Protocol
1. الكيميائية اقتران من البروتينات لالبوليمر الخرز
- ثيول-أمين الاتجاه اقتران
ملاحظة: هذا البروتوكول هو مناسبة لاقتران السيستين التي تحتوي على البروتينات إلى amine بين functionalized الخرز البوليمر، وذلك باستخدام Sulfosuccinimidyl 4- (ص -maleimidophenyl) الزبدات (سلفو-SMPB) كوكيل عبر ربط (الشكل 1).
يتم تنشيط الرقم 1. عبر ربط الاستراتيجية المستخدمة لاتجاهي اقتران ثيول-أمين البروتينات لحبات البوليمر. الخرز البوليسترين تعديل أمين مع سلفو-SMPB. وmaleimide يتفاعل مع cysteines حر في إتجاهي البروتينات الزوجان إلى الخرز. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.- إعداد الكواشف:
- إعداد برنامج تلفزيوني (100 ملي فوسفات الصوديوم، 150 ملي كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.0) والأوتوكلاف. إعداد الأسهم 100X (0.5 M أو 287 ملغ / مل في PBS) من TCEP (تريس (2-carboxyethyl) الفوسفين) مباشرة قبل الاستعمال.
- إعداد الأسهم 5X (10 ملم أو 4.58 ملغ / مل في DH 2 O) من سلفو-SMPB مباشرة قبل الاستعمال.
- إعداد الأسهم 10X (500 ملم أو 88 ملغ / مل في برنامج تلفزيوني، ودرجة الحموضة 7.0) من السيستين مباشرة قبل الاستعمال.
- تفعيل حبة:
- مزيج تعليق حبة كتبها قلب بلطف وتحويل المبلغ المطلوب من تعليق حبة (على سبيل المثال، 12 مل) في أنبوب معقم 1.5 مل تحتوي على 1 مل PBS العقيمة، ودرجة الحموضة 7.0.
- ماصة بلطف صعودا وهبوطا لتغسل حبات وبيليه بواسطة الطرد المركزي في microcentrifuge (2 دقيقة في 16000 x ج).
- إزالة بعناية طاف مع ماصة وتجاهل. resuspend الكرية حبة في 1 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة الطازجة وكرر الخطوة الغسيل. resuspend الكرية حبة في 0.8 مل من برنامج تلفزيوني.
- إضافة 200 مل من الطازجة 10 ملي سلفو-SMPB، لإعطاء تناسق النهائيالتموينية من 2 ملم.
- احتضان تعليق حبة لمدة 1 ساعة عند 25 درجة مئوية على عجلة دوارة.
- انخفاض البروتين:
- خلال فترة الحضانة للخطوة التنشيط، وإعداد البروتين للخطوة التالية اقتران ذلك يمكن إضافتها مباشرة إلى الخرز تفعيلها.
ملاحظة: على الرغم من أن هذه الخطوة للحد من ليس مطلوبا دائما لGST (الجلوتاثيون S-ترانسفيراز) البروتينات الانصهار، فمن المستحسن لضمان كفاءة اقتران عالية.- تحقق من تركيز البروتين، وتكييفه مع التركيز النهائي المطلوب للتفاعل اقتران. ملاحظة: 6 مم البروتين في برنامج تلفزيوني، وعادة ما تستخدم لحجم 1 مل.
- إضافة الأسهم TCEP لإعطاء تركيز النهائي من 5 ملم. احتضان الحل لمدة 30 دقيقة في RT.
ملاحظة: خليط التفاعل يمكن استخدامها مباشرة للتفاعل اقتران التالية. - الإبقاء على كمية صغيرة (عدد قليل مل) من محلول البروتين لتحديد الموالي تركيز البروتين وحساب كفاءة اقتران (انظر القسم 2).
- خلال فترة الحضانة للخطوة التنشيط، وإعداد البروتين للخطوة التالية اقتران ذلك يمكن إضافتها مباشرة إلى الخرز تفعيلها.
- البروتين اقتران الخطوة:
- بيليه الخرز تفعيلها من خلال الطرد المركزي (2 دقيقة، 16000 x ج في microcentrifuge)، ويغسل بيليه مرة واحدة في 1 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة الطازجة.
- resuspend الكرية في حل البروتين استعداد (على سبيل المثال، 1 مل)، لإعطاء تركيز البروتين المطلوب.
ملاحظة: إن تركيز البروتين خلال خطوة اقتران تعتمد على متوسط كفاءة اقتران (انظر القسم 2 لتحديد كفاءة اقتران) وكثافة اقتران المطلوب (كما تحسب في 1.1.4.3). كفاءة ما يقرب من 85٪ والمطلوب التركيز النهائي 5 ملم في تعليق 10X حبة، لذلك تركيز البروتين خلال خطوة اقتران يجب أن يكون حوالي 6 ملم. - حساب كثافة اقتران باستخدام الصيغة التالية:
JPG "/> حيث
ρ ج كثافة اقتران [عدد جزيئات البروتين / نانومتر 2]،
بروتين تركيز البروتين اضرب [مغ / مل]،
البروتين M ث البروتين الوزن الجزيئي [دا]،
حبة اضرب تركيز حبة [عدد حبات / L]،
قطر د حبة [نانومتر 2]
عدد أفوجادرو - استخدام كثافة اقتران لحساب متوسط التباعد يجند:
- احتضان تعليق البروتين حبة لمدة 2 ساعة على 25 درجة مئوية على عجلة دوارة.
