Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

En celle Gratis Assay til at studere Chromatin dekondensering i slutningen af ​​Mitose

Published: December 19, 2015 doi: 10.3791/53407
* These authors contributed equally

Introduction

Xenopus laevis æg ekstrakt er en kraftfuld og almindeligt anvendt værktøj til at studere komplicerede cellulære begivenheder i enkelhed et cellefrit assay. Siden deres første beskrivelse af Lohka & Masui 1 de er blevet grundigt anvendt til at undersøge mitoseprocesser såsom chromatinkondensation 2, spindelenhed 3, opdeling 4 kernemembranen, men også nucleocytoplasmic transport 5 eller DNA-replikation 6. De begivenheder, der finder sted i slutningen af mitose, der er nødvendige for gendannelse af interphasic kerne såsom reformation kernemembranen og kerneporen kompleks samling er langt mindre forstået forhold til begyndelsen af mitotiske begivenheder, men kan på lignende måde undersøgt ved anvendelse af Xenopus æggeekstrakt 7. Vi har for nylig etableret en analyse baseret på Xenopus æg ekstrakt for at studere kromatin dekondensering i slutningen af mitose 8, en under-undersøgt proces, der venter its detaljeret karakterisering.

I metazoans, er kromatin meget kondenseret ved mitotisk post med henblik på at udføre trofast adskillelse af det genetiske materiale. For at sikre at kromatin er tilgængelig for genekspression og DNA-replikation under interfase, skal det de-komprimeres i slutningen af ​​mitose. I hvirveldyr, chromatin er op til halvtreds gange mere komprimeret under mitose i forhold til interfase 9, i modsætning til gær, hvor mitotiske komprimering er normalt meget lavere, f.eks kun to gange i S. cerevisiae 10. Hvirveldyr chromatin dekondensering det meste har været undersøgt i forbindelse med sperm DNA-reorganisation efter ægbefrugtning. En molekylære mekanisme, ved hvilken nucleoplasmin, en rigelig oocyt protein, udveksler sperm-specifikke protaminer til histoner H2A og H2B er lagret i ægget. Denne proces blev også belyst ved hjælp af Xenopus æggeekstrakt 11, 12. Men udtrykketaf nucleoplasmin er begrænset til oocytter 13 og mitotiske kromatin indeholder ikke disse sperm-specifikke protaminer. Derfor chromatin dekondensering i slutningen af mitose er nucleoplasmin uafhængig 8.

Til in vitro dekondensering reaktion beskæftiger vi ekstrakt genereret fra aktiverede X. laevis æg og kromatin klynger isoleret fra synkroniserede HeLa-celler. Behandling af æg med en calciumionophor efterligner calcium udsætning i ægget genereret af sæd post under befrugtningen. Calcium bølge udløser cellecyklus genoptagelse og ægget, anholdt i den anden metafase af meiose, udvikler sig til den første interfase 14. Derfor æg ekstrakter fremstillet danner aktiverede æg repræsenterer mitotiske exit / interfase tilstand og er kompetente til at fremkalde begivenheder specifikke for mitotiske exit ligesom chromatin dekondensering, nuklear kuvert og pore komplekse reformation. Til isolering af mitotiske lmromatin klynger vi brugte en let modificeret version af protokollen udgivet af Gasser & Laemmli 15, hvor kromosom klynger frigives ved lysis fra HeLa-celler synkroniseret i mitose og isolerede i polyamin indeholdende buffere ved gradient centrifugeringer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Mitotisk chromatin Cluster Isolering fra HeLa-celler

