Summary
במהלך זבוב פירות קרבות, דפוסי ההתנהגות שנצפו, להילחם דינמיקה, והלמידה וזיכרון הקשורים מושפעות תנאי ניסוי. הפרוטוקול המובא כאן מתאר הליך רומן שלגמרי מבטל טיפול בזבובים במהלך ניסויים. זה משפר את דינמיקת קרב ומאפשר היווצרות של תופעות "לוזר" חזקות.
Abstract
התנהגות תוקפנית בmelanogaster תסיסנית מורכבת מהביטוי רציף של דפוסי התנהגות סטריאוטיפיים (לניתוח לראות 1). התנהגות מורכבת זו מושפעת מגורמים גנטיים, הורמונליים וסביבתיים. כמו באורגניזמים רבים, ניסיון לחימה קודם משפיע על אסטרטגית הלחימה של זבובים ותוצאה של תחרויות מאוחר יותר: לאבד מאבק מגדיל את ההסתברות לאבד תחרויות מאוחר יותר, חושף תופעות "לוזר" שעשויה להיות כרוך למידה וזיכרון 2-4. הלמידה והזיכרון שמלווה את הביטוי של התנהגויות חברתיות מורכבות כמו תוקפנות, הוא רגישה למבחן מראש טיפול בבעלי החיים 5,6. הפרוצדורות רבות משמשות במעבדות שונות ללמוד תוקפנות 7-9, לעומת זאת, לא באופן שגרתי פרוטוקול המשמש שאינו כולל טיפול בזבובים זמינים כעת. כאן אנו מדווחים מנגנון התנהגות חדש שמבטל טיפול של זבובים, באמצעות insteaד תגובות geotactic השליליות המולדת שלהם כדי להעביר בעלי חיים לתוך או מחוץ לתאי לחימה. בפרוטוקול זה, זירות קרב מעגליות קטנות המכילות כוס מזון מחולקות לשני חצאים שווים על ידי מחוון פלסטיק נשלף לפני כניסתה של זבובים. זבובים להיכנס תאים מבקבוקוני בידוד ביתם באמצעות דלתות זזים קאמריות וgeotaxis. לאחר ההסרה של מחווני פלסטיק, זבובים חופשיים אינטראקציה. לאחר פרק זמן נקוב, זבובים מופרדים שוב על ידי מחוונים לניסויים הבאים. כל זה נעשה בקלות ללא טיפול של זבובים בודדים. מנגנון זה מציע גישה חדשנית ללימוד תוקפנות והלמידה קשורה וזיכרון, כולל ההיווצרות של תופעות "לוזר" בקרבות זבוב. בנוסף, מנגנון זה חדש לשימוש כללי התנהגות יכול להיות מועסק ללמוד התנהגויות חברתיות אחרות של זבובים וצריכים, באופן כללי, יהיה עניין לחקירת שינויים הקשורים לניסיון בתהליכי התנהגות בסיסי.
Introduction
תוקפנות במערכות בבעלי חיים קשורה באופן הדוק לרכישה והאחזקה של משאבים כגון מזון, טריטוריה וחברים. בהתחשב בתפקיד החשוב זה משחק בכושרם של יחידים, אין זה מפתיע כי תוקפנות התפתחה על פני ממלכת החי. כתכונה אדפטיבית ישירות הטבות יחידים, מרכיב למידה וזיכרון חזק מזוהה עם תוקפנות. בתחרות על מעמד חברתי, ניסיון לחימה קודם משפיע על התוצאות של תחרויות מאוחר יותר. באופן כללי, עולה ניסיון מפסיד לפני, וניסיון מנצח יורד, ההסתברות לאבד תחרויות מאוחר יותר (המכונה "לוזר" והשפעות "מנצח"). אפקטים "לוזר" נצפו במגוון רחב של מינים, וכמה דיווחים מצביעים על כך שהללו יכולים להימשך כמה ימים ואילו השפעות "מנצח" בדרך כלל הם של משך קצר יותר 2,10,11.
הדו"ח הראשון של התנהגות תוקפניתבזבובי פירות (ampelophila ד) היה על ידי Sturtevant בשנת 1915 בעיתון העוסק בהכרה מין ובחירת מין 12. חצי מאה מאוחר יותר, בדיקות של פירות גבריים מלאים יותר לטוס תוקפנות נעשתה, שתיארה ביותר של דפוסי ההתנהגות שנצפו במהלך קרבות זבוב פירות. ניסויים אלה בעיקר בוצעו בקבוצות קטנות של זבובי זכרים ונקבה נצפו על פני שעות 13-15. לאחרונה, עם התוספת של כלים רבי עוצמה גנטיים, מערכי קרב חד מיני זוגיים וזמנים קצרים יותר של התבוננות, ד ' melanogaster התפתח כמערכת מודל חשובה למחקר של הביולוגיה של תוקפנות 1,16. ניתוח של קרבות בין זוגות אותו מין של זבובי זכרים ונקבות הראה כי תוקפנות כרוכה דפוסי התנהגות סטריאוטיפיים שהמעבר מאחת לשנייה באופן סטטיסטי אמין 1,17. חלק מדפוסי ההתנהגות שנצפו הוא מין ספציפי ואילו אחרים הם נצפו במאבקים בשני המינים. קרבות זכר ללכת לרמות עוצמה גבוהות יותר מאשר קרבות נשיים ולגרום להיווצרות של יחסי שליטה עם "זוכים" ברורים ו" מפסידים ". נכון לעכשיו, מעבדות רבות החלו לחקור את 18 ביוכימיים, 7,19-21 עצביים, ו- 22 בסיס גנטי של תוקפנות. למרבה הצער, מטה-אנליזה של מחקרים כדי לקבל תובנה דינמיקת מאבק וההקמה ותחזוקה של מערכות יחסים דומיננטיות היא בעייתי בשל השימוש בריבוי הליכי ניסוי במעבדות שונות. בעיקרו של דבר בכל הטכניקות שתוארו בספרות כרוכה טיפול ומניפולציה של זבובים להציג אותם לזירות 19,23,24 ובמהלך הניסוי התנהגותי 3,4 להעביר זבובים מזירות. שאיפה עדינה היא הדרך הנפוצה ביותר כדי לתפעל זבובים 3,4,23-25, אבל 2 הרדמה קרה או CO משמשות גם 9,26, למרות עמ 'מחקרי revious כבר דיווחו שיש להם נהלים אלה השפעות מזיקות על זבוב התנהגות 27,28. תקופה של לפחות 24 שעות מומלצת לאחר השימוש בכל הרדמה כדי למזער את ההשפעות שלהם על התנהגות 29,30.