ملاحظة: بعضالبروتينات قد لا تكون مستقرة في RT. في هذه الحالات، فإن رد فعل يمكن القيام بها في 4 درجات CO / N. - تعطيل المتبقية الجماعات تفعيلها على الخرز بإضافة الأسهم السيستين إلى تركيز النهائي من 50 ملم واحتضان تعليق لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة 25 مئوية على عجلة دوارة. بيليه الخرز بواسطة الطرد المركزي (2 دقيقة، 16000 x ج في microcentrifuge).
- الحفاظ على طاف لتحديد تركيز البروتين وحساب كفاءة اقتران (انظر القسم 2).
- يغسل بيليه حبة مرتين مع 1 مل PBS و resuspend في 1 مل PBS جديدة لإعطاء المنتج النهائي.
ملاحظة: إن البروتوكول أعلاه تعطي عادة 1 مل من البروتين بالإضافة، بتركيز نهائي من 5 ملي البروتين، والتي يمكن أن تستخدم الأسهم 10X لتجارب لاحقة (انظر القسم 3). - للشروع في الباب 3 من البروتوكول، والعمل مع 100 مل / مل من الأسهم حبة، أو في التركيز النهائي من 500 نانومتر البروتين. ملاحظة: هناك نقطة انطلاق جيدة لهذا الاجراءسوف يكون ه 2 × 10 12 حبات / مل، مما أدى إلى متوسط الكثافة اقتران 3 × 10 -4 البروتينات / 2 نانومتر أو متوسط المباعدة بين 57 نانومتر على حبة من 2 مم.
- إعداد الكواشف:
- اقتران اتجاهي ثيول-كربوكسي
ملاحظة: هذا البروتوكول هو مناسبة لاقتران السيستين التي تحتوي على البروتينات والخرز البوليسترين-functionalized الكربوكسيل. يتم تنشيط شاردة الكربوكسيل أولا باستخدام 1-إيثيل-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) / N-hydroxysuccinimide (NHS)، أمين المعدلة ومن ثم عبر المرتبطة باستخدام سلفو-SMPB (الشكل 2).
يتم تنشيط الشكل 2. الصليب ربط الاستراتيجية المستخدمة لاتجاهي اقتران ثيول-الكربوكسيل من البروتينات لحبات البوليمر. الخرز البوليسترين Carboxylated أولا مع EDC وتعديلها مع NHS لتشكيل شبه مستقر NHS استر. اللاحق أمين اقتران من ethylenediالنتائج الأمينات في مجموعة أمين حرة، الذي يتفاعل مع سلفو-SMPB. تنشيط Maleimide يمكن الخرز ثم تتفاعل مع cysteines حر في إتجاهي البروتينات الزوجان إلى الخرز. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.- إعداد الكواشف:
- إعداد برنامج تلفزيوني (100 ملي فوسفات الصوديوم، 150 ملي كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.0) والأوتوكلاف.
- إعداد الأسهم 100X (0.5 M أو 287 ملغ / مل في برنامج تلفزيوني،) من TCEP مباشرة قبل الاستعمال.
- إعداد 10X الأسهم (20 ملم أو 4 ملغ / مل في PBS) من EDC (1-إيثيل-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide) مباشرة قبل الاستعمال.
- إعداد 10X الأسهم (50 ملم أو 6 ملغ / مل في PBS) من NHS (N-hydroxysuccinimide) مباشرة قبل الاستعمال.
- إعداد الأسهم 5X (10 ملم أو 4.58 ملغ / مل في DH 2 O) من سلفو-SMPB مباشرة قبل الاستعمال.
- إعداد الأسهم 10X (500 ملم أو 88 ملغ / مل في برنامج تلفزيوني، ودرجة الحموضة 7.0) من السيستين فورا باستخدام efore.
- تفعيل حبة:
- خلط حبة التعليق من قلب بلطف وتحويل المبلغ المطلوب من تعليق حبة (على سبيل المثال، 12 مل) في أنبوب معقم 1.5 مل تحتوي على 1 مل PBS العقيمة، ودرجة الحموضة 7.0.
- ماصة بلطف صعودا وهبوطا لتغسل حبات وبيليه بواسطة الطرد المركزي في microcentrifuge (2 دقيقة في 16000 x ج).
- إزالة بعناية طاف مع ماصة وتجاهل.
- resuspend الكرية حبة في 1 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة الطازجة وكرر الخطوة الغسيل.
- resuspend الكرية حبة في 0.8 مل من برنامج تلفزيوني.
- إضافة 100 مل من 10X EDC الأوراق المالية (2 ملي التركيز النهائي) وعلى الفور 100 مل من 10X NHS حل سهم (5 ملي تركيز النهائي) إلى تعليق حبة.
- احتضان تعليق حبة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة 25 مئوية على عجلة دوارة.
- تغسل حبات مرة واحدة في 1 مل من برنامج تلفزيوني و resuspend في 0.8 مل PBS العقيمة الطازجة.
- إضافة 200 مل الإيثيلين، والمؤتمر الوطني العراقيubate تعليق حبة لمدة 1 ساعة عند 25 درجة مئوية على عجلة دوارة.
- تغسل حبات مرة واحدة مع 1 مل PBS و resuspend حبات في 0.8 مل من برنامج تلفزيوني جديد.
- ننطلق من قسم 1.1.2.4 (تفعيل حبة مع سلفو-SMPB) كما هو موضح تحت القسم 1.1.2 واتبع بقية البروتوكول هو موضح في القسم 1.1 (ثيول الأمينات اقتران اتجاهي). أداء إعداد البروتين والخطوات البروتين اقتران بطريقة مماثلة لتلك التي وصفها في القسم 1.1.
ملاحظة: كفاءة اقتران نموذجية باستخدام هذا البروتوكول هو أقل قليلا بالمقارنة مع 1.1 القسم، وبالتالي ضبط تركيز البروتين الأولي وفقا لذلك لتحقيق نفس كثافة اقتران (تقريبا 75٪).
- إعداد الكواشف:
2. تحديد كفاءة اقتران
ملاحظة: لتحديد تركيز البروتين، استخدم برادفورد الكاشف 10 والمقايسات اللونية على النحو التالي:
- بلطف عكس برادفورد الكاشف إلى البريد nsure تجانس الكاشف.
- باستخدام 10 ملغ / مل محلول المخزون BSA، وإعداد معايير البروتين تغطي تركيزات 0،1-1،5 ملغ / مل BSA في المخزن.
- إضافة 250 مل من برادفورد الكاشف للآبار لوحة 96-جيدا. إعداد ما يكفي من الآبار لجميع العينات والمعايير البروتين وضوابط السلبية (العازلة فقط).
- إضافة 5 مل من عينة بروتين (معايير البروتين أو عازلة، من أجل السيطرة السلبية) إلى الكاشف في لوحة 96-جيدا.
- احتضان لوحة على شاكر المداري في RT لمدة 10 دقيقة.
- قياس الامتصاصية في 595 نانومتر باستخدام قارئ لوحة.
- توليد منحنى مستوى تركيز BSA مقابل A595 نانومتر، واستخدام هذا لتحديد تركيزات البروتين في عينات أولية وطاف.
- حساب تركيز بروتين بالإضافة النحو التالي:
- حساب الكفاءة اقتران على النحو التالي:
00eq4.jpg "/>
3. استخدام حبة الديناميكي Adhesins في فحوصات المنافسة
- إعداد:
- البذور 1 مل لكل بئر من خلايا هيلا بتركيز 150،000 خلية / مل في 24 لوحة جيدا قبل يوم من فحص المنافسة، للسماح للخلايا لتصل إلى ما يقرب من 80٪ confluency قبل بدء التجربة.
- إعداد كل حالة تجريبية في ثلاث نسخ. وتشمل الآبار للضوابط السلبية (أي بكتيريا وأضاف خلال فحوصات المنافسة)، الضوابط الإيجابية (الخرز التحكم بالإضافة إلى الانصهار تمت إضافة علامة فقط خلال فحوصات المنافسة) والضوابط تحلل (للتجارب السمية الخلوية).
- تطعيم LB (MLB) ثقافة 5 مل البحرية مع مستعمرة جديدة من V. نظيرة الحالة للدم وتنمو O / N عند 30 درجة مئوية، والهز.
- إعداد كاف MAM-إلى جانب حبة، كما هو موضح في القسم 1. (اقتران). السماح ل 100 مل من 10X الأسهم حبة لكل بئر.
- فحص البطولة:
- في يوم من competitالتجربة أيون، وقياس OD 600 من ثقافة البكتيرية.
- إعداد وسائل الاعلام العدوى عن طريق تمييع الثقافات البكتيرية في DMEM عديم اللون من دون إضافات، قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية، تحتوي على 10٪ حجم / حجم حبة تعليق (إما حبات الخرز أو السيطرة يقترن adhesin)، لإعطاء وزارة الداخلية من 10. إعداد 1 مل / جيد و 10-20٪ حجم الفائض في العينة. ملاحظة: للحصول على الشروط المذكورة أعلاه (لوحة 24-جيدا، V. نظيرة الحالة للدم، وزارة الداخلية 10)، وحجم اللازم من O / N الثقافة التي يمكن ان تضاف لكل بئر (مل / مل) تحسب على النحو 3 / OD 600 من ثقافة. على سبيل المثال، 1 مل من إصابة متوسطة سوف تحتوي عادة على 100 مل حبة التعليق، وعدد قليل مل من ثقافة البكتيرية ويتم تصل إلى 1 مل مع عديم اللون، DMEM unsupplemented.
- إزالة المتوسطة القديمة من الآبار وغسل خلايا هيلا مثقف عن طريق إضافة 1 مل من عقيم قبل تحسنت PBS إلى 37 درجة مئوية إلى كل بئر.
- إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 1 مل من الإصابة المتوسطة لكل بئر. كذلك وضعت ضوابط، وذلك بإضافة حلول تابعaining الخرز السيطرة والبكتيريا (مراقبة إيجابية) أو حبات adhesin وليس بكتيريا (ضوابط السلبية)، أو DMEM تحتوي على 0.1٪ تريتون X-100 (مراقبة تحلل، الضرورية فقط لقياس السمية الخلوية).
- احتضان لوحة في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية لمدة المبلغ المطلوب من الزمن (مثلا 4 ساعات لقياس السمية الخلوية أو 1 ساعة لقياس التصاق).
ملاحظة: كل من التصاق البكتيريا والسمية الخلوية في الخلايا المضيفة ويمكن استخدام الرافضة قراءة لفعالية تثبيط. وإذا صاحبت النقاط وقت القياسات السمية الخلوية والالتصاق، يمكن إجراء فحوصات على حد سواء باستخدام عينات من نفس البئر، حيث يتم تحديد السمية الخلوية باستخدام طاف الثقافة والتعلق المقايسات استخدام عينات المستمدة من طبقة الخلايا المتبقية.
- قياسات سمية الخلايا:
- في نقطة زمنية المشار إليها (على سبيل المثال، 4 ساعة بعد العدوى)، وإزالة ثلاث مرات 200 مل من كل جيدا 24 ونقل إلىلوحة 96-جيدا.
- تدور لوحات 96-جيدا في 1500 x ج، 5 دقيقة، ونقل 100 مل من كل بئر في لوحة 96-جيدا جديدة. إضافة 100 مل من وسائل الإعلام المستخدمة خلال التجارب العدوى إلى آبار جديدة من لوحة 96-جيدا في ثلاث نسخ (وسوف تستخدم هذه كما الفراغات).
- تنفيذ اللاكتات فحص نازعة (LDH) الإفراج باستخدام الكشف عن عدة LDH السمية الخلوية وبعد تعليمات الشركة الصانعة.
- لفترة وجيزة، وحساب كمية كاشف اللازمة في الزيادات من 25 (على سبيل المثال، إذا 62 العينات المراد قياسها، وجعل ما يكفي من مزيج كاشف لل75 الخ).
- على سبيل المثال، عن 100 عينة، مزيج 11.25 مل من كاشف A مع 250 ميكرولتر من كاشف B. المقلوب، لا الدوامة لتجنب الرغوة.
- وضع الخليط في خزان لتكون قادرة على الماصة مع ماصة متعدد القنوات. إضافة 100 ميكرولتر من مزيج كاشف لكل عينة.
- احتضان لوحة في RT وقراءة الامتصاصية في 490 نانومتر على قارئ لوحة في 10 و 20 و 30 دقيقة. تحليل مجموعة البيانات التي الامتصاصية من العينة الضابطة تحلل مرتفع ولكن لا يزال ضمن نطاق خطية من قارئ لوحة (عادة 2-3 وحدات الامتصاصية).
- التعبير عن النتائج كنسبة مئوية السمية الخلوية، وذلك باستخدام الصيغة التالية للتحويل:
- قياس التصاق البكتيريا:
- في نقطة زمنية المشار إليها (على سبيل المثال، 1 ساعة بعد العدوى)، وإزالة وسائل الاعلام من طبقة الخلايا.
- تماما غسل طبقة الخلايا مع معقم، قبل تحسنت PBS (على الأقل 3-4 يغسل من 1 مل PBS لكل منهما) لإزالة أي خلايا من الامم المتحدة والمرفقة.
- الخلايا المضيفة ليز بإضافة 1 مل من معقم 1٪ ت / ت تريتون X-100 الحل في برنامج تلفزيوني لكل بئر. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- ماصة لكل عينة صعودا وهبوطا عدة مرات قبل نقل محتويات كل بئر لفصل 1.5 مل أنابيب. إعداد 10 أضعاف التخفيفات المسلسل من العيناتفي برنامج تلفزيوني العقيمة (على سبيل المثال، استخدم 100 مل من عينة و 900 مل من PBS).
- لوحة 100 مل من كل عينة على MLB أجار وانتشر استخدام رش الخلية. تحسين والتخفيفات لوحة اعتمادا على السلالات البكتيرية ونقطة زمنية. ملاحظة: للحصول على الإعداد التجريبية وصفها، تعطي 10 5 أو 10 6 التخفيفات أضعاف عدد مناسب من CFUs.
- احتضان لوحات عند 37 درجة CO / N وتعداد البكتيريا عن طريق مستعمرة العد.
Representative Results
وV. نظيرة الحالة للدم adhesin MAM7 يحتوي على سبعة جنبا إلى جنب إدخال خلية الثدييات (MCE) المجالات المعنية تقديرا لمستقبلات سطح المضيف. كنا الخرز البوليسترين بالإضافة إلى المؤتلف، شظايا النقاء تشمل إما كافة المجالات سبعة جنبا إلى جنب MCE (MAM7) أو فقط المجال MCE الأول (MAM1) لاختبار قدرة هذه المواد على المنافسة مع V. نظيرة الحالة للدم للخلية المضيفة ملزمة وفعالية الناتجة من هذه المواد ومثبطات التصاق. أصيب خلايا هيلا مع V. تم تقييم نظيرة الحالة للدم سلالة POR1، والسمية الخلوية الناتجة عن العدوى في المختبر بعد 4 ساعات (الشكل 3). أسفرت علاج خلايا هيلا مع 0.1٪ تريتون X-100 (مراقبة تحلل الإيجابية) في كامل تحلل الخلايا، والخلايا غير المصابة عرض مستويات منخفضة جدا للخلايا. أدى في المختبر إصابة الخلايا غير المعالجة مع POR1 في مستويات عالية جدا من تحلل الخلية، وهذا كان مستعمل من قبل MAM7 المشتركupled الخرز ولكن ليس MAM1 جانب أو الخرز ضبط بالإضافة GST (الشكل 3).
الشكل 3. توصيف الضمة نظيرة الحالة للدم يسببها السمية الخلوية في الخلايا الظهارية خلال فحوصات المنافسة. وعولج الخلايا مع V. نظيرة الحالة للدم (نائب الرئيس)، المشار إليها بالرمز (+)، أو أي بكتيريا (-) في وجود مختلف الكيانات المتنافسة (. شركات) كما هو مبين. وشملت هذه إما لم شركات. (-)، الخرز MAM7 (MAM7)، الخرز MAM1 (MAM1) أو حبات السيطرة GST (GST). والضوابط، تم علاج الخلايا إما مع تريتون X-100 (تريتون، ومراقبة تحلل)، أو ترك غير مصاب (uninf). وقد تم قياس الإفراج LDH بعد 4 ساعات كما هو موضح في الباب 3، والنتائج تطبيع لضوابط تريتون (100٪) والفراغات (0٪) كما هو موضح أعلاه. النتائج هي وسائل ± ووزارة شؤون المرأة من التجارب ثلاث نسخ. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تعداد V. كشفت نظيرة الحالة للدم تعلق إما خلايا هيلا غير المعالجة، أو الخلايا المحتضنة مع MAM7-، MAM1-، أو حبات السيطرة GST، أن MAM7 الخرز ولكن ليس MAM1- او الخرز السيطرة GST- تكومبيتي V. نظيرة الحالة للدم لمرفق لاستضافة مستقبلات سطح الخلية (الشكل 4).
الرقم 4. توصيف التصاق البكتيريا خلال التجارب المنافسة. أصيب خلايا هيلا مع V. نظيرة الحالة للدم POR2 (نائب الرئيس +)، في غياب (-) أو وجود الكيانات المتنافسة على النحو التالي: الخرز MAM7 (MAM7)، الخرز MAM1 (MAM1) أو حبات السيطرة GST (GST) (شركات). وقد تم قياس التصاق البكتيريا بعد 1 ساعة، كما هو موضح في القسم 3. النتائج هي وسائل ± ووزارة شؤون المرأة من التجارب ثلاث نسخ. يعني (FLTR في كفو / مل) هي 2.3010 6، 5 1.5310، 2.0510 6، 6 2.1210. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Adhesins بالإضافة إلى fluorophore المسمى حبات يؤدي إلى توليد المواد التي تحاكي التصاق البكتيريا إلى الخلايا المضيفة وهي أدوات قوية للتصوير الخلوي (الشكل 5). باستخدام MAM7 جانب الخرز الأزرق الفلورسنت، ونحن اتسمت بها عملية الحجز MAM7 بوساطة الخلايا الظهارية. أدى الحجز على MAM7 الخلايا المضيفة في الأكتين إعادة ترتيب وتشكيل ألياف الإجهاد، والتي كانت المشترك تصور باستخدام رودامين-phalloidin إلى وصمة عار لF-الأكتين (الشكل 5B).
_upload / 53400 / 53400fig5.jpg "/>
الرقم 5. إعداد واستخدام fluorophore المسمى الخرز الجزيئية الحيوية لأغراض التصوير. (A) إيقاف الفلورسنت الخرز بيوميمتيك الزرقاء (أنبوب المناسب، 10X الأسهم) والعازلة التحكم (أنبوب الأيسر). (ب) مرفق من الخرز MAM7 بالإضافة إلى هيلا النتائج الخلايا في إعادة ترتيب الأكتين وتكوين ألياف الإجهاد. تم تصوير الألياف مرفق من الخرز الأزرق الفلورسنت وأدى التوتر الأكتين (الحمراء، ملطخة رودامين-phalloidin) بواسطة المجهر. بار، 10 ميكرون. تم تكييف الصور في لوحة B من ليم وآخرون. (1) وتتكرر تحت رخصة المشاع الإبداعي العزو. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
هنا، وصفنا بروتوكولين، والتي يمكن استخدامها للبروتينات التي تحتوي على ثيول زوجين لamine- او الخرز البوليسترين المعدلة الكربوكسيل، على التوالي. نظرا لسهولة هذا الإجراء، ثيول-أمين اقتران هو الأفضل، ولكن اعتمادا على مواصفات حبة المطلوب (قطر، خصائص مضان)، واستخدام الخرز functionalized أمين قد لا يكون ممكنا وقمنا بالتالي تضمن البروتوكول الذي سيتم تحويل الكربوكسيل - إلى شاردة أمين لإعطاء الباحث أكبر قدر ممكن من المرونة في اختيار سقالة. على الرغم من أن كلا ثيول-أمين وثيول-الكربوكسيل عمل اقتران لأي السيستين التي تحتوي على البروتين، واقتران الاتجاه (أي الشلل في البروتين لكل من N-محطة، ومحاكاة سطح الشاشة) يتطلب البروتين دون بقايا السيستين، التي يتم إنتاجها كما الانصهار GST البروتين، أو التي تحتوي على واحدة محطة بقايا السيستين الذي عرضته موقع الموجهة الطفرات. إذا ما تم احتواء متعددة cysteines رد الفعلداخل البروتين، وهذا سوف يؤدي إلى الشلل العشوائي الذي قد يعرقل وظيفة البروتين. العديد من adhesins البكتيرية لا تحتوي على cysteines بشكل طبيعي. بالنسبة للآخرين، وهذه قد يمكن إزالتها عن طريق موقع موجه الطفرات، على الرغم من أن ذلك يتطلب فحوصات مكثفة لضمان الاحتفاظ بنية الأصلي وظيفة في متحولة. لGST البروتينات الانصهار، والنقاء GST-العلامة جانب لحبات يمكن أن تستخدم لمراقبة سلبية مناسبة. باستخدام الخرز وفكت كعنصر تحكم ينبغي تجنبها، وهذه غالبا ما يكون الميل العالي لتتجمع معا أو الانضمام إلى خلايا غير وجه التحديد. نسخة مبسطة من بروتوكول 1.2، فقط باستخدام EDC، ويمكن استخدامها للبروتينات الزوجين الخرز البوليمر functionalized الكربوكسيل، ولكن في هذه الحالة اقتران تتم عن طريق الأمينات الأولية في البروتين، وبالتالي لا يضمن اقتران الاتجاه.
TCEP كعامل مختزل يجب عدم استبدال غيرها من عوامل خفض المتاحة تجاريا والتي يشيع استخدامها، مثل dithiothreitol (DTT) أو 2-المركابتويثانول (BME)، كما التجولات الواردة في داخلها سوف تتنافس مع البروتين اقتران في خطوة اقتران ثيول maleimide. PBS يمكن استبدال مع مخازن أخرى، ولكن مع الاعتبارات التالية: قد لا يحتوي على المخازن الأمينات الأولية (حتى مخازن تريس التي تحتوي على ليست مناسبة). استخدام المخازن التي تحتوي على (<10MM) تركيزات منخفضة جدا الملح يؤدي إلى تراكمها وحبة كما ينبغي تجنبها. نقاء البروتين هو أيضا عامل مهم للنظر خلال هذا الإجراء، والحصول على بيانات ذات جودة عالية، وينبغي أن تستخدم بروتينات نقية. نحن بشكل روتيني تنقية البروتينات في خطوات متعددة، بما في ذلك على الأقل خطوة تنقية تقارب والترشيح هلام، ولكن يحدث في بعض الحالات التبادل الأيوني اللوني كخطوة ثالثة. ونتيجة لذلك نقاء البروتينات المستخدمة لاقتران هو عادة 90٪ أو أعلى، كما تقرره SDS-PAGE.
فمن المستحسن لتحديد تركيزات البروتين سواء في خليط التفاعل الأولي وكذلك من الالبريد طاف بعد الانتهاء رد فعل. هذا سوف يساعد على تحديد تركيز واضح من البروتين بالإضافة حبة، وبالتالي كثافة اقتران. وتحديد كل من القيم أيضا تسمح حساب كفاءة اقتران. يمكن أن يؤخذ هذا في الاعتبار عند إعداد الحل البروتين الأولي في التفاعلات اللاحقة، لتحقيق التركيز واقتران النهائية الكثافة المطلوبة. هي مناسبة برادفورد كاشف ولا سيما لتحديد تركيز البروتين قبل وبعد رد فعل اقتران، لأن أيا من المواد في رد فعل يتداخل مع تشكيل الصبغة المعقدة في التراكيز المستخدمة. إذا تركيزات البروتين أقل لاستخدامه، قد يكون هذا الأسلوب لتحل محلها طريقة الكشف أكثر حساسية، ولكن الاهتمام يجب أن يدفع ذلك إلى حقيقة أن لديها لتكون متوافقة مع المواد الواردة في رد فعل اقتران. ويوصى أيضا إلى استخدام الطازجة الكواشف والتعامل مع المواد الكيميائية مسحوق مع الرعاية (على سبيل المثال، مخزن في حاوية مغلقة واستخدام الخرز السيليكا، لتجنب الكواشف رسم الرطوبة) منذ نوعية الكواشف سوف تؤثر على كفاءة اقتران. اذا كانت كفاءة اقتران أقل مما كان متوقعا، والعلاجات المحتملة تشمل زيادة تركيزات حبة والبروتين الأولية. إذا كان يتم استخدام تركيزات أعلى، وتركيز الكواشف اقتران لابد من زيادة نسبيا لضمان زيادة المولي كافية. تعديل تركيزات حبة / البروتين وعادة ما يكون خطوة أفضل نحو التحسين بدلا من زيادة أوقات رد الفعل. منذ بروتوكولات للحبة اقتران تستغرق وقتا طويلا، ونحن عادة إعداد دفعة كبيرة من المواد. aliquots من تعليق يمكن تجميد المفاجئة في النيتروجين السائل وتخزينه في -20 درجة مئوية لعدة أشهر. لا ينبغي أن refrozen قسامات إذابة ويجب أن تبقى في 4 درجات مئوية وتستخدم في غضون 1-2 أيام. ومع ذلك، فإن هذا سوف تختلف مع طبيعة واستقرار بروتين يستخدم كما يجب اختبارها على دفعة صغيرة في البداية.
الصورة = "jove_content"> adhesins حبة الديناميكي يمكن استخدامها في العديد من التطبيقات، كما هو مبين أدناه. ووصف هذا البروتوكول مقايسة يستخدم عادة لقياس تثبيط للخلايا ملزمة وبوساطة العوامل المسببة للأمراض البكتيرية في الخلايا المضيفة. يتم إجراء الفحص عادة لقياس قدرة MAMs يقترن حبة لمنع تنافسية إصابة الخلايا الظهارية هيلا مع البحر التي تنقلها الأغذية الممرض الضمة نظيرة الحالة للدم، وذلك باستخدام إما انخفاضا في التصاق البكتيريا الى الخلايا المضيفة أو تخفيض السمية الخلوية كما للقراءة خارج . في كلتا الحالتين، وإعداد المقايسات والمنافسة تتبع نفس البروتوكول. اعتمادا على قراءات، سلالات مختلفة من V. تستخدم نظيرة الحالة للدم: سلالة السامة للخلايا يستخدم POR1 لقياس السمية الخلوية، في حين تم استخدام نوع غير السامة للخلايا POR2 لقياس التصاق البكتيريا، منذ موت الخلايا والخلايا المفرزة يهدد الإجراء لقياس البكتيريا المرفقة.
في البداية، تعوضأقيمت التجارب tition لتكون بمثابة خطوة حكيمة بروتوكول، حيث كانت الخلايا المضيفة الأولى المحتضنة مسبقا مع حبات قبل إضافة البكتيريا. لV. نظيرة الحالة للدم والمواصفات حبة المستخدمة (2 ميكرومتر الخرز بالإضافة إلى MAM7)، وكلاهما الخرز والبكتيريا ويمكن أن يضاف في نفس الوقت دون تغييرات في السمية الخلوية الناتجة عن ذلك. بمعنى آخر، في هذا الإعداد التجريبية، والخرز تكومبيتي البكتيريا عن الخلية المضيفة ملزمة. اعتمادا على هندسة الأنواع البكتيرية وحبة المستخدمة، قد تكون هناك أسباب وجيهة للحفاظ على التصاق حبة والعدوى البكتيرية كما خطوتين منفصلتين. على سبيل المثال، لتصيب الخلايا مع البكتيريا غير متحركة، لوحات وطرد عادة بعد إضافة وسائل الإعلام العدوى. ومع ذلك، ينبغي تجنب الطرد المركزي لوحات تحتوي على تعليق حبة، لأن هذا يؤدي إلى التوزيع غير المتكافئ للغاية من الخرز على طبقة الخلايا. إذا كان يتم استخدام أحجام الجسيمات الصغيرة، والخرز يستغرق وقتا أطول لتسوية على سطح الخلية، وفي هذه الحالة سووينبغي أن يسمح الوقت fficient لمرفق حبة مسبق للعدوى. عند استخدام التصاق البكتيريا باعتباره تلا، يجب أخذ العينات في نقاط زمنية حيث لا تلف الخلايا المضيفة بشكل كبير من سلالة تصيب، وانفصال الخلايا وتحلل ويمكن أن تمس الكمي من البكتيريا المرفقة.
بدلا من تعداد التصاق البكتيريا بواسطة الطلاء التخفيف، قد بدلا من معالجتها عينات للتصوير (الشكل 5). في هذه الحالة، يجب أن المصنف الخلايا زراعة الأنسجة على زلات غطاء زجاجي، وليس مباشرة في الآبار. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام الخرز والبكتيريا الفلورسنت معربا عن بروتين فلوري، جنبا إلى جنب مع علامات الخلية المضيفة عدوى محددة. على سبيل المثال، يتم تصوير التجارب المنافسة عادة باستخدام أحمر فلوري رودامين-phalloidin وصمة عار على الخلايا المضيفة الأكتين الهيكل الخلوي وتقييم التغيرات المورفولوجية الناتجة عن العدوى، جنبا إلى جنب مع الخرز الأزرق الفلورسنت والفلورسنتالأخضر (GFP التعبير عن أو SYTO18 الملون) البكتيريا.
وهناك مجموعة من adhesins يقترن حبة، بما في ذلك المكورات العنقودية الذهبية FnBPA، العقدية المقيحة F1 FUD والضمة نظيرة الحالة للدم MAM، وقد استخدمت كمواد المحاكاة البيولوجية لدراسة التصاق، التصاق تثبيط ومساهمة الانضمام إلى بوساطة الممرض سمية الخلايا 1 و 7 و 8. واحدة من مزايا استخدام هذا النهج هو سهولة التصور الأحداث المرفق، منذ الخرز البوليمر استخدام السقالات متوفرة في مجموعة واسعة من الألوان (على سبيل المثال، أزرق، أحمر فلوري والأزرق والأخضر والبرتقالي). وهكذا، ووضع العلامات البروتين المباشر، والتي قد تتداخل مع وظيفة، يمكن تجنبها. بالإضافة إلى ذلك، سطح يقلد اقتران العرض متعددي من adhesins على سطح البكتيرية، مما يعكس التشكل أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية بالمقارنة مع بروتينات قابلة للذوبان.
بالمقارنة مع الدراسات التي تستخدم البكتيريا سليمة أو البكترياالمسوخ القاعدة ونهج حبة تلتف المشاكل المرتبطة نمو البكتيريا. على سبيل المثال، وعلى المدى الطويل (على سبيل المثال، O / N) غالبا ما يثير الشبهة دراسات التصاق البكتيريا إلى الخلايا باستخدام البكتيريا سليمة استضافة الظواهر المصاحبة نمو البكتيريا - تحمض استنزاف متوسطة النمو والمغذيات تؤثر سلبا على الخلايا المضيفة، وتكرار البكتيرية يضر في نهاية المطاف جودة التصوير.
وفي الآونة الأخيرة، وقد تم تمديد استخدام adhesins يقترن حبة لتشمل استخدامهم كأدوات للالتنقيات تقارب من المضيف الخلوية العوامل التي تدخل في عمليات المصب من التصاق البكتيريا الإشارة. V. نظيرة الحالة للدم MAM7، عن طريق ملزمة لالأحماض الفسفاتيديك في غشاء الخلية المضيفة، وموجبات تفعيل RhoA والأكتين إعادة ترتيب 1 و 3. ويجري استخدام الخرز يقترن MAM لتنقية وتحديد البروتينات المشاركة في منصات الإشارات تجميعها نتيجة لخلية MAM-المضيفة ربط. منذ الخرز يمكنبسهولة يمكن فصلها من طاف بواسطة خطوة الطرد المركزي قصيرة، ويقترن البروتين من الفائدة تساهميا، وهذا هو وسيلة جيدة لتحقيق الانفصال عن البروتينات الملوثة وإثراء مجمعات البروتين ذات الصلة، والتي يمكن استخدامها لتطبيقات المصب مثل البروتينات أو ويسترن النشاف.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Sigma | 646547 | Danger; corrosive can be bought as solution or freshly prepared |
| Sulfosuccinimidyl 4-(p-maleimidophenyl)butyrate (Sulfo-SMPB) | Fisher | PN22317 | Danger; toxic |
| L-cysteine | Sigma | 30089 | Danger; toxic |
| Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent blue - aqueous suspension, 2.0 μm mean particle size | Sigma | L0280 | harmful; a range of alternative particle sizes and colors is available |
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC) | Thermo scientific | 22980 | |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Thermo scientific | 24500 | |
| Carboxylate-modified polystyrene beads | Sigma | CLB9 | harmful; a range of alternative particle sizes and colors is available |
| Ethylenediamine | Sigma | E26266 | Danger; flammable, corrosive, toxic, sensitizing |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Promega | W3841 | |
| Bradford reagent | Sigma | B6916 | Danger; corrosive and toxic |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose - With 4,500 mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine, sodium pyruvate, and phenol red, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | D1145 | for infection experiments |
| DMEM | Sigma | D6429 | for maintenance of cultured host cells |
| Fetal Bovine Serum, heat inactivated | Sigma | F9665 | supplement for tissue culture medium |
| Penicillin-Streptomycin - Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
Sigma | F9665 | supplement for tissue culture medium |
| PBS | Sigma | D8537 | |
| LDH Cytotoxicity detection kit | Takara | MK401 | |
| Plasticware | |||
| reagent reservoirs (25ml) | SLS | F267660 | |
| 24-well plates | Greiner | 662160 | |
| 96-well plates | Greiner | 655182 | |
| Equipment | |||
| haemocytometer | |||
| microcentrifuge | |||
| plate reader | |||
| tissue culture facilities | |||
| multichannel pipette |
References
- Lim, J., Stones, D. H., Hawley, C. A., Watson, C. A., Krachler, A. M. Multivalent Adhesion Molecule 7 clusters act as signaling platform for host cellular GTPase activation and facilitate epithelial barrier dysfunction. PLoS Pathog. 10 (9), e1004421 (2014).
- Krachler, A. M., Ham, H., Orth, K. Outer membrane adhesion factor multivalent adhesion molecule 7 initiates host cell binding during infection by gram-negative pathogens. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (28), 11614-11619 (2011).
- Krachler, A. M., Orth, K. Functional characterization of the interaction between bacterial adhesin multivalent adhesion molecule 7 (MAM7) protein and its host cell ligands. J Biol Chem. 286 (45), 38939-38947 (2011).
- Joh, D., Speziale, P., Gurusiddappa, S., Manor, J., Hook, M. Multiple specificities of the staphylococcal and streptococcal fibronectin-binding microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules. Eur J Biochem. 258 (2), 897-905 (1998).
- Bingham, R. J., et al. Crystal structures of fibronectin-binding sites from Staphylococcus aureus FnBPA in complex with fibronectin domains. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105 (34), 12254-12258 (2008).
- Ensenberger, M. G., et al. Specific interactions between F1 adhesin of Streptococcus pyogenes and N-terminal modules of fibronectin. J Biol Chem. 276 (38), 35606-35613 (2001).
- Hawley, C. A., Watson, C. A., Orth, K., Krachler, A. M. A MAM7 peptide-based inhibitor of Staphylococcus aureus adhesion does not interfere with in vitro host cell function. PLoS One. 8 (11), e81216 (2013).
- Krachler, A. M., Ham, H., Orth, K. Turnabout is fair play: use of the bacterial Multivalent Adhesion Molecule 7 as an antimicrobial agent. Virulence. 3 (1), 68-71 (2012).
- Krachler, A. M., Mende, K., Murray, C., Orth, K. In vitro characterization of multivalent adhesion molecule 7-based inhibition of multidrug-resistant bacteria isolated from wounded military personnel. Virulence. 3 (4), 389-399 (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
