Summary
Under frugt flyve kampe, de adfærdsmønstre observeret, kæmpe dynamik, og tilhørende indlæring og hukommelse påvirkes af eksperimentelle betingelser. Protokollen præsenteres her beskriver en hidtil ukendt fremgangsmåde, som helt eliminerer håndtering af fluer ved forsøg. Dette forbedrer bekæmpelse dynamik og tillader dannelse af stærke "taber" virkninger.
Abstract
Aggressiv adfærd i Drosophila melanogaster er sammensat af den sekventielle udtryk for stereotype adfærdsmønstre (til analyse se 1). Dette kompleks adfærd påvirkes af genetiske, hormonale og miljømæssige faktorer. Som i mange organismer, tidligere kæmper erfaring påvirker kampene strategi af fluer og resultatet af senere konkurrencer: tabe en kamp øger sandsynligheden for at miste senere konkurrencer, afslører "taber" effekter, der sandsynligvis involverer indlæring og hukommelse 2-4. Den indlæring og hukommelse, der ledsager udtryk for komplekse sociale adfærd som aggression, er følsom over for pre-test håndtering af dyr 5,6. Mange eksperimentelle procedurer anvendes i forskellige laboratorier for at studere aggression 7-9 imidlertid ingen rutinemæssigt anvendte protokol, der udelukker håndtering af fluer er i øjeblikket tilgængelig. Her rapporterer vi en ny adfærdsmæssige apparat, der eliminerer håndtering af fluer, hjælp instead deres medfødte negative geotactic reaktioner til at flytte dyrene ind eller ud af kampene kamre. I denne protokol, er små cirkulære kampen arenaer indeholder en fødevare kop delt i to lige store halvdele af en aftagelig plastik skyder før indførelsen af fluer. Fluer ind kamre fra deres hjem isolation hætteglas via skydedøre kammer døre og geotaxis. Efter fjernelse af plast skydere, fluer frit at interagere. Efter bestemte tidsperioder, er fluer adskilt igen ved skydere til efterfølgende eksperimenter. Alt dette sker let uden håndtering af individuelle fluer. Dette apparat giver en ny tilgang til at studere aggression og den tilhørende indlæring og hukommelse, herunder dannelsen af "taber" virkninger i flyve slagsmål. Desuden kan denne nye generelle formål adfærdsmæssige apparat anvendes til at studere andre sociale adfærd af fluer og bør i almindelighed være af interesse for at undersøge erfaring-relaterede ændringer i grundlæggende adfærdsmæssige processer.
Introduction
Aggression i animalske systemer er stærkt forbundet med køb og besiddelse af ressourcer som mad, territorium og hjælpere. I betragtning af den vigtige rolle, det spiller i fitness enkeltpersoner, er det ikke overraskende, at aggression har udviklet sig på tværs af dyreriget. Som en adaptiv træk, som direkte gavner personer, er en stærk indlæring og hukommelse komponent forbundet med aggression. I konkurrencen om social rang, tidligere kæmper erfaring påvirker resultatet af senere konkurrencer. Generelt forudgående tabende erfaring stiger, og vinde erfaring falder, sandsynligheden for at miste senere konkurrencer (kaldet "taber" og "Vinder" virkninger). "Loser" virkninger er blevet observeret i en lang række arter, og nogle rapporter tyder på, at disse kan vare i adskillige dage, mens "Vinder" virkninger normalt er af kortere varighed 2,10,11.
Den første rapport af aggressiv adfærdi bananfluer (D. ampelophila) var Sturtevant i 1915 i en beskæftiger sig med sex anerkendelse og sex valg 12 papir. Et halvt århundrede senere, mere komplette undersøgelser af mandlige frugt flyve aggression blev foretaget, der er beskrevet de fleste af de adfærdsmønstre observeret under bananfluen kampe. Disse eksperimenter blev det meste udført i små grupper af mandlige og kvindelige fluer observeret over timer 13-15. For nylig, med tilføjelse af stærke genetiske værktøjer, dyadiske enkelt sex kampen opsætninger og kortere tider af observation, D. melanogaster har vist sig som en vigtig model til undersøgelse af biologi aggression 1,16. Analyse af kampe mellem samme køn par af mandlige og kvindelige fluer viste, at aggression involverer stereotype adfærdsmønstre, at overgangen fra den ene til den anden i en statistisk pålidelig måde 1,17. Nogle af de adfærdsmønstre observerede sex-specifikke, mens andre er observeret i kampens hos begge køn. Mandlige kampe gå til højere intensitet niveauer end kvindelige slagsmål og resultat i dannelsen af dominans relationer med klare "vindere" og "tabere". På nuværende tidspunkt har mange laboratorier begyndte at undersøge den biokemiske 18, neurale 7,19-21, og genetiske 22 fundament for aggression. Desværre en meta-analyse af undersøgelser få indblik i kampen dynamik og dannelsen og vedligeholdelsen af dominans relationer er problematisk på grund af brugen af en flerhed af eksperimentelle procedurer i forskellige laboratorier. Væsentlige alle teknikkerne beskrevet i litteraturen indbefatter håndtering og manipulation af fluer at anvende dem i arenas 19,23,24 og under adfærdsmæssige forsøg 3,4 overføre fluer ud af arenaer. Let aspiration er den mest almindelige måde at manipulere fluer 3,4,23-25, men kulde eller CO 2 anæstesi anvendes også 9,26, selv om porrige undersøgelser, der allerede har rapporteret, at disse procedurer har skadelige virkninger på flue adfærd 27,28. En periode på mindst 24 timer, anbefales efter anvendelse af eventuelle bedøvelsesmidler til at minimere deres virkninger på adfærd 29,30.