זבובים ללמוד מניסיון לחימה קודם ולשנות את השימוש בדפוס ההתנהגות שלהם במצבים חדשים, המצביעים על כך למידה וזיכרון ילוו והשלכות של מפגשים התגוששותית. במובן זה, לטוס קרבות דומים למצבי למידת תניה אופרנטית שבטס ללמוד כי אסטרטגיה עבדה ולאחר מכן להשתמש בו לעתים קרובות יותר ויותר במהלך מפגשים שלאחר מכן. זבובים לשנות אסטרטגיות הלחימה שלהם לאחר יחסי דומיננטיות הוקמו במהלך קרבות, עם זוכים זנקו יותר ויותר ומפסידים פחות ופחות. לאחר תקופה של הפרדה, מפסידים קודמים להראות התנהגות הרבה יותר כנועה וסבירים מאוד לאבד 2 nd נלחם כאשר יחד עם fl הנאיביies או זוכים קודמים 3,4. עם זאת, היעדר הליך ניסיוני שאינו כולל טיפול בזבובים עשה מחקרים מפורטים של תופעות "לוזר" קשות. במחקר שנערך לאחרונה, השווינו שתי הפרוצדורות בשימוש שיגרתי במעבדות (שאיפה וקרה-הרדמה) להציג זבובים לתוך תאי התנהגות לנוהל החדש שמבטל טיפול. התוצאות הראו כי קרה-הרדמה השפעות שליליות גדולות בהרבה על תוקפנות מאשר שאיפה, אבל גם שאיפה הפחיתה את רמת האגרסיביות על ידי זבובים. השאיפה לא, לעומת זאת, גורמת לתופעות משמעותיות ביותר על הלמידה והזיכרון שילווה את התוקפנות. בעקבות פרוטוקול זהה בשני הליכי ניסוי (שאיפה ולא טיפול), אפקט "לוזר" חזק היה רק נצפה כאשר הטיפול בזבובים חוסלו מ5,6 ההליך ניסיוני.
באופן אידיאלי, מחקרים של תוקפנות דרוזופילה בlaboratories צריך לכלול מצבים סביבתיים שזבובים בדרך כלל נתקלים בטבע (תחרות על משאבים, שטח להגן וחלל לברוח). בנוסף, צריכים להיות מותאמים לתנאי ניסוי לגרום באופן מהימן, להתבונן ולפרש את ההתנהגות תחת בדיקה (מנסה למזער טיפול בבעלי חיים, להגביל את השימוש של CO 2 כחומר הרדמה, ולתקנן את הליכי ניסוי). בניסיון להתמודד עם רוב או את כל הנושאים הללו, עיצבנו מנגנון התנהגות חדש שמבטל טיפול בזבובים לפני, במהלך ואחרי החדרתם לזירות התנהגות. עם מנגנון אלה, זבובים להשתמש geotaxis השלילית המולדת שלהם להתרגש והועברה לתוך ומחוץ לתאי המאבק. על ידי ביטול טיפול בזבובים, פרוטוקול מטרה: (א) לצמצם את השונות התנהגותית בקרב אנשים; (ב) להקטין את הזמן הדרוש לזבובים לאינטראקציה וליצור מערכות יחסים דומיננטיות ברורות (זכרים); ו- (ג) באופן מהימן לגרום מספיק חזק behavioשינויי RAL כדי לאפשר היווצרות של תופעות "לוזר".
פרוטוקול זה מתאר מנגנון ניסיוני חדש וצעד אחר צעד ההליך לנתח תוקפנות ולאפשר ההיווצרות של אפקט חזק "לוזר" בד melanogaster. אנו צופים כי מנגנון התנהגות זו ניתן להתאים בקלות לחקר התנהגויות חברתיות אחרות הוצגו על ידי זבובי פירות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: להלן תיאור צעד-אחר-צעד של פרוטוקול הניסוי אנו משתמשים כדי לאפשר אמין מפעילות תוקפנות בין הזוגות של זבובי פירות זכר (ד melanogaster). הליך זה גורם להיווצרות אפקט "לוזר". השימוש בפרוטוקול זה, בטווח קצר השפעה "זוכה" גם היה דיווחה לאחרונה 5,6. איור 1 מציג את ציר הזמן של הניסויים התנהגותיים.
איור 1. ציר זמן של ניסוי תוקפנות. ביום 1, גלמים זכריים בשלב מאוחר (כאשר הכנפיים הפכו שחורות) מבודדים בבקבוקוני בידוד מוכנים טרי. ביום 5 לאחר מתעורר כמו מבוגרים, זבובי זכרים 4 ימים ישנים מורדמים עם CO 2 וצבוע בצבעים שונים למטרות זיהוי. ביום 7, כוסות מזון ותאי לחימה הןמוכן להגדיר את הניסויים התנהגותיים. שני 6-7 זכרים בוגרים בן יומו נטענים לתאים והם מסוגלים לתקשר. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
1. יום 1: בידוד חברתי של גלמים
- לגייס ולשמור על מניות לטוס בשעתי אור 12 / חממת מחזור כהה 12 שעות מבוקרות לסביבה של 25 מעלות צלזיוס ו -50% לחות יחסית.
