Summary
Во фруктов летать бои, поведенческие паттерны наблюдается, бороться динамику, и связано обучения и памяти находятся под влиянием экспериментальных условиях. Протокол, представленные здесь описывает новый порядок, что полностью исключает обработку мух в ходе экспериментов. Это улучшает динамику и позволяет бороться формирование сильных "неудачник" эффектов.
Abstract
Агрессивное поведение в дрозофилы состоит из последовательного выражения стереотипных поведенческих (для анализа см 1). Этот комплекс поведение под влиянием генетических, гормональных и экологических факторов. Как и во многих организмов, предыдущий опыт боевых влияет на стратегию борьбы мух и результаты более поздних конкурсах: поражение в бою повышает вероятность потери поздние конкурсы, выявление "неудачник" эффекты, которые, вероятно, включают в себя обучение и память 2-4. Обучение и память, которая сопровождает выражение сложных социальных поведения, как агрессия, чувствителен к предварительно тест обработку животных 5,6. Многие экспериментальные процедуры используются в различных лабораториях для изучения агрессии 7-9, однако, не регулярно используется протокол, который исключает обращение мух настоящее время доступна. Здесь мы приводим новую поведенческую аппарат, который устраняет обработки мух, используя instead их врожденные отрицательные ответы geotactic двигаться животных в или из боевых камер. В этом протоколе, небольшие круглые борьба арен, содержащие пищевой чашку делятся на две равные половины съемной пластмассовой ползуна до введения мух. Мухи ввести камеры от их дома изоляции флаконах с помощью раздвижных дверей камеры и geotaxis. После удаления пластиковых ползунков, мухи свободно взаимодействовать. После определенные периоды времени, мухи отделены снова ползунков для последующего эксперимента. Все это делается легко, без обработки отдельных мух. Этот аппарат предлагает новый подход к изучению агрессии и связанный обучения и памяти, в том числе формирование "неудачник" эффектов в лету боев. Кроме того, эта новая универсальная поведенческая установка может быть использована для изучения других форм социального поведения мух и должны, в общем, представляет интерес для исследования опыта связанных изменения в основных поведенческих процессов.
Introduction
Агрессия в системах животных сильно связано с приобретением и проведения таких ресурсов, как продовольствие, территории и товарищей. Учитывая важную роль в этом играет в пригодности лиц, это не удивительно, что агрессия превратилась по животном царстве. Как адаптивного признака, что непосредственную пользу лиц, сильная обучения и памяти компонент, связанный с агрессией. В конкурсе по социальной ранга, предыдущий опыт боевых влияет на исход последующих конкурсах. В целом, предыдущие проигрышные увеличивается опыт, и опыт победы уменьшается вероятность потерять поздние конкурсы (так называемый "неудачник" и "Победитель" эффекты). "Неудачник" эффекты наблюдались в широком диапазоне видов, и некоторые отчеты предполагают, что они могут длиться в течение нескольких дней, пока "Победитель" эффекты, как правило, имеют более короткий срок 2,10,11.
Первый доклад агрессивного поведенияу плодовых мушек (Д. ampelophila) был по Расин в 1915 году в статье, связанных с распознаванием секс и выбор пола 12. Полвека спустя, более полные исследования мужского плода летать агрессии были сделаны, что описано большинство поведенческих наблюдаемых во время боев плодовой мухи. Эти эксперименты, выполненные в основном в небольших группах мужчин и женщин мух наблюдается в течение часа 13-15. Недавно, с добавлением мощных генетических инструментов, двоичных одиночных установок секс бороться и коротких времен наблюдения, D. MELANOGASTER стала важной модельной системы для изучения биологии агрессии 1,16. Анализ боев между однополыми парами мужских и женских мух показал, что агрессия предполагает стереотипные модели поведения, что переход от одного к другому в статистически надежным способом 1,17. Некоторые из поведенческих моделей, наблюдаемых в конкретных пол, а другие наблюдаются в борьбес в обоих полов. Мужской бои идут на более высокие уровни интенсивности, чем женщин боях и в результате формирования доминирования отношений с четкими «победителей» и «проигравших». В настоящее время многие лаборатории начали расследование биохимического 18, нервной 7,19-21 и генетических основ 22 агрессии. К сожалению, мета-анализ исследований, чтобы разобраться в динамике боя и формирование и поддержание отношений доминирования является проблематичным из-за использования множества экспериментальных процедур в различных лабораториях. По существу все из методов, описанных в литературе включают обработку и манипулирование мух ввести их в арен 19,23,24 и во время эксперимента поведенческой 3,4 передать вылетает из арен. Нежный стремление является наиболее распространенным способом для манипулирования летит 3,4,23-25, но холодные или CO 2 анестезии используются также 9,26, хотя рrevious исследования уже сообщили, что эти процедуры имеют вредное воздействие на лету поведения 27,28. Период, по крайней мере 24 часов Рекомендуется после использования каких-либо анестетиков, чтобы минимизировать их влияние на поведение 29,30.