Fluer lære af tidligere kampe erfaringer og ændre deres adfærdsmæssige brugsmønster i nye situationer, hvilket tyder på, at læring og hukommelse ledsage og er konsekvenserne af agonistiske møder. I den forstand, flyve kampe ligner til operant conditioning læringssituationer, hvor flyver lære, at en strategi har virket, og derefter bruge det oftere og oftere i løbet af de efterfølgende møder. Fluer ændre deres kæmpende strategier efter dominans relationer er blevet etableret i løbet af kampe, med vindere lunge mere og mere og tabere mindre og mindre. Efter en periode med adskillelse, tidligere tabere viser meget mere underdanig adfærd og er meget tilbøjelige til at miste 2. kæmper når parret med naive flerne eller tidligere vindere 3,4. Imidlertid har der ikke findes en eksperimentel procedure, der udelukker håndtering af fluer gjort detaljerede undersøgelser af "taber" -effekter vanskelig. I en nylig undersøgelse, sammenlignede vi to eksperimentelle procedurer rutinemæssigt anvendes i laboratorier (aspiration og kold-anæstesi) at indføre fluer i adfærdsmæssige kamre til den nye procedure, der eliminerer håndtering. Resultaterne viste, at kold-anæstesi havde langt større negative virkninger for aggression end aspiration, men selv aspiration reduceret niveau af aggressivitet af fluer. Aspiration har dog forårsage meget væsentlig indvirkning på indlæring og hukommelse, der ledsager aggression. Efter identisk protokol med to eksperimentelle procedurer (aspiration og ingen håndtering), en robust "taber" effekt blev først observeret, når håndteringen af fluer blev slået ud af den eksperimentelle procedure 5,6.
Ideelt, undersøgelser af Drosophila aggression i Labotorier bør omfatte miljømæssige situationer, som fluer normalt støder på i naturen (konkurrence om ressourcerne, territorium at forsvare og plads til at flygte). Desuden bør eksperimentelle betingelser optimeres til pålideligt fremkalde, observere og fortolke opførsel under eksamen (forsøge at minimere håndtering af dyr, begrænse brugen af CO 2 som bedøvelsesmiddel, og standardisere de eksperimentelle procedurer). I forsøget på at løse de fleste eller alle disse spørgsmål, designet vi en ny adfærdsmæssige apparat der eliminerer håndtering af fluer før, under og efter at introducere dem til adfærdsmæssige arenaer. Med disse apparater, fluer bruge deres medfødte negative geotaxis skal flyttes og overføres ind og ud af kampen kamre. Ved at eliminere håndtering af fluer, protokollen har til formål at: (a) at reducere adfærdsmæssige variation blandt individer; (b) nedsætte den nødvendige tid til fluer til at interagere og generere klare dominans relationer (mænd); og (c) pålideligt inducerer stærk nok behavioral ændringer at tillade dannelse af "taber" virkninger.
Denne protokol beskriver en ny eksperimentel apparat og en trinvis fremgangsmåde til at analysere aggression og at tillade dannelsen af en stærk "taber" effekt i D. melanogaster. Vi forventer, at denne adfærdsmæssige apparat kan let tilpasses til studiet af andre sociale adfærd udstillet af bananfluer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: Følgende er en trin-for-trin beskrivelse af forsøgsprotokollen, vi bruger til at tillade pålidelig udløsning af aggression mellem par af mandlige bananfluer (D. melanogaster). Denne procedure inducerer dannelsen af en "taber" effekt. Ved hjælp af denne protokol, en kortsigtet "Vinder" effekt også er for nylig blevet rapporteret 5,6. Figur 1 viser tidslinjen af de adfærdsmæssige eksperimenter.
Figur 1. Tidslinje for aggression eksperiment. På dag 1 er sene mandlige pupper (når vinger bliver sort) isoleret i frisklavede isolation hætteglas. På dag 5 efter at opstå som voksne, er fire dage gammel mand fluer bedøvet med CO 2 og malet med forskellige farver til identifikation. På dag 7, mad kopper og kæmpende kamre erparat til at etablere de adfærdsmæssige eksperimenter. To 6-7 daggamle voksne mænd er lagt ind i kamrene og er i stand til at interagere. Klik her for at se en større version af dette tal.