- הכן בקבוקוני בידוד: מחממים מזון טרי לטוס עד נמס. בעזרת פיפטה פסטר, להעביר כ 1.5 מיליליטר של אוכל לטוס נמס לתוך צינורות בודדים ריקים מבחן זכוכית (1.6 x 10 סנטימטרים). לאפשר המזון כדי לחזק.
- לבודד גלמים: עם מכחול דק, להסיר בעדינות גולם זכר בשלב מאוחר (כאשר הכנפיים הפכו שחורות) ממניות הבקבוקון ולמקם אותו בצד של מבחנת מזון המכיל מוכנה טרי. בקבוקונים לסגור בידוד עם צמר גפן (איור 2).
גולם זכר איור 2. בידוד חברתי. אחת בשלב מאוחר ממוקם בצד על בקבוקון בידוד מוכן טרי. בקבוקונים המכילים בידוד גולם ממוקמים בשעתי האור 12 / החממה הכהה 12 שעות של 25 מעלות צלזיוס ו -50% לחות יחסית. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
2. יום 5: ציור הזבובים למטרות זיהוי פרט
- לבצע שלב זה ביום 5 עם 4 זבובי זכרי בני יומם ושני ימים לפני הניסויים התנהגותיים כדי למזער את ההשפעה השלילית של CO 2 הרדמה.
- הרדימי לטוס עם CO 2. עם קיסם דק, תוסיף נקודה קטנה של צבע אקרילי על בית החזה. הימנע מנחת צבע על הראש, כנפיים, הבטן או ברגליים (איור 3).
- בוא יבש צבע לכ 10 שניות, ובעדינות להעביר זבובים בחזרה לבקבוקוני הבידוד המקוריים שלהם.
- חזרו בקבוקוני בידוד לשעת אור 12 / החממה הכהה 12 שעות של 25 מעלות צלזיוס ו -50% לחות יחסית.
איור 3. זיהוי פרט. לאחר הרדמה זבוב עם CO 2, טיפה קטנה של צבע אקרילי מוחל על בית החזה. לצורך זיהוי אישי, בצבעים שונים משמשים (לבן וכחול כאן). ראה דיון בהמשך על שימוש של CO 2 בשלב זה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של figu זהמִחָדָשׁ.
3. יום 7: הכנת מכשירים
- הכן כוסות מזון:
- מחממים מזון טרי לטוס עד שהוא נמס.
- בעזרת פיפטה פסטר, להעביר כ 0.8 מיליליטר מזון למכסה של בקבוקון כובע בורג (1.5 סנטימטרים קוטר, גובה 1 סנטימטר) ולהתקרר. למנוע בועות אוויר.
- הפוך שמרי רסק טרי ידי ערבוב שמרים יבשים עם כמה טיפות של מים. כאשר עבה, חל ירידה קטנה של שמרים להדביק למרכז משטח כוס מזון עם קיסם (איור 4).
איור 4. הכנת כוס המזון. כוס אוכל מוכנה עם אוכל לטוס טרי. לאחר מתמצק מזון, נקודה של שמרים להדביק ממוקמת במרכז משטח כוס מזון. אנא לחץ כאן כדי view גרסה גדולה יותר של דמות זו.
- הכן לשכות הלוחמת פרט:
- ביסודיות לשטוף את תאי מנגנון ולחימה בודדת במים לפני שימוש בכל פעם. יבש עם מגבת נייר לפני השימוש.
- מניחים כוס מזון במרכזו של כל תא לחימה ולתקן במקום עם ירידה של מרק.
- לכסות תאי לחימה עם מכסה המנגנון (איור 5).
- מניחים את המכשיר לסביבה גבוהה לחות (60%) של 25 מעלות צלזיוס.
- הנח מקור אור מעל המנגנון כדי להאיר את תאי הלחימה ולהגדיר מצלמת וידאו להקלטה מלמעלה.
איור 5. הכנת תא הלחימה הבודד. כוס מזון מוכנה הטרי עם נקודה של שמרים להדביק על פני השטח קבועה לאינטרנט אלחוטי בודד שטףהנלחם תאים. תאים סגורים עם מכסה שני חלקים המאפשר החדרה של מחיצת פלסטיק אטומה לתאי לחימה בודדים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
4. יום 7: ניסוי התנהגות
- בצע את הניסויים התנהגותיים עם זבובי זכרים 6-7 יום-ישנים.
- הכנס חוצצים פלסטיק לכל תא לחימה.
- הסר את תקע הכותנה מצינור הבידוד ומקם את הצינור מתחת חור פתוח בצד של המכשיר.
- בואו לטוס להיכנס לתוך תא הלחימה על ידי geotaxis השלילית, בדרך כלל תוך מספר שניות.
- סגור את הקיר הזזה אחרי הזבוב עזב את הצינור ונכנס לחדר.
- חזור על התהליך כדי להציג את הזבוב השני לתוך תא המאבק בצד השני של המכשיר האחר.
- מניחים את המכשיר בחזרה בvideotapi המוארעמדת ng.
- להתחיל בהקלטת וידאו ולהסיר את מחיצת הפלסטיק כדי לאפשר זבובים כדי האינטראקציה.
- לניסויים בתוקפנות:
- בניסויים אלה, שיא נלחם על לפחות 20 דקות כדי להבטיח את היווצרות יחסי דומיננטיות חזקות.
- לאחר הזמן הרצוי, להפסיק את הקלטת וידאו.