1. Forberedelser

  1. Cellekulturopløsninger
    1. Forbered komplet Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) ved tilsætning af 10% føtalt kalveserum, 100 enheder / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin og 2 mM glutamin til DMEM. Forbered phosphatpuffersaltopløsning (PBS) indeholdende 2,7 mM KCI, 137 mM NaCl, 10 mM Na 2 HPO 4 2H 2 O og 2 mM KH 2 PO 4 i deioniseret vand og justering af pH til 7,4 med 10 N NaOH.
      BEMÆRK: PBS kan holdes så 10x stamopløsning over tid ved stuetemperatur. Fortyndes med deioniseret vand til 1x inden brug. Filtreres 1X-opløsning, hvis det skal anvendes i cellekultur.
    2. Forbered en 40 mM bestand af thymidin opløsning (cellekultur egnet) i DMEM-medium. Opløs 0,97 g thymidin i 90 ml DMEM-medium. Juster slutvolumen på 100 ml. Store stamopløsning ved -20 ° CC. Opløs (ADVARSEL! Arbejde under kemisk hætte, handsker og mund beskyttelse) nocodazol til en 5 mg / ml stamopløsning i DMSO.
  2. Mitotiske klynger Isolation Løsninger
    BEMÆRK: Alle løsninger er beskrevet i 1.2 skal holdes på is efter fremstilling / optøning i hele eksperimentet.
    1. Autoklave deioniseret vand i 105 minutter ved 121 ° C. Opløs spermin tetrahydrochlorid i autoklaveret deioniseret vand til en slutkoncentration på 200 mM (69,6 mg / ml). Store stamopløsning ved -20 ° C. Opløs spermidin trihydrochlorid i autoklaveret deioniseret vand til en slutkoncentration på 200 mM (50,8 mg / ml). Store stamopløsning ved -20 ° C.
    2. Forbered 5% (w / v) digitonin (ADVARSEL! Arbejde under kemisk hætte, handsker og beskyttelse munden) i varmt, deioniseret vand. Filtrer og opbevar prøver ved -20 ° C. Arbejde unde Opløs phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) (ADVARSEL!R kemisk hætte, brug handsker og mund beskyttelse) til en slutkoncentration på 200 mM (35 mg / ml) i 100% ethanol. Store stamopløsning ved -20 ° C.
    3. Opløs dithiothreitol (DTT) med deioniseret vand til en slutkoncentration på 1 M (154 mg / ml) (ADVARSEL! Arbejde under kemisk hætte, brug handsker). Filtrer og opbevar stamopløsning ved -20 ° C.
    4. Der fremstilles en 100-fold proteasehæmmer mix (PAS arbejde under kemisk hætte, brug handsker!) Ved at opløse 10 mg / ml AEBSF (4- (2-Aminoethly -) - benzensulfonylfluoride), 0,2 mg / ml leupeptin, 0,1 mg / ml pepstatin og 0,2 mg / ml aprotinin i deioniseret vand. Store stamopløsning ved -20 ° C.
    5. Der fremstilles en 10x stamopløsning af buffer A indeholdende 150 mM Tris-CI (pH 7,4), 800 mM KCI, 20 mM EDTA-KOH (pH 7,4), 2 mM spermin tetrahydrochlorid og 5 mM spermidin-trihydrochlorid. Store buffer A ved 4 ° C uden spermin tetrahydrochlorid og spermidin trihydrochlorid, som skal tilføjesfrisk lige før brug.
      BEMÆRK: EDTA kun opløses ved pH-værdier højere end 8, derfor at udarbejde en høj koncentreret EDTA-KOH-stamopløsning (0,5 M anbefales), tilsættes 5 N KOH til pH lige over 8 for at opløse den. Bagefter titreres ned til pH 7,4.
    6. Der fremstilles en 20x stamopløsning af buffer som indeholdt 100 mM Tris-HCI (pH 7,4), 400 mM KCI, 400 mM EDTA-KOH (pH 7,4) og 5 mM spermidin-trihydrochlorid. Buffer Som det kan opbevares under samme betingelser som buffer A.
      BEMÆRK: Forbered arbejdsopløsninger I-IV (se i de følgende trin), glycerol gradient, og de kolloide silicapartikler opløsninger, der indeholder silica partikler (15 til 30 nm diameter) belagt med ikke-dialyserbart polyvinylpyrrolidon (PVP) frisk lige før isolation procedure (PMSF og digitonin bør tilføjes direkte for brug som PMSF er labil i vandige opløsninger og digitonin tendens til at udfælde på lange lagring på is sigt).
    7. Forbered 100 ml opløsning I ved at tilføje 0,5x puffer A,1 mM DTT, 1: 100 af proteaseinhibitoren mix og 0,1 mM PMSF i autoklaveret deioniseret vand. Forbered 50 ml opløsning II (for cellelyse) ved tilsætning af 1x puffer A, 1 mM DTT, 1: 100 af proteaseinhibitoren mix, 0,1 mM PMSF, 0,1% digitonin og 10% glycerol i autoklaveret deioniseret vand.
    8. Forbered 200 ml opløsning III, som indeholder 0,25x buffer A, 1 mM DTT, 1: 100 af proteaseinhibitoren mix, 0,1 mM PMSF og 0,05% digitonin i autoklaveret deioniseret vand. Forbered 40 ml opløsning IV indeholder 1x buffer som, 1 mM DTT, 1: 100 af proteaseinhibitoren mix, 0,1 mM PMSF og 0,1% digitonin i autoklaveret deioniseret vand.
    9. Forbered 120 ml glycerol gradient opløsning ved tilsætning af 25% glycerol og 0,1% digitonin til opløsning I.
    10. Forbered 150 ml kolloide silicapartikler opløsning indeholdende 60% v / v (volumen per volumen) af en suspension indeholdende silicapartikler (15 til 30 nm i diameter) overtrukket med ikke-dialyserbart polyvinylpyrrolidon (PVP), 15% glycerol, 2 mM spermidine trihydrochlorid og 0,8 mM spermin tetrahydrochlorid i opløsning IV.
    11. Forbered klynge opbevaringspuffer indeholdende 250 mM sucrose, 15 mM Hepes (pH 7,4), 0,5 mM spermidin-trihydrochlorid, 0,2 mM spermin tetrahydrochlorid, 1: 100 af proteaseinhibitoren mix, 0,3% BSA og 30% glycerol. Klyngen opbevaringspuffer kan opbevares ved -20 ° C.
    12. Forbered squash fix opløsning indeholdende 10% formaldehyd (ADVARSEL! Arbejde under kemisk hætte, handsker), 50% glycerol, dobbelte Marks Modified Ringers buffer (MFR se 4.5.) Og 0,2 pg / ml DAPI (ADVARSEL! Handsker). Opbevar ved 4 ° C i lette beskyttet reaktionsrør. Det er ikke afgørende for eksperimentet at bruge denne squash fix opskrift, vil alternative opskrifter også arbejde.

2. Synkronisering Celler

  1. På dag 1: Seed HeLa-celler i fem 75 cm 2 (250 ml) kolber med medium og inkuberes det ved 37 ° C i 5% CO 2.
    BEMÆRK: Dette vil give i cirka 18 x 10 6 celler på dagen for kromatin klynge isolation.
  2. På dag 2: Når celler er mindst 50% sammenflydende (omkring halvdelen af ​​overfladen er dækket af celler, og der er stadig plads til celler at vokse), der tilsættes thymidin til en slutkoncentration på 2 mM (thymidin blok) og kultur celler til 24 timer ved 37 ° C i 5% CO2.
    BEMÆRK: Denne vil anholde cellerne ved G1 / S-fase grænse.
  3. På dag 3: Aspirer medium indeholdende thymidin og tilsæt sterilt PBS. Vask cellerne ved sarte skylning med sterilt PBS. Aspirer PBS og forsigtigt tilsættes 15-20 ml af friske, varme komplet DMEM-medium og dyrkning af celler i 3 til 4 timer ved 37 ° C i 5% CO2 for at frigøre dem fra G1 / S-faseblokering.
  4. På dag 3 (fortsat): Efter at have sluppet af cellerne fra G1 / S-faseblokering, tilføje nocodazol til en endelig koncentration på 100 ng / ml. Fortynd nocodazol ved tilsætning af 2 pi stamopløsning (5 mg / ml) til 98pi af frisk DMEM-medium, og der tilsættes 1 ml af fortyndet nocodazol pr hver ml cellekultur. Kultur celler til ca. 12 timer ved 37 ° C i 5% CO2. Dette vil blokere cellerne i mitose.