Мухи узнать из предыдущего опыта боевого и изменять их поведения использование шаблонов в новых ситуациях, предполагая, что обучения и памяти сопровождать и последствия агонистических встреч. В этом смысле, летать бои напоминают учебных ситуаций оперантного кондиционирования, в которых летит узнать, что стратегия работала, а затем использовать его все чаще и чаще в течение последующих встреч. Мухи изменить свои стратегии борьбы после доминирования отношения были установлены в ходе боев с победителями выпад больше и проигравшие все меньше и меньше. После периода разделения, предыдущие неудачники показать гораздо более покорное поведение и, весьма вероятно, потерять 2-й борется, когда в паре с наивной Флоридах годов или предыдущих победителей 3,4. Тем не менее, отсутствие экспериментальной процедуры, исключает обработки мух сделал детальные исследования "неудачник" эффектов трудно. В недавнем исследовании мы сравнили два экспериментальных процедур, обычно используемые в лабораториях (аспирации и холодной анестезии), чтобы ввести мух в поведенческих камер с новой процедурой, которая устраняет обработку. Результаты показали, что холодной анестезии было гораздо больше негативных последствий, чем на агрессии стремление, но даже стремление уменьшить уровень агрессивности мухами. Стремление не менее, вызывают высоко значительное воздействие на обучение и память, которые сопровождают агрессию. После идентичный протокол с двумя экспериментальными методами (аспирационных и не регулировать), надежный "неудачник" эффект наблюдался только, когда обращение мух выбыл из экспериментальной процедуры 5,6.
В идеале, исследования Drosophila агрессии в Laboratories должны включать экологические ситуации, которые обычно сталкиваются летит в дикой природе (конкуренции за ресурсы, территорию, чтобы защитить и пространство, чтобы избежать). Кроме того, экспериментальные условия должны быть оптимизированы, чтобы надежно индуцируют, наблюдать и интерпретировать поведение при рассмотрении (стараются свести к минимуму обработку животных, ограничить использование СО 2 в качестве анестезирующего средства, и стандартизировать экспериментальные процедуры). В попытке охватить большинство или все из этих вопросов, мы разработали новую поведенческую аппарат, который устраняет обработки мух до, во время и после введения их в поведенческих аренах. С этих аппаратов, мухи использовать их врожденные негативные geotaxis быть перемещены и передается в и из борьбы камер. Устраняя обработку мух, протокол направлен на: (а) уменьшить поведенческий вариабельность физических лиц; (б) уменьшить время, необходимое для мух, чтобы взаимодействовать и создавать четкие отношения доминирования (мужчины); и (с) побудить надежно достаточно сильный behavioRAL изменения, чтобы образование "неудачник" эффектов.
Этот протокол описывает новую экспериментальную установку и шаг за шагом процедуры для анализа агрессию и позволить формирование сильной "неудачник" эффекта в D. MELANOGASTER. Мы ожидаем, что это поведенческая установка может быть легко адаптирована для изучения других социальных поведений плодовых мушек.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Ниже шаг за шагом описание экспериментального протокола мы используем, чтобы надежно запуска агрессии между парами мужских плодовых мушек (дрозофилы). Эта процедура вызывает формирование «неудачника» эффекта. Используя этот протокол, краткосрочный "победитель" эффект также был недавно сообщили 5,6. Рисунок 1 показывает график поведенческих экспериментов.
Рисунок 1. Хронология агрессии эксперимента. 1 день, поздней стадии куколки мужчины (когда крылья становятся черными) изолированы в свежеприготовленных изоляции флаконах. На 5-й день после становится взрослым, 4 дня самцов мухи под наркозом с СО 2 и окрашены в разные цвета для целей идентификации. На 7-й день, пищевые чашки и боевые камеры являютсяготов установить поведенческие эксперименты. Два 6-7 дневных взрослые самцы загружаются в камерах и в состоянии взаимодействовать. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
1. День 1: Социальная изоляция из куколок
- Поднять и поддерживать запасы летать в экологически контролируемых 12 ч света / 12 ч инкубатора темно цикла при 25 ° С и 50% относительной влажности.
- Подготовка изоляции флаконов: Нагрейте свежие продукты летать до тех пор, пока растает. С помощью пипетки Пастера перенести приблизительно 1,5 мл талой пищи лету в отдельных пустых пробирки стекло (1,6 х 10 см). Разрешить еда затвердеть.