- הסר זבובים מתאי הלחימה על ידי היפוך ההליך שתואר לעיל.
- ביסודיות לשטוף את מנגנון ההתנהגות עם חומר ניקוי עדין ומים לאחר כל שימוש ולשטוף.
- לניסויים באפקט "לוזר":
הערה: בניסויים אלה, קרבות הראשונים נחשבים כשלב אוויר והקרבות שני כשלב בדיקה. תקופה של מנוחה בין הקרבות יכולה להיות שונה, אבל 10 דקות מאפשרת היווצרות אפקט "לוזר" חזק.- בצע את ההליך המתואר לעיל לבצע קרב ראשון.
- שלב קריטי: כדי לגרום להיווצרות של "לוזר" מנטליות, דוארNsure שהקרבות הראשונים הם לפחות 20 דקות ארוכות על מנת ליצור קשרים דומיננטי חזקים. לאחר 20 דקות, הכנס מחדש את מחיצת הפלסטיק לתוך תאי לחימה להפריד זבובים.
- לאחר תקופה של 10 דקות של מנוחה, בעדינות להסיר את מחיצת הפלסטיק כדי לאפשר זבובים לאינטראקציה לקרבות שני.
- בסופו של מאבק 20 דקות השניה, לעצור את הקלטת וידאו.
- הסר זבובים מתאי התנהגות כאמור לעיל.
- שוב, לנקות ביסודיות את מנגנון ההתנהגות.
- לניסויים בתוקפנות:
5. ניתוח התנהגות
- העברת סרטים
- חבר מצלמות למחשב.
- המרת .MTS זבובים ל.mov זבובים ולהצטרף קטעי סרטים יחד, באמצעות תוכנת המרת וידאו והאפשרות "להצטרף קטעים נבחרים".
- להתבונן ולנתח כל סרט עם תוכנת וידאו קורא.
- התנהגות הבקיע
הערה: ניתן לעשות זאת באופן ידני אוing תוכנת ניתוח התנהגות אם זמין. האיור הבא מתאר ניתוח ידני אפשרי להשפעה "לוזר".- ציון הזמן של המפגש הראשון בין הזבובים על כוס המזון (מפגשים הם יחסי גומלין בין זוגות של זבובים שיימשכו לפחות 2 שניות) ואת הזמן של הופעה של נגיחה הראשונה (דפוס התנהגות שבו זבוב אחד עולה גבוה עליה רגליים ואחוריות תינעל על ומנסה לתפוס את היריב). לאחר מכן, להבקיע חביון לזנק (המרווח בין המפגש הראשון והנגיחה הראשונה).
- לספור את המספר הכולל של מפגשים וגיחות במהלך קטטה.
הערה: אם תרצו, אפשר גם להבקיע דפוסי התנהגות אחרים, כמו איום הכנף, אגרוף, גידור, נסיגה או מספרים של מפגשים לפני הזינוק הראשון, למשל. - ציון הזמן של הקמת דומיננטית (הזמן בין המפגש הראשון והזמן שבו אחד לטוס נסוג לשלוש פעמים ברציפות את הגביע מאחור מזוןאה קבלת lunges). הערה שעפה היא המנצח והמפסיד בי של המאבק.
- חישוב אפקט "לוזר"
- מחלקים את מספר הקרבות שבי מפסידים קודמים לאבד 2 קרבות nd (מפסידנים שמאבדים: LL) במספר הכולל של קרבות, ולהכפיל ב -100 אחוז שהושג מייצג את ההשפעה "לוזר":
[(# עף LL) / (# מאבק כולל)] x 100 - השתמש במבחן צ'י מרובע כדי להשוות אם האפקט "לוזר" הוא שונה מבחינה סטטיסטית מהערך הצפוי של 50%.
- מחלקים את מספר הקרבות שבי מפסידים קודמים לאבד 2 קרבות nd (מפסידנים שמאבדים: LL) במספר הכולל של קרבות, ולהכפיל ב -100 אחוז שהושג מייצג את ההשפעה "לוזר":
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
סעיף זה מציג את העיצוב של החדר התנהגותיות והניתוח של קבוצה טיפוסית של ניסויים התנהגותיים הבאים הפרוטוקול שתואר לעיל מדידת תוקפנות ואת היווצרות אפקט "לוזר". גם מאויר הן דוגמאות של התנהגויות אחרות שניתן למדוד באמצעות מנגנון זה.
איור 6 מציג ייצוג סכמטי של המנגנון החדש. המנגנון מורכב משלוש בארות גליליות (ממד: 22.86 מ"מ קוטר, 17 גובה מ"מ) שהם תאי הלחימה. כיסוי שני החלקים סוגר את תאי הלחימה בחלק העליון ומאפשר החדרה של מחיצת פלסטיק אטומה דקה שמפצלת את התאים לשני חלקים שווים. בכל צד של המנגנון, קירות זזים עם שלושה חורים (15.88 מ"מ קוטר) לאפשר טעינה של זבובים לתאי הלחימה על ידי geotaxis השלילית ישירות מבקבוקוני בידודם. לאחר זבובים להיכנס לתאי הלחימה, הקירות זזים הם שימושד כדי לסגור את הצדדים של כל התאים. בשלב זה, שני הזבובים נמצאים בזירות הקרב, אבל לא יכולים לקיים אינטראקציה בשל המחיצות. על ידי הסרת אלה, הזבובים חופשיים אינטראקציה ויכולים להיות שנצפו דפוסי התנהגות שלאחר מכן ונרשמו.
