Summary
Durante mosca de la fruta peleas, los patrones de comportamiento observados, lucha dinámica, y el aprendizaje y la memoria asociada están influenciadas por las condiciones experimentales. El protocolo que se presenta aquí describe un procedimiento novedoso que elimina por completo la manipulación de las moscas durante los experimentos. Esto mejora la dinámica de lucha y permite la formación de efectos fuertes "perdedor".
Abstract
El comportamiento agresivo en Drosophila melanogaster se compone de la expresión secuencial de patrones de conducta estereotipados (para el análisis ver 1). Este comportamiento complejo está influenciada por factores genéticos, hormonales y ambientales. Al igual que en muchos organismos, experiencia de lucha anterior influye en la estrategia de lucha de las moscas y el resultado de los concursos posteriores: perder una pelea aumenta la probabilidad de perder concursos posteriores, revelando efectos "perdedor" que probablemente impliquen el aprendizaje y la memoria 2-4. El aprendizaje y la memoria que acompaña a la expresión de complejos comportamientos sociales como la agresión, es sensible a la validez de la prueba de manejo de los animales 5,6. Muchos de los procedimientos experimentales se utilizan en diferentes laboratorios para estudiar la agresión 7-9, sin embargo, no rutinariamente protocolo utilizado que excluye la manipulación de las moscas está disponible actualmente. Aquí, se presenta un nuevo aparato de comportamiento que elimina el manejo de las moscas, utilizando INSTEAd sus innatas respuestas geotáctico negativos para mover los animales dentro o fuera de las cámaras de lucha. En este protocolo, pequeñas arenas de lucha circular que contiene una taza de alimentos se dividen en dos mitades iguales por una corredera de plástico extraíble antes de la introducción de las moscas. Las moscas entran en las cámaras de sus viales de aislamiento casa a través de puertas corredizas de cámara y geotaxis. Tras la eliminación de controles deslizantes de plástico, las moscas son libres de interactuar. Después de períodos de tiempo especificados, las moscas se separan de nuevo por controles deslizantes para la posterior experimentación. Todo esto se hace fácilmente sin manejo de moscas individuales. Este aparato ofrece un nuevo enfoque para estudiar la agresión y el aprendizaje y la memoria asociada, incluyendo la formación de efectos "perdedor" en peleas mosca. Además, este nuevo aparato de comportamiento de uso general se puede emplear para estudiar otras conductas sociales de moscas y debe, en general, ser de interés para la investigación de los cambios relacionados con la experiencia en los procesos de comportamiento fundamentales.
Introduction
Agresión en sistemas animales está fuertemente asociado con la adquisición y tenencia de los recursos como los alimentos, el territorio y compañeros. Dado el importante papel que desempeña en el estado físico de las personas, no es de extrañar que la agresión se ha desarrollado en todo el reino animal. Como un rasgo adaptativo que beneficia directamente a los individuos, un aprendizaje y la memoria fuerte componente se asocia con la agresión. En la competencia por el rango social, experiencia en la lucha anterior influye en el resultado de los concursos posteriores. En general, antes que aumenta la experiencia perdedoras, y la experiencia de ganar disminuye, la probabilidad de perder concursos posteriores (llamados "perdedor" y efectos "ganador"). Efectos "Loser" se han observado en una amplia gama de especies, y algunos informes sugieren que estos pueden durar varios días mientras que los efectos "ganador" suelen ser de menor duración 2,10,11.
El primer informe de la conducta agresivaen moscas de la fruta (D. ampelophila) fue por Sturtevant en 1915 en un documento de que se trate con el reconocimiento de sexo y la selección del sexo 12. Medio siglo más tarde, los exámenes más completos de la fruta macho agresión volar se hicieron, que describe la mayoría de los patrones de comportamiento observados durante los combates de la mosca de la fruta. Estos experimentos se llevaron a cabo en su mayoría en pequeños grupos de moscas machos y hembras observadas durante horas 13-15. Recientemente, con la incorporación de potentes herramientas genéticas, diádicas configuraciones individuales de lucha sexo y tiempos más cortos de observación, D. melanogaster se ha convertido en un importante sistema modelo para el estudio de la biología de la agresión 1,16. Análisis de peleas entre parejas sexuales de los mismos moscas macho y hembra demostró que la agresión implica patrones de conducta estereotipadas que la transición de uno a otro de una manera estadísticamente confiable 1,17. Algunos de los patrones de comportamiento observados son sexo-específicas, mientras que otros se observan en la luchas en ambos sexos. Peleas masculinas van a niveles de intensidad más altos que las peleas femeninas y dar lugar a la formación de relaciones de dominancia con "ganadores" y "perdedores claros". En la actualidad, muchos laboratorios han comenzado a investigar la bioquímica 18, neural 7,19-21, y genéticos 22 bases de agresión. Por desgracia, un meta-análisis de estudios para comprender mejor la dinámica de la lucha y de la formación y el mantenimiento de relaciones de dominancia es problemático debido a la utilización de una multiplicidad de procedimientos experimentales en diferentes laboratorios. Esencialmente todas las técnicas descritas en la literatura implican manejo y manipulación de las moscas para introducirlos en arenas 19,23,24 y durante el experimento de comportamiento 3,4 para transferir moscas de arenas. Aspiración suave es la forma más común de manipular moscas 3,4,23-25, pero frío o CO 2 anestesia también se utilizan 9,26, a pesar de que pestudios de la mera existencia ya han informado de que estos procedimientos tienen efectos nocivos sobre el comportamiento de la mosca 27,28. Se recomienda un periodo de al menos 24 horas después de la utilización de cualquier anestésicos para minimizar sus efectos sobre el comportamiento 29,30.