3. Mitotiske Klynger Isolering

  1. På dag 4: Isoler mitotiske klynger. Ved hjælp af en lysfeltmikroskopi, kontrollere, om størstedelen af ​​celler er mitotiske. Hvis mindre end 50% af cellerne er mitotiske vente indtil flere celler nå mitose. Saml mitotiske celler ved at trykke kraftigt ved siden af ​​kolben (eller ved forsigtigt at sprøjte med pipetten), vil dette frigøre resterende mitotiske celler. Overfør cellesuspensionen til 50 ml koniske centrifugerør.
    BEMÆRK: mitotiske celler bliver rundt og kan let adskilles fra kolben bunden (ligesom celler efter trypsinisering), i modsætning til celler i andre faser cellecyklus, der er flade og solidt fastgjort til kolben.
  2. Høst mitotiske celler ved at dreje rørene ved 1.500 xg i 10 minutter (476; C eller RT) og fjernelse af supernatanten bagefter. Resuspender cellepelleten i 8 ml PBS, pool i en 50 ml konisk centrifugerør, fylde røret helt med PBS og spin igen i 10 minutter ved 1.500 x g. Gentag denne vaskeprocedure tre gange i alt.
  3. Fra nu af udføre alle trin på is med kolde løsninger. Kraftigt pellet resuspenderes i 37 ml kold opløsning II. Overfør suspensionen til en kold 40 ml glas-glashomogenisator anvendelse af en 25 ml pipette og lysere celler på is ved douncing med en stram støder indtil mitotiske klynger er fri for cytoplasmisk materiale. Antallet af slag er stærkt afhængig af digitonin lager og kan variere fra 3 til 20 gange.
    BEMÆRK: Homogenisering kan være temmelig kraftig, men bør betragtes som fuldstændig, når næsten alle mitotiske celler lyseres, og de klynger ses at være fri for cytoplasmatisk materiale (se 3.4).
  4. Efter et par slag blandes 5-10 pi af cellesuspensionen 1: 2 med Trypan blå og kontrolleres ved MICRoscopy i et Neubauer kammer. Når cellerne lyseres kromatin farves blå og fri for cellemembraner (BEMÆRK: mulige cytoplasmatiske rester vil være akkumulere omkring den blå farvede kromatin og vil være let at skelne).
    BEMÆRK: mitotiske celler vil lysere før interphasic celler, men alligevel passe på ikke at overdrive homogenisering for at undgå kontaminering med interphasic kerner og lemlæstede kromatin.
  5. Umiddelbart lag hele cellelysat i kolde tringradienter (med 5 ml 60% kolloide silicapartikler opløsning ved bunden, overlejret med 19,5 ml glycerolgradient opløsning hver) i fem polycarbonat centrifugeringsrør (28,8 x 107,0 mm, anbefales det at placere rørene på is før for at køle dem ned) anvendelse af en 10 ml pipette. Ikke holde celler i opløsning II i lang tid, og derfor anbefales det at fremstille rør og gradienten forhånd (f.eks under vasketrinnene).
  6. Centrifuger gradienter i 30 min ved 1000 xg ved 4 ° C i en rotor med fast vinkel.
    BEMÆRK: Kerner, der lyserede celler og klynger udvundet sammen ved grænsefladen af ​​glycerol og de kolloide silicapartikler lag.
  7. Fjern væsken ovenfor interfasen med en pipette og overføres resten til den kolde homogenisator. Re-homogenisere blandingen ved 3-15 slag (igen afhængigt af digitonin materiel), idet den stramme pistil at fjerne aggregater og fjerne cytoskeletale fibre fra klyngerne. Efter hvert par streger kontrollere effektiviteten af ​​homogenisering. Bland 1 pi af prøven med 1 pi squash fix suppleret med DAPI og undersøges i det fluorescerende mikroskop.
    BEMÆRK: Antallet af slag er afgørende, tilstedeværelsen af ​​klyngen aggregater midler, at antallet af slag er utilstrækkelig, mens forvredne chromatin og kerner rester indikerer, at homogeniseringen var for stærk.
  8. Fordel løsningen blandt fire nye polycarbonat centrifugering rør (28,8 x107,0 mm) (ca.. 10 ml opløsning pr rør) og fylde dem helt op med 60% kolloide silicapartikler opløsning (ca.. 30 ml kolloide silicapartikler opløsning pr rør).
    BEMÆRK: Undgå overbelastning af kolloide silicapartikler gradient, da klynger nemt kan komme i klemme, hvis der er for meget cytoplasmatisk vragrester i gradienten.
  9. Spin i 5 minutter ved 3000 x g efterfulgt af 30 minutter ved 45.440 xg ved 4 ° C i en rotor med fast vinkel.
    BEMÆRK: Som før, vil interphasic kerner holdes trænge ind i gradient (hvis homogenisering ikke skete også stærkt der frigiver kerner fra cytoplasmatisk snavs), men klyngerne vil akkumulere omkring 1,5 cm fra bunden af ​​røret, ofte som en løs bold.
  10. Fjern væsken over klynger ved hjælp af en pipette, pool resten i et rør, resuspender godt og videredistribuere til to polycarbonat centrifugering rør (28,8 x 107,0 mm). Klyngen suspension 1 Fortynd: 4 med opløsning III i hvert rør, og bland godt. Mark the websted blev pelleten bliver og spin 1.000 xg i 15 minutter ved 4 ° C i en rotor med fast vinkel.
  11. Resuspender pillerne i Solution III, pool i en 50 ml konisk centrifugerør og fylde op med Solution III. Der centrifugeres ved kun 300 x g i ca. 10 min. Må ikke centrifugeres ved højere hastighed - det kan forårsage uoprettelige sammenlægning af klynger.
  12. Vask igen med Solution III i 1,5 eller 2 ml reaktionsrør (resuspendere pillerne og fylde rørene helt op) og centrifugeres ved 300 x g. Fjern supernatanten forsigtigt med en pipette. Resuspender pellet forsigtigt i 250 pi klynge opbevaringspuffer (hvis du har flere piller bruge 250 pi til alle sammen og samle dem). Fortynd 5-10 pi af prøven 1: 2 med Trypan blå og tæller i Neubauer kammer. Hvis relevant fortyndet mere for at opnå en omtrentlig koncentration på 500 klynger / pl.
  13. Skub suspensionen gennem en 100 um cellefilter at sørge for at fjerne klynge sammenlægnings som følge af forkert resuspension. Klyngerne kan opbevares i flere måneder i -80 ° C. For at undgå flere genfrysning foretage passende portioner og snap fryse i flydende nitrogen.

4. Præparater af buffer til Interphasic Xenopus laevis Egg Uddrag

BEMÆRK: Xenopus laevis frøer vedligeholdes og behandles i overensstemmelse med de retningslinjer og regler, der er fastsat i konventionen af Europarådet om beskyttelse af hvirveldyr, der anvendes til forsøg og andre formål (EU ratificeret i 1998), og den tyske lov vedrørende brugen af ​​hvirveldyr i forskningen.