ניסויי תוקפנות: 38 קרבות בין הזוגות של הזכרים CS סוג בר בוצעו. פרמטרים התנהגותיים שונים הובקעו תוך זבובים היו על כוסות מזון והדינמיקה של קרבות נותחו (טבלה 1). ממוצע של 24 מפגשים (מפגשים קצרים בין זבובים), 54 גיחות (מחוון של לחימה בעצימות גבוהה יותר) נצפה במהלך תקופת זמן של 20 דקות, עם נגיחה 1 בדרך כלל מועברת במפגש 2 nd. בממוצע, מפגש 1 st, נגיחה -1 ואת הזמן כדי לבסס את הדומיננטיות נראו 2, 4 ו -8 דקות לאחר תחילת ההקלטה. ברוב המקרים, 12 דקות האחרונות של קרבות מורכבים של רצפים חוזרים ונשנים של enco בעוצמה הגבוהunters עם בעלי חיים כפופים מתקרבים, שהותקפו ונסוג, חיזוק הדומיננטי או כנוע מעמד של כל חיה.
ניסויי אפקט "לוזר": כדי לחפש את היווצרות אפקט "לוזר", 21 1 קרבות רחוב של 20 דקות משך בוצעו בין הזוגות של זכרים CS סוג בר. מחיצת התא הזזה אז הוכנסה להפריד זבובים. לאחר 10 דקות, 2 nd 20 קרבות דקות בוצעו בין (א) מפסידים קודמים וזוכים מוכרים או (ב) מפסידים קודמים וזוכים לא מוכרים ואלה נותחו כאמור לעיל (איור 7). בשני התנאים, 20 מפסידים קודמים איבדו 2 הקרבות שלהם nd (95.5%), הוכחת השפעה "לוזר" חזקה. תוצאות הקרב היו בהשוואה לערך הצפוי של 50-50 עם ניתוח צ'י מרובע שני זנב והשפעה "לוזר" משמעותית ביותר נמצא. שינויים התנהגותיים אחרים נצפו במאבדים אנשיםבין רח '1 ו -2 nd נלחם מלווה את היווצרות האפקט "לוזר" 5.
התנהגויות אחרות מאשר תוקפנות ניתן ללמוד במנגנון: כדי להמחיש, ניסויי חיזור והתנועה בוצעו (T מסוגל 2). לחיזור, זבובי זכר ונקבה הועמסו על ידי geotaxis השלילית לתאי ההתנהגות, מחיצות הוסרו ודפוסי התנהגות חיזור הובקעו. 34 ניסויים בוצעו והשיהוי לבית המשפט (זמן בין המפגש 1 והתנהגות חיזור 1 = 7 שניות) ולהזדווג (זמן בין המפגש 1 והזדווגות = 4 דקות) נותח. רק 2 זכרים לא הצליחו מזדווגים בזמן 15 דקות של התבוננות. חיזור Vigor המדד (את החלק היחסי של זמן שגברים בילה חיזור נקבות במהלך תקופת 15 דקות לאחר דפוס התנהגות חיזור 1), נכבש ב 75% (טבלה 2). לתנועה או חטאGLE זבובים או קבוצה של 10 זבובים הוכנסו לתאי ואת המספר הכולל של מעברי קו האמצע במהלך 5 דקות נספר. זבובים יחיד לחצות את קו האמצע של החדר על 73 פעמים בממוצע במהלך 5 דקות, ואילו זבובים בודדים בקבוצות לחצות את קו האמצע על 45 פעמים / 5 דקות ממוצעת (טבלה 2). ירידה זו נצפתה כאשר זבובים נמצאים בקבוצות יכולה להיות מוסברת על ידי המרחב המופחת זמין לזבוב ועד שהם מבלים באינטראקציה אחד עם השני במקום לחקור את השטח.
איור 6. ייצוג סכמטי של התא התנהגותיות. (א) להציג צד של המנגנון. המנגנון החדש מורכב משלושה חלקים נפרדים: (א) בלוק פלסטיק המכיל שלושה אנשים נלחמים תאים; (ב) שני קירות זזים עם שלושה חורים (15.88 מ"מ קוטר) בכל אחד; וכיסוי שני חלקים בחלק העליון (ג). (ב) למעלהתצוגה של המכשיר. הממדים של גוש הפלסטיק (א) הם 36.83 מ"מ על ידי 123.19 מ"מ. כל תא לחימה אדם יש קוטר של 22.86 מ"מ וגובה של 17 מ"מ. יש חורים בצד שיאפשר הטעינה של הזבובים בקוטר של 15.88 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 7. היווצרות אפקט "לוזר" חזק. השפעה משמעותית "לוזר" (אחוז המפסידים שמאבדים 2 nd נלחם נצפה כאשר מפסידים קודמים לזווג (א) עם זוכים מוכרים (n = 21, p *** <0.0001) או (ב) עם זוכים לא מוכרים עבור 2 nd הקרבות שלהם (n = 21, *** p <0.0001) (הפסד: 95.5%, זכה ב:. 4.5%, לא מושך) Plלהקל לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| פרמטרים התנהגותיים | יחידה | זמן (שניות) | n |
| מפגשים | 24 ± 2 | 38 | |
| Lunges | 54 ± 6 | 38 | |
| מספר המפגשים לפני נגיחה 1 | 2 ± 0.3 | 38 | |
| זמן של המפגש 1 | 145 ± 20 | 38 | |
| זמן של נגיחה 1 | 229 ± 26 | 38 | |
| זמן של דומיננטיות | 475 ± 56 | 34 | |
| חביון לזנק | 87 ± 20 | 38 | |
| חביון לדומיננטיות | 342 ± 51 | 34 |
טבלת 1:. ערכי דינמיקה של אינטראקציות התגוששותית בין הזוגות של זבובי זכרי ממוצע ± SEM מחושבים עבור כל פרמטר הבקיע כאינדיקטורים של תוקפנות. המספר הכולל של מפגשים וגיחות, והמספרמפגשים לפני נגיחה 1 הובקעה. זמנים של המפגש 1, נגיחה והדומיננטיות 1, והשיהוי לזנק ולדומיננטיות מוצגים בשניות ± SEM (n> 34).