Moscas aprenden de la experiencia de lucha anterior y modificar su uso de patrón de comportamiento en situaciones nuevas, lo que sugiere que el aprendizaje y la memoria acompañan y son consecuencias de encuentros agonísticos. En ese sentido, vuelan peleas se asemejan a las situaciones de aprendizaje condicionamiento operante en el que vuela a aprender que la estrategia ha funcionado y luego use con más y más a menudo durante los encuentros posteriores. Las moscas cambian sus estrategias de lucha después de las relaciones de dominación se han establecido durante los combates, con los ganadores lanzarse más y más y perdedores cada vez menos. Después de un período de separación, perdedores anteriores muestran un comportamiento mucho más sumisa y son altamente propensos a perder 2º combate cuando se combina con fl ingenuoies o ganadores anteriores 3,4. Sin embargo, la ausencia de un procedimiento experimental que excluye el manejo de moscas ha hecho estudios detallados de efectos "perdedor" difíciles. En un reciente estudio, se compararon dos procedimientos experimentales utilizados rutinariamente en los laboratorios (aspiración y fría-anestesia) para introducir las moscas en las cámaras de comportamiento al nuevo procedimiento que elimina el manejo. Los resultados mostraron que en frío anestesia tenía mucho mayores efectos negativos sobre la agresión de aspiración, pero incluso la aspiración reduce el nivel de agresividad por las moscas. Aspiración hizo, sin embargo, causa efectos altamente significativos en el aprendizaje y la memoria que acompaña a la agresión. Siguiendo el protocolo idéntico a dos procedimientos experimentales (aspiración y no de manipulación), un efecto robusto "perdedor", sólo se observó cuando el manejo de moscas fue eliminado del procedimiento 5,6 experimental.
Idealmente, los estudios de Drosophila agresión en laboratorios deben incluir situaciones ambientales que las moscas normalmente encuentran en la naturaleza (competencia por los recursos, el territorio para defender y espacio para escapar). Además, las condiciones experimentales deben ser optimizados para inducir de manera fiable, observar e interpretar el comportamiento bajo examen (tratan de minimizar la manipulación de animales, limitar el uso de CO 2 como anestésico, y estandarizar los procedimientos experimentales). Al tratar de resolver la mayor parte o la totalidad de estos problemas, se diseñó un nuevo aparato de comportamiento que elimina el manejo de las moscas antes, durante y después de la introducción a escenarios de comportamiento. Con estos aparatos, las moscas utilizan sus geotaxis negativas innatas a ser trasladada y transferidos dentro y fuera de las cámaras de lucha. Mediante la eliminación de la manipulación de las moscas, el protocolo tiene como objetivos: (a) reducir la variabilidad de comportamiento entre los individuos; (b) reducir el tiempo necesario para las moscas que interactúan y generan relaciones de dominancia claras (machos); y (c) inducir fiable fuerte behavio suficientecambios rales para permitir la formación de los efectos de "perdedor".
Este protocolo describe un nuevo aparato experimental y un procedimiento paso a paso para analizar la agresión y para permitir la formación de un fuerte efecto "perdedor" en D. melanogaster. Esperamos que este aparato de comportamiento puede ser fácilmente adaptado para el estudio de otros comportamientos sociales exhibidos por moscas de la fruta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Nota: La siguiente es una descripción paso a paso del protocolo experimental que usamos para permitir confiable desencadenante de la agresión entre parejas de moscas de la fruta macho (D. melanogaster). Este procedimiento induce la formación de un efecto de "perdedor". El uso de este protocolo, un corto plazo el efecto "ganador" también ha sido recientemente reportó 5,6. La figura 1 muestra la línea de tiempo de los experimentos de comportamiento.
Figura 1. Cronología de experimento agresión. El día 1, pupas macho en etapa tardía (cuando las alas se vuelven negro) están aislados en viales de aislamiento recién preparados. En el día 5 después de emerger como adultos, 4 días de edad moscas macho se anestesian con CO2 y pintadas con colores diferentes para propósitos de identificación. El día 7, tazas alimentos y cámaras de lucha sonpreparado para configurar los experimentos de comportamiento. Dos 06.07 varones adultos de un día se cargan en las cámaras y son capaces de interactuar. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
1. Día 1: Aislamiento Social de pupas
- Elevar y mantener las poblaciones de mosca en un 12 horas de luz / 12 h oscuridad ciclo incubadora de ambiente controlado a 25 ° C y una humedad relativa del 50%.