1. Dag 1: Social Isolering af Pupper
- Løft og vedligeholde flyve lagre på en miljømæssigt kontrolleret 12 timers lys / 12 timer mørke-cyklus inkubator ved 25 ° C og 50% relativ fugtighed.
- Forbered isolation hætteglas: Varm frisk flyve mad indtil smeltet. Ved hjælp af en Pasteur pipette ca. 1,5 ml smeltet flyve fødevarer i enkelte tomme reagensglas (1,6 x 10 cm). Tillad fødevarer at størkne.
- Isoler pupper: Med en fin pensel, forsigtigt fjerne en sen-fase mandlige puppe (når vinger bliver sort) fra bestanden hætteglasset og læg den på siden af en frisklavet mad, der indeholder reagensglas. Luk isolation hætteglas med bomuld (figur 2).
Figur 2. social isolation. En sen-fase mandlige puppe er placeret på siden på en frisklavet isolation hætteglas. Isolation hætteglas indeholdende puppe er placeret i 12 timers lys / 12 timer mørke inkubator ved 25 ° C og 50% relativ fugtighed. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
2. Dag 5: Maling af fluer til individuelle identifikation
- Udfør dette trin på dag 5 med 4 daggamle mandlige fluer og to dage før de adfærdsmæssige eksperimenter for at minimere den negative effekt af CO 2 anæstesi.
- Bedøver flyve med CO 2. Med en fin tandstikker, placere en lille prik af akryl maling på brystkassen. Undgå at placere maling på hovedet, vinger, mave eller ben (Figur 3).
- Lad malingen tørre i ca. 10 sek, og forsigtigt overføre fluer tilbage til deres oprindelige isolation hætteglas.
- Retur isolation hætteglas til 12 timers lys / 12 timer mørke inkubator ved 25 ° C og 50% relativ fugtighed.
Figur 3. Individuel identifikation. Efter at bedøve en flue med CO 2, en lille dråbe akryl malingen påføres på brystkassen. Til individuel identifikation formål er forskellige farver bruges (hvid og blå her). Se diskussionen nedenfor om brug af CO2 på dette trin. Klik her for at se en større version af denne Figure.
3. Dag 7: Forberedelse af Apparatus
- Forbered Food Cups:
- Varme friske flue fødevarer indtil det smelter.
- Ved hjælp af en Pasteur pipette ca. 0,8 ml fødevarer til låget af et skruelåg hætteglas (1,5 cm i diameter, 1 cm højde) og lad den afkøle. Undgå luftbobler.
- Foretag frisk gær pasta ved at blande tørgær med et par dråber vand. Når tyk, anvende en lille dråbe gær pasta til centrum af foderskålen overflade med en tandstikker (figur 4).
Figur 4. Forberedelse af mad kop. En fødevare kop tilberedes med friske flyve mad. Efter maden størkner, er en prik af gær pasta placeret i midten af maden cup overflade. Klik her for at view en større version af dette tal.
- Forbered Individuelle Fighting Chambers:
- Grundigt vaske apparater og individuel kæmper kamre med vand før brug hver gang. Tør med køkkenrulle før brug.
- Placer en fødevare kop i midten af hver kæmper kammer og fastgør med en dråbe kit.
- Dæk kæmpende kamre med apparatet låg (figur 5).
- Placer apparatet i en høj-fugtighed (60%) ved 25 ° C.
- Placer en lyskilde over apparatet til at belyse de kæmpende kamre og sætte et videokamera til optagelse fra oven.
Figur 5. Forberedelse af enkelte kampe kammeret. Er den frisklavet mad kop med en prik af gær pasta på overfladen fast i vaskede individuel fibrandbekæmpelse kamre. Kamre er lukket med den todelte låg tillader indsættelse af en uigennemsigtig plastik skillevæg i individuelle kæmper kamre. Klik her for at se en større version af dette tal.
4. Dag 7: Behavioral Experiment
- Udfør de adfærdsmæssige eksperimenter med 6-7 daggamle mandlige fluer.
- Sæt plastic dividers i hvert kæmper kammer.
- Fjern vatprop fra isolation røret og placere røret under en åbent hul på siden af apparatet.
- Lad fluen ind i kammeret fighting af negative geotaxis, sædvanligvis inden for nogle få sekunder.
- Luk skydevæggen efter fluen har forladt røret og ind i kammeret.
- Gentag proceduren for at indføre det andet flyve ind i kampen kammeret på den anden side af apparatet.
- Placer apparatet tilbage i det oplyste videotaping position.
- Begynd videooptagelse og fjern plastik divider at tillade fluer til at interagere.
- For Aggression Eksperimenter:
- I disse eksperimenter record kæmper for mindst 20 minutter for at sikre dannelsen af stærke dominans relationer.
- Efter den ønskede tid, stop videooptagelse.
- Fjern fluer fra de kæmpende kamre ved at vende den ovenfor beskrevne procedure.
- Vaskes grundigt adfærdsmæssige apparat med mildt vaskemiddel og vand efter brug og skyl.