  1. Forbered DTT og en 100-fold proteaseinhibitor blanding ifølge 1.2.3 og 1.2.4. Opløs cytochalasin B til en slutkoncentration på 10 mg / ml i DMSO, aliquot (10 eller 20 pi anbefales) og opbevares ved -20 ° C.
  2. Opløs cycloheximid til en slutkoncentration på 20 mg / ml i ethanol, aliquot (500 pianbefales) og opbevares ved -20 ° C. Opløs calcium A23187 til en slutkoncentration på 2 mg / ml i ethanol, alikvot og opbevares ved -20 ° C.
    BEMÆRK: PI kan DTT, cytochalasin B, cycloheximid og A23187 gentagne gange frosset og optøet.
  3. Forbered 20x Mark Modified Ringers puffer (MFR) indeholdende 2 M NaCl, 40 mM KCI, 20 mM MgCl2, 40 mM CaCl2, 2 mM EDTA og 100 mM Hepes, justering af pH til 8,0 med 5 N KOH.
    BEMÆRK: 20x MMR kan holdes i lang tid ved stuetemperatur. Afhængig af mængden af ​​æg, for én udarbejdelse af interphasic æg ekstrakt 1 l 1x MMR pr injiceret frøen og yderligere 5-10 liter til vasketrinene er nødvendige. Genjustere pH 1x MMR til 8,0 med 5 N KOH. 1x MMR parat til at holde frøer i O / N x 1 skal være ved stuetemperatur. 1x MFR fremstillet til fremstilling ekstraktet skal holdes koldt, indtil det anvendes, men det er ikke afgørende for forsøget, at 1x MMR er virkelig koldt.
  4. Forbered 1 L sucsteg buffer indeholdende 250 mM sucrose, 50 mM KCI, 2,5 mM MgCl2 og 10 mM Hepes pH 7,5. Saccharose buffer bør være forberedt dagen før du bruger sterilt vand og skal opbevares ved 4 ° C.
  5. Forbered dejellying løsning frisk om morgenen af ​​eksperimentet ved at opløse 2% L-cystein i 0,25x MMR. Indstil pH til 7,8 med 5 N KOH. Opbevares ved 4 ° C, indtil det anvendes.

5. Protocolfor Interphasic Xenopu s laevis æggeekstrakt

  1. Injicere 120 IE gravid hoppe serum gonadotropin (PMSG) ind i dorsale lymfeknuder sæk af hver frøen 3-10 dage før eksperimentet (5 ml sprøjter, 27 g ¾ '' nåle).
    BEMÆRK: Denne injektion vil fremkalde ægløsning. Mængden af ​​æggene et frø lægger varierer meget. En godt om frøen kan producere æg indtager en volumen på op til 7 ml efter at være de-jellynated hvilket svarer til op til 3,5 ml rå ekstrakt. Men mener, at nogle frøer måske ikke lægge eller vil lay dårlige æg.
  2. Injicer 500 IE humant choriongonadotropin (hCG) pr frog aftenen før eksperimentet (5 ml sprøjter, 27G ¾ '' nåle). Dette vil inducere frigivelse af æggene. Hold frøer i 13-17 timer ved 18 ° C i individuelle tanke, der indeholder 1,2 l 1x MMR (pH 8).
  3. Saml æggene ved at hælde dem i 600-1.000 ml glas bægre.
    BEMÆRK: Tag kun de gode partier af æg, der er individuelt fastsatte, lignende i størrelse og klart pigmenteret med en mørk og en lys farvet halvdel. Du må ikke tage æg, der danner strenge eller at se oppustede og hvid. Disse skal sorteres ud under hele proceduren ved anvendelse af en Pasteur-pipette af plast. For en detaljeret beskrivelse af gode versus dårlige æg se Gillespie et al. 6
  4. Vask æg intensivt, ca 4 gange, med 1x MMR ved dekantering af supernatanten, når æggene har slået sig ned, og genopfyldning bægeret med frisk buffer bagefter.
    BEMÆRK:æg er stabile inden de dejellynated og vaskepufferen kan anvendes direkte på æggene.
  5. Dejellynate æggene ved inkubering i 2% cystein opløsning. Skift buffer én gang efter 2-4 minutter ved dekantering bufferen og omhyggeligt fylde bægeret med frisk buffer. Considerdejellying fuldstændig, når mængden af ​​æggene drastisk falder, og æggene bliver mere tæt pakket.
    BEMÆRK: dejellying brug ca. 5-7 min og bør stoppes, når synlig, men senest efter 10 min.
  6. Vaske æg ca 4 gange med 1x MMR ved dekantering og genopfyldning buffer supernatanten.
    BEMÆRK: Æggene er mere skrøbelig efter at være blevet dejellynated og dermed skal gøres mere omhyggeligt vasketrinene. MFR bør snarere skylles på væggen i bægeret i stedet for direkte på æggene.
  7. Aktiver æg i 100 ml 1x MFR ved tilsætning af 8 pi af calciumionophor (2 mg / ml i ethanol). Stop aktivering, når dyr kasket sammentrækning værekommer synlige eller efter 10 min.
    BEMÆRK: Dyret kasket sammentrækning kan identificeres ved komprimering af den sorte halvdel af ægget.
  8. Vask omhyggeligt 4 gange med 1x MMR ved dekantering og genopfyldning bufferen supernatanten.
  9. Inkuber æg til 20 minutter i 1x MMR ved RT.
  10. Forbered centrifugeringsrør under inkubationstiden: Sted 50 pi sucrosebuffer 50 pi 100-fold proteaseinhibitor mix, 5 pi 1 M DTT, 12,5 pi cycloheximid (for at forhindre translation, især cyclin B) og 2,5 pi cytochalasin B (til forhindre actinpolymerisation) i 5 ml centrifugeringsrør (13 x 51 mm). Alternativt, for mere end 30 ml æg, 14 ml rør (14 x 95 mm), kan anvendes, i denne stigning volumen tilfælde med 2,4 gange.
  11. Vask æggene to gange med kold saccharose buffer (dekanteres og refill buffer i bægerglas) og overføre dem til centrifugering rør ved hjælp af en plastik Pasteur-pipette med bred åbning (afbrød smalle ende).
  12. Pakkeæg ved centrifugering i 1 min ved 130 x g. Sæt rørene i 15 ml koniske centrifugerør til dette formål (sætte 14 ml rør i 50 ml koniske centrifugerør, henholdsvis). Målet er at fjerne så meget som muligt buffer for at forhindre fortynding af ekstrakten. Efter centrifugering fjernes overskud af puffer ved anvendelse af en Pasteur-pipette af plast og til sidst fylde flere æg på toppen.
  13. Spin i en 6 x 5 ml swing rotor i 20 minutter ved 21.000 xg ved 4 ° C.
  14. Fjern lav hastighed ekstrakt under anvendelse af en 5 ml sprøjte med en 16 G 1½ '' nål mellem gul blomme på toppen og mørke brudt æg snavs i bunden. Til dette formål, skubbe kanylen gennem væggen i centrifugeglasset lige over laget af knuste æg snavs i bunden. Hold røret mod en modstand, når skubbe med nålen.
    BEMÆRK: En fyldt 5 ml centrifugerør giver mellem 1,8-2,5 ml ekstrakt.
  15. Per 1 ml ekstrakt tilsættes 10 pi 100-fold proteaseinhibitor mix, 1 pi1 M DTT, 2,5 pi cycloheximid (20 mg / ml) og 0,5 pi cytochalasin B (10 mg / ml). Hold ekstraktet på is.
    BEMÆRK: Ekstrakten kan enten anvendes direkte til forsøg eller opdelt i portioner, lynfrosset og opbevaret i flydende nitrogen i adskillige måneder. Frysning ekstraktet vil falde dets aktivitet. For sarte eksperimenter som immunodepletion er det stærkt anbefales at bruge friske ekstrakt med det samme.

6. Forberedelse af buffere til in vitro Rekonstituering af Chromatin dekondensering

  1. Forbered energimix stamopløsning indeholdende 25 mM ATP, 25 mM GTP, 127,5 mg / ml creatin phosphat og 2,5 mg / ml kreatinkinase i buffer indeholdende 250 mM saccharose, 1,2 mM Hepes, 5,9 mM KCI og 0,3 mM MgCI2. Alikvot og opbevares ved -80 ° C. Brug frisk efter optøning, må ikke nedfryses igen.
  2. Opløs 0,2 g / ml glycogen i deioniseret vand. Opbevar ved -20 ° C. Opløs 6-dimethyl aminopurin (DMAP) til en slutkoncentration0,25 M i DMSO. Alikvot og opbevares ved -20 ° C. Brug frisk efter optøning, må ikke nedfryses igen.
  3. Forbered 30% (vægt / volumen) saccharose i PBS, filter og opbevares ved 4 ° C. Forbered 4% VikiFix opløsning indeholdende 80 mM RØR pH 6,8, 1 mM MgCl2, 150 mM saccharose og 4% paraformaldehyd (PFA) (ADVARSEL! Arbejde under kemisk hætte, handsker og beskyttelse munden).
    BEMÆRK: PFA er svært at opløse derfor anbefales det at gøre det som følgende: For 1 l Viki-Fix opløse 24,2 g Rør og 40 g PFA i separate bægre, både i varmt (næsten kogende) demineraliseret vand. Begge vil opløse gennem tilsætning af 10 N NaOH, men vær forsigtig for ikke at tilføje for meget. Tilføj 51,4 ​​g saccharose og 1 ml 1 M MgCl2 til PFA opløsning. Tilsæt RØR løsning på den anden blanding. Fyld op til 1 liter slutvolumen og justere pH til neutral ved tilsætning af NaOH.
  4. Opløs 10 mg / ml 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) i vand (ADVARSEL! Handsker). Opbevar imørke ved -20 ° C.

7. Protokol for in vitro Rekonstituering af Chromatin dekondensering

  1. Spin lav hastighed interphasic ekstrakt i 12 minutter ved 386.000 xg i en fast vinkel 20 x 0,2 ml eller 355 000 x g i en 10 x 2,0 ml rotor.
  2. Fjern forsigtigt lipid lag oven ved hjælp af en vakuumpumpe eller pipette og tage supernatanten (herefter kaldet højhastigheds ekstrakt) undgå forurening membran fra det nederste lag og kassér pellet.
    BEMÆRK: For at reducere mulig forurening membran er det tilrådeligt at spinde ekstraktet to gange eller at fortynde ekstraktet med 20% af volumen med saccharose buffer før centrifugering. Imidlertid kan fortynding og yderligere centrifugeringstrin reducere ekstrakt aktivitet.
  3. Pipetter 18 pi højhastigheds-ekstrakt i et 1,5 ml reaktionsrør, tilsættes 0,7 pi mitotisk klynge (beløb kan let varieres ifølge chromatin stamkoncentration), 0,5 pi glycogen, 0,5 pienergimix og 0,3 pi DMAP. Brug tips med bred åbning til at blande reaktionen så snart tilsættes kromatin at forhindre forskydning af dekondensering kromatin.
    BEMÆRK: Reaktionen kan udføres i nærvær eller fravær af membraner (se figur 3). At decondense kromatin i nærvær af membraner, tilsættes 2 pi flød membraner fremstillet ifølge protokollen beskrevet af Eisenhardt et al. 16
  4. Inkuber reaktionsblandingen i op til 2 timer (eller mindre at studere tidligere tidspunkter af dekondensering processen) ved 20 ° C.
  5. Fastgør prøven ved tilsætning af iskold 0,5 ml Viki-Fix indeholdende 0,5% glutaraldehyd og 0,1 mg / ml DAPI og inkubation i 20-30 min på is.
    BEMÆRK: Hvis prøverne vil blive behandlet yderligere i immunfluorescens bør fikseringen ske uden glutaraldehyd, da dette ofte forstyrrer antistoffarvning. Men hvis kun DAPI farvning vil blive analyseret, tilsætning af overflodaraldehyde vil bevare en pænere chromatinstruktur.
  6. Inkuber runde dækglas (diameter 12 mm) i 5 minutter med poly-L-lysin opløsningen for at forøge affiniteten af ​​dækglassene til kromatin. Tør dækglassene på filterpapir bagefter.
  7. Saml fladbundede centrifugeringsrør (6 ml, 16/55 mm) ved at sætte dækglassene med den coatede websted til toppen på bunden af ​​centrifugerør. Tilføj 800 pi af sucrosepude 30% og lag den faste prøve på toppen.
  8. Spin for 15 min ved 2500 xg ved 4 ° C.
    BEMÆRK: De fladbundede centrifugering rør passer til rotorer, der udsteder 15 ml koniske centrifugerør.
  9. Dekanteres, derefter fjerne dækglassene fra rørene ved forsigtigt at stikke bunden af ​​centrifugerør med en 16 G 1½ '' kanyle. Til dette formål tape låget af nålen og nålen sig sammen ved deres bunde og skære den forreste ende af låget, så nålen stikker ca. 3mm ud. Når dækglasset løftes af nålen på et websted, skal du bruge pincet til at fjerne dækglasset.
  10. Vask dækglasset hurtigt ved at dyppe den i deioniseret vand, tørre det forsigtigt ved at trykke på sin side til filtrerpapir, og placere den på objektglas på en dråbe monteringsmedium. Forsegle det med neglelak, tørt og holde mørke.
    BEMÆRK: Prøver fastsættes uden glutaraldehyd kan opbevares i PBS i en 24-brønds plade og anvendes yderligere til immunfluorescensfarvning. Hvis opbevaret i flere dage, tilsættes 0,05% natriumazid (ADVARSEL! Bære handsker) til PBS for at undgå forurening med bakterier.
  11. Analysere prøver ved fluorescensmikroskopi af DAPI signal (ved hjælp af f.eks et konfokalt mikroskop med en 405 nm laser).

8. Udarbejdelse af buffer til immunfluorescensfarvning af In Vitro rekonstitueret Chromatin dekondensering Prøver

  1. Forbered PBS ifølge 1.1.1. Opløs NH4Cl til en final koncentration på 50 mM i PBS. Denne opløsning opbevares ved 4 ° C. Opløs 5 ug / ml DAPI i PBS (forberede frisk). Tilføj 0,1% Triton X-100 til PBS. Hold ved 4 ° C. Forbered blokerende buffer umiddelbart før brug ved fortynding 3% bovint serumalbumin (BSA) i PBS + 0,1% Triton X-100.

9. Protokol for immunfluorescensfarvning af In Vitro rekonstitueret Chromatin dekondensering Prøver

BEMÆRK:. Alle følgende inkubationer af dækglas er lavet i en 24-brønds plade med mindst 250 gi opløsning pr godt, hvis ikke andet er anført In vitro dekondenseret kromatin prøver er mere følsomme end faste celler derfor være forsigtig, når du tilføjer eller fjerner løsninger. Det anbefales at bruge plastik Pasteur-pipetter skåret kantet. Til vask trin og sekundært antistof inkubation placere pladen ved RT på rokkende eller roterende platform, bevæger sig ikke hurtigere end 100 rpm.

  1. Quench prøver ved at inkubere dækglassets med 1 ml NH4Cl i PBS i 5 minutter. Blok prøver ved inkubation med 1 ml dem blokeringsbuffer i mindst 30 min.
  2. Saml et fugtighedskammer til inkubation med det primære antistof: Sæt en vådt væv på bunden af ​​en lukbar box og låget på plade med 24 brønde på hovedet oven på den våde væv. Placer parafilm i låget og tilsæt 70 ul af antistofopløsningen per prøve på parafilm. For antistofopløsning fortyndet antiserum eller affinitetsoprensede antistoffer 1: 100 i blokeringspuffer.
  3. Placer dækglassene op og ned på toppen af ​​antistofopløsning og inkuber dem i 1 til 2 timer. Placer dækglassene tilbage til 24-brønds plade med prøven opad og vaske prøver tre gange i 10 minutter med 1 ml 0,1% Triton X-100 i PBS.
  4. Inkuber dækglas i 1 time ved stuetemperatur i 250 pi sekundært fluorescerende-mærket antistof fortyndet i blokeringsbuffer til en koncentration, der anbefales af producenten. Beskyt mod lys. Vask three gange i 10 minutter med 1 ml 0,1% Triton X-100 i PBS.
  5. Inkuber prøverne i 10 minutter med 1 ml 5 ug / ml DAPI i PBS. Der vaskes tre gange i 5 minutter med 1 ml 0,1% Triton X-100 i PBS.
  6. Vask dækglasset hurtigt ved at dyppe den i deioniseret vand, tørre det forsigtigt ved at trykke på sin side til et filtrerpapir og placere den på objektglasset på toppen af ​​en dråbe monteringsmedium. Forsegle det med neglelak, tør og holde ved 4 ° C i mørke indtil anvendelse. Analyser prøverne ved fluorescensmikroskopi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tidsafhængighed af dekondensering reaktionen

Figur 1 viser et typisk tidsforløb for dekondensering assay. Klyngen af ​​kromosomer synlige i begyndelsen af ​​reaktionen decondenses og går over i en enkelt, rund og glat kerne. Når æggeekstraktet erstattes af saccharose buffer kromosomet klynge forbliver kondenseret, hvilket tyder på, at dekondensering aktivitet er til stede i æggeekstrakt.

Chromatin dekondensering er en energiafhængig proces

In vitro dekondensering reaktion kan bekvemt manipuleres fx ved tilsætning af inhibitorer. I eksperimentet vist i figur 2, den ikke-hydrolyserbare ATP eller GTP analoger, ATPyS eller GTPyS, blev tilsat til reaktionen. Både inhiberer dekondensering viser, at det er en ATP og GTP afhængig, aktiv proces (figur 2).

Den dekondensering assay blev udført i nærvær eller fravær af membraner (figur 3). Bemærk, at kromatin i begge betingelser undergår dekondensering dog tilsætning af membraner resulterer i større kerner. Sandsynligvis, reformation af den nukleare kuvert inducerer en sekundær dekondensering trin endnu en mekanisme, afhængig af nuklear transport.

Figur 1
Figur 1. Tidsforløb for th e in vitro dekondensering reaktion. Mitotisk chromatin klynger fra HeLa-celler blev inkuberet med interphasic Xenopus æggeekstrakt. Prøver blev fastsat ved angivne tidspunkter med 4% PFA og 0,5% glutaraldehyd, farvet med DAPI og analyseret ved co nfocal mikroskopi. Re-udskrives fra Magalska et al. 8. Scale bar er 5 pm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. chromatin dekondensering kræver ATP og GTP hydrolyse. Chromatin dekondensering blev udført i nærvær af 10 mM ATPyS, 10 mM GTPyS eller kontrol buffer. Prøver blev fikseret med 4% PFA og 0,5% glutaraldehyd ved angivne tidspunkter og analyseret ved konfokal mikroskopi. Re-udskrives fra Magalska et al. 8. Scale bar er 5 pm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3 "src =" / files / ftp_upload / 53407 / 53407fig3.jpg "/>
Figur 3. chromatin dekondensering i nærvær og fravær af membraner. Chromatin dekondensering blev udført i fravær (A) eller nærvær (B) af floatation oprenset membraner til 120 min. Prøver blev fikseret med 4% PFA og 0,5% glutaraldehyd og analyseret ved konfokal mikroskopi. Kromatin er farvet med DAPI, membraner med DiIC 18 (1,1'-dioctadecyl-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorat). Scale bar er 5 pm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Xenopus laevis æg ekstrakter er et meget nyttigt redskab til at gengive cellulære processer in vitro, og dette system blev med succes anvendt i karakteriseringen af cellecyklus og celledeling begivenheder 2, 3,5,6,17. På grund af store lagre af nukleare komponenter afsondret i ægget under oogenese, æg ekstrakter er en glimrende kilde til cellulære komponenter. Sammenlignet med andre tilgange som RNAi om pattedyrvæv cellelinjer eller genetisk manipulation, det giver flere fordele: Cellen-frit system gør det muligt at studere cellulære processer, hvor cellulær levedygtighed ville være ellers en begrænsning. Desuden enkelte trin af komplekse processer kan analyseres i simple assays. Den her præsenterede dekondensering analysen tillader at studere molekylære mekanismer i postmitotiske dekondensering uden indblanding fra andre mitotiske begivenheder henholdsvis. Xenopus æg ekstrakter er nemme at manipulere med udtømning af specifikke proteinerog tilsætning af inhibitorer eller muterede proteiner 8. For eksempel, figur 2 viser resultatet af at lægge de ikke-hydrolyserbare ATP-analoger eller GTP, ATPyS og GTPyS til dekondensering assay. Ved fortynding og differentieret centrifugering af Xenopus æg komponenter som membraner og cytosol kan adskilles 16. Figur 3 viser dekondensering assay udføres i nærvær eller fravær af membraner. Endelig kan det cellefrie assay også anvendes til at identificere hidtil ukendte faktorer fx ved en fraktionering tilgang. Ved hjælp af en sådan strategi, vi har identificeret AAA + -ATPases RuvBL1 / RuvBL2 som afgørende dekondensering faktorer 8.

In vitro-systemer baseret på X. laevis æg er blevet ansat med forskellige DNA-skabeloner:. Forbes et al viste, at injektion af fag λ DNA i ubefrugtet X. laevis æg inducerede samling af kromatin på NAKed fag λ DNA. Injektion af viralt DNA aktiveret ægget blev samlingen af kromatin efterfulgt af dannelsen af en kerne-lignende struktur 18 og tilsvarende λ-fag-DNA kan anvendes i kombination med æggeekstrakter at generere kernen lignende strukturer in vitro 19. Magnetiske perler belagt med DNA er blevet brugt til at studere chromatinization af DNA 20 og rekruttering af nukleare membraner 21 samt montering af en nuklear kuvert og pore komplekser 22, selv om det stadig er åbent, i hvilket omfang dette lignede en bona fide nuklear re-samleprocessen . Protokollen præsenteres her giver dekondensering af isolerede mitotiske kromatin klynger fra HeLa-celler under anvendelse af ekstrakt dannet fra aktiverede Xenopus æg. Det rekonstruerer grundigt begivenheder, der førte til en reformation af et interphasic kerne 8. I forhold til almindeligt anvendt nukleare samlingsreaktionen anvendt til at undersøge dannelse af nuklear kappe ogkerneporen komplekser ved udgangen af ​​mitose, i dekondensering assay HeLa mitotiske kromatin klynger i stedet for sperma DNA anvendes. Sperm DNA kan samles til mitotisk kromatin eller endda individuelle kromosomer ved inkubering med ekstrakt fremstillet ud fra ubefrugtede og ikke-aktiverede æg 3. Vi besluttede at bruge mitotiske klynger som kromatin kilde til at forenkle proceduren og undgå interferens fra chromatinkondensering. Desuden er fremstillingen af ​​æggeekstraktet let modificeret: For chromatin dekondensering lav hastighed ekstrakt væk for to højhastighedscentrifugering trin i fast vinkel rotorer anvendes. Lav hastighed ekstrakt kan opbevares i op til 6 måneder i flydende nitrogen uden at miste sin aktivitet. I modsætning hertil i reaktionerne nukleare montage, cytosol og flød membraner genereres fra lav hastighed ekstrakter ved fortynding og differentieret høj hastighed centrifugering før muligt frysning (se Eisenhardt et al. 16 for en detaiførte protokol). I vores analysesystem, tilsætning af membraner tillader dannelsen af ​​et lukket nuklear kappe herunder nukleare pore komplekser. De resulterende kerner er kompetente for nuklear import og eksport 8. Således dette system understøtter både chromatin dekondensering og reformation nukleare kuvert. Interessant, chromatin dekondensering er også muligt i fravær af membraner (figur 3). Men tilsætning af membraner resulterer i lidt større kerner. Mest sandsynligt, reformationen af ​​den nukleare kuvert inducerer en sekundær dekondensering trin endnu udefinerede mekanismer, som afhænger af nukleare import.

Til isolering af mitotiske kromatin klynger fra HeLa-celler blev en modificeret version af protokollen er oprettet ved Gasser og Laemmli 15 anvendes. Synkroniserede mitotiske celler lyseres i en buffer indeholdende ikke-ionisk detergent digitonin og mekaniske kræfter. Kromatin isoleres som klynger, der indeholderalle kromosomer fra en kerne. Den afgørende forskel i forhold til en enkelt kromosom isolation protokoller er, at cellerne ikke er hypotonisk hævede men afkølet til 4 ° C før lysering. Dette forhindrer frakobling af de enkelte kromosomer 15, 23. Sammenlignet med protokollen offentliggjort af JR Paulson 23, som erkendte fordel af isolering af hele kromatin klynger, Gasser & Laemmli anvendes EDTA-holdige buffere polyamin i stedet for Mg 2+ buffere til at reducere aktiviteten af kinaser, nukleaser, proteaser og phosphataser og af denne formindske mængden af protein- og DNA ændringer, der opstår under isolationsprocessen 15. Derudover bruger en kolloide silicapartikler gradient under differentiel centrifugering stærkt reducerer cytoplasmatisk forurening. Protokollen kan også anvendes til at isolere mitotiske kromatin klynger fra kinesisk hamsterovarie og museceller 15.

af in vitro chromatin dekondensering kan være i det mindste delvist forklares ved inddragelse af RuvBL1 / 2, men også en anden AAA + -ATPase, p97, som fjerner det mitotiske kinase Aurora B fra chromatin i mitotisk exit 24. Hvorfor processen kræver GTP hydrolyse er en af ​​de åbne spørgsmål, som vi har til hensigt at besvare ved hjælp af denne opsætning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af den tyske Research Foundation og ERC (AN377 / 3-2 og 309.528 CHROMDECON til WA) og en ph.d.-Eventyret om Boehringer Ingelheim Fonds til AKS Figur 1 & 2 er genoptrykt fra Developmental Cell 31 (3), Magalska et al., RuvB-lignende ATPaser funktion i kromatin dekondensering i slutningen af mitose, 305-318, 2014, med venlig tilladelse fra Elsevier.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
spermine tetrahydrochloride Fluka analytical 85610-25G
spermidine trihydrochloride Sigma  S2501-5G
high-purity digitonin Millipore 300410-1GM toxic
PMSF Applichem A0999,0100 toxic
thymidine Calbiochem 6060
nocodazole Calbiochem 487928 toxic
37% formaldehyde solution Roth 7398-1 toxic
trypan blue solution (0.4%) Sigma T8154 toxic
1,4-dithiothreitol (DTT) Roth 6908.2
AEBSF hydrochloride Applichem A1421,0001
pepstatin Roth 2936.1/2/3
leupeptin Roth CN334
aprotinin Roth A162.3
Percoll (colloidal silica particles solution) GE Healthcare 17-0891-01
glutamine Gibco 25030-024
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
75 cm² tissue culture flasks Greiner Bio-one 658175
heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) Gibco 10500-064
Homogenizer (40 ml tissue grinder) Wheaton 357546
Neubauer chamber Assistent 441/1
 Oak Ridge Centrifuge Tubes, polycarbonate (50 ml) Nalgene 3118-0050
100 µm cell strainer, nylon BD Falcon 352360
cytochalasin B Applichem A7657,0010 toxic
cycloheximide Roth 8682.3 toxic
L-cystein Merck 1,028,381,000
hCG available as Ovogest MSD 1431593
PMSG available as Intergonan MSD 1431015
A23187 (mixed calcium-magnesium-salt) Enzo ALX-450-002-M010 toxic
syringe needles (1.20 x 40 mm, 18 G x 1 1/2") Braun 4665120
ATP Serva 10920.03
GTP, 2 Na x 3 H20 Roth K056.1/2/3/4
creatine phosphat disodium salt Calbiochem 2380
creatine phosphokinase Sigma C3755-35KU
DMAP Sigma D2629-1G
DAPI  Roche 10236276001
PFA Sigma P-6148 toxic
centrifugation tubes for TLA 100 (7 x 10 mm, 5/16 x 13/16 in.) Beckman Coulter 343775
"Cell-Saver" (tips with wide opening, 1,000 µl) Biozym 729065
50% glutaraldehyde solution, grade I Sigma alderich G7651-10 ml toxic
0.1% (w/v) poly-L-lysine solution Sigma P8920-100 ml
flat-bottom tubes (6 ml, 16.0/55 mm) Greiner Bio-one 145211
Vectashield mounting medium Vector laboratories H1000
tubes for TLA120 (11 x 34 mm, 7/16 x 1 3/8 in.) Beckman Coulter 343778
"Cell-Saver" (tips with wide opening, 200 µl) Biozym 729055
12 mm coverslips Thermo Scientific 0784 #1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lohka, M. J., Masui, Y. Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components. Science. 220, 719-721 (1983).
  2. de la Barre, A. E., Robert-Nicoud, M., Dimitrov, S. Assembly of mitotic chromosomes in Xenopus egg extract. Methods Mol Biol. 119, 219-229 (1999).
  3. Maresca, T. J., Heald, R. Methods for studying spindle assembly and chromosome condensation in Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 459-474 (2006).
  4. Galy, V., et al. A role for gp210 in mitotic nuclear-envelope breakdown. J Cell Sci. 121, 317-328 (2008).
  5. Chan, R. C., Forbes, D. I. In vitro study of nuclear assembly and nuclear import using Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 289-300 (2006).
  6. Gillespie, P. J., Gambus, A., Blow, J. J. Preparation and use of Xenopus egg extracts to study DNA replication and chromatin associated proteins. Methods. 57, 203-213 (2012).
  7. Gant, T. M., Wilson, K. L. Nuclear assembly. Annu Rev Cell Dev Biol. 13, 669-695 (1997).
  8. Magalska, A., et al. RuvB-like ATPases function in chromatin decondensation at the end of mitosis. Developmental Cell. 31, 305-318 (2014).
  9. Belmont, A. S. Mitotic chromosome structure and condensation. Curr Opin Cell Biol. 18, 632-638 (2006).
  10. Lavoie, B. D., Tuffo, K. M., Oh, S., Koshland, D., Holm, C. Mitotic chromosome condensation requires Brn1p, the yeast homologue of Barren. Mol Biol Cell. 11, 1293-1304 (2000).
  11. Philpott, A., Leno, G. H. Nucleoplasmin remodels sperm chromatin in Xenopus egg extracts. Cell. 69, 759-767 (1992).
  12. Philpott, A., Leno, G. H., Laskey, R. A. Sperm decondensation in Xenopus egg cytoplasm is mediated by nucleoplasmin. Cell. 65, 569-578 (1991).
  13. Burglin, T. R., Mattaj, I. W., Newmeyer, D. D., Zeller, R., De Robertis, E. M. Cloning of nucleoplasmin from Xenopus laevis oocytes and analysis of its developmental expression. Genes Dev. 1, 97-107 (1987).
  14. Whitaker, M. Calcium at fertilization and in early development. Physiological reviews. 86, 25-88 (2006).
  15. Gasser, S. M., Laemmli, U. K. Improved methods for the isolation of individual and clustered mitotic chromosomes. Exp Cell Res. 173, 85-98 (1987).
  16. Eisenhardt, N., Schooley, A., Antonin, W. Xenopus in vitro assays to analyze the function of transmembrane nucleoporins and targeting of inner nuclear membrane proteins. Methods Cell Biol. 122, 193-218 (2014).
  17. Wignall, S. M., Deehan, R., Maresca, T. J., Heald, R. The condensin complex is required for proper spindle assembly and chromosome segregation in Xenopus egg extracts. J Cell Biol. 161, 1041-1051 (2003).
  18. Forbes, D. J., Kirschner, M. W., Newport, J. W. Spontaneous formation of nucleus-like structures around bacteriophage DNA microinjected into Xenopus eggs. Cell. 34, 13-23 (1983).
  19. Hartl, P., Olson, E., Dang, T., Forbes, D. J. Nuclear assembly with lambda DNA in fractionated Xenopus egg extracts: an unexpected role for glycogen in formation of a higher order chromatin intermediate. J Cell Biol. 124, 235-248 (1994).
  20. Sandaltzopoulos, R., Blank, T., Becker, P. B. Transcriptional repression by nucleosomes but not H1 in reconstituted preblastoderm Drosophila chromatin. EMBO J. 13, 373-379 (1994).
  21. Ulbert, S., Platani, M., Boue, S., Mattaj, I. W. Direct membrane protein-DNA interactions required early in nuclear envelope assembly. J Cell Biol. 173, 469-476 (2006).
  22. Zhang, C., Clarke, P. R. Chromatin-independent nuclear envelope assembly induced by Ran GTPase in Xenopus egg extracts. Science. 288, 1429-1432 (2000).
  23. Paulson, J. R. Isolation of chromosome clusters from metaphase-arrested HeLa cells. Chromosoma. 85, 571-581 (1982).
  24. Ramadan, K., et al. Cdc48/p97 promotes reformation of the nucleus by extracting the kinase Aurora B from chromatin. Nature. 450, 1258-1262 (2007).

Tags

Molekylær Biologi Cell-fri assay mitotisk exit kromatin isolation, chromatin dekondensering nuklear reformation chromatinkondensering
En celle Gratis Assay til at studere Chromatin dekondensering i slutningen af ​​Mitose
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schellhaus, A. K., Magalska, A.,More

Schellhaus, A. K., Magalska, A., Schooley, A., Antonin, W. A Cell Free Assay to Study Chromatin Decondensation at the End of Mitosis. J. Vis. Exp. (106), e53407, doi:10.3791/53407 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter