Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

תא Assay חינם לחקר הכרומטין Decondensation בסוף מיטוזה

Published: December 19, 2015 doi: 10.3791/53407
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1
1Friedrich Miescher Laboratory, Max Planck Society, 2Nencki Institute of Experimental Biology, Polish Academy of Sciences
* These authors contributed equally

Introduction

תמצית ביצת laevis Xenopus היא כלי רב עוצמה ומיושם באופן נרחב כדי ללמוד אירועים הסלולר מסובכים בפשטות של assay תא ללא. מאז התיאור הראשון שלהם על ידי Lohka & 1 Masui הם כבר בשימוש נרחב ללמוד תהליכי mitotic כגון הכרומטין עיבוי 2, הרכבה ציר 3, התמוטטות מעטפת גרעין 4, אלא גם תחבורת nucleocytoplasmic 5 או DNA שכפול 6. אירועים המתרחשים בסוף מיטוזה, הכרחיים להרפורמציה של גרעין interphasic כגון הרפורמציה מעטפת גרעין והרכבה מחדש מורכבת נקבובית הגרעיני הם הרבה פחות מובנים בהשוואה לאירועי mitotic המוקדמים אך ניתן ללמוד באופן דומה באמצעות תמצית ביצת צפרדעי 7. יש לנו לאחרונה הוקם assay המבוסס על תמצית ביצת צפרדעים ללמוד decondensation הכרומטין בסוף מיטוזה 8, תהליך נחקר תחת שמחכה ליTS אפיון מפורט.

בmetazoans, הכרומטין מרוכז מאוד בכניסה mitotic על מנת לבצע בנאמנות הפרדה של החומר הגנטי. כדי להבטיח שהכרומטין נגיש לביטוי גנים ושכפול ה- DNA במהלך שלבי הביניים, זה צריך להיות דה-נדחס בסוף מיטוזה. בבעלי חוליות, הכרומטין הוא עד חמישים ולקפל יותר דחוס במיטוזה לעומת הביניים 9, בניגוד לשמרים שבו דחיסת mitotic היא בדרך כלל נמוכה בהרבה, למשל, כפול רק בס cerevisiae 10. decondensation הכרומטין חוליות כבר למד בעיקר בהקשר של ארגון מחדש DNA הזרע לאחר הפריית ביצית. מנגנון מולקולרי, שבי nucleoplasmin, חלבון ביצית בשפע, מחליף protamines זרע ספציפי לH2A ההיסטונים וH2B מאוחסן בביצה. תהליך זה גם הובהר באמצעות תמצית Xenopus ביצת 11, 12. עם זאת, הביטוישל nucleoplasmin מוגבל לביציות 13 והכרומטין mitotic אינו מכיל protamines הזרע ספציפי אלה. לכן הכרומטין decondensation בסוף מיטוזה הוא nucleoplasmin עצמאי 8.

במבחנת התגובה decondensation אנו מעסיקים תמצית המופקת מהביצים מופעלות X. laevis ואשכולות הכרומטין המבודדים מתאי הלה מסונכרנים. טיפול בביצים עם ionophore סידן מחקה את שחרור סידן לתוך הביצית שנוצרה על ידי כניסת זרע במהלך הפריה. גל סידן גורם לחידוש מחזור התא והביצה, נעצר בmetaphase השני של המיוזה, התקדמות לשלבי הביניים הראשונים 14. לכן, תמציות ביצה מוכנות ביצי צורה מופעלת לייצג את מדינת יציאה / הביניים mitotic ומוכשרים כדי לגרום לאירועים ספציפיים ליציאת mitotic כמו decondensation הכרומטין, מעטפת גרעין ולהתעמק הרפורמציה מורכבת. לבידוד של CH mitoticromatin אשכולות השתמשנו גרסה מעט שונה של הפרוטוקול שפורסם על ידי גאסר וLaemmli 15, שבו אשכולות כרומוזום פורסמו על ידי תמוגה מתאי הלה מסונכרן במיטוזה ומבודדת במאגרים המכיל polyamine ידי centrifugations שיפוע.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

