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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Isolamento de células de Sertoli e as células de rato peritubular Testículos

Published: February 8, 2016 doi: 10.3791/53389
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1
1Institut für Anatomie und Zellbiologie, Justus-Liebig-Universität Gießen, 2Institut für Zytobiologie und Zytopathologie, Philipps-Universität Marburg

Summary

células de Sertoli primária são necessários para o estudo de testículo-imune privilégio, transdução de sinal durante a inflamação ou infecção, e a utilização das suas propriedades imunoprotectoras. Aqui, descrevemos um protocolo com base em enzima para o isolamento de células de Sertoli primário altamente purificadas e células peritubulares a partir de testículos de rato.

Abstract

O testículo, e em particular o gameta masculino, desafia o sistema imunológico de uma forma única, porque o esperma diferenciado aparecem em primeiro lugar no momento da puberdade - mais de dez anos após o estabelecimento da tolerância imunológica sistêmica. células espermatogénicas expressar um certo número de proteínas que podem ser consideradas como não-auto pelo sistema imunológico. O testículo deve, então, ser capaz de estabelecer a tolerância a estes neo-antígenos, por um lado, mas ainda ser capaz de proteger-se de infecções e desenvolvimento do tumor, por outro lado. Portanto, o testículo é um dos poucos lugares privilegiados do sistema imunológico do corpo que toleram os antígenos estranhos sem evocar uma resposta imune inflamatória prejudicial. células de Sertoli desempenham um papel chave para a manutenção deste ambiente privilegiado imune dos testículos e também prolongar a sobrevivência de células cotransplanted em um ambiente externo. Portanto, células de Sertoli primárias são uma importante ferramenta para estudar o privilégio imunitário do testículo que não pode ser easily substituídos por linhas celulares estabelecidas ou outros modelos de celulares. Aqui apresentamos um protocolo detalhado e abrangente para o isolamento de células de Sertoli - e células peritubulares se desejado - a partir de testículos de ratos em um único dia.

Introduction

Testículos produzem gametas masculinos e hormônios sexuais, ou seja, os andrógenos. O órgão é composto de dois compartimentos. No compartimento intersticial, que representa cerca de 10-12% do volume total de testículo 1, a esteroidogénese tem lugar no interior das células de Leydig. O compartimento tubular representa cerca de 60-80% do volume de testículo 1 e contém células germinais, de dois tipos de células somáticas - peritubulares células de Sertoli e as células. O testículo é dividido por septos de tecido conjuntivo em 250-300 lóbulos, cada um contendo 1-3 túbulos seminíferos altamente complicadas. Estes tubos são fechados por uma membrana basal, uma folha de colagénio, e uma camada periférica de células peritubulares (Figura 1A).

O epitélio germinal está localizada no lado luminal da membrana basal. células de Sertoli são grandes células alongadas que se estendem por todo o epitélio germinal da membrana basal para o lúmen. Eles são fortemente attdoía para a membrana basal e formar uma folha contínua celular através de junções apertadas organizados basolaterais que oclui o epitélio germinal do interstício e representa a barreira hemato-testicular. células de Sertoli têm projeções citoplasmáticas proeminentes e ramificações que lhes permitam entrar em contato morfológica e funcional apertado com um número específico da espécie, mas constante de células germinativas. células-tronco germinais diplóides proliferam e se diferenciam em espermatogônias.

Durante a meiose I curta duração espermatócitos tetraplóides são gerados que desenvolvem ainda mais em quatro espermátides haplóides durante a meiose II. Todas as células germinais são interligadas por pontes citoplasmáticas de modo que eles formam uma rede celular. O principal evento durante a maturação dos espermatídeos é a extrusão de grandes partes do citoplasma, formação de corpos residuais, num processo denominado spermiogenesis. organismos residuais são fagocitadas pelas células de Sertoli. spermatids tardias são, em seguida, liberado paraa luz tubular e transportado para o epidídimo para posterior maturação. células de Sertoli e células germinativas parecem coordenar mutuamente espermatogênese topograficamente e funcionalmente.

Preparação de tipos de células testiculares individuais começou quase um século atrás, quando pequenos pedaços testiculares foram cultivadas e tipos de células identificadas por microscopia 2. Por dissecção cuidadosa dos túbulos após a abertura da túnica albugínea usando uma pinça de ponta fina foi mais tarde possível separar tubular e compartimentos intersticial 3. Em 1975 e Welsh Wiebe introduzido um tratamento de colagenase, a fim de libertar os túbulos de tecido aderente intersticial e um tratamento de pancreatina para a remoção da camada de células peritubular exterior 4. Desde cedo ratos jovens imaturos (cerca de 20 dias de idade) foram usadas no qual as células de Sertoli compreendem uma grande fracção da população celular tubular porque a espermatogénese ainda não começou. Neste Sert rato idadeoli células deixam de se dividir, e junções apertadas entre as células vizinhas formar de modo que a barreira hemato-testicular é estabelecida 5.

Independente do galês e Wiebe Dorrington et al. Introduziram uma combinação de tripsina e desoxirribonuclease seguido por inibidor soybeen tripsina e tratamento colagenase, que foi publicado no mesmo ano 6. Ambos os grupos também utilizada força mecânica (desenho os fragmentos digeridos tubulares repetidamente através de uma agulha de seringa ou uma pipeta de Pasteur, respectivamente), a fim de produzir uma suspensão de células homogéneas para revestimento que contém aproximadamente 70% de células de Sertoli. Após 3 dias em cultura, utilizando um meio que é isento de soro, a percentagem de células de Sertoli aumenta para aproximadamente 90%. Isto poderia ser atribuído principalmente à morte de contaminar células germinativas. peritubulares células residuais (PTCs), no entanto, manter-se firmemente ligado através de sua matriz extracelular. PTCs, mas não de células de Sertoli, são conhecidos para produzirfibronectina que pode servir como uma proteína marcadora para estimar a contaminação com PTCs. Portanto, Tung et al. fundamentado que um tratamento adicional hialuronidase pode melhorar a pureza da fracção de células de Sertoli 7. Na verdade, eles poderiam mostrar que um tratamento adicional foi capaz de reduzir a contaminação por PTCs aproximadamente 20 vezes, o que se torna particularmente evidente quando em comparação com um meio contendo soro é utilizado para a cultura de células de Sertoli purificados. A partir de então o procedimento melhorado de Tung et al. tornou-se o protocolo vigente e foi amplamente utilizado por outros grupos importantes no campo 8 (Figura 1B).

Durante o tratamento com colagenase a maioria dos PTCs são libertados e podem ser isolados em paralelo para células de Sertoli. Considerando que os PTCs vigorosamente proliferar e não respondem à hormona folículo-estimulante (FSH), células de Sertoli não sofrem mitose mais e responder aos FSH por alterações morfológicas característicose um aumento da adenosina monofosfato cíclico (cAMP) 9 concentração. Protocolos de digestão enzimática muito semelhantes pode ser usado para o isolamento de células de Sertoli primárias a partir de outros animais como o homem 10, 11,12 rato, hamster Siberiano 13 ou 14 Yak. Para a remoção de grandes quantidades de contaminantes de células germinais um choque hipotónico pode ser empregada, no final do procedimento de isolamento 15. Isto permite também o isolamento eficiente de células de Sertoli de testículos de rato adulto 16. Uma suspensão de células de Sertoli enriquecido também pode ser separado a partir de células germinais por plaqueamento da suspensão em pratos revestidos com lectina de aglutinina de Datura stramonium 17. Apenas as células de Sertoli e algumas PTCs residuais aderir às placas de lectina.

culturas de células de Sertoli primário, principalmente a partir do rato, foram utilizados inicialmente para investigar a capacidade de resposta aos hormônios ou o estabelecimento de linhas celulares como o li células de Sertoline TM4 18. Esta linha celular foi investigada em mais do que uma centena de estudos até hoje. Numa abordagem as células de Sertoli de translação têm sido utilizados para a imuno-protecção de células e tecidos, como no processo de co-transplante de ilhéus pancreáticos alogénicos ou xeno- para a sobrevivência do enxerto a longo prazo co-cultivados sem imunossupressão sistémica 19. Células de Sertoli isolados foram também usados ​​em experimentos de co-cultura para o estudo epitelial-mesenquimal (células de Sertoli - PTCC) e de células somáticas de germes (células de Sertoli - células germinativas) interações 20, 21. Células de Sertoli recentemente primários foram utilizados para investigar a expressão de receptores de tipo Toll e a secreção de citoquinas pró-inflamatórias, bem como as cascatas de transdução do sinal que conduz à expressão de citocinas após infecção com E. não patogénico e uropatogênica coli 22. Outras investigações recentes estavam usando células de Sertoli para estudar testicular p imunológicorivilege 23 e demonstraram que a testosterona pré-tratamento suprime a resposta inflamatória induzida por LPS 24.

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Protocol

Declaração 1. Ética animal

Experimentos aqui descritos foram realizados de acordo com as diretrizes do Regierungspräsidium Giessen, Alemanha, como a autoridade local e confirme com o Código alemão de Prática para o Cuidado e Utilização de Animais para Fins Experimentais (Permissão não:. GI 20/23 Nr A 31 / 2012).

2. Preparação de Meios, soluções enzima e Animais

  1. Prepare 1% de álcool de iodo através da dissolução de 1 g de iodo em 100 ml de etanol.
  2. Prepare 2x 500 ml de fosfato de Dulbecco tamponado com solução salina (PBS) sem Ca 2+ e Mg 2+ suplementado cada um com 7,5 ml de D-glicose (100 g / L) e 5 mL de 100 x penicilina / estreptomicina solução-mãe (15 mg / ml de D -glucose, 50 U / ml de penicilina e 50 ug / ml de estreptomicina final).
  3. Suplemento 1x 500 ml de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 com 5 ml de solução stock de 100 x penicilina / estreptomicina (50 U / ml de penicilina e 50 ug / ml de estreptomicina aletaai).
  4. Prepara-se uma solução de tripsina-I ADNase (2,5 mg / ml de tripsina e 10 ug / ml de DNase I) por adição de 25 mg de tripsina e 0,1 ml de DNase I (1 mg / ml de DNase I) a 9,9 ml de PBS.
  5. Dissolve-se 50 mg Inibidor de tripsina, em 5 ml de PBS para o inibidor de tripsina Uma solução (10 mg / ml). Dissolve-se 25 mg Inibidor de tripsina, em 10 ml de PBS para uma solução de tripsina inibidor B (2,5 mg / ml).
  6. Para uma solução de colagenase-hialuronidase-desoxirribonuclease I (ADNase I) dissolver 10 mg de colagenase A (1 mg / mL de concentração final), 10 mg de hialuronidase (1 mg / mL final) e 0,1 ml de DNase I (1 mg / ml de DNase I) ( 10 ug / ml final,) em 10 ml de PBS.
  7. Prepara-se uma solução de hialuronidase I-ADNase por adição de 10 mg de hialuronidase (1 mg / mL final) e uma solução de 0,1 ml de DNase I (1 mg / ml) (10 ug / ml final,) a 9,9 ml de PBS.
  8. Encomendar ratos Wistar no tempo de modo que eles são 19 dias de idade no dia do isolamento de células de Sertoli.
    Nota: O protocolo descrito foi concebido para 10 ratos, mas pode ser modificado para um mínimo de 5 e um máximo de 20 ratos.Os volumes de todas as soluções têm de ser ajustados em conformidade.
  9. Preparar a solução estoque Oil Red O dissolvendo 0,35 g Oil Red O em 100 ml de isopropanol. Agitar S / N, filtra-se através de 0,2 um e armazenar a temperatura ambiente durante até um ano.
  10. Preparar solução corante Oil Red O misturando 6 ml de solução de estoque Oil Red O com 4 ml de água (3: 2). Após 10-20 minutos, filtra-se através de 0,2 um. Use no próximo 2 horas.
  11. Prepara-se uma 4% (w / v) de solução de formaldeído em uma capa ventilado através da adição de 4 g de paraformaldeído em pó (PFA) a 80 ml de 1x PBS, enquanto se agitava gentilmente. Aquece-se a ~ 60 ° C, adiciona-se 1 ml de NaOH 1 M e continuar a agitar até que o paraformaldeído esteja dissolvido. Deixar a solução arrefecer até à TA, ajustar o pH a 7,4 com HCl 1 M e o volume para 100 ml com PBS 1x. Filtra-se a solução (0,45 um) e usar fresco ou armazenar em alíquotas a -20 ° C durante vários meses.
    Nota: formaldeído polimerizada (PFA) despolimeriza para formaldeído monomérico em água. Este processo écatalisada por aquecimento moderado e um pH ligeiramente alcalino. Preparar todas as soluções de enzima recentemente e filtro de esterilização (0,2 | iM) eles no dia da utilização. Se um fabricante diferente para uma enzima (veja Materiais / Equipamentos Table) é usado, cuidadosamente ajustar a sua concentração / atividade.
    No protocolo seguinte um "pipeta" significa uma pipeta serológica.

3. Preparação de seminíferos Palhinha

  1. 10 Anestesiar ratos Wistar do sexo masculino, uma a uma num exsicador utilizando CO 2 e uma taxa de fluxo que desloca, pelo menos, 20% do volume da câmara por minuto. Espere até que a respiração pára, a anestesia teste apertando a almofada do pé, e se não há reação eutanásia cada rato por deslocamento cervical. Drenar o sangue pelo corte da veia jugular e da artéria carótida (carotica vagina) sob água corrente. Desinfectar o abdómen, limpando com 70% de etanol.
  2. Utilizando uma pinça levantar a pele do mus abdominalCiclos e cortar um lobo pele em forma oval que se estende a partir da sínfise púbica ao esterno (Figura 2A) e bater para cima sobre o peito. Em seguida, pegue os músculos abdominais e fazer uma incisão medial da sínfise púbica ao esterno.
    1. Espremer o abdômen com os polegares de pelve para cima, a fim de empurrar os testículos fora da parte baixa da bacia. Escolha a gordura epididimal (Figura 2B) com uma pinça para puxar para cima o testículo mais. Cortar o cordão espermático (Figura 2B), deixando intacta a túnica albugínea, e recolher todos os testículos em 20 mL de PBS num tubo de 50 ml (Figura 2C).
  3. Depois de recolher todos os testículos, desinfectar los por adição de um volume igual (20 ml) de 1% de iodo em etanol (v / w). Inverter o tubo duas vezes e decanta-se o sobrenadante imediatamente. Lavar os testículos rapidamente duas vezes com 25 ml de PBS de cada (Figura 2D).
  4. Transferir os testículos para uma placa de Petri conterção 15 ml de PBS (Figura 2E). Segure cada testículo com firmeza por meio de fórceps em uma extremidade, fazer uma pequena incisão na túnica albugínea na extremidade oposta, e esprema os túbulos usando lâminas da tesoura fechados como uma ferramenta de raspagem.
    Nota: Os túbulos ainda deve formar um feixe em forma de testículo compacto, com apenas alguns túbulos que se prolonga para dentro da solução, a fim de permitir a digestão enzimática homogénea (Figura 2F).
  5. Transfira os testículos capsuladas-de de um frasco de 100 ml com tampa de rosca contendo 10 ml de tripsina-DNase I solução. Realizar a digestão num banho de água com agitação a 32 ° C (120 oscilações / min). Após 4 min avaliar os túbulos com a olho nu para a dispersão dos túbulos. Uma vez túbulos começam a se dispersar na solução, parar a digestão imediatamente. Se necessário, continue a incubação por até 2 min.
  6. Pare de digestão com tripsina, adicionando 5 ml de solução de inibidor de tripsina A. Misture bem a solução pipetando cima e para baixo 3-4 vezs usando uma pipeta de 10 mL e transferi-lo para um tubo de 50 ml.
  7. Após 5 min de incubação observar os túbulos resolver por unidade de gravidade, remover o sobrenadante cuidadosamente usando a pipeta de 10 ml a partir do passo 3.6 e adicionar 10 ml de solução de inibidor de tripsina de B, a fim de parar totalmente a digestão com tripsina. Ressuspender os túbulos pipetando cima e para baixo 2-3 vezes.
  8. De modo a remover a contaminação de células intersticiais lavar os túbulos 9 vezes com 25 ml de PBS cada uma. Ressuspender túbulos em cada lavagem, utilizando uma pipeta de 25 ml e permitir-lhes a resolver, por unidade de gravidade para 10 min. Sempre usar a mesma pipeta de 25 ml de PBS por pipetagem, ressuspensão e remoção do sobrenadante.

4. Remoção / Isolamento de células peritubulares (PTCs)

  1. Transferir todos os túbulos de um frasco de 100 ml com tampa de rosca e adicionar a solução de colagenase I-hialuronidase de ADNase (Figura 3A). Realizar a digestão durante 10 min num banho de água com agitação a 32 ° C (120 oscilações / min).
  2. Pipeta uma gota de suspensão em uma lâmina de vidro e rapidamente verificar os túbulos sob um microscópio de luz invertida para cultura de células de rotina em 100x. Se a digestão não está suficientemente avançada continuar a incubação durante mais 2 min (não contam o tempo necessário para a verificação microscópica).
    Nota: Durante esta etapa, todos os túbulos se reduzido em comprimento e tubulares bordas devem tornar-se áspera (Figura 3B e C). arestas são indicativos para a liberação de células peritubulares.
  3. Transferir a suspensão com túbulos digerido a um tubo de 50 ml utilizando a pipeta de 25 ml a partir do passo 3.8. Lavar o frasco de 100 ml com 10 ml de PBS e adicioná-lo aos túbulos no tubo cónico. Permitir que os túbulos digeridos resolver por unidade de gravidade durante 10 minutos e, cuidadosamente, aspirar o sobrenadante, contendo os PTCs, usando a 25 ml pipeta de novo, e transferi-lo para um novo tubo cônico. Para a aspiração dos últimos poucos mililitros utilizar uma pipeta de 5 ml em order para evitar qualquer carry-over de túbulos.
  4. Adiciona-se 20 ml de meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino inactivado pelo calor (FBS) aos sobrenadantes recolhidos tubulares, misturar e centrifugar a 300 xg durante 10 min à temperatura ambiente sem utilizar a ruptura.
  5. Cuidadosamente decantar o sobrenadante e ressuspender o pellet PTCs em 20 ml de meio RPMI 1640 suplementado com FBS inactivado por calor a 10% e 4 ml de cada semente em cinco balões T75 contendo 16 ml de meio de cada um. Incubar a 37 ° C em 5% de CO2 (Figura 4A).
  6. No dia 3 rd de cultura trypsinize os PTCs e dividi-los 1: 2 em frascos T75 contendo 16 ml de meio RPMI 1640 suplementado com FBS inactivado por calor a 10% cada (rendimento 10 frascos por completo) (Figura 4B). Continuar a incubação a 37 ° C em 5% de CO2.
  7. No dia 5 dias de cultura das PTCs trypsinize novamente e placa-los em 6 poços ou 24 poços, placas, dependendo da experiência(Um frasco T75 por placa). Experiências pode ser realizado no dia 6.

5. Isolamento de células de Sertoli (SCs)

  1. Ressuspender os túbulos estabeleceram a partir do passo 4.3 completamente em 25 ml de PBS usando uma pipeta de 25 ml e permitir-lhes a resolver, por unidade de gravidade para 12 min. Use a mesma 25 ml de pipeta para pipetagem PBS, ressuspensão dos túbulos e remoção do sobrenadante. Repetir a lavagem 3 vezes (4 lavagens no total).
  2. Após a última lavagem, transferir os túbulos digeridos com mais 100 ml com tampa de rosca frasco contendo a solução de hialuronidase-ADNase I. Realizar a digestão num banho de água com agitação a 32 ° C (120 oscilações / min).
  3. Após 5 min verificar os túbulos novamente por inspecção microscópica de luz uma ampliação de 100X, tal como descrito na etapa 4.2.
    Nota: túbulos curtos, agregados tubulares e células libertadas devem ser visíveis (Figura 3D).
    1. Permitir que os agregados tubulares depositar durante 10 min, e aspirar o sobrenadante nósing uma pipeta de 25 mL. Lavar agrega 4 vezes utilizando 25 mL de PBS e um tempo de sedimentação de 10 minutos para cada etapa de lavagem (Figura 3E).
  4. Adicionar 20 ml de meio RPMI 1640 e passar a suspensão a 10 vezes através de uma agulha 18 G montado em uma seringa de 20 ml. Evitar bolhas de ar.
    Nota: Puxando a suspensão dentro e para fora através da agulha é considerado como uma passagem. A ruptura das células e a homogeneização por cisalhamento hidrodinâmico é uma técnica padrão na preparação de células que tendem a agregar-se. A passagem de células através de uma agulha hipodérmica de diâmetro interno pequeno é pouco provável que tenha um impacto sobre suas propriedades funcionais 25. Figura 5C e D mostra a ultra-estrutura normal das células de Sertoli purificadas no dia 4 de cultura.
    1. Pipeta uma gota de suspensão em uma lâmina de vidro e rapidamente verificar os túbulos sob um microscópio de luz invertida para cultura de células de rotina no aumento de 10x, se a aggRegates são todos dispersos (Figura 3F). Filtra-se a suspensão de células através de um coador de células de 70 uM, a fim de se obter uma suspensão de célula única pura no filtrado.
  5. Centrifuga-se o filtrado do passo de 5,4 a 200 xg durante 10 min à temperatura ambiente sem utilizar a ruptura. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante utilizando uma pipeta de 25 ml, e voltar a suspender as células de Sertoli em 40 ml de meio RPMI 1640 (sem soro).
  6. Misturar 100 ul de suspensão celular com 100 ul de azul de tripano e contagem de células mancha com uma câmara de Neubauer melhorada. Ajustar a concentração de células de 3 x 10 6 culas / ml de acordo com o resultado da contagem. Semente de 1 ml por cavidade em uma placa de 6 poços (= dia 1). Se uma coloração Oil Red O (passo 6) está previsto colocar uma lamela em um ou alguns poços antes da semeadura células de Sertoli.
    Nota: as células de Sertoli em suspensão assentar rapidamente, de modo que o tubo deve ser agitada brevemente antes de cada vez que um aliquota de células é feita com a pipeta. Até o dia 4 eles firmemente attACH o substrato.
  7. A fim de remover as células germinativas flutuantes ou aderentes no dia 4 (Figura 4C) lavar cada poço das placas de 6 poços utilizados para cultivar células de Sertoli isolado (passo 5.6) com PBS (Figura 4D). Aspirar o meio, adicionar 1-2 mL de PBS a cada poço e agitar as placas de 6 poços horizontalmente sobre uma mesa vigorosamente, mas sem derramar PBS. Repetir a lavagem 3 vezes e executar o mesmo procedimento de lavagem no dia 5 e 6 (Figura 4E).
    Nota: No dia 4 células de Sertoli têm firmemente ligado e mostrar um paralelepípedo como padrão sob o microscópio de luz invertida (Figura 4C). As experiências podem ser realizadas a partir do dia 7 em diante.
    1. (Alternativa para o passo 5.7), durante a remoção de células germinais e de flutuação aderentes executar um choque hipotónico 3 dias após a sementeira em placas de 6 poços. Remover o meio e adicionar 1 ml de Tris 20 mM pH 7,5 levado diretamente para fora do frigorífico. Aspirar o tampão Tris, após 90 a 120 segundos, mas nãomais tarde. Lavar as células duas vezes com PBS, e adicionar 2 ml de meio RPMI 1640 (sem soro-). Opcionalmente, realizar experimentos no dia seguinte.
      Nota: A maior for a duração do choque hipotónico é mais células germinais pode ser removido, mas os mais células de Sertoli se perder bem. A primeira lavagem PBS deve ser efectuada rapidamente, mas com cuidado de modo a não deslocar quaisquer células de Sertoli. Imediatamente após o tratamento hipotónico numerosos vacúolos de tamanhos diferentes pode ser observada no citoplasma por meio de microscopia de contraste de fase. Vacúolos desaparecer dentro de algumas horas após o tratamento hipotónico.

6. Oil Red O Coloração

  1. Execute todas as etapas na RT. No dia 7 de lavagem de células de Sertoli cultivadas em uma lamela (passo 5.6) com PBS duas vezes e corrigi-los com formalina a 10% em PBS. Depois de 10 min com uma solução de formalina a substituir fresco, e continuar a fixação durante mais 60 minutos.
    Nota: Todas as soluções são adicionadas ao poço (s) com uma lamela de cobertura e aspirado antes do passo seguinte. Aspirar formalina, lavar as células duas vezes com água e adicionar 60% isopropanol. Após 5 min permitir que as células secar ao ar durante alguns minutos.
  2. Adicionar 1 ml de solução corante Oil Red O por poço e incubar durante 10 min. Aspirar a solução, e lavar as células imediatamente 4 vezes com água e tampa de montagem desliza em glicerol-PBS (9: 1). Tome imagens de campo claro com um microscópio de luz de rotina (figura 4F).

7. Imunofluorescência Coloração

  1. Lavar PTCs (a partir do passo 4.5) ou a partir de células de Sertoli (passo 5.5) cultivadas numa lamela de cobertura com PBS duas vezes e corrigi-los com PFA a 4% durante 10 min à TA.
  2. Incubar com 5% de BSA em PBS durante 1 h à TA. Descartar a solução de BSA-PBS e adicionar solução fresca de BSA-PBS contendo actina (músculo liso) (de PTCs) ou vimentina (para células de Sertoli) anticorpo primário (diluição 1: 100 para ambos os anticorpos) e incubar a 4 ° CO / N.
    Nota: A incubação com BSA bloqueia a ligação não especifica do anticorpo primário.
  3. Lavar tampa desliza 3 vezes durante 5 min em PBS-0,1% de Tween 20 e incubar com anticorpo corante verde-fluorescente conjugado de cabra anti-ratinho secundário (diluição 1: 1000) à temperatura ambiente durante 1 h no escuro.
  4. Lavar tampa desliza 3 vezes durante 5 min em PBS-0,1% de Tween 20 e montá-los em DAPI meio de montagem.

8. Análise ultra-estrutural

  1. Lavar as células de Sertoli (do passo 5,6) cultivadas numa placa de cultura de 6 células cm, com PBS e corrigi-los durante 2 horas a 4 ° C numa mistura de 2,5% de glutaraldeido, 2,5% de paraformaldeído e 0,05% de ácido pícrico em tampão cacodilato 67 mM ( pH 7,4) de acordo com Ito e Karnovsky 26.
  2. Realizar pós-fixação em 1% de tetróxido de ósmio, seguido por uma incubação / N O em 0,3% de acetato de uranilo dissolvido em 50 mM de tampão maleato (pH 5). amostras incorporar ao incorporar mídia de acordo com os procedimentos padrão. Cortar seções finas, contrastá-los com citrato de chumbo e examinar com um microscópio eletrônico.

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Representative Results

O procedimento descrito permite o isolamento de aproximadamente 12 x 10 7 células de Sertoli de testículos de ratos 10. 3 X 10 6 células são plaqueadas por cavidade em uma placa de 6 poços de modo a que seis a sete placas de 6 poços estão disponíveis para as experiências no dia 7. A tripsina-digestão com DNase I é o passo mais importante durante o isolamento de células de Sertoli. Se a digestão, neste ponto está avançando muito longe, a proporção de células germinais / células de Sertoli vai desproporcionalmente aumentar até o final. Durante o dia 3-6 de cultura é importante para lavar cuidadosamente longe como muitos não aderentes ou livremente ligados células germinativas quanto possível. Como uma alternativa para lavagens extensas ao longo de 4 dias as células germinais pode ser removido por tratamento hipotónico no dia 3 27. Uma vantagem deste método é que o tempo de cultura de células de Sertoli é mantida ao mínimo para que as funções específicas de células de Sertoli são potencialmente melhor retido do que depois de um período prolongado de cultura.

(Figura 5B). Como as células peritubulares têm um forte potencial proliferativo, a cultura de células de Sertoli tem de ser realizada na ausência de soro. Na presença de 10% de soro PTCs constituiriam cerca de 20% de todas as células, após 6 dias de cultura enquanto que a sua fracção pode ser deverá ser inferior a 1%, na ausência de soro de 7. células de Sertoli Praticamente todos os isolados são viáveis, tal como avaliado por coloração com azul de tripano (não mostrado). Por volta do dia 7 de cultura, as células de Sertoli isolados são menos contaminados com células germinativas e células peritubulares (Figura 4), ​​de modo que as experiências devem ser executadas em torno deste dia, se possível. Para uma boa reprodutibilidade é importante repetir experimentos sempre no mesmo dia da cultura. Se transfecções são planeados que deve ser efectuada no dia 4 ou 5, e extractos de células deve ser feita no dia 5 ou 6.

Ao longo de pelo menos duas semanas em células de Sertoli condições isentas de soro são responsivos ao FSH e produzir mais proteína de ligação ao androgénio, e activador de plasminogénio de transferrina após o tratamento com FSH. Para períodos mais longos de cultura é necessária uma camada alimentadora de células peritubulares ou soro. Após quatro semanas, as culturas deteriorar-se, e as células destacar do substrato 7.

No dia 6 de cultura de células de Sertoli mais adquiriram gotículas lipídicas. Na maioria das células de uma única grande vacúolo formou (Figura 5C e 5D). O teor de lípidos neutros podem ser facilmente visualizados por Oil Red O coloração (Figura 4F).

Além de Sertoli CEL LS dos PTCs removidos podem ser cultivadas, bem como (Figura 4A e 4B). PTCs de 10 testículos produzir cinco balões T75 que podem ser esperadas para formar uma camada confluente após 2 dias de cultura. Assim como as células de Sertoli isoladas PTCs recém-isoladas são contaminadas por células germinativas que podem ser em grande parte removidos por passagens. Os frascos são divididas 1: 2 por tripsinização padrão de modo a que 10 tubos vai ser confluentes no dia 5 após o isolamento. Pureza de PTCs isolado é> 95% e pode ser confirmada utilizando imunomarcação actina de músculo liso-α (Figura 5A). A partir deste dia em diante PTCs pode ser utilizado para experiências. Um frasco é suficiente para, aproximadamente, uma placa de 6 poços, e os poços devem ser confluentes no dia seguinte. As células podem ser passadas várias vezes, mas as experiências devem ser executadas sempre na mesma passagem, a fim de se certificar que as células se comportam de uma maneira reprodutível.

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Figura 1. Morfologia do testículo e fluxo de trabalho do processo. (A) Um sector de um túbulo seminífero com tecido intersticial adjacente é mostrado esquematicamente. túbulos seminíferos são delimitados por uma membrana basal (BM) e uma camada circunferencial de células peritubulares mióides (PTC). O epitélio germinal está localizada no lado luminal da membrana basal. células de Sertoli (SC), que abrangem todo o epitélio germinal estão fortemente ligados à BM e interligados por meio basolateral posicionado junções de oclusão que representam a barreira hemato-testicular (CEL). Seu núcleo irregular (N) mostra um ou mais recortes fissura-like e contém um nucléolo. células germinativas (CG) estão em contato íntimo com SCs em todas as fases do seu desenvolvimento. O compartimento intersticial entre os túbulos contém células de Leydig (LC) e células do sistema imunológico, tais como os macrófagos (MO), bem como os vasos sanguíneos (BV). Figuraadaptado de Fijak e Meinhardt 28. (B) Fluxo de Trabalho do procedimento; codificação de cores é como em (A). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. Os testículos de ratos Wistar machos são excisados ​​e decapsulated. (A) A cavidade peritoneal é aberto através de uma incisão longitudinal, como descrito no texto. Um asterisco (*) indica a almofada epidydimal gordura. (B) testículos são removidos por corte do cordão espermático e (C) recolhido num tubo cónico de 50 ml contendo 20 ml de PBS. Quando todos os testículos foram recolhidos são desinfectadas em 20 ml de 1% (w / v) de iodo em etanol. Para a remoção do iodo que são rapidamente lavadas duas vezes com 25 mlCada PBS. (D) Testes após a primeira lavagem PBS. (E) testículos são transferidos para uma placa de Petri (à direita), e túbulos seminíferos são espremidos para fora da túnica albugínea aberto por meio de lâminas de tesoura fechados (do lado esquerdo) como descrito no texto. (F) Os testículos Decapsulated ainda formar uma massa em forma de testículo compacto com túbulos individuais salientes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. Isolamento de células de Sertoli. (A) após a remoção das células intersticiais pela tripsina-digestão com DNase I e de lavagem 9 x com PBS túbulos se organizem e parecer limpo. (B) Durante colagenase-hialuronidase-DNase I tratamento peritubular celulars a partir das células germinais e da camada exterior são libertadas. Os túbulos se encurtado e obter uma aparência áspera. (C) fragmentos tubulares 4x após lavagem com PBS. (D) de hialuronidase-ADNase I de tratamento lançamentos peritubulares células residuais, bem como células germinativas. Túbulos se ainda mais reduzido, e os agregados tubulares formar. (E) Tubular agrega depois de lavar 4x com PBS. Células (F) Um único Sertoli são produzidos fazendo passar os agregados 10x através de uma agulha 18G. Barras de escala em (AE) = 200 mm, em (F) = 50 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4. Cultura de células peritubulares (AB) e células de Sertoli (CF) e remoção de de contaminantes ing células germinativas. (A) PTCs ressuspendidas a partir do passo 4.5 foram semeadas imediatamente e fotografado no dia seguinte. (B) Após a divisão em três dias contaminação com células germinais é reduzida. (C) No dia 4 células de Sertoli mostrar um padrão típico de paralelepípedos-like. Flutuantes e aderentes células germinativas são visíveis antes da lavagem com PBS. (D) A mesma bem depois de lavar 3x com PBS. O número de células germinais contaminantes é reduzida. Lavar três vezes com PBS é repetido no dia 5 e 6. (E) No dia 6 de cultura praticamente todas as células germinais foram removidos. células de Sertoli ter formado uma camada de células de vista original, ea maioria das células adquiriram um único vacúolo grande. O coloração vermelha (F) Óleo mostra que esses vacúolos são gotículas lipídicas contendo lípidos neutros em grande parte. As barras de escala em (AD) = 200 um, em (E) = 50 mm e em (f) = 25 uM..jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5. Imunofluorescência coloração. Coloração de células primárias peritubulares purificadas com actina (músculo liso) anticorpo (A) e de células de Sertoli com anticorpo vimentina (B). Nenhum células contaminantes são visíveis em ambos os campos de visão. A barra de escala em (A) e (B) = 10 uM. (C) e (D) Electron imagens microscópicas de células de Sertoli após 4 dias em cultura. (C) Observe o contato próximo de células adjacentes (setas) que leva ao padrão de calçada-like, como visto na Figura 4C. Uma gotícula de lípido simples (G) é observada no citoplasma de cada célula. (D) organelos mais abundantes são mitocôndrias (M) e do aparelho de Golgi (G).O núcleo (N) contém um nucléolo (Nc) e mostra o recuo típico fissura-like. Barra de escala em (C) = 1 mm e (D) = 0,25 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Os autores gostariam de agradecer Guido Verhoeven e Ludo Deboel, Leuven, que foram extremamente útil para estabelecer o isolamento de células de Sertoli primárias no laboratório Meinhardt em Giessen. Monika Fijak, Gießen, é reconhecido por sua ajuda com a figura 1A e conselhos. Os estudos foram apoiados pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft através BH concessão 93 / 1-1 (SB) e financiamento do International Research graduado da faculdade JLU Gießen (Alemanha) / Universidade Monash (Melbourne, Austrália) GRK 1871 (SB). O suporte também foi obtido a partir de uma concessão do Estado de Hessen dentro do programa "Exzellenz Landes-ofensiva zur Entwicklung Wissenschaftlich-ökonomischer" (LOEWE) chamou de "Männliche Infertilität bei Infektion & Entzündung" (MIBIE).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Actin (smooth muscle) antibody clone 1A4 Dako M0851 Monoclonal mouse anti human antibody.
Use 1:100 dilution for immunofluorescence.
Albumin bovine fraction V
Standard grade, lyophilized		 Serva 11930.04 Filter (0.45 µm) BSA solutions used for immunofluorescence.
Corning Cell Strainers 70 µm Corning 431751 White color
Collagenase A from Clostridium histolyticum Roche 10103586001
DAPI mountant ProLong Gold Antifade Life technologies P-36931
D-glucose Sigma G8644 100 g/L
Dulbecco´s PBS without Ca2+/Mg2+ Gibco 14190-094
DNase I Roche 10104159001
Electron microscope Zeiss EM 109S
Fluorescence microscope Zeiss Axioplan 2
Hyaluronidase from bovine testis Sigma H3506
Inverted light microscope Olympus CKX41 Routine cell culture microscope
Mouse IgG / IgM (H+L) polyclonal
secondary Antibody 		 Life technologies A-10684 Alexa Fluor 488 conjugate
Oil Red O Sigma O0625 Has replaced Sudan III and Sudan IV because of brighter color.
Paraformaldehyde Sigma P6148
Penicillin (5,000 U/ml)/
Streptomycin (5,000 µg/ml)		 Gibco 15070-063 100x solution
RPMI-1640 Gibco 21875-034 Contains 300 mg/L L-glutamine
Trypsin from porcine pancreas Sigma T5266
Trypan Blue Stain (0.4%) Gibco 15250-061
Trypsin inhibitor from soybean Sigma T6522 The Sigma product is considerably cheaper than the previously used
BPTI (Aprotinin) from Roche.
Vimentin antibody (V9) Sigma V6630 Monoclonal mouse anti pig vimentin antibody.  Use 1:100 dilution for immunofluorescence.
Wistar WU rats Charles River Should be 19 days old on day of experiment.

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