| פרמטרים התנהגותיים | זמן (שניות) | יחידה | (%) | n |
| התנהגות חיזור | ||||
| חביון לבית המשפט | 7 ± 3 | 34 | ||
| חביון להזדווג | 273 ± 62 </ Td> | 32 | ||
| חיזור Vigor אינדקס | 75 ± 0.05 | 34 | ||
| תְנוּעָה | ||||
| צלבים סה"כ קו האמצע (זבוב אחד) | 73 ± 4 | 48 | ||
| צלבים סה"כ קו האמצע (קבוצה של זבובים) | 45 ± 3 | 20 |
טבלת 2:. ערכי ניתוח של התנהגות חיזור ותנועה ממוצעת ± SEM מחושבים לשיהוי לבית משפט ולהזדווג (בשניות). מדד מרץ החיזור(ב% מהזמן בילה חיזור אחרי תצוגת חיזור 1), נכבש אחרי זכרים ונקבות הועמסו תאי התנהגות ידי geotaxis השלילית (n> 32). תנועה, כאשר זבובים או קבוצות של 10 זבובים אחת הועמסו תאים, נכבש על ידי ספירת המספר הכולל של מעברי קו האמצע במהלך 5 דקות (n = 48 ו -20).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
העידן המודרני של שימוש בשיטות גנטיות תסיסנית החזקה שלה כאורגניזם מודל לחקר התוקפנות החל לפני כתריסר שנים עם ההקדמה של זירות ניסיוניות רומן שבו ניתן הייתה לקבל אמינה התנהגות לחימה עם זוגות בודדים של זבובים 1,7, 8,17,19. זירות אלה כללו משאבים רצויים (כוס מזון, בני זוג פוטנציאליים) ומקום לוזר עף לסגת ל. כאשר תוצאות שהושגו עם זירות אלה נוספו לידיעה קודמת על זבוב פירות התנהגות מאבק, melanogaster תסיסנית הוקם בתקיפות כמערכת מודל רצויה מאוד לבחינת התנהגות מורכבת כמו תוקפנות ומשמש במעבדות רבות. התוצאות שהתקבלו עולות כי סיכמו: (א) זבובי תוקפנות תערוכה בתחרות על משאבי מזון, גישה לבני זוג או להגנת על השטח 14,15; קרבות (ב) מורכבים מסדרה רציפה של דפוסי התנהגות סטריאוטיפיים 1; (ג)זבובי זכרים ונקבות להילחם באותו זיווגים מין (כמה דפוסים ספציפיים גברי, חלקם נשים ספציפיות וחלקם משותף לשני המינים) 17; רק קרבות זכר (ד) ללכת לרמות עוצמה גבוהות ולגרום להיווצרות של יחסים היררכיים עם ברור «המנצח» ו «וזר» עף 17; (ה) גן יחיד עקר, של היררכית קביעת מין, קובע אם זבובים להילחם כמו גברים או נשים 16 ו- (ו) חומרים הורמונליים מרובים כולל אמינים ופפטידים להשפיע תוקפנות בזבובי פירות 7,8,19,20.
כאן, גישה חדשנית מתוארת לחקר זבוב הפירות תוקפנות שבטיפול בזבובים במהלך הניסויים מתבטל. זו מציעה שיפור משמעותי בפרוטוקול הניסוי ככל המדידות התנהגותיות הם השתפרו 5,6, מידע חדש הנוגע להתנהגות כבר צבר והלמידה והזיכרון שמלווהקרבות זבוב זכר הוא השתפר מאוד. לשם המחשה, רק שני מחקרים קודמים דיווחו ההיווצרות של תופעות "לוזר" ב3,4 מערכת מודל זה. בשני אלה, תאים גדולים יותר מאלה שתוארו בפרוטוקול זה שמשו, זבובים הועברו לתוך ומחוץ לזירות קרב על ידי שאיפה, ופעמים יותר מאבק ופעמים מרווח בין הקרבות היו הכרחיות כדי ליצור אפקטים "לוזר" ברורים. המחקר שנערך לאחרונה שלנו הוכיח כי ביטול טיפול מפרוטוקול הניסוי, יחסי דומיננטיות ברורים בין הזוגות של ד זבובי זכרי melanogaster הם נצפו רק לאחר 20 דקות של אינטראקציה. סכום זה זמן מספיק כדי לגרום לשינויים משמעותיים באסטרטגיות לחימה בשני הזבובים במהלך קרבות 1 st ולצפות את ההיווצרות של השפעות חזקות "לוזר" בקרבות 2 nd באופן מהימן. בנוסף, בפעם הראשונה, השפעות "זוכה" לטווח קצר ברור גם שנצפו במהלך 2 ndנלחם 5,6.
להצלחה תוך שימוש בפרוטוקול זה, כמה נקודות קריטיות צריכים לציין. כדי לגרום וללבחון דפוסי התנהגות אגרסיביים חזקים אנו ממליצים להשתמש 6-7 זבובי זכרי בני יומם שכבר הוחזקו בבידוד חברתי מאז השלב מאוחר גלמים. באופן כללי, את הזמינות של משאבים שעפה מוכנות להתחרות על (מזון, בני זוג) רצוי מאוד כדי להשיג חזקה התנהגות לחימה והקמה של מערכות יחסים דומיננטיות. במהלך פרוטוקול זה, זבובים צבועים לאחר הרדמה באמצעות CO 2, ושעשויים להיות של דאגה כמו המחקר שפורסם לאחרונה שלנו מראה כי הרדמה זבובים מפריעה ברצינות עם התנהגות 5 שלאחר מכן. דרכים אפשריות כדי להימנע מהרדמה עשויות להיות לא לצייר בעלי חיים, אם זה לא חשוב לעקוב אחר אנשים. אם הציור הוא הכרחי, עם זאת, יש להשתמש בהרדמה 48 שעות לפני בעלי החיים המשמשים לניסויים, או גישות חלופיות לזהותאנשים גם עשויים לשמש 31. כדי לגרום "לוזר" חזק ואפקטים "מנצח", זה קריטי, כי זבובים להקים ולקיים מערכת יחסים דומיננטיות בקרבות הראשונים. בפרוטוקול שהוצג כאן, באמצעות מתח CS wild-type של 25 מעלות צלזיוס, 20 דקות של אינטראקציה היא מספיק כדי ליצור "זוכים" ברורים ו" מפסידים "ולצפות לשינויים באסטרטגיות המאבק של שני האנשים. בניסויים שבוצעו בטמפרטורות שונות מ -25 מעלות צלזיוס או עם גנוטיפים אחרים מאשר CS, עם זאת, הזמן הממוצע להקמת מערכת יחסים דומיננטי חזקה עשוי להיות שונה. בהתאם לכך, תקופת הלחימה צריכה להיות מותאמת על ידי ביצוע סטים של ניסויים ראשוניים. לבסוף, איך זוגות של זבובים מופרדים לאחר הקרבות הראשונים שלהם עשוי להיות חשוב בשימור הזיכרון של תוצאות מאבק. זה כנראה חשוב לצמצום תנועה של המנגנון ולהיות עדינים בכניסתה של מחיצת הפלסטיק כדיכדי למזער את ההפרעה של בעלי החיים.
העיצוב של המכשיר ואת כיסוי שני חלקים המאפשר הפרדה של תאי ההתנהגות לשני תאים שווים, לעשות את זה קל להפריד בין שני הזבובים לאחר הקרבות הראשונים ולהציג את היריבים חדשים ב 2 nd קרבות. כמו כן, כפי שמוצג בטבלה 2, עם התאמות קטנות של פרוטוקול הניסוי, אותו המנגנון יכול לשמש כדי ללמוד חיזור, תנועה או אכן רוב התנהגויות זבוב פירות במה צריך להיות תנאים פחות מלחיצים עבור חיות ניסוי. שיפורים נוספים אפשריים בהליך עשויים להיות להציג סוג מסוים של שליטת תרמוסטטי למנגנון (אלמנט פיזואלקטריים או סליל להסתובב נוזל בטמפרטורה מבוקרת) כדי לאפשר שימוש קל של חומרים כימיים רגישים לטמפרטורה (TS1 shibire, ערוץ dTRPA1).
לסיכום, יש לנו המצאתי מכשיר חדשני שמציע אסטרטגיה חדשה לחקר אני תוקפנותn זבובי פירות שבי טיפול בזבובים לפני, במהלך ואחרי ניסויים חוסלו. כל האמצעים התנהגותיים הם השתפרו עם המנגנון החדש בהשוואה לכמה דרכים נפוצות אחרות של טיפול בזבובים. אולי הערה כללית יותר לעשות היא שבעצם כל הניסויים התנהגותיים בסביבות מעבדה כרוכות הנסיינים להרים או בדרכים אחרות, טיפול בבעלי חיים. למרות מאמצים להיות עדינים בטיפול זה, זה עשוי להיות מלחיץ עבור בעלי החיים. זה יכול להיות שימושי להמציא שיטות לחסל טיפול זה בכל ההזדמנות אפשרית, כדי שבעלי חיים יכולים להיות שנצפו תחת מעט יותר תנאים רגילים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהמכון הלאומי למדעי רפואה כלליים (GM099883 וGM074675) לeak היו הממנים לא היה תפקיד בעיצוב מחקר, איסוף נתונים וניתוח, החלטה לפרסם, או הכנה של כתב היד. אנו מודים לאנשים מהמכונה החנות שלנו בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת הרווארד לעיצוב של המנגנון התנהגותי (קשר: http://mikesmachine.com).
תרומות מחבר: ST, לפני הספירה נועדו מנגנון ההתנהגות. ST תוכנן ומותאם פרוטוקול הניסוי. ST ולפנה"ס בוצעו וניתחו את הניסויים. ST, eak ולפנה"ס כתב העיתון.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila melanogaster pupa | Bloomington Stock Center | ||
| Standard fly food | Fabricated in-house. | ||
| Behavioral chambers | Mike machine | Fabricated in-house. Directly contact the compagny for more informations. | |
| Borosilicate glass vials | VWR International | 47729-576 | 16 x 10 mm |
| Cotton | Fisherbrand | 22-456-881 | Any brand can be used |
| Pasteur pipettes | VWR International | 53300-567 | |
| Paintbrush | Blick Art Material | 06157-7030 | Round , Size 3/0 |
| Toothpick | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Acrylic paint (blue/white) | Blick Art Material | 01637-5172/01637-1022 | Any brand can be used |
| Dry active yeast | Sigma | YSC2-500G | |
| Srew cap tube | VWR International | 10011-394 | 15 mm diameter, 10 mm height |
| Eppendorf | VWR International | 22363212 | |
| Tape | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Plastic slices | Electron Microscopy Sciences | 70329-40 | 22 x 40 x 0.25 mm Thickness |
| Light source (bulb) | VWR International | 500003-418 | Any brand can be used |
| Timer | VWR International | 62344-641 | Any brand can be used |
| Incubator | Percival | Directly contact the constructor for more informations. | |
| Carbon Dioxide Dry (CO2) | Medical-Technical Gases, Inc | 14H31 | |
| Binocular | Nikon | SMZ-745 | Any brand can be used |
| Camera (SONY Handycam HDR-CX330) | B&H | SOHDRCX330B | Any brand can be used |
| Computer | With a minimum of 1.4 Ghz Processor, running Microsoft Windows or Machintosh HD | ||
| ClipWrap | Download online | Any importing software can be used | |
| QuickTime Player | Download online | Any reading software can be used | |
| GraphPad Software | Online | Any statistical software can be used |
References
- Chen, S., Lee, A. Y., Bowens, N. M., Huber, R., Kravitz, E. A. Fighting fruit flies: a model system for the study of aggression. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 5664-5668 (2002).
- Hsu, Y., Earley, R. L., Wolf, L. L. Modulation of aggressive behaviour by fighting experience: mechanisms and contest outcomes. Biol Rev Camb Philos Soc. 81, 33-74 (2006).
- Yurkovic, A., Wang, O., Basu, A. C., Kravitz, E. A. Learning and memory associated with aggression in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 17519-17524 (2006).
- Penn, J. K., Zito, M. F., Kravitz, E. A. A single social defeat reduces aggression in a highly aggressive strain of Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 12682-12686 (2010).
- Trannoy, S., Chowdhury, B., Kravitz, E. A. Handling alters aggression and 'loser' effect formation in Drosophila melanogaster. Learn Mem. 22, 64-68 (2015).
- Trannoy, S., Kravitz, E. A. Learning and memory during aggression in Drosophila: handling affects aggression and the formation of a ''loser'' effect. Journal of Nature and Science. 1 (3), e56 (2015).
- Alekseyenko, O. V., Chan, Y. B., Li, R., Kravitz, E. A. Single dopaminergic neurons that modulate aggression in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 6151-6156 (2013).
- Dierick, H. A., Greenspan, R. J. Serotonin and neuropeptide F have opposite modulatory effects on fly aggression. Nat Genet. 39, 678-682 (2007).
- Williams, M. J., et al. Regulation of aggression by obesity-linked genes TfAP-2 and Twz through octopamine signaling in Drosophila. Genetics. 196, 349-362 (2014).
- Chase, I. D., Bartolomeo, C., Dugatkin, L. A. Aggressive interactions and inter-contest interval: how long do winners keep winning? Anim. Behav. 48, 393-400 (1994).
- Goessmann, C., Hemelrijk, C., Huber, R. The formation and maintenance of crayfish hierarchies: behavioral and self-structuring properties. Behav Ecol Sociobiol. 48, 418-428 (2000).
- Sturtevant, A. H. Experiments on sex recognition and the problem of sexual selection in Drosophila. J Animal Behav. 5, 351-366 (1915).
- Jacobs, M. E. Influence of light on mating of Drosophila melanogaster. Ecology. 41, 182-188 (1960).
- Dow, M. A., von Schilcher, F. Aggression and mating success in Drosophila melanogaster. Nature. 254, 511-512 (1975).
- Hoffmann, A. A laboratory study of male territoriality in the sibling species Drosophila melanogaster and D. simulans. Anim. Behav. 35, 807-818 (1987).
- Vrontou, E., Nilsen, S. P., Demir, E., Kravitz, E. A., Dickson, B. J. fruitless regulates aggression and dominance in Drosophila. Nat Neurosci. 9, 1469-1471 (2006).
- Nilsen, S. P., Chan, Y. B., Huber, R., Kravitz, E. A. Gender-selective patterns of aggressive behavior in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 12342-12347 (2004).
- Fernandez, M. P., Kravitz, E. A. Aggression and courtship in Drosophila: pheromonal communication and sex recognition. J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol. 199, 1065-1076 (2013).
- Alekseyenko, O. V., et al. Single serotonergic neurons that modulate aggression in Drosophila. Current biology : CB. 24, 2700-2707 (2014).
- Asahina, K., et al. Tachykinin-expressing neurons control male-specific aggressive arousal in Drosophila. Cell. 156, 221-235 (2014).
- Andrews, J. C., et al. Octopamine neuromodulation regulates Gr32a-linked aggression and courtship pathways in Drosophila males. PLoS genetics. 10, e1004356 (2014).
- Zwarts, L., et al. Complex genetic architecture of Drosophila aggressive behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 17070-17075 (2011).
- Dierick, H. A. A method for quantifying aggression in male Drosophila melanogaster. Nat Protoc. 2, 2712-2718 (2007).
- Wang, L., et al. Hierarchical chemosensory regulation of male-male social interactions in Drosophila. Nat Neurosci. 14, 757-762 (2011).
- Davis, S. M., Thomas, A. L., Nomie, K. J., Huang, L., Dierick, H. A. Tailless and Atrophin control Drosophila aggression by regulating neuropeptide signalling in the pars intercerebralis. Nat Commun. 5, 3177 (2014).
- Yuan, Q., Song, Y., Yang, C. H., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Female contact modulates male aggression via a sexually dimorphic GABAergic circuit in Drosophila. Nat Neurosci. 17, 81-88 (2014).
- Perron, J. M., Huot, L., Corrivault, G. W., Chawla, S. S. Effects of carbon dioxide anaesthesia on Drosophila melanogaster. J Insect Physiol. 18, 1869-1874 (1972).
- Joachim, D., Curtsinger, J. W. Genotype and anesthetic determine mate choice in Drosophila melanogaster. Behav Genet. 20, 73-79 (1990).
- Barron, A. B. Anaesthetising Drosophila for behavioural studies. J Insect Physiol. 46, 439-442 (2000).
- Greenspan, R. J. Fly Pushing: The theory and Practice of Drosophila Genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. (1997).
- Cabral, L. G., Foley, B. R., Nuzhdin, S. V. Does sex trade with violence among genotypes in Drosophila melanogaster? PLoS One. 3 (4), e1986 (2008).