- For "Loser" Effect Eksperimenter:
Bemærk: I disse eksperimenter er første kampe betragtes som konditioneringsfase og andet slagsmål som testfasen. Perioden for hvile mellem kampene kan variere, men 10 min tillader dannelsen af en stærk "taber" effekt.- Følg proceduren beskrevet ovenfor til at udføre en første kamp.
- Afgørende skridt: At inducere dannelsen af en "taber" mentalitet, ePÍ at første kampe er mindst 20 minutter lang, for at etablere stærke dominans relationer. Efter 20 minutter, sæt det i igen plastik divider i kampene kamre at adskille fluer.
- Efter en 10 minutters hvileperiode, forsigtigt fjerne plastik divider at tillade fluer at interagere for andet slagsmål.
- Ved udgangen af den anden 20 min kamp, stoppe videooptagelsen.
- Fjern fluer fra adfærdsmæssige kamre som ovenfor.
- Igen, renses grundigt adfærdsmæssige apparat.
- For Aggression Eksperimenter:
5. Behavioral Analysis
- Overførsel af film
- Tilslut kameraer til computeren.
- Konverter fluer .mts til .mov fluer og deltage film klip sammen, ved hjælp af video konvertering software og indstillingen "slutte valgte klip".
- Observere og analysere hver film med video-læser software.
- Scoring Behavior
Bemærk: Dette kan gøres manuelt eller osing adfærdsmæssige analyseprogram software, hvis tilgængelig. Illustrationen nedenfor beskriver en mulig manuel analyse for en "taber" effekt.- Score tidspunktet for det første møde mellem de fluer på maden kop (møder er interaktioner mellem par af fluer, der holder mindst 2 sek) og tidspunktet for fremkomsten af den første lunge (et adfærdsmønster, hvor en flue stiger højt på sin bagben og snaps ned på, og forsøger at få fat i modstanderen). Derefter score latenstiden til at kaste (intervallet mellem det første møde og den første udfald).
- Tæl det samlede antal møder og lunges i løbet af en kamp.
Bemærk: Hvis det ønskes, man også kan score andre adfærdsmønstre, som fløj trussel, boksning, fægtning, tilbagetog eller antallet af møder før den første lunge, for eksempel. - Score tidspunktet for etablering af dominans (tid mellem det første møde, og det tidspunkt, hvor man flyver retreats tre på hinanden følgende gange fra fødevarer cup agtersteER modtager lunges). Bemærk der flyver er vinderen, og som taberen af kampen.
- Beregning af en "Loser" Effekt
- Divider antallet af kampe, hvor de tidligere tabere taber 2 nd slagsmål (tabere, der mister: LL) med det samlede antal af kampe, og gang med 100. Den procentdel opnåede repræsenterer "taberen" effekt:
[(# Fluer LL) / (# samlede kamp)] x 100 - Brug en Chi-square test for at sammenligne, om "taber" effekt er statistisk forskellig fra den forventede værdi på 50%.
- Divider antallet af kampe, hvor de tidligere tabere taber 2 nd slagsmål (tabere, der mister: LL) med det samlede antal af kampe, og gang med 100. Den procentdel opnåede repræsenterer "taberen" effekt:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I dette afsnit præsenteres udformningen af adfærdsmæssige kammeret og analyse af et typisk sæt af adfærdsmæssige forsøg ifølge protokollen beskrevet ovenfor måling aggression og dannelsen af en "taber" effekt. Også illustreret er prøver af andre adfærd, der kan måles ved dette apparat.
Figur 6 viser en skematisk gengivelse af det nye apparatur. Apparatet består af tre cylindriske boringer (mål: 22.86 mm, 17 mm højde), der er de kæmpende kamre. Den todelte dæksel lukker de kæmpende kamre på toppen og tillader indføring af et tyndt uigennemsigtigt plastik skillevæg, der deler kamrene i to lige store dele. På hver side af apparatet, skydevægge med tre huller (diameter 15,88 mm) tillader indlæsning af fluer i de kæmpende kamre af negative geotaxis direkte fra deres isolation hætteglas. Efter fluer ind de kæmpende kamre, de glidende vægge er brugd for at lukke siderne af alle kamre. På dette tidspunkt er de to fluer er inden kampen arenaer men kan ikke interagere grund deleorganerne. Ved at fjerne disse, fluerne er fri til at interagere og de efterfølgende adfærdsmønstre kan observeres og registreres.
Aggression eksperimenter: 38 kampe mellem par af vildtype CS hanner blev udført. Forskellige adfærdsmæssige parametre blev scoret mens fluer var på fødevarer kopper og dynamikken i slagsmål blev analyseret (tabel 1). Et gennemsnit på 24 møder (korte møder mellem fluer), 54 lunges (en indikator for højere intensitet kampene) blev observeret under en 20 min periode, med 1. lunge normalt leveret i 2. støde på. I gennemsnit blev der den 1. møde, den 1. lunge og tid til at etablere dominans set 2, 4 og 8 min efter starten af optagelsen. I de fleste tilfælde er de sidste 12 min af kampe består af gentagne sekvenser af høj intensitet encoUnters med underordnede dyr nærmer sig, bliver angrebet og tilbagetog, styrke dominans eller underdanige status hvert dyr.
"Loser" effekt eksperimenter: For at søge efter dannelsen af en "taber" effekt, 21 1 m kampe af 20 min varighed blev udført mellem par af vildtype CS hanner. Kammeret glidende divider derefter blev indsat for at adskille fluer. Efter 10 minutter blev 2 ND 20 min slagsmål udføres mellem (a) tidligere tabere og velkendte vindere eller (b) tidligere tabere og ukendte vindere og disse blev analyseret som ovenfor (Figur 7). I begge tilstande, 20 tidligere tabere mistede deres 2 nd kampe (95,5%), hvilket viser en robust "taber" effekt. Kampen resultater blev sammenlignet med den forventede værdi af 50-50 med en to-halet Chi-square analyse og en meget betydelig "taber" effekt blev fundet. Blev observeret andre adfærdsændringer i at miste individermellem 1 og 2. kæmper ledsager dannelsen af "taber" virkning 5.
Andre adfærd end aggression kan studeres i apparatet: at illustrere, blev frieri og bevægelseskomponenter eksperimenter udført (T stand 2). For frieri blev mandlige og kvindelige fluer indlæst af negative geotaxis ind i de adfærdsmæssige kamre blev skillevægge fjernet og adfærdsmæssige frieri mønstre blev scoret. 34 forsøg blev udført, og latency til retten (tid mellem 1. møde og 1. frieri adfærd = 7 sek), og at parre sig (tid mellem den 1. møde og samleje = 4 min) blev analyseret. Kun 2 hanner lykkedes ikke kopulerende under 15 min tid for observation. Frieri Vigor Index (den del af tiden, at mænd brugt kur hunner i løbet af en 15 minutters periode efter 1. frieri adfærdsmønster) blev scoret på 75% (tabel 2). Til brug enten syndGLE fluer eller en gruppe af 10 fluer blev indført i kamre og det samlede antal af midterlinjen afgange i løbet af 5 min blev talt. Single fluer krydse midterlinjen af kammeret i gennemsnit 73 gange i løbet af 5 min, medens individuelle fluer i grupper krydse midterlinjen i gennemsnit 45 gange / 5 min (tabel 2). Dette fald iagttages, når fluer er i grupper kan forklares ved den reducerede plads pr flue og, når de bruger interaktivt med hinanden i stedet for at udforske område.
Figur 6. Skematisk repræsentation af adfærdsmæssige kammer. (A) set fra siden af apparatet. At det nye apparat består af tre separate dele: (a) en plastblok indeholdende tre personer kæmper kamre; (b) to skydevægge med tre huller (15,88 mm i diameter) i hvert; og (c) den todelte dæksel på toppen. (B) Topafbildning af apparatet. Dimensionerne af plastik blok (a) er 36.83 mm x 123,19 mm. Hver enkelt kæmper kammer har en diameter på 22,86 mm og en højde på 17 mm. Huller på den side, der tillader indlæsningen af fluerne har en diameter på 15,88 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7. Dannelsen af en robust "taber" effekt. En væsentlig "taber" effekt (procentdel af tabere, der mister 2. kæmper observeres, når tidligere tabere blev parret (a) med velkendte vindere (n = 21, *** p <0,0001), eller (b) med ukendte vindere for deres 2 nd kampe (n = 21, *** p <0,0001) (Lose: 95,5%, Win:. 4,5%, Nej trækker) Pllethed klik her for at se en større version af dette tal.
| Adfærdsparametre | Enhed | Tid (sek) | n |
| Encounters | 24 ± 2 | 38 | |
| Lunges | 54 ± 6 | 38 | |
| Antal møder før 1. lunge | 2 ± 0,3 | 38 | |
| Tidspunkt for 1. møde | 145 ± 20 | 38 | |
| Tidspunkt for 1. lunge | 229 ± 26 | 38 | |
| Tidspunkt for dominans | 475 ± 56 | 34 | |
| Latenstid at kaste | 87 ± 20 | 38 | |
| Latens til dominans | 342 ± 51 | 34 |
Tabel 1:. Dynamik agonistiske interaktioner mellem par af mandlige fluer Mean værdier ± SEM beregnes for hver parameter scoret som indikatorer for aggressivitet. Det samlede antal møder og lunges, og antalletaf møder før 1. lunge blev scoret. Tidspunkter af 1. møde, 1st lunge og dominans, og latenstider at kaste og dominans er præsenteret i sek ± SEM (n> 34).
| Adfærdsparametre | Tid (sek) | Enhed | (%) | n |
| Frieri adfærd | ||||
| Latens for retten | 7 ± 3 | 34 | ||
| Latenstid at parre sig | 273 ± 62 </ td> | 32 | ||
| Frieri Vigor Indeks | 75 ± 0,05 | 34 | ||
| Locomotion | ||||
| Total midterlinjen kors (single flyve) | 73 ± 4 | 48 | ||
| Total midterlinjen kors (gruppe af fluer) | 45 ± 3 | 20 |
Tabel 2:. Analyse af frieri adfærd og bevægelse Middelværdier ± SEM er beregnet for de latenstider for retten og parre sig (i sek). En frieri vigør indeks(i% af tid brugt kurtiserer efter 1. frieri display) blev scoret efter hanner og hunner blev fyldt i adfærdsmæssige kamre af negative geotaxis (n> 32). Bevægelse, når enkelte fluer eller grupper af 10 fluer blev fyldt i kamre, blev scoret ved at tælle det samlede antal krydsninger midterlinjen i 5 min (n = 48 og 20).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den moderne æra af at bruge Drosophila med sin kraftfulde genetiske metoder som en model organisme for studiet af aggression begyndte omkring en halv snes år siden med indførelsen af nye eksperimentelle arenaer, hvor pålidelig kæmper adfærd kunne opnås med enkelte par af fluer 1,7, 8,17,19. Disse arenaer omfattede ønskede ressourcer (en fødevare kop, potentielle hjælpere) og et rum for taber flyver at trække sig tilbage ind. Når resultaterne opnået med disse arenaer blev tilsat til tidligere viden om bananflue bekæmpelse adfærd blev Drosophila melanogaster fast etableret som en meget ønskværdig modelsystem til undersøgelse af en kompleks adfærd som aggression og bruges i mange laboratorier. De summerede opnåede resultater viste, at: (a) fluer udviser aggression i konkurrencen om fødevarer ressourcer, adgang til hjælpere eller til forsvar af territorium 14,15; (b) kampe er sammensat af en række på stereotype adfærdsmønstre 1; (c)mandlige og kvindelige fluer kæmpe i samme køn fodboldmesterskaber (nogle mønstre er mandlige specifikke, nogle er kvindelige specifikke og nogle er fælles for begge køn) 17; (d) kun mandlige kampe gå til høj intensitet niveauer og resultere i dannelsen af hierarkiske relationer med klar «vinder» og «taber» fluer 17; (e) et enkelt gen frugtesløs, hierarki på kønsbestemmelse, afgør, om fluer kæmper som mænd eller kvinder 16 og (f) multiple hormonale stoffer, herunder aminer og peptider indflydelse aggression i Bananfluer 7,8,19,20.
Her er en ny tilgang beskrevet for studiet af bananfluer aggression, hvor håndtering af fluer ved forsøg elimineres. Dette giver en betydelig forbedring i forsøgsprotokollen, da alle adfærdsmæssige målinger er forbedret 5,6, nye oplysninger om adfærden er blevet vundet og indlæring og hukommelse, der ledsagerMale fly slagsmål er stærkt forbedret. For at illustrere, har kun to tidligere undersøgelser rapporteret dannelsen af "taber" effekter i dette modelsystem 3,4. I begge disse blev større kamre end dem, der er beskrevet i denne protokol anvendte, fluer blev overført ind og ud af kampen arenaer ved aspiration, og længere kampen tider og interval tider mellem slagsmål var nødvendige for at generere klare "taber" virkninger. Vores seneste undersøgelse viste, at fjerne håndtering fra forsøgsprotokollen, klare dominans relationer mellem par af D. melanogaster mandlige fluer er observeret efter kun 20 min af interaktion. Denne mængde tid er tilstrækkelig til at fremkalde betydelige ændringer i kampene strategier i begge fluer i løbet af 1 m kampe og pålideligt observere dannelsen af stærke "taber" virkninger i 2 nd slagsmål. Endvidere for første gang, klare kortsigtede "Vinder" virkninger blev også observeret under 2.kæmper 5,6.
For succes ved hjælp af denne protokol, nogle kritiske punkter skal bemærkes. At fremkalde og observere robuste aggressive adfærdsmønstre Vi anbefaler at bruge 6-7 daggamle mandlige fluer, der er blevet afholdt i social isolation siden slutningen puppestadiet. Generelt er tilgængeligheden af ressourcer, der flyver er villige til at konkurrere i (mad, hjælpere) er særdeles ønskeligt for at opnå en stærk kæmper adfærd og etablering af dominans relationer. I løbet af denne protokol, er fluer malet efter anæstesi ved hjælp af CO2, og som kan være af interesse som vores nyligt offentliggjorte undersøgelse, der viser, at bedøve fluer alvorligt forstyrrer efterfølgende adfærd 5. Mulige måder at undgå anæstesi kunne være at ikke male dyr, hvis det ikke er vigtigt at holde styr på enkeltpersoner. Hvis maleriet er imidlertid nødvendigt, anæstesi bør anvendes 48 timer inden dyrene bruges til forsøg, eller alternative metoder til at identificereindivider også kan anvendes 31. For at fremkalde stærk "taber" og "vinder" virkninger, er det afgørende, at fluer etablere og opretholde en dominans forhold under de første kampe. I den protokol, der præsenteres her, ved hjælp af vildtype-CS-stammen ved 25 ° C, 20 min af interaktion er tilstrækkelig til at generere klare "vindere" og "tabere" og til at observere ændringer i kampen strategier både enkeltpersoner. I forsøg udført ved forskellige temperaturer end 25 ° C eller med andre genotyper end CS, dog kan den gennemsnitlige tid for oprettelse af et robust dominans forhold være anderledes. Derfor bør kampene periode justeres ved at udføre sæt af indledende forsøg. Og endelig, hvordan par af fluer adskilles efter deres første kampe kan være vigtigt at bevare mindet om kampen udfald. Det er sandsynligvis vigtigt at reducere bevægelse af apparatet og være forsigtig under indføringen af plastmaterialet divider med henblik påat minimere forstyrrelse af dyrene.
Udformningen af apparatet og den todelte låg tillader adskillelse af de adfærdsmæssige kamre i to lige rum, gør det nemt at adskille de to fluer efter de første kampe og indføre nye modstandere i 2. slagsmål. Som vist i tabel 2, med små justeringer af forsøgsprotokollen, det samme apparat kan anvendes til at studere frieri, bevægelse eller endog de fleste bananfluer adfærd, der skulle være mindre stressende forhold til forsøgsdyrene. Eventuelle yderligere forbedringer på procedure kunne være at indføre en form for termostatstyring i apparatet (piezoelektriske element eller en spole til at cirkulere temperaturkontrolleret væske) at gøre det let brug af temperaturfølsomme reagenser (shibire TS1, dTRPA1 kanal).
Sammenfattende har vi udtænkt en hidtil ukendt apparat, der tilbyder en ny strategi for studiet af aggression in bananfluer, hvor håndteringen af fluer før, under og efter forsøgene blev elimineret. Alle adfærdsmæssige foranstaltninger er forbedret med den nye apparat i forhold til flere andre almindelige måder at håndtere fluer. Måske en mere generel bemærkning er, at væsentlige alle adfærdsmæssige eksperimenter i laboratoriemiljøer involverer eksperimentatorer optagning eller på andre måder, håndtering dyr. Trods bestræbelserne på at være blid i denne håndtering, dette sandsynligvis være stressende for dyrene. Det kunne være nyttigt at udtænke metoder til at fjerne denne håndtering når det er muligt, således at dyrene måske kan ses under lidt mere normale forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af tilskud fra Statens Institut for General Medical Sciences (GM099883 og GM074675) til EAK De finansieringskilderne havde nogen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Vi takker de mennesker fra vores maskinværksted ved Harvard Medical School for udformningen af den adfærdsmæssige apparat (kontakt: http://mikesmachine.com).
Forfatter bidrag: ST, BC designet adfærdsmæssige apparat. ST designet og optimeret forsøgsprotokollen. ST og BC udført og analyseret eksperimenterne. ST, EAK og BC skrev papiret.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila melanogaster pupa | Bloomington Stock Center | ||
| Standard fly food | Fabricated in-house. | ||
| Behavioral chambers | Mike machine | Fabricated in-house. Directly contact the compagny for more informations. | |
| Borosilicate glass vials | VWR International | 47729-576 | 16 x 10 mm |
| Cotton | Fisherbrand | 22-456-881 | Any brand can be used |
| Pasteur pipettes | VWR International | 53300-567 | |
| Paintbrush | Blick Art Material | 06157-7030 | Round , Size 3/0 |
| Toothpick | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Acrylic paint (blue/white) | Blick Art Material | 01637-5172/01637-1022 | Any brand can be used |
| Dry active yeast | Sigma | YSC2-500G | |
| Srew cap tube | VWR International | 10011-394 | 15 mm diameter, 10 mm height |
| Eppendorf | VWR International | 22363212 | |
| Tape | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Plastic slices | Electron Microscopy Sciences | 70329-40 | 22 x 40 x 0.25 mm Thickness |
| Light source (bulb) | VWR International | 500003-418 | Any brand can be used |
| Timer | VWR International | 62344-641 | Any brand can be used |
| Incubator | Percival | Directly contact the constructor for more informations. | |
| Carbon Dioxide Dry (CO2) | Medical-Technical Gases, Inc | 14H31 | |
| Binocular | Nikon | SMZ-745 | Any brand can be used |
| Camera (SONY Handycam HDR-CX330) | B&H | SOHDRCX330B | Any brand can be used |
| Computer | With a minimum of 1.4 Ghz Processor, running Microsoft Windows or Machintosh HD | ||
| ClipWrap | Download online | Any importing software can be used | |
| QuickTime Player | Download online | Any reading software can be used | |
| GraphPad Software | Online | Any statistical software can be used |
References
- Chen, S., Lee, A. Y., Bowens, N. M., Huber, R., Kravitz, E. A. Fighting fruit flies: a model system for the study of aggression. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 5664-5668 (2002).
- Hsu, Y., Earley, R. L., Wolf, L. L. Modulation of aggressive behaviour by fighting experience: mechanisms and contest outcomes. Biol Rev Camb Philos Soc. 81, 33-74 (2006).
- Yurkovic, A., Wang, O., Basu, A. C., Kravitz, E. A. Learning and memory associated with aggression in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 17519-17524 (2006).
- Penn, J. K., Zito, M. F., Kravitz, E. A. A single social defeat reduces aggression in a highly aggressive strain of Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 12682-12686 (2010).
- Trannoy, S., Chowdhury, B., Kravitz, E. A. Handling alters aggression and 'loser' effect formation in Drosophila melanogaster. Learn Mem. 22, 64-68 (2015).
- Trannoy, S., Kravitz, E. A. Learning and memory during aggression in Drosophila: handling affects aggression and the formation of a ''loser'' effect. Journal of Nature and Science. 1 (3), e56 (2015).
- Alekseyenko, O. V., Chan, Y. B., Li, R., Kravitz, E. A. Single dopaminergic neurons that modulate aggression in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 6151-6156 (2013).
- Dierick, H. A., Greenspan, R. J. Serotonin and neuropeptide F have opposite modulatory effects on fly aggression. Nat Genet. 39, 678-682 (2007).
- Williams, M. J., et al. Regulation of aggression by obesity-linked genes TfAP-2 and Twz through octopamine signaling in Drosophila. Genetics. 196, 349-362 (2014).
- Chase, I. D., Bartolomeo, C., Dugatkin, L. A. Aggressive interactions and inter-contest interval: how long do winners keep winning? Anim. Behav. 48, 393-400 (1994).
- Goessmann, C., Hemelrijk, C., Huber, R. The formation and maintenance of crayfish hierarchies: behavioral and self-structuring properties. Behav Ecol Sociobiol. 48, 418-428 (2000).
- Sturtevant, A. H. Experiments on sex recognition and the problem of sexual selection in Drosophila. J Animal Behav. 5, 351-366 (1915).
- Jacobs, M. E. Influence of light on mating of Drosophila melanogaster. Ecology. 41, 182-188 (1960).
- Dow, M. A., von Schilcher, F. Aggression and mating success in Drosophila melanogaster. Nature. 254, 511-512 (1975).
- Hoffmann, A. A laboratory study of male territoriality in the sibling species Drosophila melanogaster and D. simulans. Anim. Behav. 35, 807-818 (1987).
- Vrontou, E., Nilsen, S. P., Demir, E., Kravitz, E. A., Dickson, B. J. fruitless regulates aggression and dominance in Drosophila. Nat Neurosci. 9, 1469-1471 (2006).
- Nilsen, S. P., Chan, Y. B., Huber, R., Kravitz, E. A. Gender-selective patterns of aggressive behavior in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 12342-12347 (2004).
- Fernandez, M. P., Kravitz, E. A. Aggression and courtship in Drosophila: pheromonal communication and sex recognition. J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol. 199, 1065-1076 (2013).
- Alekseyenko, O. V., et al. Single serotonergic neurons that modulate aggression in Drosophila. Current biology : CB. 24, 2700-2707 (2014).
- Asahina, K., et al. Tachykinin-expressing neurons control male-specific aggressive arousal in Drosophila. Cell. 156, 221-235 (2014).
- Andrews, J. C., et al. Octopamine neuromodulation regulates Gr32a-linked aggression and courtship pathways in Drosophila males. PLoS genetics. 10, e1004356 (2014).
- Zwarts, L., et al. Complex genetic architecture of Drosophila aggressive behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 17070-17075 (2011).
- Dierick, H. A. A method for quantifying aggression in male Drosophila melanogaster. Nat Protoc. 2, 2712-2718 (2007).
- Wang, L., et al. Hierarchical chemosensory regulation of male-male social interactions in Drosophila. Nat Neurosci. 14, 757-762 (2011).
- Davis, S. M., Thomas, A. L., Nomie, K. J., Huang, L., Dierick, H. A. Tailless and Atrophin control Drosophila aggression by regulating neuropeptide signalling in the pars intercerebralis. Nat Commun. 5, 3177 (2014).
- Yuan, Q., Song, Y., Yang, C. H., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Female contact modulates male aggression via a sexually dimorphic GABAergic circuit in Drosophila. Nat Neurosci. 17, 81-88 (2014).
- Perron, J. M., Huot, L., Corrivault, G. W., Chawla, S. S. Effects of carbon dioxide anaesthesia on Drosophila melanogaster. J Insect Physiol. 18, 1869-1874 (1972).
- Joachim, D., Curtsinger, J. W. Genotype and anesthetic determine mate choice in Drosophila melanogaster. Behav Genet. 20, 73-79 (1990).
- Barron, A. B. Anaesthetising Drosophila for behavioural studies. J Insect Physiol. 46, 439-442 (2000).
- Greenspan, R. J. Fly Pushing: The theory and Practice of Drosophila Genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. (1997).
- Cabral, L. G., Foley, B. R., Nuzhdin, S. V. Does sex trade with violence among genotypes in Drosophila melanogaster? PLoS One. 3 (4), e1986 (2008).