- Preparar los viales de aislamiento: Calentar alimentos mosca fresca hasta que se derrita. Utilizando una pipeta Pasteur, transferir aproximadamente 1,5 ml de la comida mosca fundida en tubos de ensayo de vidrio vacíos individuales (1,6 x 10 cm). Permita que la comida se solidifique.
- Aislar pupas: Con un pincel fino, retire suavemente una pupa masculino en etapa tardía (cuando las alas se convierten en negro) de las existencias vial y colocarlo en el lado de un tubo de ensayo recién preparado alimenticio que contiene. Cerrar los tubos de aislamiento con algodón (Figura 2).
Figura 2. Aislamiento Social. Una pupa masculino en etapa tardía se coloca en el lado en un vial aislamiento recién preparado. Viales de aislamiento que contienen pupa se colocan en el 12 horas de luz / 12 h incubadora oscuridad a 25 ° C y una humedad relativa del 50%. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
2. Día 5: Pintura las Moscas para la identificación individual Propósitos
- Realice este paso en el día 5 con 4 moscas macho de un día y dos días antes de los experimentos de comportamiento para minimizar el efecto negativo de CO 2 anestesia.
- Anestesiar mosca con CO 2. Con un palillo de dientes finos, coloque un pequeño punto de la pintura de acrílico en el tórax. Evite colocar la pintura en la cabeza, las alas, el abdomen o las piernas (Figura 3).
- Deja que la pintura seca durante aproximadamente 10 segundos, y la transferencia suavemente moscas a sus viales de aislamiento originales.
- Volver viales de aislamiento a la 12 horas de luz / 12 h incubadora oscuridad a 25 ° C y una humedad relativa del 50%.
Figura 3. La identificación individual. Después de anestesiar a una mosca con CO 2, una pequeña gota de pintura acrílica se aplica en el tórax. Para propósito individual de identificación, diferentes colores se utilizan (blanco y azul aquí). Véase la discusión a continuación sobre el uso de CO 2 en este paso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figure.
3. Día 7: Preparación del Aparato
- Preparar Copas alimentos:
- Calentar alimentos mosca fresca hasta que se derrita.
- Con una pipeta Pasteur, transferir aproximadamente 0,8 ml de alimentos a la tapa de un vial de tapón de rosca (1,5 cm de diámetro, 1 cm de altura) y dejar enfriar. Evite las burbujas de aire.
- Hacer pasta de levadura fresca mezclando la levadura seca con unas gotas de agua. Cuando gruesa, aplicar una pequeña gota de pasta de levadura al centro de la superficie de la taza del alimento con un palillo de dientes (Figura 4).
Figura 4. Preparación de la taza de la comida. Una taza comida es preparada con alimentos mosca fresco. Después de que los alimentos se solidifica, un punto de pasta de levadura se coloca en el centro de la superficie de la taza del alimento. Por favor, haga clic aquí para vIEW una versión más grande de esta figura.
- Preparar individuales Cámaras de extinción:
- Lave bien las cámaras de aparatos y lucha individuo con agua antes de su uso cada vez. Seque con una toalla de papel antes de su uso.
- Coloque una taza de comida en el centro de cada cámara luchando y fijar en su lugar con una gota de masilla.
- Cubra cámaras de lucha con la tapa aparato (Figura 5).
- Coloque el aparato en un ambiente de alta humedad (60%) a 25 ° C.
- Coloque una fuente de luz por encima del aparato para iluminar las cámaras de lucha y establecer una cámara de vídeo para grabar desde arriba.
Figura 5. Preparación de la cámara de lucha individual. La copa comida recién preparada con un punto de la pasta de levadura en la superficie se fija en lavó fi individuoghting cámaras. Cámaras se cierran con la tapa de dos piezas permite la inserción de un divisor de plástico opaco en cámaras de combate individual. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
4. Día 7: Experimento del Comportamiento
- Lleve a cabo los experimentos de comportamiento con 6-7 días de edad moscas macho.
- Inserte separadores de plástico en cada cámara luchando.
- Quitar el tapón de algodón desde el tubo de aislamiento y posicionar el tubo por debajo de un agujero abierto en el lado del aparato.
- Deje que la mosca entre en la cámara de la lucha por geotaxis negativos, por lo general dentro de unos pocos segundos.
- Cierre la pared deslizante después de la marcha ha salido del tubo y entrado en la cámara.
- Repita el procedimiento para introducir la segunda marcha en la cámara de lucha en el otro lado del aparato.
- Coloque el aparato de nuevo en el videotapi iluminadaposición ng.
- Comienza la grabación de vídeo y retire el separador de plástico para permitir que las moscas para interactuar.
- Para experimentos Agresión:
- En estos experimentos, ficha lucha por al menos 20 min para asegurar la formación de relaciones de dominancia fuertes.
- Después del tiempo deseado, detener la grabación de vídeo.
- Retire las moscas de las cámaras de extinción de invirtiendo el procedimiento descrito anteriormente.
- Lave bien el aparato de comportamiento con un detergente suave y agua después de cada uso y enjuague.
- Para "Loser" Experimentos Efecto:
Nota: En estos experimentos, primeras peleas son considerados como la fase de acondicionamiento y segundo peleas como la fase de prueba. El período de descanso entre peleas puede diferir, pero 10 minutos permite la formación de un fuerte efecto "perdedor".- Siga el procedimiento descrito anteriormente para realizar una primera pelea.
- PASO CRÍTICO: Para inducir la formación de un "perdedor" mentalidad, esegurar que las primeras peleas son por lo menos 20 minutos de largo con el fin de establecer relaciones de dominancia fuertes. Después de 20 minutos, vuelva a insertar el divisor de plástico en cámaras de lucha para separar las moscas.
- Después de un período de 10 minutos de descanso, retire suavemente el divisor de plástico para permitir que las moscas que interactúan para segundas peleas.
- Al final de la segunda 20 min pelea, detener la grabación de vídeo.
- Retire las moscas de las cámaras de comportamiento que el anterior.
- Una vez más, limpiar a fondo el aparato de comportamiento.
- Para experimentos Agresión:
5. Análisis del Comportamiento
- Transferencia Películas
- Conecte las cámaras a la computadora.
- Convertir moscas .MTS a .mov moscas y unir clips películas juntos, el uso de vídeo software de conversión y la opción "unirse a los clips seleccionados".
- Observar y analizar cada película con el software lector de vídeo.
- Comportamiento de puntuación
Nota: esto se puede hacer de forma manual o nosing de software programa de análisis de comportamiento si está disponible. La siguiente ilustración describe una posible análisis manual para un efecto de "perdedor".- Puntuación del momento del primer encuentro entre las moscas en la copa de los alimentos (encuentros son interacciones entre pares de moscas que duran al menos 2 seg) y el momento de aparición de la primera estocada (un patrón de comportamiento en el que una mosca se eleva en lo alto de su patas traseras y broches de presión hacia abajo y los intentos de agarrar al oponente). Entonces, la puntuación de la latencia para lanzarse (el intervalo entre el primer encuentro y la primera estocada).
- Cuente el número total de encuentros y las estocadas durante una pelea.
Nota: Si se desea, también se puede marcar otras pautas de comportamiento, como la amenaza de ala, el boxeo, la esgrima, la retirada o el número de encuentros antes de la primera estocada, por ejemplo. - Puntuación del tiempo de establecimiento de la dominación (tiempo entre el primer encuentro y el tiempo vuela cuando uno se retira por tres veces consecutivas de la popa de taza de alimentoser estocadas recibiendo). Nota que vuela es el ganador y que el perdedor de la pelea.
- Cálculo de un efecto de "Loser"
- Divida el número de peleas en el que los perdedores anteriores pierden 2 peleas nd (perdedores que pierden: LL) por el número total de peleas, y se multiplica por 100. El porcentaje obtenido representa el efecto "perdedor":
[(# Vuela LL) / (# lucha total)] x 100 - Utilice una prueba de Chi-cuadrado para comparar si el efecto "perdedor" es estadísticamente diferente del valor esperado de 50%.
- Divida el número de peleas en el que los perdedores anteriores pierden 2 peleas nd (perdedores que pierden: LL) por el número total de peleas, y se multiplica por 100. El porcentaje obtenido representa el efecto "perdedor":
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En esta sección se presenta el diseño de la cámara de comportamiento y el análisis de un conjunto típico de experimentos de comportamiento siguiendo el protocolo descrito anteriormente medición de la agresión y la formación de un efecto de "perdedor". También ilustró son muestras de otras conductas que pueden ser medidos usando este aparato.
La figura 6 muestra una representación esquemática del nuevo aparato. El aparato se compone de tres pozos cilíndricos (dimensión: 22,86 mm de diámetro, 17 mm de altura) que son las cámaras de lucha. La tapa de dos piezas, cierra las cámaras de lucha en la parte superior y permite la inserción de un divisor de plástico opaco delgada que divide las cámaras en dos secciones iguales. A cada lado del aparato, las paredes de corredera con tres agujeros (15,88 mm de diámetro) permitir la carga de moscas en las cámaras de extinción de por geotaxis negativos directamente desde sus viales de aislamiento. Después de moscas entran en las cámaras de lucha, las paredes correderas son usod para cerrar los lados de las todas las cámaras. En este punto, los dos moscas están dentro de las arenas pelea, pero no pueden interactuar, debido a los divisores. Mediante la eliminación de estos, las moscas son libres de interactuar y los patrones de comportamiento posteriores se pueden observar y registrar.
Se llevaron a cabo 38 peleas entre pares de tipo salvaje hombres CS: experimentos Agresión. Diferentes parámetros de comportamiento se puntuaron mientras que las moscas estaban en las tazas de los alimentos y la dinámica de las peleas fueron analizadas (Tabla 1). Se observó un promedio de 24 encuentros (breves reuniones entre las moscas), 54 estocadas (un indicador de mayor intensidad de los combates) durante un período de tiempo de 20 minutos, con la primera estocada generalmente entregados durante el encuentro 2º. En promedio, el 1 er encuentro, el 1 de estocada y el tiempo para establecer su dominio se observaron 2, 4 y 8 minutos después del inicio de la grabación. En la mayoría de los casos, los últimos 12 minutos de peleas consisten en secuencias repetitivas de alta intensidad encoUnters con animales subordinados se acerca, de ser atacado y retrocediendo, lo que refuerza la dominación o el estado de sumisión de cada animal.
"Loser" experimentos de efecto: Con el fin de buscar la formación de un efecto de "perdedor", 21 1 st peleas de 20 minutos de duración se llevaron a cabo entre pares de tipo salvaje hombres CS. El divisor de cámara de deslizamiento a continuación, se insertó para separar las moscas. Después de 10 minutos, 2 nd 20 min peleas se realizaron entre (a) los perdedores y ganadores anteriores o familiares (b) anteriores perdedores y ganadores desconocidos y éstos se analizaron como anteriormente (Figura 7). En ambas condiciones, 20 perdedores anteriores perdieron sus 2 peleas nd (95,5%), lo que demuestra un efecto robusto "perdedor". Los resultados de la lucha se compararon con el valor esperado de 50-50 con un análisis de Chi-cuadrado de dos colas y un efecto muy significativo "perdedor" fue encontrado. Se observaron otros cambios de comportamiento en la pérdida de individuosentre el 1 y 2 de lucha que acompaña la formación del efecto "perdedor" 5.
Otros comportamientos que la agresión se pueden estudiar en el aparato: para ilustrar, cortejo y locomoción experimentos se realizaron (T abla 2). Para cortejo, moscas macho y hembra se cargaron por geotaxis negativos en las cámaras de comportamiento, se eliminaron los divisores y los patrones de comportamiento de cortejo se puntuaron. 34 experimentos se realizaron y se analizaron las latencias a la corte (el tiempo entre el primero encuentro y el comportamiento de cortejo primero = 7 seg) y copular (tiempo entre la primera y la cópula encuentro = 4 min). Sólo 2 machos no lograron copular durante el tiempo de 15 minutos de observación. El Índice Vigor Cortejo (la fracción de tiempo que los hombres pasó cortejar mujeres durante un período de 15 minutos después de la primera cortejo patrón de comportamiento) se anotó en el 75% (Tabla 2). Para la locomoción sea el pecadogle vuela o grupo de 10 moscas se introdujeron en las cámaras y se contó el número total de los cruces de la línea media durante 5 min. Moscas individuales cruzan la línea media de la cámara de un promedio de 73 veces durante 5 min, mientras que las moscas individuales en grupos cruzan la línea media en promedio 45 veces / 5 min (Tabla 2). Esta disminución observada cuando las moscas están en grupos se puede explicar por la reducción del espacio disponible por mosca y por el tiempo que pasan interactuar unos con otros en vez de explorar el territorio.
Figura 6. Representación esquemática de la cámara de comportamiento. (A) Vista lateral del aparato. El nuevo aparato se compone de tres partes: (a) un bloque de plástico que contiene tres individuos que luchan cámaras; (b) dos paredes corredizas con tres agujeros (15,88 mm de diámetro) en cada uno; y (c) la tapa de dos piezas en la parte superior. (B) Topvista del aparato. Las dimensiones del bloque de plástico (a) son 36,83 mm de 123.19 mm. Cada cámara de lucha individuo tiene un diámetro de 22,86 mm y una altura de 17 mm. Agujeros en el lado que permiten la carga de las moscas tienen un diámetro de 15.88 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7. La formación de un efecto robusto "perdedor". Un efecto significativo "perdedor" (porcentaje de perdedores que pierden 2º lucha se observa cuando se emparejaron perdedores anteriores (a) con los ganadores familiares (n = 21, p *** <0.0001) o (b) con los ganadores desconocidos para sus peleas 2 nd (n = 21, *** p <0,0001) (Lose: 95,5%, Win:. 4,5%, No empates) Plaliviar clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Parámetros de comportamiento | Unidad | Tiempo (seg) | norte |
| Encuentros | 24 ± 2 | 38 | |
| Estocadas | 54 ± 6 | 38 | |
| Número de encuentros antes de primera estocada | 2 ± 0,3 | 38 | |
| Tiempo del 1er encuentro | 145 ± 20 | 38 | |
| Tiempo de la primera estocada | 229 ± 26 | 38 | |
| Tiempo de la dominación | 475 ± 56 | 34 | |
| Latencia de Lunge | 87 ± 20 | 38 | |
| Latencia de dominancia | 342 ± 51 | 34 |
Tabla 1:. Dinámica de interacciones agonísticas entre pares de moscas macho Los valores medios ± SEM se calculan para cada parámetro anotó como indicadores de agresividad. El número total de encuentros y las estocadas, y el númerode los encuentros antes se anotó la primera estocada. Los tiempos de la primera encuentro, primera estocada y el dominio, y las latencias de lanzarse a la dominación y se presentan en la sec ± SEM (n> 34).
| Parámetros de comportamiento | Tiempo (seg) | Unidad | (%) | norte |
| El comportamiento de cortejo | ||||
| Latencia a los tribunales | 7 ± 3 | 34 | ||
| Latencia de copular | 273 ± 62 </ td> | 32 | ||
| Cortejo Índice Vigor | 75 ± 0,05 | 34 | ||
| Locomoción | ||||
| Cruces de la línea media total (sola mosca) | 73 ± 4 | 48 | ||
| Cruces de la línea media en total (grupo de moscas) | 45 ± 3 | 20 |
Tabla 2:. Análisis del comportamiento de cortejo y la locomoción Los valores medios ± SEM se calculan para las latencias a la corte y copular (en segundos). Un índice de vigor noviazgo(en% del tiempo dedicado a cortejar después display primera cortejo) se anotó después de machos y hembras fueron cargados en cámaras de comportamiento por geotaxis negativos (n> 32). Locomotion, cuando las moscas o grupos de 10 moscas individuales fueron cargados en las cámaras, se obtuvo contando el número total de cruces de la línea media durante 5 min (n = 48 y 20).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La era moderna de la utilización de Drosophila con sus métodos genéticos de gran alcance como un organismo modelo para el estudio de la agresión comenzó hace alrededor de una docena de años con la introducción de nuevos escenarios experimentales en los que la conducta de lucha confiable podría obtenerse con pares individuales de moscas 1,7, 8,17,19. Estos escenarios incluyen recursos deseados (una taza de comida, parejas potenciales) y un espacio para el perdedor vuela a retirarse a. Cuando se agregaron los resultados obtenidos con estos ámbitos de conocimientos previos sobre el comportamiento lucha mosca de la fruta, Drosophila melanogaster se estableció firmemente como un sistema modelo altamente deseable para el examen de un comportamiento complejo como la agresión y se utiliza en muchos laboratorios. Los resultados obtenidos revelaron que sumadas: (a) vuela agresión exposición en la competencia por los recursos alimenticios, el acceso a los compañeros o para la defensa del territorio 14,15; (b) peleas se componen de una serie secuencial de patrones de comportamiento estereotípicos 1; (do)moscas machos y hembras luchan en mismas parejas sexuales (algunos patrones son específicos de sexo masculino, algunos son de sexo femenino específico y algunos son compartidos por ambos sexos) 17; (d) sólo peleas masculinas van a altos niveles de intensidad y dan lugar a la formación de relaciones jerárquicas con un claro «ganador» y «perdedores» moscas 17; (e) un solo gen infructuoso, de la jerarquía de la determinación del sexo, determina si las moscas luchan como hombres o mujeres y 16 (f) de múltiples sustancias hormonales incluyendo aminas y péptidos influyen en la agresión en moscas de la fruta 7,8,19,20.
Aquí, un enfoque novedoso se describe para el estudio de la agresión de la fruta en el que se elimina el manejo de las moscas durante los experimentos volar. Esto ofrece una mejora significativa en el protocolo experimental como todas las mediciones de comportamiento se mejoran 5,6, nueva información relacionada con el comportamiento ha sido adquirida y el aprendizaje y la memoria que acompañapeleas de moscas macho se mejora en gran medida. Para ilustrar esto, sólo dos estudios anteriores han informado de la formación de efectos "perdedor" en este modelo de sistema 3,4. En ambos, se utilizaron cámaras más grandes que los que se describen en este protocolo, las moscas fueron transferidos dentro y fuera de las arenas de lucha por aspiración, y los tiempos de lucha más largos y tiempos de intervalo entre peleas eran necesarias para generar efectos claros "perdedor". Nuestro estudio reciente demostró que la eliminación de la manipulación del protocolo experimental, relaciones de dominancia claras entre pares de D. melanogaster masculinos moscas se observan después de sólo 20 minutos de la interacción. Esta cantidad de tiempo es suficiente para inducir cambios significativos en las estrategias de lucha en los dos moscas durante 1 peleas st y observar de manera fiable la formación de efectos fuertes "perdedor" en 2 peleas nd. Además, por primera vez, clara a corto plazo efectos "ganador", también se observaron durante la 2 ªcombate el 5,6.
Para tener éxito con este protocolo, algunos puntos críticos necesitan ser observado. Para inducir y observar los patrones de conducta agresivos robustos recomendamos utilizando 6-7 moscas macho de un día que se han celebrado en el aislamiento social, ya que la fase de pupa tarde. En general, la disponibilidad de recursos que ofrece están dispuestos a competir sobre (comida, compañeros) es muy conveniente con el fin de obtener un fuerte comportamiento de lucha y el establecimiento de relaciones de dominancia. Durante este protocolo, las moscas están pintados después de la anestesia utilizando CO 2, y que pueden ser motivo de preocupación ya que nuestro estudio publicado recientemente demuestra que anestesiar las moscas seriamente interfiere con la conducta posterior 5. Las posibles maneras de evitar la anestesia podría ser la de no pintar los animales si no es importante hacer un seguimiento de los individuos. Si la pintura es necesario, sin embargo, la anestesia se debe utilizar antes de 48 horas los animales se utilizan para los experimentos, o enfoques alternativos para identificarindividuos también pueden ser utilizados 31. Para inducir fuerte "perdedor" y efectos "ganador", es crucial que las moscas de establecer y mantener una relación de dominación en los primeros combates. En el protocolo que aquí se presenta, utilizando la cepa CS de tipo salvaje a 25 ° C, 20 min de interacción es suficiente para generar "ganadores" y "perdedores claros" y observar los cambios en las estrategias de lucha de ambos individuos. En experimentos realizados a diferentes temperaturas de 25 ° C o con otros genotipos que CS, sin embargo, el tiempo medio para establecer una relación de dominancia robusta podría ser diferente. En consecuencia, el período de lucha debe ser ajustada mediante la realización de series de experimentos preliminares. Por último, ¿cómo se separan pares de moscas después de sus primeras peleas podría ser importante en la preservación de la memoria de los resultados de la lucha. Es probablemente importante para reducir el movimiento del aparato y ser suave durante la introducción del divisor de plástico con el finpara minimizar la alteración de los animales.
El diseño del aparato y la tapa de dos piezas que permite la separación de las cámaras de comportamiento en dos compartimentos iguales, hacen que sea fácil de separar las dos moscas después de las primeras peleas e introducir nuevos oponentes en 2 peleas nd. También, como se muestra en la Tabla 2, con pequeños ajustes del protocolo experimental, el mismo aparato puede ser utilizado para estudiar el cortejo, la locomoción o de hecho la mayoría de los comportamientos de mosca de la fruta en lo que debería ser condiciones menos estresante para los animales de experimentación. Posibles nuevas mejoras en el procedimiento podría ser la introducción de algún tipo de control termostático en el aparato (elemento piezoeléctrico o una bobina para hacer circular el fluido a temperatura controlada) para permitir un fácil uso de reactivos sensibles a la temperatura (ts1 shibire, canal dTRPA1).
En resumen, hemos ideado un nuevo aparato que ofrece una nueva estrategia para el estudio de la agresión in moscas de la fruta en el que, antes, durante y después de los experimentos fue eliminado manejo de moscas. Todas las medidas de comportamiento se han mejorado con el nuevo aparato en comparación con otras formas comunes de manejo de moscas. Tal vez un comentario más general de hacer es que prácticamente todos los experimentos de comportamiento en entornos de laboratorio implican experimentadores recogiendo o de otras maneras, la manipulación de animales. A pesar de los esfuerzos por ser suave en este manejo, esto es probable que sea estresante para los animales. Podría ser útil para idear métodos para eliminar este tratamiento siempre que sea posible, para que los animales puedan ser observados bajo un poco más condiciones normales.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por subvenciones del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales (GM099883 y GM074675) para EAK Los financiadores no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión de publicar, o la preparación del manuscrito. Damos las gracias a la gente de nuestro taller de mecánica en la Escuela de Medicina de Harvard para el diseño del aparato conductual (contacto: http://mikesmachine.com).
Contribuciones de los autores: ST, BC diseñaron el aparato de comportamiento. ST diseñado y optimizado el protocolo experimental. ST y BC realizado y analizado los experimentos. ST, EAK y BC escribió el documento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila melanogaster pupa | Bloomington Stock Center | ||
| Standard fly food | Fabricated in-house. | ||
| Behavioral chambers | Mike machine | Fabricated in-house. Directly contact the compagny for more informations. | |
| Borosilicate glass vials | VWR International | 47729-576 | 16 x 10 mm |
| Cotton | Fisherbrand | 22-456-881 | Any brand can be used |
| Pasteur pipettes | VWR International | 53300-567 | |
| Paintbrush | Blick Art Material | 06157-7030 | Round , Size 3/0 |
| Toothpick | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Acrylic paint (blue/white) | Blick Art Material | 01637-5172/01637-1022 | Any brand can be used |
| Dry active yeast | Sigma | YSC2-500G | |
| Srew cap tube | VWR International | 10011-394 | 15 mm diameter, 10 mm height |
| Eppendorf | VWR International | 22363212 | |
| Tape | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Plastic slices | Electron Microscopy Sciences | 70329-40 | 22 x 40 x 0.25 mm Thickness |
| Light source (bulb) | VWR International | 500003-418 | Any brand can be used |
| Timer | VWR International | 62344-641 | Any brand can be used |
| Incubator | Percival | Directly contact the constructor for more informations. | |
| Carbon Dioxide Dry (CO2) | Medical-Technical Gases, Inc | 14H31 | |
| Binocular | Nikon | SMZ-745 | Any brand can be used |
| Camera (SONY Handycam HDR-CX330) | B&H | SOHDRCX330B | Any brand can be used |
| Computer | With a minimum of 1.4 Ghz Processor, running Microsoft Windows or Machintosh HD | ||
| ClipWrap | Download online | Any importing software can be used | |
| QuickTime Player | Download online | Any reading software can be used | |
| GraphPad Software | Online | Any statistical software can be used |
References
- Chen, S., Lee, A. Y., Bowens, N. M., Huber, R., Kravitz, E. A. Fighting fruit flies: a model system for the study of aggression. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 5664-5668 (2002).
- Hsu, Y., Earley, R. L., Wolf, L. L. Modulation of aggressive behaviour by fighting experience: mechanisms and contest outcomes. Biol Rev Camb Philos Soc. 81, 33-74 (2006).
- Yurkovic, A., Wang, O., Basu, A. C., Kravitz, E. A. Learning and memory associated with aggression in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 17519-17524 (2006).
- Penn, J. K., Zito, M. F., Kravitz, E. A. A single social defeat reduces aggression in a highly aggressive strain of Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 12682-12686 (2010).
- Trannoy, S., Chowdhury, B., Kravitz, E. A. Handling alters aggression and 'loser' effect formation in Drosophila melanogaster. Learn Mem. 22, 64-68 (2015).
- Trannoy, S., Kravitz, E. A. Learning and memory during aggression in Drosophila: handling affects aggression and the formation of a ''loser'' effect. Journal of Nature and Science. 1 (3), e56 (2015).
- Alekseyenko, O. V., Chan, Y. B., Li, R., Kravitz, E. A. Single dopaminergic neurons that modulate aggression in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 6151-6156 (2013).
- Dierick, H. A., Greenspan, R. J. Serotonin and neuropeptide F have opposite modulatory effects on fly aggression. Nat Genet. 39, 678-682 (2007).
- Williams, M. J., et al. Regulation of aggression by obesity-linked genes TfAP-2 and Twz through octopamine signaling in Drosophila. Genetics. 196, 349-362 (2014).
- Chase, I. D., Bartolomeo, C., Dugatkin, L. A. Aggressive interactions and inter-contest interval: how long do winners keep winning? Anim. Behav. 48, 393-400 (1994).
- Goessmann, C., Hemelrijk, C., Huber, R. The formation and maintenance of crayfish hierarchies: behavioral and self-structuring properties. Behav Ecol Sociobiol. 48, 418-428 (2000).
- Sturtevant, A. H. Experiments on sex recognition and the problem of sexual selection in Drosophila. J Animal Behav. 5, 351-366 (1915).
- Jacobs, M. E. Influence of light on mating of Drosophila melanogaster. Ecology. 41, 182-188 (1960).
- Dow, M. A., von Schilcher, F. Aggression and mating success in Drosophila melanogaster. Nature. 254, 511-512 (1975).
- Hoffmann, A. A laboratory study of male territoriality in the sibling species Drosophila melanogaster and D. simulans. Anim. Behav. 35, 807-818 (1987).
- Vrontou, E., Nilsen, S. P., Demir, E., Kravitz, E. A., Dickson, B. J. fruitless regulates aggression and dominance in Drosophila. Nat Neurosci. 9, 1469-1471 (2006).
- Nilsen, S. P., Chan, Y. B., Huber, R., Kravitz, E. A. Gender-selective patterns of aggressive behavior in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 12342-12347 (2004).
- Fernandez, M. P., Kravitz, E. A. Aggression and courtship in Drosophila: pheromonal communication and sex recognition. J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol. 199, 1065-1076 (2013).
- Alekseyenko, O. V., et al. Single serotonergic neurons that modulate aggression in Drosophila. Current biology : CB. 24, 2700-2707 (2014).
- Asahina, K., et al. Tachykinin-expressing neurons control male-specific aggressive arousal in Drosophila. Cell. 156, 221-235 (2014).
- Andrews, J. C., et al. Octopamine neuromodulation regulates Gr32a-linked aggression and courtship pathways in Drosophila males. PLoS genetics. 10, e1004356 (2014).
- Zwarts, L., et al. Complex genetic architecture of Drosophila aggressive behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 17070-17075 (2011).
- Dierick, H. A. A method for quantifying aggression in male Drosophila melanogaster. Nat Protoc. 2, 2712-2718 (2007).
- Wang, L., et al. Hierarchical chemosensory regulation of male-male social interactions in Drosophila. Nat Neurosci. 14, 757-762 (2011).
- Davis, S. M., Thomas, A. L., Nomie, K. J., Huang, L., Dierick, H. A. Tailless and Atrophin control Drosophila aggression by regulating neuropeptide signalling in the pars intercerebralis. Nat Commun. 5, 3177 (2014).
- Yuan, Q., Song, Y., Yang, C. H., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Female contact modulates male aggression via a sexually dimorphic GABAergic circuit in Drosophila. Nat Neurosci. 17, 81-88 (2014).
- Perron, J. M., Huot, L., Corrivault, G. W., Chawla, S. S. Effects of carbon dioxide anaesthesia on Drosophila melanogaster. J Insect Physiol. 18, 1869-1874 (1972).
- Joachim, D., Curtsinger, J. W. Genotype and anesthetic determine mate choice in Drosophila melanogaster. Behav Genet. 20, 73-79 (1990).
- Barron, A. B. Anaesthetising Drosophila for behavioural studies. J Insect Physiol. 46, 439-442 (2000).
- Greenspan, R. J. Fly Pushing: The theory and Practice of Drosophila Genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. (1997).
- Cabral, L. G., Foley, B. R., Nuzhdin, S. V. Does sex trade with violence among genotypes in Drosophila melanogaster? PLoS One. 3 (4), e1986 (2008).