בידוד אשכול mitotic הכרומטין מתאי הלה

1. הכנות

  1. פתרונות תרבית תאים
    1. הכן בינוני של הנשר שונה Dulbecco המלא (DMEM) על ידי הוספת 10% בסרום עוברי עגל, 100 יחידות / מיליליטר פניצילין, 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין וגלוטמין 2 מ"מ לDMEM. הכן מלוח פוספט חיץ (PBS) המכיל 2.7 מ"מ KCl, 137 מ"מ NaCl, 10 מ"מ Na 2 4 HPO 2H 2 O ו- 2 pH KH 2 PO 4 במים ללא יונים, ולהתאים מ"מ עד 7.4 עם 10 N NaOH.
      הערה: אפשר לשמור PBS כפתרון מניות 10x לאורך זמן על RT. לדלל אותו עם מים ללא יונים ל1x לפני השימוש. סנן את פתרון 1x שוב אם זה יהיה בשימוש בתרבית תאים.
    2. הכן מלאי 40 מ"מ של פתרון תימידין (תרבית תאים מתאימה) במדיום DMEM. ממיסים 0.97 תימידין גרם ב 90 מיליליטר של מדיום DMEM. להתאים את עוצמת קול סופי ל -100 מיליליטר. פתרון מניות חנות ב -20 °ג ממיסים (זהירות! לעבוד מתחת למכסת מנוע כימי, ללבוש כפפות ופה הגנה) nocodazole ל5 מ"ג / מיליליטר פתרון מניות בDMSO.
  2. פתרונות בידוד אשכולות mitotic
    הערה: כל הפתרונות מתוארים ב1.2 צריכים להיות כל הזמן על קרח לאחר הכנה / הפשרה לאורך כל הניסוי.
    1. מים ללא יוני החיטוי במשך 105 דקות ב 121 מעלות צלזיוס. ממיסים tetrahydrochloride spermine במי autoclaved, deionized לריכוז סופי של 200 מ"מ (69.6 מ"ג / מיליליטר). פתרון מניות חנות ב -20 ° C. ממיסים trihydrochloride spermidine במי autoclaved, deionized לריכוז סופי של 200 מ"מ (50.8 מ"ג / מיליליטר). פתרון מניות חנות ב -20 ° C.
    2. הכן 5% (w / v) digitonin (זהירות! לעבוד מתחת למכסת מנוע כימי, ללבוש כפפות ופה הגנה) במים חמים, ללא יונים. aliquots סינון ולאחסן ב -20 ° C. ממיסים פלואוריד phenylmethylsulfonyl (PMSF) (זהירות! עובד undeמכסה המנוע כימי R, ללבוש כפפות ופה הגנה) לריכוז סופי של 200 מ"מ (35 מ"ג / מיליליטר) ב 100% אתנול. פתרון מניות חנות ב -20 ° C.
    3. ממיסים dithiothreitol (DTT) עם מים ללא יונים לריכוז סופי של 1 M (154 מ"ג / מיליליטר) (זהירות! לעבוד מתחת למכסת מנוע כימי, ללבוש כפפות). פתרון סינון ומניית החנות ב -20 ° C.
    4. הכן פי 100 תערובת מעכבי פרוטאז (זהירות לעבוד מתחת למכסת מנוע כימי, ללבוש כפפות!) על ידי המסת 10 מ"ג / מיליליטר AEBSF (4 (2-Aminoethly -) - benzensulfonylfluoride), מ"ג 0.2 / מיליליטר leupeptin, 0.1 מ"ג / מיליליטר pepstatin 0.2 מ"ג / מיליליטר aprotinin במים ללא יונים. פתרון מניות חנות ב -20 ° C.
    5. הכן פתרון מניות 10x של חיץ המכיל 150 מ"מ טריס-Cl (pH 7.4), 800 מ"מ KCl, 20 מ"מ EDTA-KOH (pH 7.4), tetrahydrochloride spermine 2 מ"מ ו 5 trihydrochloride spermidine מ"מ. חיץ חנות ב 4 ° C ללא tetrahydrochloride spermine וtrihydrochloride spermidine, שיש להוסיףטרי רק לפני שימוש.
      הערה: EDTA מתמוסס רק בPHS גבוה יותר מ -8, ולכן, כדי להכין את הפתרון גבוה מרוכז EDTA-KOH מניות (0.5 M המומלץ), להוסיף 5 N KOH לpH מעל 8 לפזר אותו. לאחר מכן לכיל עד pH 7.4.
    6. הכן פתרון 20x מניות של חיץ הכמכיל 100 מ"מ טריס- HCl (pH 7.4), 400 מ"מ KCl, 400 מ"מ EDTA-KOH (pH 7.4) וtrihydrochloride spermidine 5 מ"מ. ניתן לאחסן חיץ כמו תחת אותם תנאים כמו א חיץ
      הערה: הכן את הפתרונות עובדים I עד IV (ראה בשלבים הבאים), שיפוע גליצרול ואת הפתרונות שחלקיקי סיליקה colloidal המכילים חלקיקי סיליקה (15 עד 30 בקוטר ננומטר) מצופים בpolyvinylpyrrolidone אינו dialyzable (PVP) טריות רק לפני הבידוד ההליך (PMSF וdigitonin יש להוסיף ישירות לפני השימוש כPMSF הוא יציב בתמיסות מימיות וdigitonin נוטה לזרז על אחסון לטווח ארוך על קרח).
    7. הכן של פתרון אני 100 מיליליטר על ידי הוספת חיץ 0.5x,1 מ"מ DTT, 1: 100 של תמהיל פרוטאז המעכב ו0.1 מ"מ PMSF למים autoclaved, ללא יונים. הכן 50 מיליליטר של התמיסה השנייה (לתא תמוגה) על ידי הוספת חיץ 1x, 1 מ"מ DTT, 1: 100 של תמהיל מעכבי פרוטאז, 0.1 מ"מ PMSF, digitonin 0.1% וגליצרול 10% למים autoclaved, ללא יונים.
    8. הכן 200 מיליליטר של תמיסת III חיץ 0.25x מכיל, 1 מ"מ DTT, 1: 100 של תמהיל מעכבי פרוטאז, 0.1 מ"מ PMSF וdigitonin 0.05% במי autoclaved, ללא יונים. הכן 40 מיליליטר של תמיסה המכיל רביעי חיץ 1x כ, 1 מ"מ DTT, 1: 100 של תמהיל מעכבי פרוטאז, 0.1 מ"מ PMSF וdigitonin 0.1% במי autoclaved, ללא יונים.
    9. הכן 120 מיליליטר של תמיסת שיפוע גליצרול על ידי הוספת גליצרול 25% וdigitonin 0.1% לI. פתרון
    10. הכן 150 מיליליטר של תמיסת חלקיקי סיליקה colloidal המכיל 60% V / V (נפח לכל נפח) של חלקיקי השעיה המכילה סיליקה (קוטר 15 עד 30 ננומטר) מצופים בpolyvinylpyrrolidone אינו dialyzable (PVP), גליצרול 15%, 2 מ"מ שלpermidine trihydrochloride ו0.8 tetrahydrochloride spermine מ"מ IV פתרון.
    11. הכן מאגר אחסון אשכול המכיל 250 סוכרוז מ"מ, 15 מ"מ Hepes (pH 7.4), trihydrochloride spermidine 0.5 מ"מ, tetrahydrochloride spermine 0.2 מ"מ, 1: 100 של תמהיל מעכבי פרוטאז, BSA 0.3% ו- 30% גליצרול. מאגר אחסון האשכול יכול להיות כל הזמן ב -20 ° C.
    12. הכן פתרון תיקון סקווש המכיל 10% פורמלדהיד (זהירות! לעבוד מתחת למכסת מנוע כימי, ללבוש כפפות), 50% גליצרול, כפול חיץ Ringers השתנה של מארק (MMR לראות 4.5.) ושל 0.2 מיקרוגרם / מיליליטר DAPI (זהירות! ללבוש כפפות). חנות ב 4 מעלות צלזיוס בצינורות תגובת אור מוגנת. זה לא קריטי עבור הניסוי להשתמש מתכון תיקון סקווש זו, מתכונים חלופיים יעבדו גם.

2. סנכרון של תאים

  1. ביום 1: תאי הלה זרע בחמישה 75 סנטימטר 2 (250 מיליליטר) צנצנות עם תקשורת ודגירה זה על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2.
    הערה: זו תניב בכ 18 x 10 6 תאים ביום של בידוד אשכול הכרומטין.
  2. ביום 2: כאשר תאים הם לפחות 50% ומחוברות (כמחצית מהשטח מכוסה על ידי תאים ויש עדיין מקום לתאים לגדול), להוסיף תימידין לריכוז סופי של 2 מ"מ (בלוק תימידין) ותאי תרבות ל 24 שעות על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2.
    הערה: זה יעצור את התאים בG1 / S גבול השלב.
  3. ביום 3: בינוני לשאוב מכיל thymidine ולהוסיף PBS סטרילי. לשטוף את התאים על ידי שטיפה עדינה עם PBS סטרילי. לשאוב PBS ועדינות להוסיף 15-20 מיליליטר של תאים טריים, חמים מלאים DMEM בינוני והתרבות במשך 3 עד 4 שעות על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 לשחרר אותם מגוש G1 / S-השלב.
  4. ביום 3 (המשך): לאחר שחרור התאים מגוש G1 / S-השלב, להוסיף nocodazole לריכוז סופי של 100 ng / ml. לדלל nocodazole על ידי הוספת 2 μl של פתרון מניות (5 מ"ג / מיליליטר) עד 98μl של מדיום DMEM הטרי, ולהוסיף 1 μl של דילול nocodazole לכל מיליליטר של תרבית תאים. תרבות תאים לכ -12 שעות על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2. זה יחסום את התאים במיטוזה.