- Изолировать куколки: С тонкой кистью, аккуратно удалите мужской куколку поздней стадии (когда крылья становятся черными) с фондового флакона и поместить его на стороне свежеприготовленной пищи, содержащей пробирке. Закрыть изоляции флаконы с хлопком (рисунок 2).
Рисунок 2. Социальная изоляция. Один поздней стадии куколки мужчины находится на стороне, на свежеприготовленного флакона изоляции. Изоляционные флаконы, содержащие куколки помещаются в 12 ч света / 12 ч темноты инкубаторе при 25 ° С и 50% относительной влажности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
2. День 5: Живопись Мухи для индивидуальных целей идентификации
- Выполните этот шаг на 5-й день с 4-дневных самцов мух и двух дней до поведенческих экспериментов, чтобы свести к минимуму негативное воздействие СО 2 наркозом.
- Обезболить муху с CO 2. С тонкой зубочисткой, поместить маленькую точку акриловой краской на грудную клетку. Избегайте размещения краску на голове, крыльях, живот или ноги (рисунок 3).
- Пусть сохнет краска примерно 10 сек, и аккуратно перенести мух обратно в свои оригинальные флаконы изоляции.
- Возврат изоляции флаконы с 12 ч света / 12 ч темноты инкубаторе при 25 ° С и относительной влажности 50%.
Рисунок 3. индивидуальный идентификационный. После анестезии муху с CO 2, небольшую каплю акриловой краской наносится на грудную клетку. Для индивидуального идентификационного цели, используются различные цвета (белый и синий здесь). См обсуждение ниже об использовании CO 2 в этом шаге. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенное FIGUчисло рейнольдса
3. День 7: Подготовка Аппарат
- Подготовка Кубки Питание:
- Нагрейте свежие продукты летать, пока он не растает.
- С помощью пипетки Пастера перенести приблизительно 0,8 мл еду к крышке флакона с винтовой крышкой (1,5 см диаметром, высота 1 см) и дать остыть. Избегайте воздушных пузырьков.
- Сделайте свежие дрожжи, пасту путем смешивания сухих дрожжей с добавлением нескольких капель воды. Когда толстый, нанесите небольшое падение дрожжей пасты к центру поверхности пищевого чашки с зубочисткой (рис 4).
Рисунок 4. Подготовка пищевой чашку. Питание чашка приготовленные из свежих продуктов питания лету. После еды не затвердеет, точка дрожжей пасты находится в центре поверхности пищевого чашки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы противМЭН большую версию этой фигуры.
- Подготовка отдельных камер боя:
- Тщательно мыть устройство и отдельные боевые камеры с водой перед использованием каждый раз. Сухой бумажным полотенцем перед использованием.
- Поставьте чашку пищевой в центре каждого боевого камеры и зафиксировать на месте с помощью капли шпаклевки.
- Обложка боевые камеры с крышкой аппарата (рисунок 5).
- Поместите устройство в среде с высокой влажностью (60%) при 25 ° С.
- Поместите источник света над аппаратом, чтобы осветить боевые камер и установить видеокамеру для записи сверху.
Рисунок 5. Подготовка индивидуального боевого камеру. Свежеприготовленный чашки пища с точкой дрожжей пасты на поверхности фиксируется в индивидуальной промывают Fighting камеры. Камеры закрыты с двух частей крышки, позволяющей введение непрозрачного пластикового разделителя в отдельных боевых камер. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
4. День 7: Поведенческая Эксперимент
- Выполните поведенческие эксперименты с 6-7-дневных самцов мух.
- Вставьте пластиковые разделители в каждой боевой камеры.
- Извлеките ватный тампон из изолирующего трубу и положение трубки ниже открытом стволе на стороне устройства.
- Пусть мухи войти в боевой камере негативных geotaxis, как правило, в течение нескольких секунд.
- Закройте скользящую стену после муха оставил трубку и вошел в камеру.
- Повторите процедуру, чтобы ввести второй муху в бой камеры на другой стороне устройства.
- Поместите аппарат обратно в освещенной videotapiнг позиция.
- Начните запись видео и снять пластиковую перегородку, чтобы мухи, чтобы взаимодействовать.
- Для агрессии экспериментов:
- В этих экспериментах, запись борется за по крайней мере, 20 мин, чтобы обеспечить формирование прочных отношений доминирования.
- После требуемого времени, остановить запись видео.
- Удалить мух из боевого камер в обратном процедуре, описанной выше.
- Тщательно промойте поведения аппарат с мягким моющим средством и водой после каждого использования и полоскания.
- Для "Loser" эффект экспериментов:
Примечание: В этих экспериментах, первые бои считаются фазы кондиционирования и второй бои в качестве тестовой фазе. Период отдыха между боями может отличаться, но 10 мин позволяет формирование сильной "неудачник" эффект.- Выполните процедуру, описанную выше, чтобы выполнить первый бой.
- ВАЖНЫЙ ШАГ: индуцировать образование "неудачник" менталитет, еУбедитесь, что предприняты первые бои, по крайней мере 20 мин долго для того, чтобы установить прочные отношения доминирования. Через 20 мин, повторно вставить пластиковую перегородку в боевых камер, чтобы отделить мух.
- После 10-минутного периода покоя, аккуратно удалите пластиковую перегородку, чтобы мухи взаимодействовать для второго боя.
- В конце второй 20 мин борьбы, остановить запись видео.
- Удалить из поведенческих мух камер, как указано выше.
- Еще раз тщательно очистите поведения аппарата.
- Для агрессии экспериментов:
5. поведенческого анализа
- Передача видеофильмов
- Подключение камер к компьютеру.
- Преобразование мух .MTS в .mov мух и присоединиться фильмы клипы вместе, с использованием видео-преобразования программного обеспечения, а также возможность "присоединиться выбранные клипы".
- Наблюдать и анализировать каждый фильм с видео программное обеспечение для чтения.
- Забив Поведение
Примечание: это может быть сделано вручную или с намиING поведения программное анализ, если имеется. На рисунке ниже представлен возможный ручного анализа для "неудачник" эффект.- Оценка времени первой встречи между мухи на пищевой чашку (встречи являются взаимодействия между парами мух, которые длятся по крайней мере 2 сек) и время появления первого выпада (в модели поведения, в которых один муха поднимается высоко на его Задние ноги и встанет вниз на и пытается захватить противника). Затем, оценка задержки выпад (интервал между первой встрече и первом выпада).
- Подсчитать общее количество встреч и выпады во время боя.
Примечание: При желании, можно также набрать другие поведенческие модели, как крыло угрозы, бокс, фехтование, отступления или числа столкновений до первого выпада, например. - Оценка времени установления господства (время между первой встрече и время, когда один летать отступает три раза подряд от еды чашки кормовойэ получения выпады). Примечание который летать победителем и проигравшим, которые в борьбе.
- Расчет "неудачник" эффект
- Разделите количество боев, в которых ранее проигравшие теряют 2-й бои (проигравшие, которые теряют: LL) на общее количество боев, и умножить на 100. Процент, полученный представляет "неудачник" эффект:
[(# Летит LL) / (# общая борьба)] х 100 - Используйте хи-квадрат тест, чтобы сравнить ли "проигравший" эффект статистически отличается от ожидаемого значения 50%.
- Разделите количество боев, в которых ранее проигравшие теряют 2-й бои (проигравшие, которые теряют: LL) на общее количество боев, и умножить на 100. Процент, полученный представляет "неудачник" эффект:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этом разделе представлены дизайн поведенческой камеры и анализ типичного набора поведенческих экспериментов следуя протоколу, описанному выше измерения агрессии и формирование «неудачника» эффекта. Также проиллюстрированы образцы других поведения, которые могут быть измерены с использованием этого аппарата.
Фиг.6 показывает схематичное представление нового аппарата. Устройство состоит из трех цилиндрических скважин (размеры: диаметр 22,86 мм, 17 мм высота), которые являются боевые камеры. Из двух частей крышка закрывает боевые камеры сверху и позволяет вставлять тонкой непрозрачной пластиковой перегородки, что разделяет камер на две равные части. На каждой стороне аппарата, раздвижные стены с тремя отверстиями (диаметр 15,88 мм) позволяют загрузку мух в боевых камер отрицательными geotaxis непосредственно из их изоляции флаконах. После мухи введите боевые камеры, раздвижные стены использованиеd, чтобы закрыть боковые стороны всех камер. В этот момент, два мухи в борьбе арен, но не могут взаимодействовать за счет перегородок. Удалив эти мухи свободно взаимодействовать и последующие модели поведения могут наблюдаться и регистрироваться.
Агрессия эксперименты: 38 боев между парами дикого типа CS мужчин были выполнены. Различные поведенческие параметры оценивались в то время как мухи на кормушками и динамика боев были проанализированы (таблица 1). В среднем 24 встреч (краткие встречи между мух), 54 выпады (показатель высшего боевых интенсивности) наблюдались в течение периода времени 20 мин, с 1-го выпад, как правило, поставляется в течение 2-й встрече. В среднем, 1-й встречи, 1-й выпад и время, чтобы установить господство были замечены 2, 4 и 8 мин после начала записи. В большинстве случаев, за последние 12 мин боев состоят из повторяющихся последовательностей высокой интенсивности ENCOunters с подчиненные животных приближается, подвергается нападению, и отступая, укрепляя господство или покорное состояние каждого животного.
"Неудачник" эффект эксперименты: Для того, чтобы найти для формирования "неудачник" эффект, 21 1-й бои продолжительностью 20 мин проводились между парами дикого типа CS мужчин. Делитель камера скольжения затем был вставлен, чтобы отделить мух. Через 10 мин, 2-й 20 мин бои проводились между (а) предыдущие проигравших и победителей знакомых или (б) предыдущие неудачники и незнакомые победители и они были проанализированы, как описано выше (рис 7). В обоих условиях, 20 предыдущие неудачники лишились 2-й бои (95,5%), демонстрируя устойчивую "неудачник" эффект. Результаты были борьба по сравнению с ожидаемым значением 50-50 с двумя хвостами хи-квадрат анализа и весьма значительным "неудачник" эффект был обнаружен. Другие поведенческие изменения наблюдались в потере лицмежду 1-й и 2-й борется сопровождающих формирование "неудачник" эффект 5.
Другие поведения, чем агрессии могут быть изучены в аппарате: для иллюстрации, ухаживания и передвижение Эксперименты проводились (Т состоянии 2). Для ухаживания, мужчины и женщины мухи были загружены негативными geotaxis в поведенческих камер, разделители были удалены, и поведенческие модели ухаживания были забиты. 34 Эксперименты проводились и были проанализированы задержки в суд (время между 1-й встрече и 1 ухаживании = 7 сек) и совокупляться (время между 1-й встречи и совокупления = 4 мин). Только 2 мужчин не удалось сексом во время 15 мин времени наблюдения. Ухаживание Вигор Индекс (доля времени, что самцы отработанного ухаживает самок в течение периода 15 мин после 1-го ухаживании модели поведения) был забит на 75% (таблица 2). Для передвижения либо грехагле летит или группа 10 мух были введены в камерах и общее количество пересечений средней линии в течение 5 мин подсчитывают. Одиночные мухи пересекают среднюю линию камере в среднем 73 раз в течение 5 мин, в то время как отдельные мухи в группах пересекают среднюю линию на средней 45 раз / 5 мин (таблица 2). Это снижение наблюдается при мухи в группы, можно объяснить снижение свободного пространства за лету и к тому времени, которое они проводят взаимодействующие друг с другом вместо того, исследуя территорию.
Рисунок 6. Схематическое изображение поведенческой камеры. (А) вид сбоку аппарата. Новый аппарат состоит из трех отдельных частей: (а) пластмассовый блок, содержащий три человека, борющихся камеры; (б) два раздвижные с тремя отверстиями (15.88 мм диаметра) в каждой; и (с) покрытие из двух частей в верхней части. (Б) Вверхвид устройства. Размеры пластикового блока (А) 36.83 мм по 123.19 мм. Каждый боевые камера имеет диаметр 22,86 мм и высоту 17 мм. Отверстия на стороне, которые позволяют загрузку мух имеют диаметр 15,88 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7. Формирование надежной "неудачник" эффект. Значительное "неудачник" эффект (процент неудачников, которые потеряют 2-й борется наблюдается при предыдущих проигравшие в паре (а) со знакомыми победителей (п = 21, р *** <0,0001) или (б) с незнакомыми победителей за их 2-й бои (п = 21 ***, р <0,0001) (Lose: 95,5%, Выиграйте: 4.5.%, нет ничьих) Plоблегчить нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Поведенческие показатели | Ед. изм | Время (сек) | N |
| Столкновения | 24 ± 2 | 38 | |
| Выпады | 54 ± 6 | 38 | |
| Количество встреч до 1 выпада | 2 ± 0,3 | 38 | |
| Время 1 встречи | 145 ± 20 | 38 | |
| Время 1-го выпад | 229 ± 26 | 38 | |
| Время господства | 475 ± 56 | 34 | |
| Задержка выпад | 87 ± 20 | 38 | |
| Задержка на доминирование | 342 ± 51 | 34 |
Таблица 1:. Динамика агрессивных взаимодействиях между парами мужских мух Средние значения ± SEM рассчитываются для каждого параметра забил в качестве индикаторов агрессивности. Общее количество встреч и выпады, а числовстреч до 1 выпад забили. Времена 1 столкновение, 1-й выпад и господства, и задержек выпад и доминирования представлены в сек ± SEM (п> 34).
| Поведенческие показатели | Время (сек) | Ед. изм | (%) | N |
| Ухаживание поведение | ||||
| Задержка в суд | 7 ± 3 | 34 | ||
| Задержка совокупляться | 273 ± 62 </ TD> | 32 | ||
| Ухаживание индекс Vigor | 75 ± 0,05 | 34 | ||
| Передвижение | ||||
| Всего срединной линии кресты (один Fly) | 73 ± 4 | 48 | ||
| Всего срединной линии кресты (группа мух) | 45 ± 3 | 20 |
Таблица 2:. Анализ поведения ухаживания и передвижения Средние значения ± SEM рассчитываются для задержки в суд и совокупляются (в сек). Индекс ухаживания энергичность(в% от времени, затраченного ухаживал после 1 дисплей ухаживания) был забит после самцы и самки были загружены в поведенческих камер негативными geotaxis (п> 32). Передвижение, при одиночных мухи или группы 10 мух были загружены в камерах, был забит путем подсчета общего числа пересечений средней линии в течение 5 мин (п = 48 и 20).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Современная эра использования дрозофилы с мощными генетическими методами в качестве модельного организма для изучения агрессии стали около десятка лет назад с введением новых экспериментальных арен, в которой надежно поведение бои можно было бы получить с одиночными парами мух 1,7, 8,17,19. Эти арены включены нужные ресурсы (пищевой чашку, потенциальных партнеров) и пространство для проигравшего летит отступить в. Когда результаты, полученные с этих арен были добавлены в предыдущем знаний о поведении бой плодовой мухи, дрозофилы было твердо установлено в высшей степени желательно модельной системы для изучения сложного поведения, как агрессия и используется во многих лабораториях. Суммированные результаты показали, что: (а) летит выставочная агрессию в конкурсе на продовольственных ресурсов, доступ к товарищам или для защиты территории 14,15; (б) борется состоят из последовательного ряда стереотипных поведенческих моделей 1; (в)мужские и женские мухи бой в однополых парах (некоторые модели являются мужчины конкретные, некоторые женщины конкретные и некоторые разделяют обоих полов) 17; (г) только мужские бои идут с высоким уровнем интенсивности и привести к образованию иерархических отношений с ясно «победитель» и «проигравший» летит 17; (е) один ген бесплодными, иерархии определения пола, определяет бороться мухи, как мужчин и женщин 16 и (F) несколькими гормональных веществ, включая амины и пептиды влияют агрессию в плодовых мух 7,8,19,20.
Здесь новый подход описан для изучения фруктов летать агрессию, в которой обработка мух в ходе экспериментов устранена. Это дает существенное улучшение в протоколе, поскольку все поведенческие измерения улучшена 5,6, новая информация, относящаяся к поведению был накоплен и обучения и памяти, который сопровождаетмужчины бои летать значительно улучшилось. Чтобы проиллюстрировать, только два предыдущие исследования сообщили образование "неудачник" эффектов в модели системы 3,4. В обоих из них, были использованы более крупные камеры, чем те, которые описаны в данном протоколе, мухи были переданы в и из боя аренах стремлением, и больше раз бой и интервальные раз между боями были необходимы для создания четких "неудачник" эффекты. Наше недавнее исследование показало, что устранение обработки из экспериментального протокола, явное преобладание отношения между парами D. мухи MELANOGASTER мужчины наблюдаются только после 20 мин взаимодействия. Это количество времени достаточно, чтобы вызвать значительные изменения в стратегии борьбы в обоих мух в течение 1-го боев и надежно наблюдать образование сильных "неудачник" эффектов в 2-й бои. Кроме того, впервые, очевидно, краткосрочные «победитель» эффекты также наблюдались во 2-йборется 5,6.
Для успеха с помощью этого протокола, некоторые критические точки должны быть отмечены. Для стимулирования и наблюдать надежные агрессивные поведенческие паттерны, которые мы рекомендуем использовать 6-7 день-летний мужчина мух, которые были проведены в социальной изоляции с конца стадии куколки. В целом, наличие ресурсов, летит готовы конкурировать за (еда, товарищи) весьма желательно, чтобы получить сильную боевую поведение и установление господства отношений. Во время этого протокола, мухи окрашены после наркоза с использованием СО 2, и это может быть беспокойство, так как наша Недавно опубликованное исследование показывает, что обезболивающее мух серьезно мешает последующее поведение 5. Возможные способы, чтобы избежать анестезии может быть не рисовать животных, если это не важно отслеживать лиц. Если картина Необходимо, однако, анестезия должна использоваться 48 ч до того, как животные использовали для экспериментов, или альтернативных подходов к идентификациилюди также могут быть использованы 31. Для индукции сильного "неудачник" и "победитель" эффекты, важно, что мухи установить и поддерживать отношения доминирования во первых боях. В протоколе, представленные здесь, используя дикого типа CS напряжение при 25 ° С, 20 мин взаимодействия достаточно для создания четких «победителей» и «проигравших» и наблюдать изменения в борьбе стратегий отдельных лиц. В экспериментах, выполненных при различных температурах выше 25 ° C или с другими генотипами, чем CS, однако, среднее время для установления надежного доминантности отношения могут быть различными. Следовательно, период боевые должны быть скорректированы путем выполнения наборов предварительных экспериментов. Наконец, как пары мух разделены после первых боев может быть важно в сохранении памяти о результатах боя. Это, вероятно, важно уменьшить движение аппарата и быть нежным во время введения пластиковой перегородки в порядкечтобы свести к минимуму нарушение животных.
Конструкция аппарата и двух частей крышка позволяет разделение поведенческих камер на две равные отсеков, сделать его легко отделить мух после двух первых боях и ввести новые противники в 2-й бои. Кроме того, как показано в таблице 2, с небольшими корректировками в протоколе, то же устройство может быть использовано для изучения ухаживание, передвижения или даже большинство плодовых мух поведения в том, что должна быть меньше стрессовых условиях для экспериментальных животных. Возможные дальнейшие улучшения по процедуре может быть ввести некоторую форму терморегулятором в устройство (пьезоэлектрического элемента или катушки рассылает контролем температуры жидкости), что позволяет легко использовать чувствительных к температуре реагентов (shibire ts1, dTRPA1 канала).
В целом, мы разработали новое устройство, которое предлагает новую стратегию для изучения агрессии Iп дрозофил, в котором до, во время и после экспериментов была ликвидирована обращение мух. Все поведенческие меры улучшили с нового аппарата по сравнению с несколькими другими распространенных способов обработки мух. Возможно, более общий комментарий, чтобы сделать то, что практически все поведенческие эксперименты в лабораторных условиях привлекать экспериментаторы поднять или другими способами, обращении с животными. Несмотря на попытки быть нежным в этой обработке, это, вероятно, будет стресс для животных. Это может быть полезно, чтобы разработать методы устранения этой обработки, когда это возможно, так что животные могут наблюдаться при слегка более нормальных условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано грантами от Национального института общих медицинских наук (GM099883 и GM074675), чтобы ЕАК Доноры не было никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи. Мы благодарим людей из нашей машины магазине в Гарвардской медицинской школе для проектирования поведенческой аппарата (контакт: http://mikesmachine.com).
Автор взносы: ST, BC разработаны поведенческие аппарат. ST разработаны и оптимизированы экспериментальный протокол. ST и ВС выполнены и проанализированы эксперименты. ST, ЕАК и ВС написал бумагу.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila melanogaster pupa | Bloomington Stock Center | ||
| Standard fly food | Fabricated in-house. | ||
| Behavioral chambers | Mike machine | Fabricated in-house. Directly contact the compagny for more informations. | |
| Borosilicate glass vials | VWR International | 47729-576 | 16 x 10 mm |
| Cotton | Fisherbrand | 22-456-881 | Any brand can be used |
| Pasteur pipettes | VWR International | 53300-567 | |
| Paintbrush | Blick Art Material | 06157-7030 | Round , Size 3/0 |
| Toothpick | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Acrylic paint (blue/white) | Blick Art Material | 01637-5172/01637-1022 | Any brand can be used |
| Dry active yeast | Sigma | YSC2-500G | |
| Srew cap tube | VWR International | 10011-394 | 15 mm diameter, 10 mm height |
| Eppendorf | VWR International | 22363212 | |
| Tape | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Plastic slices | Electron Microscopy Sciences | 70329-40 | 22 x 40 x 0.25 mm Thickness |
| Light source (bulb) | VWR International | 500003-418 | Any brand can be used |
| Timer | VWR International | 62344-641 | Any brand can be used |
| Incubator | Percival | Directly contact the constructor for more informations. | |
| Carbon Dioxide Dry (CO2) | Medical-Technical Gases, Inc | 14H31 | |
| Binocular | Nikon | SMZ-745 | Any brand can be used |
| Camera (SONY Handycam HDR-CX330) | B&H | SOHDRCX330B | Any brand can be used |
| Computer | With a minimum of 1.4 Ghz Processor, running Microsoft Windows or Machintosh HD | ||
| ClipWrap | Download online | Any importing software can be used | |
| QuickTime Player | Download online | Any reading software can be used | |
| GraphPad Software | Online | Any statistical software can be used |
References
- Chen, S., Lee, A. Y., Bowens, N. M., Huber, R., Kravitz, E. A. Fighting fruit flies: a model system for the study of aggression. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 5664-5668 (2002).
- Hsu, Y., Earley, R. L., Wolf, L. L. Modulation of aggressive behaviour by fighting experience: mechanisms and contest outcomes. Biol Rev Camb Philos Soc. 81, 33-74 (2006).
- Yurkovic, A., Wang, O., Basu, A. C., Kravitz, E. A. Learning and memory associated with aggression in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 17519-17524 (2006).
- Penn, J. K., Zito, M. F., Kravitz, E. A. A single social defeat reduces aggression in a highly aggressive strain of Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 12682-12686 (2010).
- Trannoy, S., Chowdhury, B., Kravitz, E. A. Handling alters aggression and 'loser' effect formation in Drosophila melanogaster. Learn Mem. 22, 64-68 (2015).
- Trannoy, S., Kravitz, E. A. Learning and memory during aggression in Drosophila: handling affects aggression and the formation of a ''loser'' effect. Journal of Nature and Science. 1 (3), e56 (2015).
- Alekseyenko, O. V., Chan, Y. B., Li, R., Kravitz, E. A. Single dopaminergic neurons that modulate aggression in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 6151-6156 (2013).
- Dierick, H. A., Greenspan, R. J. Serotonin and neuropeptide F have opposite modulatory effects on fly aggression. Nat Genet. 39, 678-682 (2007).
- Williams, M. J., et al. Regulation of aggression by obesity-linked genes TfAP-2 and Twz through octopamine signaling in Drosophila. Genetics. 196, 349-362 (2014).
- Chase, I. D., Bartolomeo, C., Dugatkin, L. A. Aggressive interactions and inter-contest interval: how long do winners keep winning? Anim. Behav. 48, 393-400 (1994).
- Goessmann, C., Hemelrijk, C., Huber, R. The formation and maintenance of crayfish hierarchies: behavioral and self-structuring properties. Behav Ecol Sociobiol. 48, 418-428 (2000).
- Sturtevant, A. H. Experiments on sex recognition and the problem of sexual selection in Drosophila. J Animal Behav. 5, 351-366 (1915).
- Jacobs, M. E. Influence of light on mating of Drosophila melanogaster. Ecology. 41, 182-188 (1960).
- Dow, M. A., von Schilcher, F. Aggression and mating success in Drosophila melanogaster. Nature. 254, 511-512 (1975).
- Hoffmann, A. A laboratory study of male territoriality in the sibling species Drosophila melanogaster and D. simulans. Anim. Behav. 35, 807-818 (1987).
- Vrontou, E., Nilsen, S. P., Demir, E., Kravitz, E. A., Dickson, B. J. fruitless regulates aggression and dominance in Drosophila. Nat Neurosci. 9, 1469-1471 (2006).
- Nilsen, S. P., Chan, Y. B., Huber, R., Kravitz, E. A. Gender-selective patterns of aggressive behavior in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 12342-12347 (2004).
- Fernandez, M. P., Kravitz, E. A. Aggression and courtship in Drosophila: pheromonal communication and sex recognition. J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol. 199, 1065-1076 (2013).
- Alekseyenko, O. V., et al. Single serotonergic neurons that modulate aggression in Drosophila. Current biology : CB. 24, 2700-2707 (2014).
- Asahina, K., et al. Tachykinin-expressing neurons control male-specific aggressive arousal in Drosophila. Cell. 156, 221-235 (2014).
- Andrews, J. C., et al. Octopamine neuromodulation regulates Gr32a-linked aggression and courtship pathways in Drosophila males. PLoS genetics. 10, e1004356 (2014).
- Zwarts, L., et al. Complex genetic architecture of Drosophila aggressive behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 17070-17075 (2011).
- Dierick, H. A. A method for quantifying aggression in male Drosophila melanogaster. Nat Protoc. 2, 2712-2718 (2007).
- Wang, L., et al. Hierarchical chemosensory regulation of male-male social interactions in Drosophila. Nat Neurosci. 14, 757-762 (2011).
- Davis, S. M., Thomas, A. L., Nomie, K. J., Huang, L., Dierick, H. A. Tailless and Atrophin control Drosophila aggression by regulating neuropeptide signalling in the pars intercerebralis. Nat Commun. 5, 3177 (2014).
- Yuan, Q., Song, Y., Yang, C. H., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Female contact modulates male aggression via a sexually dimorphic GABAergic circuit in Drosophila. Nat Neurosci. 17, 81-88 (2014).
- Perron, J. M., Huot, L., Corrivault, G. W., Chawla, S. S. Effects of carbon dioxide anaesthesia on Drosophila melanogaster. J Insect Physiol. 18, 1869-1874 (1972).
- Joachim, D., Curtsinger, J. W. Genotype and anesthetic determine mate choice in Drosophila melanogaster. Behav Genet. 20, 73-79 (1990).
- Barron, A. B. Anaesthetising Drosophila for behavioural studies. J Insect Physiol. 46, 439-442 (2000).
- Greenspan, R. J. Fly Pushing: The theory and Practice of Drosophila Genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. (1997).
- Cabral, L. G., Foley, B. R., Nuzhdin, S. V. Does sex trade with violence among genotypes in Drosophila melanogaster? PLoS One. 3 (4), e1986 (2008).
