolicellene) primært antistoff (fortynning 1: 100 for begge antistoffer) og inkuberes ved 4 ° CO / N.
    Merk: Inkubering med BSA blokker ikke-spesifikk binding av det primære antistoff.
  3. Vask dekkglassene 3 ganger i 5 minutter i PBS-0,1% Tween 20, og inkuberes med grønt-fluorescerende fargestoff konjugert geite-anti-muse-sekundært antistoff (fortynning 1: 1000) ved romtemperatur i 1 time i mørke.
  4. Vask dekkglassene 3 ganger i 5 minutter i PBS-0,1% Tween 20 og montere dem på DAPI monteringsmedium.

8. ultrastructural Analysis

  1. Vask Sertoli-celler (fra trinn 5.6) dyrket på en 6 cm cellekulturplate med PBS og løse dem i 2 timer ved 4 ° C i en blanding av 2,5% glutaraldehyd, 2,5% paraformaldehyd og 0,05% pikrinsyre i 67 mM kakodylatbuffer ( pH 7,4) i henhold til Ito og Karnovsky 26.
  2. Utføre post-fiksering i 1% osmiumtetroksyd, etterfulgt av en O / N inkubering i 0,3% uranylacetat oppløst i 50 mM maleat buffer (pH 5). Legge ned prøver i innbygging media i henhold til standard fremgangsmåter. Skjær tynne snitt, kontrast dem med bly citrate og undersøke med et elektronmikroskop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den beskrevne fremgangsmåte tillater isolering av ca 12 x 10 7 Sertolicellene fra 10 rotte testiklene. 3 x 10 6 celler blir sådd ut per brønn på en 6-brønns plate, slik at seks til syv 6-brønns plater er tilgjengelige for eksperimenter på dag 7. Trypsin-DNase I fordøyelse er den mest kritiske trinnet i løpet av Sertoli-celleisolasjon. Hvis spaltning på dette punktet er fremme for langt, forholdet mellom kimceller / Sertoli-celler blir uforholdsmessig økning opp til enden. I løpet av dagen 3-6 kultur er det viktig å vaske bort så mange ikke-vedheftende eller løst festet kimceller nøye som mulig. Som et alternativ til omfattende vaskinger i løpet av 4 dager kjønnsceller kan fjernes ved hypoton behandling på dag 3 27. En fordel ved denne metoden er at den tiden av Sertoli-cellekultur er holdt på et minimum, slik at Sertoli-celle-spesifikke funksjoner er potensielt bedre beholdt enn etter en lengre periode med kultur.

(figur 5B). Fordi peritubular celler har en sterk proliferativ potensial, har Sertoli-cellekultur som skal utføres i fravær av serum. I nærvær av 10% serum PTCs ville utgjøre ca. 20% av alle celler etter 6 dagers dyrking, mens dens fraksjon kan forventes å være under 1% i fravær av serum 7. Praktisk talt alle isolerte Sertoli-cellene er levedyktig som bedømt ved Trypan blå farging (ikke vist). Rundt dag 7 av kulturen de isolerte Sertoli-cellene er minst forurenset med bakterie-celler og peritubular-celler (figur 4), slik at forsøk bør utføres rundt denne dagen hvis mulig. For god reproduserbarhet er det viktig å gjenta eksperimenteter alltid på samme dag med kultur. Hvis transfections er planlagt de skal utføres på dag 4 eller 5, og celleekstrakter bør gjøres på dag 5 eller 6.

Over minst to uker i serum-frie betingelser Sertoli-celler reagerer på behandling med FSH og produsere mer androgen-bindende protein, plasminogen-aktivator og transferrin etter FSH-behandling. For lengre kultur er nødvendig for en mater lag peritubular celler eller serum. Etter fire uker kulturer svekkes, og cellene løsner fra underlaget 7.

På dag 6 av kultur mest Sertolicellene har kjøpt lipid dråper. I de fleste cellene en enkelt stor vakuolen har dannet (figur 5C og 5D). Den nøytrale lipid innhold lett kan visualiseres ved Oil Red O farging (figur 4F).

I tillegg til Sertoli cel ls de fjernede PTCs kan dyrkes også (Figur 4A og 4B). PTCs fra 10 testiklene gi fem T75 kolber som kan forventes å danne en konfluent lag etter 2 dager med kultur. Som isolerte Sertolicellene ferskt isolerte PTCs er forurenset av kjønnsceller som kan i stor grad fjernes ved aging. Flaskene blir delt 1: 2 ved standard trypsinering slik at 10 kolber blir konfluente på dag 5 etter isolering. Purity av isolerte PTCs er> 95% og kan bekreftes ved hjelp av α-glatt muskel aktin immunolabeling (figur 5A). Fra denne dag og framover PTCs kan brukes til eksperimenter. En kolbe er tilstrekkelig for omtrent en 6-brønns plate, og brønnene bør være konfluente neste dag. Celler kan bli passert flere ganger, men forsøk bør utføres alltid ved den samme passasje for å sørge for at cellene oppfører seg på en reproduserbar måte.

laste opp / 53389 / 53389fig1.jpg "/>
Figur 1. Morfologi av testis og arbeidsflyt av fremgangsmåten. (A) En sektor av en seminiferous tubuli med tilstøtende interstitielle vev skjematisk vist. Sædkanaler er omsluttet av en membran (BM) og en periferi lag av myoid peritubular celler (PTC). Den germinal epitel er plassert på den luminale siden av basalmembranen. Sertoli celler (SC), som strekker seg over hele Germinal epitel er sterkt knyttet til BM og sammen via basolaterale plassert bitende veikryss representerer blod-testikkelbarrieren (BTB). Deres uregelmessig kjerne (N) viser en eller flere sprekken lignende fordypninger og inneholder en kjerne. Kjønnsceller (GC) er i intim kontakt med SC'er på alle stadier av deres utvikling. Det mellomliggende rommet mellom rørelementene inneholder Leydig-celler (LC) og immunceller slik som makrofager (Mii) samt blodkar (BV). Figurtilpasset fra Fijak og Meinhardt 28. (B) Arbeidsflyt av prosedyren; Fargekoden er som i (A). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Testikler fra Wistar-rotter blir skåret ut og Decapsulated. (A) bukhulen er åpnet ved et langsgående snitt som beskrevet i teksten. En stjerne (*) indikerer epidydimal fett pad. (B) Testikler fjernes ved å kutte sædlederen og (C) samles i et 50 ml konisk rør inneholdende 20 ml PBS. Når alle prøvene er samlet de blir desinfisert i 20 ml 1% (w / v) jod i etanol. For fjerning av jod de er raskt vasket to ganger med 25 mlPBS hver. (D) Testes etter første PBS vask. (E) Testikler blir overført til en petriskål (til høyre), og sædkanaler er presset ut av den åpnede tunica albuginea ved hjelp av lukkede saksebladene (til venstre) som beskrevet i teksten. (F) Decapsulated testiklene fremdeles danner en kompakt testikkel formet masse med enkelt tubuli utstående. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Isolering av Sertolicellene. (A) Etter fjerning av interstitiell celler ved Trypsin-DNase I fordøyelsen og vaske 9x med PBS tubuli blitt mobilisert og ser rent. (B) Under kollagenase-hyaluronidase-DNase behandling peritubular celles fra de ytre lag og kjønnsceller frigjøres. Tubuli bli forkortet og få en grov utseende. (C) Tubular fragmenter etter vask 4x med PBS. (D) Hyaluronidase-DNase I behandlings utgivelser rest peritubular celler samt kjønnsceller. Tubuli bli ytterligere forkortet, og rørformede aggregater danne. (E) Tubular aggregater etter vask 4x med PBS. (F) En Sertoli-celler fremstilles ved å føre de aggregater 10x gjennom en 18G nål. Skala barer i (AE) = 200 mikrometer, i (F) = 50 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Kultur av peritubular celler (AB) og Sertoli-celler (CF) og fjerning av contaminat ing kjønnsceller. (A) Resuspenderte PTCs fra trinn 4.5 ble sådd umiddelbart fotografert og den neste dag. (B) Etter avspaltning på dag 3 forurensning med bakterieceller reduseres. (C) På dag 4 Sertoli-celler viser en typisk brostein-lignende mønster. Flytende og man følger kjønnsceller er synlige før vasking med PBS. (D) Den samme vel etter vasking 3 ganger med PBS. Antallet forurensende bakterieceller reduseres. Vasking tre ganger med PBS ble gjentatt på dag 5 og 6. (E) På dag 6 av kulturen praktisk talt alle kjønnscellene er blitt fjernet. Sertolicellene har dannet en unik ser celle laget, og de fleste celler har kjøpt en eneste stor vacuole. (F) Oil rød farging O viser at disse vakuoler er fettdråper som inneholder stort sett nøytrale lipider. Skala barer i (AD) = 200 um, i (E) = 50 um og i (F) = 25 um..jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. Immunfluorescens farging. Farging av rensede primære peritubular celler med aktin (glatt muskel) antistoff (A) og av Sertoli-celler med vimentin antistoff (B). Ingen forurensende celler er synlig i begge synsfelt. Målestokken i (A) og (B) = 10 um. (C) og (D) Elektron mikroskopiske bilder av Sertoli-celler etter 4 dager i kultur. (C) Legg merke til nærkontakt av tilstøtende celler (pilspisser) som fører til brostein-lignende mønster som vist i figur 4C. En enkelt oljedråpe (L) er observert i cytoplasma i hver celle. (D) mest tallrike organeller er mitochondria (M) og Golgi-apparatet (G).Kjernen (N) inneholder en kjerne (NC) og viser typiske sprekken lignende innrykk. Scale bar i (C) = 1 mikrometer og i (D) = 0,25 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å takke Guido Verhoeven og Ludo Deboel, Leuven, som var svært nyttig i å etablere isolering av primær Sertoli celler i Meinhardt lab i Giessen. Monika Fijak, Gießen, er kjent for hennes hjelp med figur 1A og råd. Studiene ble støttet av Deutsche Forschungsgemeinschaft gjennom stipend BH 93 / 1-1 (SB) og finansiering av International Research Graduate College JLU Gießen (Tyskland) / Monash University (Melbourne, Australia) GRK 1871 (SB). Støtte ble også hentet fra et tilskudd av staten Hessen innenfor programmet "Landes-Offensive zur Entwicklung Wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz" (LOEWE) kalt "Männliche Infertilität bei Infektion & Entzündung" (MIBIE).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Actin (smooth muscle) antibody clone 1A4 Dako M0851 Monoclonal mouse anti human antibody.
Use 1:100 dilution for immunofluorescence.
Albumin bovine fraction V
Standard grade, lyophilized		 Serva 11930.04 Filter (0.45 µm) BSA solutions used for immunofluorescence.
Corning Cell Strainers 70 µm Corning 431751 White color
Collagenase A from Clostridium histolyticum Roche 10103586001
DAPI mountant ProLong Gold Antifade Life technologies P-36931
D-glucose Sigma G8644 100 g/L
Dulbecco´s PBS without Ca2+/Mg2+ Gibco 14190-094
DNase I Roche 10104159001
Electron microscope Zeiss EM 109S
Fluorescence microscope Zeiss Axioplan 2
Hyaluronidase from bovine testis Sigma H3506
Inverted light microscope Olympus CKX41 Routine cell culture microscope
Mouse IgG / IgM (H+L) polyclonal
secondary Antibody 		 Life technologies A-10684 Alexa Fluor 488 conjugate
Oil Red O Sigma O0625 Has replaced Sudan III and Sudan IV because of brighter color.
Paraformaldehyde Sigma P6148
Penicillin (5,000 U/ml)/
Streptomycin (5,000 µg/ml)		 Gibco 15070-063 100x solution
RPMI-1640 Gibco 21875-034 Contains 300 mg/L L-glutamine
Trypsin from porcine pancreas Sigma T5266
Trypan Blue Stain (0.4%) Gibco 15250-061
Trypsin inhibitor from soybean Sigma T6522 The Sigma product is considerably cheaper than the previously used
BPTI (Aprotinin) from Roche.
Vimentin antibody (V9) Sigma V6630 Monoclonal mouse anti pig vimentin antibody.  Use 1:100 dilution for immunofluorescence.
Wistar WU rats Charles River Should be 19 days old on day of experiment.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Andrology. Male Reproductive Health and Dysfunction. Nieschlag, E., Behre, H., Nieschlag, S. , 3rd ed, Springer. (2010).
  2. Esaki, S. Über Kulturen des Hodengewebes der Säugetiere und über die Natur des interstitiellen Hodengewebes und der Zwischenzellen. Z. Mikrosk. Anat. Forsch. 15, 368-404 (1928).
  3. Hall, P. F., Irby, D. C., De Kretser, D. M. Conversion of cholesterol to androgens by rat testes: comparison of interstitial cells and seminiferous tubules. Endocrinology. 84, 488-496 (1969).
  4. Welsh, M. J., Wiebe, J. P. Rat sertoli cells: a rapid method for obtaining viable cells. Endocrinology. 96, 618-624 (1975).
  5. Vitale, R., Fawcett, D. W., Dym, M. The normal development of the blood-testis barrier and the effects of clomiphene and estrogen treatment. Anat. Rec. 176, 331-344 (1973).
  6. Dorrington, J. H., Roller, N. F., Fritz, I. B. Effects of follicle-stimulating hormone on cultures of Sertoli cell preparations. Mol. Cell. Endocrinol. 3, 57-70 (1975).
  7. Tung, P. S., Skinner, M. K., Fritz, I. B. Fibronectin synthesis is a marker for peritubular cell contaminants in Sertoli cell-enriched cultures. Biol. Reprod. 30, 199-211 (1984).
  8. Verhoeven, G., Cailleau, J. Testicular peritubular cells secrete a protein under androgen control that inhibits induction of aromatase activity in Sertoli cells. Endocrinology. 123, 2100-2110 (1988).
  9. Tung, P. S., Dorrington, J. H., Fritz, I. B. Structural changes induced by follicle-stimulating hormone or dibutyryl cyclic AMP on presumptive Sertoli cells in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 72, 1838-1842 (1975).
  10. Teng, Y., et al. Isolation and culture of adult Sertoli cells and their effects on the function of co-cultured allogeneic islets in vitro. Chin. Med. J. (Engl.). 118, 1857-1862 (2005).
  11. Kohno, S., Ziparo, E., Marek, L. F., Tung, K. S. Murine Sertoli cells: major histocompatibility antigens and glycoconjugates. J. Reprod. Immunol. 5, 339-350 (1983).
  12. Dufour, J. M., et al. Sertoli cell line lacks the immunoprotective properties associated with primary Sertoli cells. Cell Transplant. 17, 525-534 (2008).
  13. Majumdar, S. S., Tsuruta, J., Griswold, M. D., Bartke, A. Isolation and culture of Sertoli cells from the testes of adult Siberian hamsters: analysis of proteins synthesized and secreted by Sertoli cells cultured from hamsters raised in a long or a short photoperiod. Biol. Reprod. 52, 658-666 (1995).
  14. Zhang, H., Liu, B., Qiu, Y., Fan, J., Yu, S. Pure cultures and characterization of yak Sertoli cells. Tissue Cell. 45, 414-420 (2013).
  15. Ziparo, E., Geremia, R., Russo, M. A., Stefanini, M. Surface interaction in vitro between Sertoli cells and germ cells at different stages of spermatogenesis. Am. J. Anat. 159, 385-388 (1980).
  16. Anway, M. D., Folmer, J., Wright, W. W., Zirkin, B. R. Isolation of Sertoli cells from adult rat testes: an approach to ex vivo studies of Sertoli cell function. Biol. Reprod. 68, 996-1002 (2003).
  17. Scarpino, S., et al. A rapid method of Sertoli cell isolation by DSA lectin, allowing mitotic analyses. Mol. Cell. Endocrinol. 146, 121-127 (1998).
  18. Mather, J. P. Establishment and characterization of two distinct mouse testicular epithelial cell lines. Biol. Reprod. 23, 243-252 (1980).
  19. Korbutt, G. S., Elliott, J. F., Rajotte, R. V. Cotransplantation of allogeneic islets with allogeneic testicular cell aggregates allows long-term graft survival without systemic immunosuppression. Diabetes. 46, 317-322 (1997).
  20. Fritz, I. B. Somatic cell-germ cell relationships in mammalian testes during development and spermatogenesis. Ciba Found. Symp. 182, 271-281 (1994).
  21. Whaley, P. D., Chaudhary, J., Cupp, A., Skinner, M. K. Role of specific response elements of the c-fos promoter and involvement of intermediate transcription factor(s) in the induction of Sertoli cell differentiation (transferrin promoter activation) by the testicular paracrine factor PModS. Endocrinology. 136, 3046-3053 (1995).
  22. Bhushan, S., et al. Uropathogenic Escherichia coli block MyD88-dependent and activate MyD88-independent signaling pathways in rat testicular cells. J. Immunol. 180, 5537-5547 (2008).
  23. Meinhardt, A., Hedger, M. P. Immunological, paracrine and endocrine aspects of testicular immune privilege. Mol. Cell. Endocrinol. 335, 60-68 (2011).
  24. Fijak, M., et al. Influence of Testosterone on Inflammatory Response in Testicular Cells and Expression of Transcription Factor Foxp3 in T Cells. Am. J. Reprod. Immunol. , 12-25 (2015).
  25. Mamidi, M. K., et al. Impact of passing mesenchymal stem cells through smaller bore size needles for subsequent use in patients for clinical or cosmetic indications. J. Transl. Med. 10, 229 (2012).
  26. Ito, S., Karnovsky, M. J. Formaldehyde-glutaraldehyde fixatives containing trinitro compounds. J. Cell. Biol. 39, 168-169 (1968).
  27. Galdieri, M., Ziparo, E., Palombi, F., Russo, M. A., Stefanini, M. Pure Sertoli cell cultures: a new model for the study of somatic-germ cell interactions. J. Androl. 5, 249-254 (1981).
  28. Fijak, M., Meinhardt, A. The testis in immune privilege. Immunol. Rev. 213, 66-81 (2006).
  29. Jegou, B. The Sertoli cell in vivo and in vitro. Cell Biol. Toxicol. 8, 49-54 (1992).
  30. Pineau, C., Le Magueresse, B., Courtens, J. L., Jegou, B. Study in vitro the phagocytic function of Sertoli cells in the rat. Cell Tissue Res. 264, 589-598 (1991).
  31. Ren, Y., Savill, J. Apoptosis: the importance of being eaten. Cell Death Differ. 5, 563-568 (1998).
  32. Ducray, A., et al. Establishment of a mouse Sertoli cell line producing rat androgen-binding protein (ABP). Steroids. 63, 285-287 (1998).
  33. Konrad, L., et al. Rat Sertoli cells express epithelial but also mesenchymal genes after immortalization with SV40. Biochim. Biophys. Acta. 1722, 6-14 (2005).

Tags

Immunologi testis primære rotte Sertolicellene primære peritubular celler mannlig reproduksjon immun privilegium immunoprotection urogenitale veisinfeksjon mannlig faktor ufruktbarhet
Isolering av Sertoli celler og Peritubular Celler fra Rat Testes
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bhushan, S., Aslani, F., Zhang, Z.,… More

Bhushan, S., Aslani, F., Zhang, Z., Sebastian, T., Elsässer, H. P., Klug, J. Isolation of Sertoli Cells and Peritubular Cells from Rat Testes. J. Vis. Exp. (108), e53389, doi:10.3791/53389 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter