Protocol
1. Kjemisk Kobling av proteiner til polymerperler
- Tiol-amin retnings kobling
Merk: Denne protokollen er egnet for kobling av cystein inneholdende proteiner og amin-funksjonalisert polymerperler ved bruk av sulfosuccinimidyl 4- (p -maleimidophenyl) butyrat (Sulfo-SMPB) som tverrbindingsmiddel (figur 1).
Figur 1. Kryssbindings strategi som brukes for retnings tiol-amin kobling av proteiner til polymerperler. Amin-modifisert polystyren perler blir aktivert med Sulfo-SMPB. Maleimidet reagerer med frie cysteiner til retnings par proteiner til perler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.- Forberedelse av reagenser:
- Forbered PBS (100 mM natriumfosfat, 150 mM NaCl, pH 7,0) og autoklav. Forbered en 100x lager (0,5 M eller 287 mg / ml i PBS) av TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine) umiddelbart før bruk.
- Forbered en 5x lager (10 mm eller 4,58 mg / ml i dH 2 O) fra Sulfo-SMPB umiddelbart før bruk.
- Forbered en 10x lager (500 mm eller 88 mg / ml i PBS, pH 7,0) av cystein umiddelbart før bruk.
- Perlene aktivering:
- Bland perlesuspensjon ved forsiktig å invertere og overføre den nødvendige mengde perlesuspensjon (for eksempel, 12 ml) i et sterilt 1,5 ml rør inneholdende 1 ml steril PBS, pH 7,0.
- Forsiktig pipettere opp og ned for å vaske perlene og pellet ved sentrifugering i en mikrosentrifuge (2 min ved 16 000 xg).
- Fjern forsiktig supernatanten med en pipette og kast. Resuspender pelleten kulen i 1 ml friskt sterilt PBS og gjenta vasketrinnet. Resuspender pelleten kulen i 0,8 ml PBS.
- Tilsett 200 ml nyfremstilt 10 mM Sulfo-SMPB, for å gi en endelig concentrasjon av 2 mM.
- Inkuber perlesuspensjon i 1 time ved 25 ° C på et roterende hjul.
- Protein reduksjon:
- Under inkubasjonsperioden av aktiveringstrinnet, fremstille proteinet for følgende koblingstrinn slik at den kan umiddelbart tilsettes til de aktiverte perler.
Merk: Selv om denne reduksjonen trinnet er ikke alltid nødvendig for GST (glutation S-transferase) fusjonsproteiner, anbefales det å sikre en høy kopling effektivitet.- Kontroller proteinkonsentrasjonen, og justere den til den endelige konsentrasjonen som er nødvendig for koblingsreaksjonen. Merk: 6 mM protein i PBS, og et volum på 1 ml blir vanligvis brukt.
- Legg TCEP lager for å gi en endelig konsentrasjon på 5 mm. Inkuber løsningen i 30 minutter ved RT.
Merk: reaksjonsblandingen kan brukes direkte for den følgende koblingsreaksjon. - Beholde en liten mengde (noen få ml) i proteinoppløsningen for å bestemme pro protein konsentrasjon og beregning av koblings effektivitet (se kapittel 2).
- Under inkubasjonsperioden av aktiveringstrinnet, fremstille proteinet for følgende koblingstrinn slik at den kan umiddelbart tilsettes til de aktiverte perler.
- Protein koblingstrinn:
- Pellet aktiverte kuler ved sentrifugering (2 min, 16 000 x g i en mikrosentrifuge), og vaske pelleten gang i 1 ml friskt sterilt PBS.
- Resuspender pellet i den fremstilte proteinoppløsningen (f.eks, 1 ml), for å gi det ønskede proteinkonsentrasjon.
Merk: Proteinkonsentrasjonen i løpet av koblingstrinnet vil avhenge av den gjennomsnittlige koblingsgrad (se seksjon 2 for å bestemme koblingsgraden) og den ønskede koblingstetthet (som beregnet i 1.1.4.3). Virkningsgraden er ca. 85% og den ønskede sluttkonsentrasjon 5 mM i 10x kulesuspensjonen, slik at proteinkonsentrasjonen i løpet av koblingstrinnet, bør være ca 6 mM. - Beregn koblingstetthet ved hjelp av følgende formel:
jpg "/> der
ρ c koblingstetthet [antall proteinmolekyler / nm 2],
protein kons proteinkonsentrasjon [mg / ml]
protein M w protein molekylvekt [Da]
bead kons bead konsentrasjon [antall perler / L],
d perle diameter [nm 2]
Avogadros tall - Bruk koplingen tetthet for å beregne den gjennomsnittlige ligand Avstand:
- Inkuber protein-bead suspensjonen i 2 timer ved 25 ° C på et roterende hjul.
Merk: Noenproteiner kan ikke være stabil ved romtemperatur. I disse tilfeller kan reaksjonen bli utført ved 4 ° CO / N. - Deaktiveres gjenværende aktiverte grupper på kulene ved tilsetning av cystein lager til en endelig konsentrasjon på 50 mM, og suspensjonen inkuberes i 30 minutter ved 25 ° C på et roterende hjul. Pellet perlene ved sentrifugering (2 min, 16 000 x g i en mikrosentrifuge).
- Hold supernatanten for bestemmelse av proteinkonsentrasjon og beregning av koblingseffektivitet (se kapittel 2).
- Vask vulsten pellet to ganger med 1 ml PBS og resuspendert i 1 ml frisk PBS for å gi sluttproduktet.
Merk: Den ovennevnte protokoll vil typisk gi en ml av koblet protein, ved en sluttkonsentrasjon på 5 mM protein, som kan anvendes som et 10x lager for etterfølgende eksperimenter (se punkt 3). - For å gå videre til § 3 i protokollen, arbeide med 100 ml / ml perle lager, eller i en endelig konsentrasjon på 500 nM protein. Merk: Et godt utgangspunkt for denne procedure vil være 2 x 10 12 perler / ml, noe som resulterer i en gjennomsnittlig koplings tetthet på 3 x 10 -4-proteiner / nm 2 eller en gjennomsnittlig avstand på 57 nm på en perle av 2 mm diameter.
- Forberedelse av reagenser:
- Tiol-karboksv retnings kobling
Merk: Denne protokollen er egnet for kobling av cystein-inneholdende proteiner til karboksyl-funksjonaliserte polystyren perler. Karboksyldelen blir først aktivert ved anvendelse av 1-etyl-3- (3-dimetylaminopropyl) karbodiimid (EDC) / N-hydroksysuccinimid (NHS), amin-modifisert og deretter kryssbundet ved hjelp av Sulfo-SMPB (figur 2).
Figur 2. Kryssbindings strategi som brukes for retnings tiol-karboksyl kobling av proteiner til polymerperler. Karboksylerte polystyren-perler blir først aktivert med EDC og modifisert med NHS for å danne en semi-stabil NHS-ester. Påfølgende amin-kobling av etylendi-amin resulterer i en fri amingruppe, som reagerer med Sulfo-SMPB. Maleimid aktivert perler kan da reagere med frie cysteiner til retnings par proteiner til perler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.- Forberedelse av reagenser:
- Forbered PBS (100 mM natriumfosfat, 150 mM NaCl, pH 7,0) og autoklav.
- Forbered en 100x lager (0,5 M eller 287 mg / ml i PBS,) av TCEP umiddelbart før bruk.
- Tilbered en 10x lager (20 mM, og 4 mg / ml i PBS) EDC (1-etyl-3- (3-dimetylaminopropyl) karbodiimid) umiddelbart før bruk.
- Tilbered en 10x lager (50 mM, eller 6 mg / ml i PBS) av NHS (N-hydroksysuksinimid) umiddelbart før bruk.
- Forbered en 5x lager (10 mm eller 4,58 mg / ml i dH 2 O) fra Sulfo-SMPB umiddelbart før bruk.
- Forbered en 10x lager (500 mm eller 88 mg / ml i PBS, pH 7,0) av cystein umiddelbart before bruk.
- Perlene aktivering:
- Bland perlesuspensjon ved forsiktig å invertere og overføre den nødvendige mengde perlesuspensjon (for eksempel, 12 ml) i et sterilt 1,5 ml rør inneholdende 1 ml steril PBS, pH 7,0.
- Forsiktig pipettere opp og ned for å vaske perlene og pellet ved sentrifugering i en mikrosentrifuge (2 min ved 16 000 xg).
- Fjern forsiktig supernatanten med en pipette og kast.
- Resuspender pelleten kulen i 1 ml friskt sterilt PBS og gjenta vasketrinnet.
- Resuspender pelleten kulen i 0,8 ml PBS.
- Legg 100 ml 10x EDC lager (2 mM sluttkonsentrasjon) og umiddelbart 100 ml 10x NHS stamløsning (5 mM sluttkonsentrasjon) i perlesuspensjon.
- Inkuber perlesuspensjon i 30 minutter ved 25 ° C på et roterende hjul.
- Vask kulene en gang i 1 ml PBS og resuspendert i 0,8 ml friskt sterilt PBS.
- Tilsett 200 ml etylen, og økUbate den perlesuspensjon i 1 time ved 25 ° C på et roterende hjul.
- Vask kulene en gang med 1 ml PBS og resuspender kulene i 0,8 ml frisk PBS.
- Fortsett fra seksjon 1.1.2.4 (perle aktivering med Sulfo-SMPB) som beskrevet under punkt 1.1.2 og følge resten av protokollen beskrevet i kapittel 1.1 (Tiol-amin retnings kopling). Utføre proteinpreparat og protein koblingstrinn på en måte som er identisk med de som er beskrevet i avsnitt 1.1.
Merk: Den typiske koblingseffektivitet ved bruk av denne protokollen er noe lavere sammenlignet med avsnitt 1.1, således justere den opprinnelige proteinkonsentrasjon tilsvarende for å oppnå den samme koblingstetthet (ca. 75%.).
- Forberedelse av reagenser:
2. Fastsettelse av Coupling Efficiency
Merk: For å bestemme proteinkonsentrasjonen, bruke Bradford Reagens 10 og kolorimetriske analyser som følger:
- Vend forsiktig Bradford Reagens til e ONTROLLER homogenitet av reagenset.
- Ved hjelp av en 10 mg / ml BSA stamløsning, fremstille proteinstandarder som dekker konsentrasjoner 0,1 til 1,5 mg / ml BSA i buffer.
- Tilsett 250 ml av Bradford-reagens til brønner i en 96-brønns plate. Forbered nok brønner for alle prøvene, protein standarder og negative kontroller (buffer only).
- Tilsett 5 ml av proteinprøven (proteinstandarder eller buffer, for den negative kontroll) til reagensen i 96-brønns plate.
- Inkuber platen på en orbital rister ved romtemperatur i 10 min.
- Måle absorbans ved 595 nm med en plateleser.
- Generere en standardkurve av BSA-konsentrasjon versus A595 nm og bruke dette til å bestemme proteinkonsentrasjonen i første og supernatantprøvene.
- Beregn konsentrasjonen av protein er koplet som følger:
- Beregn koblingseffektiviteten som:
00eq4.jpg "/>
3. Bruk av Bead-coupled adhesinene i konkurranse Analyser
- Preparat:
- Seed 1 ml per brønn av HeLa-celler ved en konsentrasjon på 150.000 celler / ml i en 24-brønns plate dagen før konkurranseanalyse, for å tillate cellene å nå ca. 80% sammenflytning før start av eksperimentet.
- Sett opp hver eksperimentell tilstand i tre eksemplarer. Inkluder brønner for negative kontroller (ingen bakterier lagt under konkurranseanalyser), positive kontroller (kontroll perler koblet til fusion-tag bare lagt under konkurranseanalyser) og oppløsnings kontroller (for cytotoksisitetstester eksperimenter).
- Inokulere en 5 ml marin LB (MLB) kultur med en frisk koloni av V. parahaemolyticus og vokse O / N ved 30 ° C, risting.
- Forberede tilstrekkelig perle-coupled MAM, som beskrevet i punkt 1. (Coupling). Tillat for 100 ml 10x perle lager per brønn.
- Konkurranseanalyse:
- På dagen for den competition eksperiment, måle OD 600 av bakteriekulturen.
- Forbered infeksjon media ved å fortynne bakteriekulturer i fargeløs DMEM uten tilsetningsstoffer, forvarmet til 37 ° C, som inneholder 10% v / v perle suspensjon (enten adhesin-coupled perler eller kontroll perler), for å gi en MOI på 10. Forbered 1 ml / brønn og 10-20% overflødig volum per prøve. Merk: For de ovennevnte forhold (24-brønns plate, V. parahaemolyticus, MOI 10), den nødvendige volumet av O / N kultur for å bli tilsatt per brønn (ml / ml) er beregnet som 3 / OD 600 av kulturen. For eksempel vil en ml av infeksjon medium inneholder typisk 100 ml perlesuspensjon, et par ml bakteriekultur og gjøres opp til 1 ml med fargeløst, usupplert DMEM.
- Fjerne gamle mediet fra brønnene og vaskes dyrkede HeLa-celler ved å tilsette 1 ml steril PBS forvarmet til 37 ° C i hver brønn.
- Fjern PBS og tilsett 1 ml infeksjon medium per brønn. Også satt opp kontroller, ved å legge til løsninger fortsinnelukker kontrollperlene og bakterier (positiv kontroll) eller adhesin perler og ingen bakterier (negative kontroller), eller i DMEM inneholdende 0,1% Triton X-100 (lysis kontroll, bare nødvendig for cytotoksisitet målinger).
- Inkuber platen i en vevskulturinkubator ved 37 ° C i den ønskede tidsperiode (for eksempel 4 timer for cytotoksiske måling eller en hr for klebe målinger).
Merk: Både bakteriell adhesjon og cytotoksisitet på vertsceller kan anvendes som avlesinger for effekten av inhibering. Ved tidspunktene for cytotoksisitet og heft-målinger sammenfallende, kan begge analysen utføres ved hjelp av prøver fra den samme brønnen, ettersom cytotoksisitet bestemmes ved hjelp av kultur supernatant og festeanalyser bruker prøver fra det gjenværende cellelaget.
- Cytotoksisitets målinger:
- På angitte tidspunkter (f.eks 4 timer etter infeksjon), fjerne tre ganger 200 ml fra hver 24-brønn og overføring tilen 96-brønns plate.
- Spin 96-brønners plater ved 1500 x g, 5 min og overfør 100 ml fra hver brønn inn i en ny 96-brønners plate. Tilsett 100 ml av mediet som brukes under smitteforsøk til friske brønner på 96-brønners plate i triplikat (disse vil bli brukt som blanks).
- Utføre laktat dehydrogenase (LDH) slipper analysen bruker en LDH cytotoksisitet deteksjon kit og følge produsentens instruksjoner.
- I korthet, beregne mengden av reagens som er nødvendig i trinn på 25 (for eksempel hvis 62 prøvene som skal måles, utgjør nok reagensblanding for 75 etc.).
- For eksempel, for 100 prøver, bland 11,25 ml av reagens A med 250 pl av reagens B. Invert, ikke vortex å unngå skumdannelse.
- Sett blandingen i et reservoar for å være i stand til å pipettér med en multikanal pipette. Tilsett 100 pl av reagens blanding til hver prøve.
- Inkuber platen ved RT og lese av absorbansen ved 490 nm på en plateavleser ved 10, 20, 30 min. Analyser av datasettet som absorbansen til lysis kontrollprøven er høy, men likevel innenfor det lineære området for plateleser (vanligvis 2-3 absorbansenheter).
- Uttrykke resultatene som% cytotoksisitet, ved hjelp av følgende formel for konvertering:
- Måling av bakteriell adhesjon:
- På angitte tidspunkter (f.eks en timer etter infeksjon), fjerne media fra cellelaget.
- Vask cellelaget med steril, forvarmet PBS (minst 3-4 vaskinger med 1 ml PBS hver) for å fjerne eventuelle un-festede celler.
- Lyse vertsceller ved å tilsette 1 ml av en steril 1% v / v Triton X-100-løsning i PBS per brønn. Inkuber platen ved 37 ° C i 5 min.
- Pipette hver prøve opp og ned flere ganger før overføring av innholdet av hver brønn for å skille 1,5 ml rør. Forbered 10-fold serielle fortynninger av prøveneinn steril PBS (f.eks bruke 100 ml prøve og 900 ml PBS).
- Plate 100 ml av hver prøve på agar MLB og spres ved hjelp av en celle sprederen. Optimaliser som fortynninger til platen, avhengig av bakteriestammer og tidspunkt. Merk: For den beskrevne eksperimentelle oppsettet, 10 5 eller 10 6 ganger fortynninger gi et passende antall CFU.
- Inkuber platene ved 37 ° CO / N og telle bakterier ved kolonitelling.
Representative Results
Den V. parahaemolyticus adhesin MAM7 inneholder sju tandem pattedyrcelleoppføring (MCE) domener som er involvert i erkjennelse av vertsoverflatereseptorer. Vi brukte isopor perler koblet til rekombinant, rensede fragmenter som omfatter enten alle sju tandem MCE domener (MAM7) eller bare den første MCE domene (MAM1) for å teste muligheten av disse materialene til å konkurrere med V. parahaemolyticus for vertscellebinding og den resulterende effekt av disse materialene som adhesjon inhibitorer. HeLa-celler ble infisert med V. parahaemolyticus belastning POR1, og cytotoksisitet som følge av in vitro-infeksjon ble evaluert etter 4 timer (figur 3). Behandling av HeLa-celler med 0,1% Triton X-100 (positiv lysis kontroll) resulterte i fullstendig cellelyse, ikke-infiserte celler viste svært lave nivåer av cytotoksisitet. In vitro infeksjon av ubehandlede celler med POR1 resulterte i meget høye nivåer av cellelyse, og denne ble inhibert med MAM7-coupled perler men ikke MAM1 koblet eller GST-kombinert kontrollperler (figur 3).
Figur 3. Karakterisering av Vibrio parahaemolyticus indusert cytotoksisitet i epitel-celler i løpet av kompetitive analyser. Celler ble behandlet med V. parahaemolyticus (Vp), vist med (+) eller ingen bakterier (-) i nærvær av forskjellige konkurrerende enheter (. comp) som angitt. Disse inkluderte heller ingen komp. (-), MAM7 kuler (MAM7), MAM1 kuler (MAM1) eller GST kontrollperler (GST). Som kontroller ble celler behandlet med enten Triton X-100 (Triton, lysis kontroll), eller forble uinfisert (ikke-brenn). LDH meldingen etter fire timer ble målt som beskrevet i kapittel 3, og resultatene normalisert til Triton kontroller (100%) og blanks (0%) som beskrevet ovenfor. Resultatene er gjennomsnitt ± SEM fra tredoble eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Opplisting av V. parahaemolyticus festet til enten ubehandlede Hela-celler, eller celler inkubert med MAM7-, MAM1-, eller GST kontroll perler, avslørte at MAM7-perler, men ikke MAM1- eller GST kontroll perler utkonkurrere V. parahaemolyticus for feste til vert celleoverflatereseptorer (figur 4).
Figur 4. Karakterisering av bakteriell festing ved konkurranseeksperimenter. HeLa-celler ble infisert med V. parahaemolyticus POR2 (Vp +), i fravær (-) eller nærvær av konkurrerende enheter som følger: MAM7 kuler (MAM7), MAM1 kuler (MAM1) eller GST kontrollperler (GST) (forb.). Bakteriell adhesjon ble målt etter 1 time, så beskrevet i kapittel 3. Resultatene er gjennomsnitt ± SEM fra tredoble eksperimenter. Midler (FLTR i CFU / ml) er 2,3010 6, 1,5310 5, 2,0510 6, 2,1210 6. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Adhesiner koplet til fluoroformerket perler resultere i genereringen av materialer som etterligner bakteriell adhesjon til vertsceller, og er kraftige verktøy for celle imaging (figur 5). Bruke MAM7-koblede fluorescerende blå perler, preget vi prosessen med MAM7-mediert vedlegg til epitelceller. Festing av MAM7 vertsceller resulterte i aktin rearrangements og dannelsen av stress fibre, som var co-visualisert ved hjelp rhodamin-phalloidin å farge for F-aktin (Figur 5B).
_upload / 53400 / 53400fig5.jpg "/>
Figur 5. Fremstilling og bruk av fluoroformerket biomimetic perler for bildebehandling formål. (A) suspensjon av fluorescerende blå biomimetic perler (høyre tube, 10x lager) og buffer kontroll (venstre tube). (B) Festing av MAM7-koblede perler til Hela cellene resulterer i aktin rearrangements og stress fiber dannelse. Vedlegg av fluorescerende blå perler og resulterer aktin stresset fiber (rød, farget med rhodamin-phalloidin) ble fotografert ved mikroskopi. Bar, 10 mikrometer. Bilder i panel B ble tilpasset fra Lim et al. 1 og gjengitt under Creative Commons Attribution-lisens. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Heri beskrives to protokoller, som kan brukes til å kople tiol-inneholdende proteiner til amin- eller karboksylat-modifisert polystyren perler, respektivt. På grunn av den lette operasjonsprosess, er tiol-amin kobling å foretrekke, men avhengig av den ønskede perlespesifikasjon (diameter, fluorescens-egenskaper), kan bruk av aminfunksjonaliserte perler ikke være mulig, og vi har derfor tatt en protokoll som vil omdanne karboksylat - inn i en amingruppe for å gi forskeren størst mulig fleksibilitet i valg av stillaset. Selv om begge tiol-amin og tiol-karboksyl kopling verket for ethvert cystein inneholdende protein, retningskopling (dvs. immobilisering av protein per sin N-terminale ende, etterligne overflaten display) krever et protein uten cysteinrester, som er produsert som et GST fusjons protein, eller som inneholder en enkelt terminal cysteinrest innføres ved seterettet mutagenese. Hvis flere reaktive cysteiner finnesinnenfor proteinet, vil dette føre til tilfeldige immobilisering noe som kan hindre proteinfunksjon. Mange bakterielle adhesiner ikke inneholder cysteiner naturlig. For andre, kan disse fjernes ved hjelp av seterettet mutagenese, selv om dette ville kreve omfattende prøver for å sikre opprinnelige struktur og funksjon er beholdt i mutant. For GST fusjonsproteiner, kan renset GST-tag koblet til kulene skal brukes som et passende negativ kontroll. Ved hjelp av koblede perler som en kontroll bør unngås, da disse ofte har en høyere tendens til å klumpe seg sammen eller holde celler ikke-spesifikt. En forenklet versjon av protokollen 1.2., Ved å bruke kun EDC, kan brukes til å kople proteiner til karboksyl-funksjonaliserte polymerperler, men i dette tilfelle koplingen skjer ved hjelp av primære aminer på proteinet og således garanterer ikke rettet kobling.
TCEP som reduksjonsmiddel må ikke erstattes med andre kommersielt tilgjengelige, og som vanligvis anvendes reduksjonsmidler, som for eksempel dithiothreitol (DTT) eller 2-merkaptoetanol (BME), som tioler som finnes i dem vil konkurrere med protein kopling i tiol-maleimid koblingstrinn. PBS kan erstattes med andre buffere, men med de følgende betraktninger: Buffere kan ikke inneholde primære aminer (så Tris-inneholdende buffere er ikke egnet). Bruk av buffere som inneholder meget lave (<10 mm) saltkonsentrasjoner fører til bead klumpdannelse, og bør også unngås. Protein renhet er også en viktig faktor å vurdere i løpet av denne fremgangsmåten, og for å oppnå data av høy kvalitet, bør rene proteiner brukes. Vi rutinemessig rense proteiner i flere trinn, innbefattende minst en affinitetsrensing og gel-filtreringstrinn, men i noen tilfeller ionebyttekromatografi er gjort som et tredje trinn. Som et resultat av renheten av proteiner som brukes for koblingen er vanligvis 90% eller høyere, som bedømt ved SDS-PAGE.
Det anbefales å bestemme proteinkonsentrasjonene både i den initiale reaksjonsblanding, så vel som av the supernatanten etter ferdig reaksjon. Dette vil bidra til å bestemme den tilsynelatende konsentrasjon av perle-koblet protein, og dermed koblings tetthet. Bestemmelse av begge verdier vil også tillate beregning av koblingseffektiviteten. Dette kan tas hensyn til ved fremstilling av den innledende proteinoppløsningen i etterfølgende reaksjoner, for å oppnå den ønskede sluttkonsentrasjon og kobling tetthet. Bradford-reagens er spesielt egnet for bestemmelse av proteinkonsentrasjon før og etter koblingsreaksjonen, da ingen av stoffene i reaksjonen forstyrrer fargestoff kompleksdannelsen ved de konsentrasjoner som benyttes. Dersom lavere proteinkonsentrasjoner som skal brukes, kan denne fremgangsmåten har til å bli erstattet av en mer sensitiv deteksjonsmetode, men hensyn må tas hensyn til det faktum at det må være forenlig med de stoffer som inneholdes i koblingsreaksjonen. Det anbefales også å bruke nylagde reagenser og håndtere pulveriserte reagenser med forsiktighet (for eksempel butikki en lukket beholder og anvende silikakuler, for å unngå reagensene tegningen fuktighet) siden kvaliteten av reagenser vil påvirke koblingseffektiviteten. Dersom koblingsgraden er lavere enn forventet, inkluderer mulige løsninger øker de innledende perle og proteinkonsentrasjoner. Ved høyere konsentrasjoner blir brukt, har konsentrasjonen av koblingsreagenser økes proporsjonalt for å sikre tilstrekkelig molart overskudd. Modifisere perle / proteinkonsentrasjonen er vanligvis et bedre skritt mot optimalisering stedet for å øke reaksjonstider. Siden protokollene for vulsten kopling er lange, vi vanligvis forberede en stor sats av materialet. Porsjoner av suspensjonen kan snap-frosset i flytende nitrogen og lagret ved -20 ° C i flere måneder. Tinte alikvoter bør ikke fryses på nytt og må holdes ved 4 ° C og anvendt i løpet av 1-2 dager. Dette vil imidlertid variere med typen og stabiliteten av proteinet brukes som skal testes på et lite parti i utgangspunktet.
Vibrio parahaemolyticus, enten ved hjelp av en nedgang i bakterie vedlegg til vertsceller eller redusert cytotoksisitet som en skrive ut . I begge tilfeller, forberedelse og kompetitive analyser følge den samme protokoll. Avhengig av avlesning, ulike stammer av V. parahaemolyticus blir brukt: den cytotoksiske stammen POR1 brukes for cytotoksisitets-målinger, mens de ikke-cytotoksiske stamme POR2 benyttes for måling av bakteriell adhesjon, ettersom celledød og celle løsgjøring kompromisser fremgangsmåten for kvantifisering festet bakterier.
Utgangspunktet, komperanse forsøk ble satt opp som en trinnvis protokoll, hvor vertscellene ble først pre-inkubert med perler før tilsetningen av bakterier. For V. parahaemolyticus og perle spesifikasjoner som brukes (2 mikrometer perler koblet til MAM7), kan både perler og bakterier legges samtidig uten endringer i den resulterende cytotoksisitet. Dvs, i dette eksperimentelle oppsettet, perler utkonkurrere bakterier for vertscelle bindende. Avhengig av bakteriearter og kulegeometri brukes, kan det være gode grunner for å opprettholde vulsten adhesjon og bakteriell infeksjon som to separate trinn. For eksempel, for å infisere celler med ikke-motile bakterier, blir platene vanligvis sentrifugert etter tilsetning av infeksjonen media. Imidlertid bør sentrifugering av plater inneholdende kulesuspensjoner bør unngås, da dette fører til en meget ujevn fordeling av perler på cellelaget. Hvis mindre partikkelstørrelser blir brukt, vil perler ta lengre tid å slå seg ned på celleoverflaten, i så fall sufficient tid bør være tillatt for perle vedlegg før infeksjonen. Når bakteriell adhesjon blir brukt som en lest ut, må prøvene tatt ved punktene hvor vertsceller som ikke er vesentlig skadet av den infiserende stamme, som cellelysering og løsgjøring kan kompromittere kvantifisering av vedlagte bakterier.
I stedet for opplisting bakteriell adhesjon ved fortynning plettering, kan prøvene eventuelt behandles for imaging (figur 5). I dette tilfellet bør vevskultur-cellene sådd ut på glass dekkglass, i stedet for direkte inn i brønnene. I tillegg kan fluorescerende kuler og bakterier som uttrykker et fluorescent protein bli brukt, sammen med smitte-spesifikke vertscellemarkører. For eksempel er konkurranse eksperimenter ofte avbildes med fluoriserende rød rhodamin-phalloidin å farge vertscellenes aktin cytoskjelettet og vurdere morfologiske endringer som følge av infeksjon, sammen med fluorescerende blå perler og fluorescerendegrønn (GFP uttrykke eller SYTO18 farget) bakterier.
En rekke kule-koplet adhesiner, deriblant Staphylococcus aureus FnBPA, Streptococcus pyogenes F1 FUD og Vibrio parahaemolyticus MAM, har blitt brukt som biomimetic materialer for å studere adhesjon adhesjon inhibering og bidraget av adhesjonen til patogen-mediert cytotoksisitet 1, 7, 8. En av fordelene med å bruke denne tilnærmingen er den enkle visualisering av festearrangementer, ettersom polymerperlene som benyttes som stillas er tilgjengelige i et bredt spekter av farger (for eksempel blå, fluoriserende rød, blå, grønn, orange). Således protein direkte merking, noe som kan forstyrre funksjonen, kan unngås. I tillegg er overflaten koblingsetterligner det flerverdige visningen av adhesiner på bakterieoverflaten, således reflekterer en mer fysiologisk relevant konformasjon i forhold til oppløselige proteiner.
Sammenlignet med studier med intakte bakterier eller bacterial mutanter, omgår vulsten tilnærmingen problemene forbundet med bakterievekst. For eksempel, lengre sikt (f.eks, O / N) studier av bakteriell adhesjon til vertsceller ved bruk av intakte bakterier ofte er kompromittert av fenomener tilhørende bakterievekst - surgjøring av vekstmediet og næringsutarming negativt påvirke vertsceller, og bakteriell replikasjon slutt kompromitterer bildekvalitet.
Mer nylig er bruk av kule-koplet adhesiner blitt utvidet til å omfatte deres anvendelse som verktøy for affinitets-rensinger av vertscelle faktorer involvert i signaleringsprosesser nedstrøms av bakteriell festing. V. parahaemolyticus MAM7, via binding til fosfatidinsyre syrer i vertscellemembran, utløser RhoA aktivering og actin rearrangementer 1, 3. MAM-koplet perler blir brukt til å rense og identifisere proteiner som er involvert i signaleringsplattformene montert som en konsekvens av MAM-vertscelle bindende. Siden perler kanlett bli separert fra supernatanten ved en kort sentrifugeringstrinn, og proteinet av interesse er kovalent bundet, er dette en god metode for å oppnå separasjon av forurensende proteiner og berike relevante proteinkomplekser, som kan brukes til nedstrøms applikasjoner som proteomforskning eller Western blotting.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Sigma | 646547 | Danger; corrosive can be bought as solution or freshly prepared |
| Sulfosuccinimidyl 4-(p-maleimidophenyl)butyrate (Sulfo-SMPB) | Fisher | PN22317 | Danger; toxic |
| L-cysteine | Sigma | 30089 | Danger; toxic |
| Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent blue - aqueous suspension, 2.0 μm mean particle size | Sigma | L0280 | harmful; a range of alternative particle sizes and colors is available |
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC) | Thermo scientific | 22980 | |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Thermo scientific | 24500 | |
| Carboxylate-modified polystyrene beads | Sigma | CLB9 | harmful; a range of alternative particle sizes and colors is available |
| Ethylenediamine | Sigma | E26266 | Danger; flammable, corrosive, toxic, sensitizing |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Promega | W3841 | |
| Bradford reagent | Sigma | B6916 | Danger; corrosive and toxic |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose - With 4,500 mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine, sodium pyruvate, and phenol red, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | D1145 | for infection experiments |
| DMEM | Sigma | D6429 | for maintenance of cultured host cells |
| Fetal Bovine Serum, heat inactivated | Sigma | F9665 | supplement for tissue culture medium |
| Penicillin-Streptomycin - Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
Sigma | F9665 | supplement for tissue culture medium |
| PBS | Sigma | D8537 | |
| LDH Cytotoxicity detection kit | Takara | MK401 | |
| Plasticware | |||
| reagent reservoirs (25ml) | SLS | F267660 | |
| 24-well plates | Greiner | 662160 | |
| 96-well plates | Greiner | 655182 | |
| Equipment | |||
| haemocytometer | |||
| microcentrifuge | |||
| plate reader | |||
| tissue culture facilities | |||
| multichannel pipette |
References
- Lim, J., Stones, D. H., Hawley, C. A., Watson, C. A., Krachler, A. M. Multivalent Adhesion Molecule 7 clusters act as signaling platform for host cellular GTPase activation and facilitate epithelial barrier dysfunction. PLoS Pathog. 10 (9), e1004421 (2014).
- Krachler, A. M., Ham, H., Orth, K. Outer membrane adhesion factor multivalent adhesion molecule 7 initiates host cell binding during infection by gram-negative pathogens. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (28), 11614-11619 (2011).
- Krachler, A. M., Orth, K. Functional characterization of the interaction between bacterial adhesin multivalent adhesion molecule 7 (MAM7) protein and its host cell ligands. J Biol Chem. 286 (45), 38939-38947 (2011).
- Joh, D., Speziale, P., Gurusiddappa, S., Manor, J., Hook, M. Multiple specificities of the staphylococcal and streptococcal fibronectin-binding microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules. Eur J Biochem. 258 (2), 897-905 (1998).
- Bingham, R. J., et al. Crystal structures of fibronectin-binding sites from Staphylococcus aureus FnBPA in complex with fibronectin domains. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105 (34), 12254-12258 (2008).
- Ensenberger, M. G., et al. Specific interactions between F1 adhesin of Streptococcus pyogenes and N-terminal modules of fibronectin. J Biol Chem. 276 (38), 35606-35613 (2001).
- Hawley, C. A., Watson, C. A., Orth, K., Krachler, A. M. A MAM7 peptide-based inhibitor of Staphylococcus aureus adhesion does not interfere with in vitro host cell function. PLoS One. 8 (11), e81216 (2013).
- Krachler, A. M., Ham, H., Orth, K. Turnabout is fair play: use of the bacterial Multivalent Adhesion Molecule 7 as an antimicrobial agent. Virulence. 3 (1), 68-71 (2012).
- Krachler, A. M., Mende, K., Murray, C., Orth, K. In vitro characterization of multivalent adhesion molecule 7-based inhibition of multidrug-resistant bacteria isolated from wounded military personnel. Virulence. 3 (4), 389-399 (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