3. בידוד אשכולות mitotic

  1. ביום 4: לבודד אשכולות mitotic. שימוש במיקרוסקופ שדה בהיר, לבדוק אם רוב התאים mitotic. אם פחות מ -50% מהתאים הם לחכות עד mitotic יותר תאים מגיעים מיטוזה. איסוף תאי mitotic ידי הקשה במרץ בצד של הבקבוק (או על ידי בעדינות ריסוס עם פיפטה), זה יהיה לנתק את תאי mitotic שנותרו. להעביר את ההשעיה תא 50 צינורות צנטריפוגה חרוטי מיליליטר.
    הערה: תאי mitotic להיות עגולים ויכולים בקלות להיות מנותקים מתחתית הבקבוק (בדיוק כמו תאים לאחר trypsinization), שלא כמו תאים בשלבי מחזור תא אחרים, שהם שטוחים ומחוברים היטב לבקבוק.
  2. קציר תאי mitotic ידי ספינינג את הצינורות ב 1500 XG במשך 10 דקות (476; C או RT) והסרת supernatant לאחר מכן. Resuspend התא גלולה ב 8 מיליליטר PBS, בריכה לאחד 50 מיליליטר צינור צנטריפוגות חרוטי, למלא את הצינור עם PBS לחלוטין וספין שוב במשך 10 דקות ב 1500 x גרם. חזור על תהליך זה כביסה שלוש פעמים בסך הכל.
  3. מעתה והלאה לבצע את כל הצעדים על קרח עם פתרונות קרים. במרץ resuspend גלולה ב -37 מיליליטר של תמיסה קרה השני. מעבירים את ההשעיה לhomogenizer זכוכית זכוכית 40 מיליליטר קר באמצעות תאי פיפטה וlyse 25 מיליליטר על קרח בdouncing עם העלי הדוק עד אשכולות mitotic חופשיים של חומר cytoplasmic. מספר משיכות תלוי מאוד במניית digitonin ויכול להשתנות 3-20 פעמים.
    הערה: Homogenization יכול להיות די נמרץ, אבל צריך להיחשב שלם, כאשר כמעט כל תאי mitotic הם lysed והאשכולות נראים להיות חופשי של חומר cytoplasmic (ראה 3.4).
  4. אחרי כמה משיכות לערבב 5-10 μl של ההשעיה תא 1: 2 עם Trypan כחול ולבדוק על ידי MICRoscopy בתא נויבאואר. הכרומטין כאשר תאי lysed מוכתם כחול וללא קרום תא (הערה: שרידי cytoplasmic אפשריים יהיו לצבור סביב הכרומטין הצבעוניים הכחול ויהיה קל להבחין).
    הערה: תאי mitotic יהיה lyse לפני תאי interphasic אבל בכל זאת להיזהר לא להגזים הומוגניזציה כדי למנוע זיהום עם גרעיני interphasic והכרומטין המרוסק.
  5. מייד שכבה השלם lysate התא מעל הדרגתיים צעד קר (עם 5 מיליליטר של 60% פתרון חלקיקי סיליקה colloidal בתחתית, ועליהן 19.5 מיליליטר של תמיסת גליצרול שיפוע כל אחד) בחמישה צינורות צנטריפוגה פוליקרבונט (28.8 x 107.0 מ"מ, מומלץ מניח את הצינורות על קרח לפני להתקרר) בעזרת פיפטה 10 מיליליטר. אין להשאיר תאים בפתרון השני במשך זמן רב, ולכן זה מומלץ להכין את הצינורות והשיפוע מראש (לדוגמא, במהלך שלבי הכביסה).
  6. צנטריפוגה הדרגתיים במשך 30 מילn XG ב 1000 ב 4 מעלות צלזיוס בהרוטור זווית קבועה.
    הערה: גרעינים, תאים ואשכולות unlysed הם התאוששו יחד בממשק של גליצרול ושכבות חלקיקי סיליקה colloidal.
  7. הסר את הנוזל מעל הביניים בעזרת פיפטה ולהעביר את השאר לhomogenizer הקר. תערובת-Homogenize מחדש על ידי 3-15 שבץ (שוב תלוי במניית digitonin) עם העלי ההדוק לחסל אגרגטים וכדי להסיר סיבי cytoskeletal מהאשכולות. אחרי כל כמה משיכות לבדוק את היעילות של הומוגניות. לערבב 1 μl של המדגם עם 1 μl של תיקון סקווש בתוספת DAPI ולבחון תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
    הערה: מספר משיכות הוא חיוני, הנוכחות של אשכול צוברת אמצעי, שמספר משיכות אינו מספיק, ואילו הכרומטין המרוסק וגרעינים פסולת עולים כי הומוגניזציה הייתה חזקה מדי.
  8. להפיץ את הפתרון בין ארבעה צינורות צנטריפוגה פוליקרבונט חדשים (28.8 x107.0 מ"מ) (כ. 10 מיליליטר פתרון לכל צינור) ולמלא אותם לחלוטין עם 60% פתרון חלקיקי סיליקה colloidal (כ. 30 מיליליטר פתרון חלקיקי סיליקה colloidal לכל צינור).
    הערה: הימנע מעומס יתר שיפוע חלקיקי סיליקה colloidal מאז קלות יכולים להיות לכוד אשכולות אם יש יותר מדי פסולת cytoplasmic בשיפוע.
  9. ספין של 5 דקות ב3,000 XG, ואחרי 30 דקות ב 45440 XG ב 4 מעלות צלזיוס בהרוטור זווית קבועה.
    הערה: כמו בעבר, גרעיני interphasic יישמרו מלהיכנס לשיפוע (אם הומוגניזציה לא נעשתה יותר מדי אשר משחררת גרעינים מcytoplasmic פסולת), אבל האשכולות יצטברו כ -1.5 סנטימטר מהחלק התחתון של הצינור, לעתים קרובות ככדור חופשי.
  10. הסר את הנוזל מעל האשכולות בעזרת פיפטה, בריכה שאר לתוך צינור אחד, גלול היטב ולהפיץ לשני צינורות פוליקרבונט צנטריפוגה (28.8 x 107.0 מ"מ). לדלל את ההשעיה אשכול 1: 4 עם הפתרון שלישי בצינור אחד ומערבבים היטב. מארק האתר דואר היה גלולה תהיה ספין 1000 XG במשך 15 דקות על 4 מעלות צלזיוס בהרוטור זווית קבועה.
  11. Resuspend את כדורים בפתרון שלישי, בריכה לאחד 50 מיליליטר צינור צנטריפוגות חרוטי ומתמלאים בפתרון שלישי. צנטריפוגה ב 300 XG רק לכ -10 דקות. אל צנטריפוגות במהירות גבוהה יותר - זה עלול לגרום לצבירה בלתי הפיכה של אשכולות.
  12. לשטוף שוב עם הפתרון השלישי ב 1.5 או 2 מיליליטר צינורות תגובה (resuspend את כדורים ולמלא את הצינורות לחלוטין) וצנטריפוגות ב 300 x גרם. הסר את supernatant בזהירות עם טפטפת. Resuspend גלולה בזהירות ב250 חיץ אחסון אשכול μl (אם יש לך כמה כדורים להשתמש 250 μl לכולם ביחד וברכתם). לדלל 5-10 μl של המדגם 1: 2 עם Trypan הכחול ולספור בתא נויבאואר. אם לדלל ישים יותר כדי להשיג ריכוז משוער של 500 אשכולות / μl.
  13. לדחוף את ההשעיה דרך מסננת תא 100 מיקרומטר לוודא להסיר צבירת אשכולים כתוצאה מresuspension לא תקין. האשכולות יכולים להיות מאוחסנים במשך חודשים ב-80 ° C. כדי להימנע מrefreezing מרובה לעשות aliquots המתאים ולהצמיד הקפאה בחנקן נוזלי.

4. תכשירים מהמאגר לInterphasic Xenopus laevis חלץ ביצה

הערה: Xenopus laevis צפרדעים נשמרות ותטופל בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו באמנה של מועצת אירופה על ההגנה על בעלי החיים בעלי חוליות המשמשת לניסויים ולמטרות אחרות (האיחוד האירופי אשררו בשנת 1998) והחוק הגרמני הנוגע ל השימוש בבעלי החיים בעלי חוליות במחקר.

  1. הכן DTT ושילוב מעכבי פרוטאז פי 100 על פי 1.2.3 ו1.2.4. ממיסים cytochalasin B לריכוז סופי של 10 מ"ג / מיליליטר בDMSO, aliquot (10 או 20 μl המומלץ) ולאחסן ב -20 ° C.
  2. ממיסים cycloheximide לריכוז סופי של 20 מ"ג / מיליליטר באתנול, aliquot (500 μlמומלץ) ולאחסן ב -20 ° C. ממיסים את ionophore סידן A23187 לריכוז סופי של 2 מ"ג / מיליליטר באתנול, aliquot ולאחסן ב -20 ° C.
    הערה: PI, DTT, cytochalasin B, cycloheximide וA23187 אפשר להקפיא שוב ושוב ומופשר.
  3. הכן 20x החיץ של מארק השתנה Ringers (MMR) המכיל 2 M NaCl, 40 מ"מ KCl, 20 מ"מ MgCl 2, 40 מ"מ CaCl 2, 2 מ"מ EDTA ו 100 מ"מ Hepes, להתאים את ה- pH 8.0 עם 5 N KOH.
    הערה: יכול להיות כל הזמן 20x MMR לאורך זמן ארוך ב RT. בהתאם לכמויות של ביצים, להכנה אחד L תמצית ביצת interphasic 1 של MMR 1x לצפרדע מוזרקת ו5-10 ליטרים נוספים לשלבי הכביסה נחוצים. להתאים מחדש את ה- pH של 1x MMR 8.0 עם 5 N KOH. 1x MMR מוכן לשמור על הצפרדעים בO / N x 1 צריך להיות בRT. צריך להישמר 1x MMR מוכן להכנת התמצית קר עד שהוא משמש, אולם זה לא חיוני לניסוי שMMR 1x הוא ממש קר.
  4. הכן 1 ליטר של sucעלה מאגר המכיל 250 סוכרוז מ"מ, 50 מ"מ KCl, 2.5 מ"מ MgCl 2 ו -10 מ"מ Hepes pH 7.5. חיץ סוכרוז צריך להיות מוכן ביום שלפני השימוש במים סטריליים וצריך להיות כל הזמן על 4 מעלות צלזיוס.
  5. הכן את פתרון dejellying טרי בבוקרו של הניסוי על ידי המסת 2% L-cystein בMMR 0.25x. התאם ל- pH 7.8 עם 5 N KOH. שמור על 4 מעלות צלזיוס עד שהוא משמש.

תמצית ביצת laevis 5. Protocolfor Interphasic של Xenopu

  1. להזריק 120 גונדוטרופין IE של הסוסה בהריון בסרום (PMSG) לתוך שק הלימפה הגבי של כל צפרדע 3-10 ימים לפני הניסוי (5 מיליליטר מזרקים, 27 G ¾ '' מחטים).
    הערה: הזרקה זה תגרום לביוץ. כמות ביצי צפרדע אחת מטילה משתנה הרבה. צפרדע גם הנחת עשויה לייצר ביצים הכובשים היקף של עד 7 מיליליטר לאחר שדה-jellynated אשר תואם עד 3.5 מיליליטר של תמצית גולמי. עם זאת, רואים כי חלק הצפרדעים אולי לא שכבו או תהיה להביצים רעות y.
  2. להזריק 500 גונדוטרופין כוריוני אנושי IE (hCG) לצפרדע בערב שלפני הניסוי (5 מיליליטר המזרקים, 27G ¾ '' מחטים). זה יגרום לשחרורו של הביצים. שמור את הצפרדעים ל13-17 שעות על 18 מעלות צלזיוס בטנקים בודדים המכילים 1.2 ליטר 1x MMR (pH 8).
  3. לאסוף את הביצים על ידי שפיכתם ל600-1,000 כוסות זכוכית מיליליטר.
    הערה: קח את קבוצות טובות רק ביצים שמוטלות באופן אינדיבידואלי, דומות בגודל ובצורה ברורה פיגמנט עם כהה וחצי בהיר. אל תיקח את הביצים שיוצרות מחרוזות או שנפוח מראה ולבן. אלה צריכים להיות מסודר לאורך כל ההליך באמצעות פיפטה פסטר מפלסטיק. לתיאור מפורט של ביצים טובות מול רעות לראות et al גילספי. 6
  4. לשטוף ביצים אינטנסיבית, כ 4 פעמים, עם 1x MMR באמצעות אחסון supernatant כאשר הביצים נרגעות ומילוי הכוס עם חיץ טרי לאחר מכן.
    הערה:ביצים הן יציבים לפני שהם dejellynated וחיץ הכביסה יכול להיות מיושם ישירות על הביצים.
  5. Dejellynate ביצי דגירה בפתרון cystein 2%. לשנות חיץ פעם אחת אחרי 2-4 דקות באמצעות אחסון החיץ וממלא את הכוס עם חיץ טרי בזהירות. Considerdejellying מלא כאשר היקף הביצים באופן דרסטי מפחית והביצים הופכות צפופות יותר.
    הערה: dejellying צריך כ 5-7 דקות ויש להפסיק כאשר נראים, אך האחרון אחרי 10 דקות.
  6. ביצים לשטוף כ 4 פעמים עם 1x MMR באמצעות אחסון ומילוי supernatant החיץ.
    הערה: הביצים הן יותר שבירות לאחר שdejellynated ו, ומכאן, שלבי הכביסה צריכים להיעשות בזהירות רבה יותר. MMR צריך להיות ולא שטף על הקיר של הכוס במקום ישירות על הביצים.
  7. הפעל ביצים ב100 מיליליטר 1x MMR ידי הוספת 8 μl של ionophore סידן (2 מ"ג / מיליליטר באתנול). להפסיק הפעלה כאשר תהיה התכווצות כובע בעלי החייםמגיע גלוי או אחרי 10 דקות.
    הערה: התכווצות כובע בעלי החיים יכולה להיות מזוהות על ידי הדחיסה של המחצית השחורה של הביצה.
  8. שטוף בזהירות 4 פעמים עם 1x MMR באמצעות אחסון ומילוי supernatant החיץ.
  9. דגירה ביצים במשך 20 דקות ב1x MMR ב RT.
  10. הכן את צינורות צנטריפוגה בזמן הדגירה: מקום 50 μl חיץ סוכרוז, 50 μl פי 100 תערובת מעכבי פרוטאז, 5 μl 1 M DTT, 12.5 cycloheximide μl (כדי למנוע תרגום, במיוחד של cyclin B) וcytochalasin B 2.5 μl (ל למנוע פילמור אקטין) ב 5 מיליליטר צינורות צנטריפוגה (13 x 51 מ"מ). לחלופין, ליותר מ -30 מיליליטר של ביצים, 14 מיליליטר צינורות (14 x 95 מ"מ) יכולים לשמש, בהיקפי עליית מקרה זה על ידי 2.4 פעמים.
  11. לשטוף את הביצים פעמיים עם חיץ קר סוכרוז (למזוג וחיץ מילוי בכוס הזכוכית) ולהעביר אותם לתוך צינורות צנטריפוגה בעזרת פיפטה פסטר מפלסטיק עם פתח רחב (לחתוך את הקצה הצר).
  12. לֶאֱרוֹזביצים על ידי ספינינג דקות 1 ב 130 x גרם. שים את הצינורות בצינורות צנטריפוגות חרוטי 15 מיליליטר למטרה זו (לשים 14 מיליליטר צינורות צינורות צנטריפוגות חרוטי 50 מיליליטר, בהתאמה). המטרה היא להסיר כמה שיותר חיץ ככל האפשר כדי למנוע דילול של התמצית. לאחר צנטריפוגה, להסיר עודפים של חיץ בעזרת פיפטה פסטר מפלסטיק וסופו של דבר למלא יותר ביצים על גבי.
  13. ספין ב6 x 5 מיליליטר הנדנדה הרוטור במשך 20 דקות ב 21,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס.
  14. הסר לחלץ במהירות נמוכה באמצעות מזרק 5 מיליליטר עם ½ 1 מחט 16 G '', בין חלמון הצהוב על גבי ופסולת ביצה שבורה כהה בתחתית. לצורך כך, לדחוף את מחט המזרק דרך הקיר של צינור צנטריפוגות רק מעל השכבה של פסולת ביצה שבורה בתחתית. החזק את הצינור נגד התנגדות כאשר דוחף עם המחט.
    הערה: צינור צנטריפוגה 5 מיליליטר מלא נותנת בין 1.8-2.5 מיליליטר של תמצית.
  15. לכל 1 מיליליטר של תמצית להוסיף 10 פי 100 תערובת מעכבי פרוטאז, μl 1 μlשל 1 M DTT, 2.5 cycloheximide μl (20 מ"ג / מיליליטר) וcytochalasin B 0.5 μl (10 מ"ג / מיליליטר). שמור את התמצית על קרח.
    הערה: ניתן להשתמש בתמצית באופן ישירה לניסוי או aliquoted, הצמד קפוא ומאוחסן בחנקן נוזלי במשך כמה חודשים. הקפאת התמצית תקטן פעילותה. בניסויים עדינים כמו immunodepletion מומלץ מאוד להשתמש תמצית טריות מייד.

6. הכנת חוצצים במבחנה הכינון מחדש של הכרומטין Decondensation

  1. הכן את פתרון מניות תמהיל אנרגיה המכיל 25 מ"מ ATP, 25 מ"מ GTP, 127.5 מ"ג / מיליליטר פוספט קריאטין ו -2.5 מ"ג / קריאטין קינאז מיליליטר במאגר המכיל 250 סוכרוז מ"מ, 1.2 מ"מ Hepes, 5.9 מ"מ KCl ו -0.3 מ"מ MgCl 2. Aliquot ולאחסן ב -80 ° C. להשתמש טרי לאחר הפשרה, לא refreeze.
  2. ממיסים 0.2 גר '/ מיליליטר גליקוגן במים ללא יונים. חנות ב -20 מעלות צלזיוס. ממיסים aminopurine 6-דימתיל (DMAP) לריכוז סופישל 0.25 מ 'בDMSO. Aliquot ולאחסן ב -20 ° C. להשתמש טרי לאחר הפשרה, לא refreeze.
  3. הכן 30% (w / v) סוכרוז ב PBS, מסנן ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס. הכן 4% פתרון VikiFix המכיל 80 מ"מ צינורות pH 6.8, 1 מ"מ MgCl 2, 150 סוכרוז ו -4% paraformaldehyde מ"מ (PFA) (זהירות! לעבוד מתחת למכסת מנוע כימי, ללבוש כפפות ופה הגנה).
    הערה: PFA קשה לפזר לכן מומלץ לעשות את זה כבא: עבור 1 ליטר ויקי-תקן לפזר 24.2 צינורות גרם ו -40 גרם PFA בכוסות נפרדות, שניהם במים חמים (כמעט רותחים) deionized. שני יתמוססו באמצעות תוספת של 10 N NaOH אבל להיות זהיר כדי לא להוסיף יותר מדי. להוסיף 51.4 סוכרוז ז ו 1 מיליליטר 1 M MgCl 2 לפתרון PFA. מוסיף את פתרון צינורות לתערובת אחרת. למלא עד נפח סופי 1 ליטר ולהתאים את ה- pH ניטראלי על ידי הוספת NaOH.
  4. ממיסים 10 מ"ג / מיליליטר 4, 6-diamidino-2-phenylindole '(DAPI) במים (זהירות! ללבוש כפפות). אחסן בהחושך ב -20 ° C.

7. פרוטוקול במבחנה הכינון מחדש של הכרומטין Decondensation

  1. ספין תמצית interphasic מהירות נמוכה לדקות 12 ב386.000 XG בזווית קבועה של 20 x 0.2 מיליליטר או ב355 000 XG בגודל 10 x 2.0 מיליליטר הרוטור.
  2. להסיר בעדינות את שכבת שומנים על גבי באמצעות משאבת ואקום או פיפטה ולקחת את supernatant (נקרא לאחר מכן לחלץ במהירות גבוהה) הימנעות זיהום קרום מהשכבה התחתונה וזורקים את הכדור.
    הערה: כדי להפחית את זיהום קרום אפשרי רצוי לסובב את התמצית פעמיים או לדלל את התמצית עם 20% מההיקף עם חיץ סוכרוז לפני צנטריפוגה. עם זאת, דילול וצעדים נוספים צנטריפוגה יכולים להפחית את פעילות התמצית.
  3. Pipet 18 μl של תמצית במהירות גבוהה לתוך צינור 1.5 מיליליטר תגובה, להוסיף 0.7 μl אשכול mitotic (סכום יכול להיות מגוון מעט בהתאם לריכוז מניית הכרומטין), 0.5 μl גליקוגן, 0.5 μlתמהיל אנרגיה וDMAP 0.3 μl. השתמש בעצות עם פתח רחב לערבב את התגובה בהקדם הכרומטין מתווסף למנוע מריחה של הכרומטין decondensing.
    הערה: התגובה יכולה להתבצע בנוכחות או עדר של ממברנות (ראה איור 3). לdecondense הכרומטין בנוכחות של קרומים, להוסיף 2 μl של קרומים ריחפו הוכן בהתאם לפרוטוקול שתואר על ידי Eisenhardt et al. 16
  4. דגירה תערובת התגובה עד שעה 2 (פחות או ללמוד נקודות זמן מוקדמות יותר של תהליך decondensation) ב 20 ° C.
  5. תקן את המדגם על ידי הוספת קרח קר 0.5 מיליליטר ויקי-תקן המכיל glutaraldehyde 0.5% ושל 0.1 מ"ג / מיליליטר DAPI ודגירה של 20-30 דקות על קרח.
    הערה: אם דגימות עיבוד נוספת לimmunofluorescence, הקיבעון צריך להיעשות ללא glutaraldehyde כמו זה לעתים קרובות מפריע למכתים הנוגדן. עם זאת, אם רק מכתים DAPI ינותח, התוספת של שפעaraldehyde ישמור מבנה הכרומטין יותר נחמד.
  6. דגירה coverslips העגול (קוטר 12 מ"מ) במשך 5 דקות עם פתרון ליזין פולי-L-להגדיל את הזיקה של coverslips להכרומטין. יבש coverslips על נייר סינון לאחר מכן.
  7. להרכיב צינורות שטוחים תחתון צנטריפוגה (6 מיליליטר, 16/55 מ"מ) על ידי הצבת coverslips עם האתר המצופה לעליונה על החלק התחתון של צינור צנטריפוגה. להוסיף 800 μl של 30% כרית סוכרוז ושכבת המדגם הקבוע על גבי.
  8. ספין במשך 15 דקות ב 2500 XG ב 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: צינורות צנטריפוגה שטוחים תחתון יתאימו לרוטורים שיאמצו 15 מיליליטר צינורות צנטריפוגה חרוטי.
  9. למזוג supernatant, ולאחר מכן להסיר את coverslips מהצינורות על ידי חדירה בזהירות את החלק התחתון של צינור צנטריפוגה עם ½ 16 G 1 '' מחט מזרק. לקלטת מטרה זו את המכסה של המחט והמחט עצמה יחד בתחתיתם ולחתוך את הקצה הקדמי של המכסה כך שהמחט מקלות על 3מ"מ החוצה. כאשר coverslip יוסר על ידי המחט באתר אחד, להשתמש בפינצטה כדי להסיר את coverslip.
  10. לשטוף את coverslip במהירות על ידי טבילתו במים ללא יונים, לייבש אותו בעדינות על ידי הנגיעה בצד שלה לנייר סינון ולמקם אותו בשקופית מיקרוסקופ על ירידה של תקשורת הרכבה. לאטום אותו עם לק, יבש ולשמור בחושך.
    הערה: דוגמאות קבועות ללא glutaraldehyde ניתן לאחסן בPBS בצלחת 24 גם ומשמשות עוד למכתים immunofluorescence. אם מאוחסן במשך כמה ימים, להוסיף 0.05% אזיד הנתרן (זהירות! ללבוש כפפות) לPBS, כדי למנוע זיהום בחיידקים.
  11. ניתוח הדגימות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי של אות DAPI (באמצעות למשל, מיקרוסקופ confocal עם לייזר 405 ננומטר).

8. הכנת המאגר לImmunofluorescence מכתים של דוגמאות הכרומטין Decondensation במבחנה מחדש

  1. הכן PBS על פי 1.1.1. ממיסים NH 4 Cl לסנפירריכוז אל של 50 מ"מ בPBS. שמור פתרון זה ב 4 מעלות צלזיוס. לפזר 5 מיקרוגרם DAPI מיליליטר / בPBS (להכין טרי). להוסיף 0.1% Triton X-100 לPBS. שמור על 4 מעלות צלזיוס. הכן חיץ חסימה טרי לפני השימוש על ידי דילול 3% אלבומין בסרום שור (BSA) בPBS 0.1% Triton X-100 +.

9. פרוטוקול Immunofluorescence מכתים של דוגמאות הכרומטין Decondensation במבחנה מחדש

הערה:. Incubations כל של coverslips הבא נעשים בצלחת 24 גם עם פתרון μl לפחות 250 לכל גם, אם לא צוין אחרת במבחנה decondensed דגימות הכרומטין הן רגישות יותר מתאים קבועים ולכן להיות זהיר בעת הוספה או הסר של פתרונות. מומלץ להשתמש בטפטפות פסטר מפלסטיק לחתוך זוויתי. לשלבי כביסה ודגירת נוגדנים משני למקם את הצלחת ב RT על נדנדה או מסתובבים פלטפורמה, נע מהר יותר מלא 100 סל"ד.

  1. להרוות דגימות ידי דוגרים coverslipים עם Cl 1 מיליליטר NH 4 בPBS במשך 5 דקות. דגימות בלוק על ידי דוגריהם עם 1ml חיץ חסימה לפחות 30 דקות.
  2. להרכיב תא לחות לדגירה עם הנוגדן הראשוני: שים רקמות רטובות בתחתית תיבת closable ואת המכסה של צלחת 24 גם במהופך על גבי הרקמה הרטובה. הנח parafilm לתוך המכסה ומוסיף 70 μl של פתרון הנוגדנים לדגימה על parafilm. לפתרון הנוגדנים, נוגדנים לדלל מטוהרים antiserum או זיקה 1: 100 בחסימת מאגר.
  3. מניחים את coverslips במהופך על גבי פתרון נוגדן דגירה אותם ל1 עד 2 שעות. מניחים את coverslips חזרה לצלחת 24 גם עם צד המדגם פונה כלפי מעלה ולשטוף דגימות שלוש פעמים במשך 10 דקות עם 1 מיליליטר 0.1% Triton X-100 ב PBS.
  4. דגירה coverslips עבור שעה 1 ב RT ב250 נוגדן מתויג ניאון המשני μl דילול בחסימת מאגר לריכוז המומלץ על ידי היצרן. להגן מפני אור. לשטוף thrפעמים EE במשך 10 דקות עם 1 מיליליטר 0.1% Triton X-100 ב PBS.
  5. דגירה הדגימות במשך 10 דקות עם 1ml של 5 מיקרוגרם / מיליליטר DAPI ב PBS. לשטוף שלוש פעמים ל5 דקות עם 1 מיליליטר 0.1% Triton X-100 ב PBS.
  6. לשטוף את coverslip במהירות על ידי טבילתו במים ללא יונים, לייבש אותו בעדינות על ידי הנגיעה בצד שלה לנייר סינון ולמקם אותו בשקופית מיקרוסקופ על גבי ירידה של תקשורת הרכבה. לאטום אותו עם לק, יבש ולשמור על 4 מעלות צלזיוס בחושך עד שימוש. ניתוח הדגימות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תלות בזמן של תגובת decondensation

איור 1 מציג כמובן זמן אופייני של assay decondensation. האשכול של כרומוזומים גלויים בתחילת התגובה decondenses ומתמזג אחת, סיבוב גרעין חלק ו. כאשר תמצית הביצה הוא הוחלף על ידי סוכרוז חיץ אשכול כרומוזום נשאר מרוכז, אשר מצביעים על כך שפעילות decondensation נוכחת בתמצית הביצה.

decondensation הכרומטין הוא תהליך תלוי באנרגיה

תגובת decondensation במבחנה ניתן להשפיע בנוחות לדוגמא, על ידי תוספת של מעכבים. בניסוי שמוצג באיור 2, ATP אינו hydrolyzable או תחליפי GTP, ATPγS או GTPγS, נוספו לתגובה. שני לעכב את מראה decondensation, שזה ATP וGTP תלוי, תהליך פעיל (איור 2).

ניתן להפריד s => decondensation הכרומטין "jove_content" והרפורמציה מעטפת גרעין

Assay decondensation בוצע בנוכחות או עדר של ממברנות (איור 3). שים לב כי בשני תנאי הכרומטין עובר decondensation, אולם תוספת של תוצאות ממברנות בגרעינים גדולים יותר. ככל הנראה, הרפורמציה של מעטפת הגרעין גורמת צעד decondensation משנית על ידי עוד מנגנון תלוי בתחבורה גרעינית.

איור 1
איור 1. כמובן זמן של ה e במבחנה decondensation תגובה. Mitotic הכרומטין אשכולות מתאי הלה הודגרו עם תמצית ביצת צפרדעי interphasic. דגימות קבועות בנקודות זמן מצוינת עם PFA 4% ושל 0.5% glutaraldehyde, מוכתם עם DAPI ונותחו על ידי שיתוף מיקרוסקופיה nfocal. מet al Magalska. 8-מודפס מחדש. בר סולם הוא 5 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. decondensation הכרומטין דורש הידרוליזה ATP וGTP. Decondensation הכרומטין בוצע בנוכחות של 10 מ"מ ATPγS, 10 GTPγS מ"מ או חיץ שליטה. דגימות קבועות עם PFA 4% ו -0.5% glutaraldehyde בנקודות זמן מצוינת ונותחו על ידי מיקרוסקופיה confocal. מet al Magalska. 8-מודפס מחדש. בר סולם הוא 5 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3 "src =" "/> / קבצים / ftp_upload / 53,407 / 53407fig3.jpg
איור 3. decondensation הכרומטין בנוכחות והיעדרות של ממברנות. Decondensation הכרומטין בוצע בהעדר (א) או הנוכחות (B) של קרומי ציפה מטוהרת במשך 120 דקות. דגימות קבועות עם 4% glutaraldehyde PFA ושל 0.5% ונותחו על ידי מיקרוסקופיה confocal. הכרומטין מוכתם עם DAPI, קרומים עם האחרונים נערכו 18 (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3 ', פרכלורט 3'-tetramethylindocarbocyanine). בר סולם הוא 5 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Xenopus laevis תמציות ביצה הן כלי שימושי מאוד לשחזר בנאמנות תהליכים תאיים במבחנה, ומערכת זו שימשה בהצלחה באפיון של אירועי מחזור התא וחלוקת תא 2, 3,5,6,17. בשל חנויות גדולות של רכיבים גרעיניים מוחרם בביצה במהלך oogenesis, תמציות ביצה הן מקור מצוין של מרכיבים תאיים. בהשוואה לגישות אחרות כמו RNAi בשורות תאי רקמות יונקים או מניפולציה גנטית, היא מציעה כמה יתרונות: מערכת התא ללא מאפשרת לימוד תהליכים תאיים שבכדאיות סלולרית תהיה אחרת הגבלה. יתר על כן צעדים בודדים של תהליכים מורכבים ניתן לנתח במבחנים פשוטים. Assay decondensation כאן מוצג מאפשר לימוד מנגנונים מולקולריים של decondensation postmitotic ללא הפרעות מאירועי mitotic אחרים, בהתאמה. תמציות ביצת צפרדעים קלות לתמרן על ידי דלדול של חלבונים ספציפייםותוספת של מעכבים או חלבוני מוטציה 8. לדוגמא, איור 2 מראה את התוצאה של הוספת תחליפי ATP או GTP אינו hydrolyzable, ATPγS וGTPγS לassay decondensation. על ידי דילול וצנטריפוגה ההפרש של רכיבי ביצי צפרדעים כמו קרומים וcytosol ניתן להפריד 16. איור 3 מציג את assay decondensation בוצע בנוכחותו או היעדריו של קרום. לבסוף, assay התא ללא יכול לשמש גם כדי לזהות גורמי רומן למשל, על ידי גישת חלוקה. שימוש באסטרטגיה כזו שזיהינו AAA + -ATPases RuvBL1 / RuvBL2 כdecondensation מכריע גורמי 8.

במערכות מבחנה המבוסס על X. laevis ביצים כבר מועסקות בתבניות DNA שונות: הראה פורבס et al שהזרקה של ה- DNA λ הפאג לX. מופרה. ביצי laevis מושרה ההרכבה של הכרומטין על NAKDNA הפאג λ ed. כהזרקה של ה- DNA הנגיפי הפעילה את הביצה, ההרכבה של הכרומטין בעקבות היווצרות של מבנה כמו גרעין-18 ובאופן דומה DNA λ-הפאג ניתן להשתמש בשילוב עם תמציות ביצה כדי ליצור גרעין כמו מבנים במבחנה 19. חרוזים מגנטיים מצופים עם DNA ששימשו ללמוד chromatinization של DNA 20 וגיוס של קרומים גרעיניים 21 כמו גם הרכבה של מעטפת גרעין ונקבובי קומפלקסים 22, למרות שזה נשאר פתוח למידה שבה זה דומה לתהליך גרעיני בתום לב הרכבה מחדש . הפרוטוקול שהוצג כאן מאפשר decondensation של אשכולות הכרומטין mitotic מבודדים מתאי הלה באמצעות תמצית המופקת מביצי צפרדעים מופעלות. זה ביסודיות משחזר אירועים שהובילו לרפורמה של גרעין interphasic 8. בהשוואה לתגובת ההרכבה גרעינית מיושמת באופן נרחב בשימוש ללמוד ההיווצרות של מעטפת הגרעין והמתחמים הגרעיניים הנקבוביות בסוף מיטוזה, באשכולות הכרומטין mitotic הלה assay decondensation במקום DNA הזרע משמשים. ה- DNA הזרע ניתן להרכיב להכרומטין mitotic או אפילו כרומוזומים בודדים על דגירה עם תמצית שהוכנה מהביצים מופרות והופעל ללא 3. החלטנו להשתמש באשכולות mitotic כמקור הכרומטין כדי לפשט את ההליך ולמנוע הפרעה מעיבוי הכרומטין. בנוסף, הכנת תמצית הביצה היא שונה במקצת: לתמצית המהירות הנמוכה decondensation הכרומטין פינתה על ידי שני צעדי צנטריפוגה במהירות גבוהה ברוטורים זווית קבועים משמשות. תמצית מהירות נמוכה ניתן לאחסן עד 6 חודשים בחנקן נוזלי מבלי לאבד את פעילותה. לעומת זאת, בתגובות ההרכבה הגרעיניות, cytosol וקרומים ריחפו נוצרות מתמציות מהירות נמוכות על ידי דילול וצנטריפוגה ההפרש במהירות גבוהה לפני אפשרי הקפאה (ראה Eisenhardt et al. 16 לDetaiפרוטוקול הוביל). במערכת assay שלנו, תוספת של קרומים מאפשרת ההיווצרות של מעטפת גרעין סגורה כוללים מתחמים נקבוביות גרעיניים. הגרעינים וכתוצאה מכך הם מוסמך ליבוא ויצוא 8 גרעיניים. כך, מערכת זו תומכת הן decondensation הכרומטין והרפורמציה מעטפת גרעין. מעניין לציין, decondensation הכרומטין הוא גם אפשרי בהעדר הקרומים (איור 3). עם זאת תוספת של תוצאות ממברנות בגרעינים מעט יותר גדולים. סביר להניח, הרפורמציה של מעטפת הגרעין גורמת צעד שני decondensation על ידי מנגנונים עדיין לא מוגדרים, שתלוי ביבוא גרעיני.

לבידוד של אשכולות הכרומטין mitotic מתאי הלה, גרסה שונה של הפרוטוקול שהוקם על ידי גאסר ו -15 Laemmli הייתה בשימוש. תאי mitotic מסונכרנים הם lysed במאגר המכיל חומר הניקוי digitonin שאינו יוני ועל ידי כוחות מכונאי. הכרומטין מבודד כמו אשכולות המכילים כל הכרומוזומים מגרעין אחד. ההבדל המכריע בהשוואה לפרוטוקולים בידוד כרומוזום אחד הוא העובדה שהתאים אינם hypotonically נפוחים אבל התקררו עד 4 מעלות צלזיוס לפני תמוגה. זה מונע את הניתוק של כרומוזומים הבודדים 15, 23. בהשוואה לפרוטוקול שפורסם על ידי JR פולסון 23 שהכיר ביתרון של הבידוד של אשכולות הכרומטין כל, גאסר וLaemmli משמש מאגרי מאגרי polyamine במקום Mg מבוסס המכיל EDTA 2 + לצמצם את הפעילות של קינאז, nucleases, פרוטאזות וphosphatases ו על ידי זה להקטין את כמות שינויי חלבון ו- DNA מתרחשים במהלך תהליך הבידוד 15. בנוסף, באמצעות שיפוע חלקיקי סיליקה colloidal במהלך צנטריפוגה ההפרש מאוד מפחית זיהום cytoplasmic. גם הפרוטוקול יכול לשמש כדי לבודד אשכולות הכרומטין mitotic משחלת אוגר סיני ותאי עכבר 15.

class = "jove_content"> בסך הכל, הפרוטוקול שלנו בנאמנות reconstitutes decondensation הכרומטין כפי שזה קורה בסוף מיטוזה. התלות של ATP decondensation הכרומטין במבחנה יכולה להיות לפחות בחלקו מוסבר על ידי המעורבות של RuvBL1 / 2, אלא גם אחר AAA + -ATPase, p97, אשר מסיר את קינאז mitotic אורורה B מהכרומטין במהלך יציאת mitotic 24. למה התהליך דורש הידרוליזה GTP הוא אחת השאלות פתוחות שאנחנו מתכוונים לענות באמצעות התקנה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי קרן המחקר הגרמנית וERC (AN377 / 3-2 ו309,528 CHROMDECON לWA) ומלגת דוקטורט של Boehringer Ingelheim חטיבות לAKS איור 1 & 2 הם נדפסו מתא התפתחותית 31 (3), Magalska et al., פונקצית ATPases כמו-RuvB בdecondensation הכרומטין בסוף מיטוזה, 305-318, 2014, באישור סוג מElsevier.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
spermine tetrahydrochloride Fluka analytical 85610-25G
spermidine trihydrochloride Sigma  S2501-5G
high-purity digitonin Millipore 300410-1GM toxic
PMSF Applichem A0999,0100 toxic
thymidine Calbiochem 6060
nocodazole Calbiochem 487928 toxic
37% formaldehyde solution Roth 7398-1 toxic
trypan blue solution (0.4%) Sigma T8154 toxic
1,4-dithiothreitol (DTT) Roth 6908.2
AEBSF hydrochloride Applichem A1421,0001
pepstatin Roth 2936.1/2/3
leupeptin Roth CN334
aprotinin Roth A162.3
Percoll (colloidal silica particles solution) GE Healthcare 17-0891-01
glutamine Gibco 25030-024
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
75 cm² tissue culture flasks Greiner Bio-one 658175
heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) Gibco 10500-064
Homogenizer (40 ml tissue grinder) Wheaton 357546
Neubauer chamber Assistent 441/1
 Oak Ridge Centrifuge Tubes, polycarbonate (50 ml) Nalgene 3118-0050
100 µm cell strainer, nylon BD Falcon 352360
cytochalasin B Applichem A7657,0010 toxic
cycloheximide Roth 8682.3 toxic
L-cystein Merck 1,028,381,000
hCG available as Ovogest MSD 1431593
PMSG available as Intergonan MSD 1431015
A23187 (mixed calcium-magnesium-salt) Enzo ALX-450-002-M010 toxic
syringe needles (1.20 x 40 mm, 18 G x 1 1/2") Braun 4665120
ATP Serva 10920.03
GTP, 2 Na x 3 H20 Roth K056.1/2/3/4
creatine phosphat disodium salt Calbiochem 2380
creatine phosphokinase Sigma C3755-35KU
DMAP Sigma D2629-1G
DAPI  Roche 10236276001
PFA Sigma P-6148 toxic
centrifugation tubes for TLA 100 (7 x 10 mm, 5/16 x 13/16 in.) Beckman Coulter 343775
"Cell-Saver" (tips with wide opening, 1,000 µl) Biozym 729065
50% glutaraldehyde solution, grade I Sigma alderich G7651-10 ml toxic
0.1% (w/v) poly-L-lysine solution Sigma P8920-100 ml
flat-bottom tubes (6 ml, 16.0/55 mm) Greiner Bio-one 145211
Vectashield mounting medium Vector laboratories H1000
tubes for TLA120 (11 x 34 mm, 7/16 x 1 3/8 in.) Beckman Coulter 343778
"Cell-Saver" (tips with wide opening, 200 µl) Biozym 729055
12 mm coverslips Thermo Scientific 0784 #1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lohka, M. J., Masui, Y. Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components. Science. 220, 719-721 (1983).
  2. de la Barre, A. E., Robert-Nicoud, M., Dimitrov, S. Assembly of mitotic chromosomes in Xenopus egg extract. Methods Mol Biol. 119, 219-229 (1999).
  3. Maresca, T. J., Heald, R. Methods for studying spindle assembly and chromosome condensation in Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 459-474 (2006).
  4. Galy, V., et al. A role for gp210 in mitotic nuclear-envelope breakdown. J Cell Sci. 121, 317-328 (2008).
  5. Chan, R. C., Forbes, D. I. In vitro study of nuclear assembly and nuclear import using Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 289-300 (2006).
  6. Gillespie, P. J., Gambus, A., Blow, J. J. Preparation and use of Xenopus egg extracts to study DNA replication and chromatin associated proteins. Methods. 57, 203-213 (2012).
  7. Gant, T. M., Wilson, K. L. Nuclear assembly. Annu Rev Cell Dev Biol. 13, 669-695 (1997).
  8. Magalska, A., et al. RuvB-like ATPases function in chromatin decondensation at the end of mitosis. Developmental Cell. 31, 305-318 (2014).
  9. Belmont, A. S. Mitotic chromosome structure and condensation. Curr Opin Cell Biol. 18, 632-638 (2006).
  10. Lavoie, B. D., Tuffo, K. M., Oh, S., Koshland, D., Holm, C. Mitotic chromosome condensation requires Brn1p, the yeast homologue of Barren. Mol Biol Cell. 11, 1293-1304 (2000).
  11. Philpott, A., Leno, G. H. Nucleoplasmin remodels sperm chromatin in Xenopus egg extracts. Cell. 69, 759-767 (1992).
  12. Philpott, A., Leno, G. H., Laskey, R. A. Sperm decondensation in Xenopus egg cytoplasm is mediated by nucleoplasmin. Cell. 65, 569-578 (1991).
  13. Burglin, T. R., Mattaj, I. W., Newmeyer, D. D., Zeller, R., De Robertis, E. M. Cloning of nucleoplasmin from Xenopus laevis oocytes and analysis of its developmental expression. Genes Dev. 1, 97-107 (1987).
  14. Whitaker, M. Calcium at fertilization and in early development. Physiological reviews. 86, 25-88 (2006).
  15. Gasser, S. M., Laemmli, U. K. Improved methods for the isolation of individual and clustered mitotic chromosomes. Exp Cell Res. 173, 85-98 (1987).
  16. Eisenhardt, N., Schooley, A., Antonin, W. Xenopus in vitro assays to analyze the function of transmembrane nucleoporins and targeting of inner nuclear membrane proteins. Methods Cell Biol. 122, 193-218 (2014).
  17. Wignall, S. M., Deehan, R., Maresca, T. J., Heald, R. The condensin complex is required for proper spindle assembly and chromosome segregation in Xenopus egg extracts. J Cell Biol. 161, 1041-1051 (2003).
  18. Forbes, D. J., Kirschner, M. W., Newport, J. W. Spontaneous formation of nucleus-like structures around bacteriophage DNA microinjected into Xenopus eggs. Cell. 34, 13-23 (1983).
  19. Hartl, P., Olson, E., Dang, T., Forbes, D. J. Nuclear assembly with lambda DNA in fractionated Xenopus egg extracts: an unexpected role for glycogen in formation of a higher order chromatin intermediate. J Cell Biol. 124, 235-248 (1994).
  20. Sandaltzopoulos, R., Blank, T., Becker, P. B. Transcriptional repression by nucleosomes but not H1 in reconstituted preblastoderm Drosophila chromatin. EMBO J. 13, 373-379 (1994).
  21. Ulbert, S., Platani, M., Boue, S., Mattaj, I. W. Direct membrane protein-DNA interactions required early in nuclear envelope assembly. J Cell Biol. 173, 469-476 (2006).
  22. Zhang, C., Clarke, P. R. Chromatin-independent nuclear envelope assembly induced by Ran GTPase in Xenopus egg extracts. Science. 288, 1429-1432 (2000).
  23. Paulson, J. R. Isolation of chromosome clusters from metaphase-arrested HeLa cells. Chromosoma. 85, 571-581 (1982).
  24. Ramadan, K., et al. Cdc48/p97 promotes reformation of the nucleus by extracting the kinase Aurora B from chromatin. Nature. 450, 1258-1262 (2007).

Tags

ביולוגיה מולקולרית גיליון 106 assay ללא סלולארי יציאת mitotic בידוד הכרומטין, decondensation הכרומטין הרפורמציה גרעינית עיבוי הכרומטין
תא Assay חינם לחקר הכרומטין Decondensation בסוף מיטוזה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schellhaus, A. K., Magalska, A.,… More

Schellhaus, A. K., Magalska, A., Schooley, A., Antonin, W. A Cell Free Assay to Study Chromatin Decondensation at the End of Mitosis. J. Vis. Exp. (106), e53407, doi:10.3791/53407 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter