Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Сотовый бесплатно Анализ по изучению хроматина деконденсацию в конце митоза

Published: December 19, 2015 doi: 10.3791/53407
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1
1Friedrich Miescher Laboratory, Max Planck Society, 2Nencki Institute of Experimental Biology, Polish Academy of Sciences
* These authors contributed equally

Introduction

Xenopus Laevis яйцо экстракт является мощным и широко прикладной инструмент для изучения сложных клеточных событий в простоте бесклеточной анализа. Так их первого описания по Lohka & Мазуи 1 они были широко используется для изучения митоза процессы, такие как конденсации хроматина 2, сборки веретена 3, пробоя ядерной оболочки 4, но и цитоплазматический транспорт 5 или 6 репликации ДНК. События, происходящие в конце митоза, необходимые для реформирования межфазной ядра, такие как реформирования ядерной оболочки и ядерных пор сложной сборки значительно менее понятны по сравнению с началом митоза событий, но аналогично могут быть изучены с помощью Xenopus яичный экстракт 7. Недавно мы установили анализа, основанного на Xenopus яичного экстракта для изучения хроматина деконденсацию в конце митоза 8, процесс под исследовали, что ожидает ят.с. подробную характеристику.

В многоклеточных, хроматин конденсируется при высокой митотической вступления в целях выполнения точно, в сегрегации генетического материала. Чтобы гарантировать, что хроматин доступна экспрессии генов и репликации ДНК во время интерфазы, он должен быть де-уплотненный на конце митоза. У позвоночных, хроматин до пятидесяти раз больше уплотняется во время митоза по сравнению с интерфазе 9, в отличие от дрожжей, где митотический уплотнения, как правило, значительно ниже, например, только в два раза в S. Cerevisiae 10. Позвоночных хроматина деконденсация была в основном изучена в контексте реорганизации ДНК спермы после оплодотворения яйцеклетки. Молекулярный механизм, в котором нуклеоплазмина, обильное белок яйцеклетки, сперма обмен конкретных протамины в гистонов H2B H2A и хранящиеся в яйце. Этот процесс был также выяснены при помощи Xenopus экстракт яичного 11, 12. Однако выражениеиз нуклеоплазмина ограничен ооцитов 13 и митотического хроматина не содержит этих спермы конкретных протамины. Поэтому хроматина деконденсацию в конце митоза нуклеоплазмина независимая 8.

Для реакции в пробирке деконденсацию мы используем экстракт сгенерированный из активированных X. Laevis яиц и хроматина кластеров, выделенных из клеток HeLa синхронизированных. Лечение яиц с ионофора кальция имитирует высвобождение кальция в яйцеклетки, порожденной вступления сперматозоидов в процессе оплодотворения. Волна кальция вызывает возобновление клеточного цикла и яйцо, арестованного во второй метафазе мейоза, прогрессирует до первого интерфазы 14. Таким образом, яйцо экстракты, приготовленные формы активируется яйца представляют митотическую состояние выхода / интерфазной и компетентны, чтобы вызвать события, специфические для выхода из митоза как хроматина деконденсации, ядерной оболочки и корпеть комплексного реформирования. Для выделения митотического чromatin кластеров мы использовали слегка модифицированную версию протокола, опубликованного Гассер и Laemmli 15, где кластеры хромосом выпущен лизис клеток HeLa с синхронизированными в митозе и изолированных в полиаминными содержащий буферов градиентные центрифугирования.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Митотическое хроматина кластера Изоляция от клеток HeLa

1. Подготовка

  1. Культура клеток Решения
    1. Подготовьте среду полном Игла в модификации Игла (DMEM), добавив 10% фетальной телячьей сыворотки, 100 единиц / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 2 мМ глутамина в DMEM. Приготовьте фосфатный буфер солевой раствор (PBS), содержащего 2,7 мМ KCl, 137 мм NaCl, 10 мМ Na 2 HPO 4 · 2H 2 O и 2 мМ KH 2 PO 4 в деионизированной воде, и доведения рН до 7,4 с помощью 10 N NaOH.
      Примечание: PBS, может быть, как 10-кратным маточного раствора с течением времени при комнатной температуре. Развести его деионизированной водой до 1x перед использованием. Фильтр 1x раствор еще раз, если он будет использоваться в клеточной культуре.
    2. Подготовьте 40 мм запас тимидина раствора (для культивирования клеток подходит) в DMEM среде. Растворите 0,97 г тимидина в 90 мл DMEM среде. Регулировка конечного объема 100 мл. Магазин раствор при -20 °С. Растворите (ВНИМАНИЕ! Работать под капотом химической, носить перчатки и защиту рту) нокодазол в 5 мг / мл маточного раствора в ДМСО.
  2. Митотические Кластеры изоляции Решения
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все решения, описанные в 1.2 должны быть сохранены на льду после приготовления / размораживания в течение всего эксперимента.
    1. Автоклав деионизированной воды на 105 мин при 121 ° С. Растворите спермин тетрагидрохлорид в автоклаве, деионизированной водой до конечной концентрации 200 мМ (69,6 мг / мл). Магазин раствор при -20 ° С. Растворите спермидинсинтазу тригидрохлорид в автоклаве, деионизированной водой до конечной концентрации 200 мМ (50,8 мг / мл). Магазин раствор при -20 ° С.
    2. Подготовка 5% (вес / объем) дигитониновым (ВНИМАНИЕ! Работать под капотом химической, носить перчатки и защиту рту) в горячей деионизированной водой. Фильтр и хранят аликвоты при -20 ° С. Растворите Фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ) (ВНИМАНИЕ! Работать недеформированнойг химической капот, надеть перчатки и защиту рту) до конечной концентрации 200 мМ (35 мг / мл) в 100% этанола. Магазин раствор при -20 ° С.
    3. Растворите дитиотреитола (DTT) с деионизированной водой до конечной концентрации 1 М (154 мг / мл) (осторожно! Работать под капотом химической, в перчатках). Фильтр и магазин раствор при -20 ° C.
    4. Приготовьте 100-кратное ингибитор протеазы смеси (ОСТОРОЖНО работать под капотом химической, в перчатках!) Путем растворения 10 мг / мл AEBSF (4- (2-Aminoethly -) - benzensulfonylfluoride), 0,2 мг / мл лейпептина, 0,1 мг / мл пепстатина и 0,2 мг / мл апротинина в деионизированной воде. Магазин раствор при -20 ° С.
    5. Подготовка 10x маточного раствора буфера А, содержащего 150 мМ Трис-Cl (рН 7,4), 800 мМ KCl, 20 мМ ЭДТА-КОН (рН 7,4), 2 мМ спермин тетрагидрохлорид и 5 мм спермидинсинтазу тригидрохлорид. Магазин буфер А при 4 ° С без спермина тетрагидрохлорид и спермидина тригидрохлорид, которые должны быть добавленынедавно как раз перед использованием.
      Примечание: ЭДТА растворяется только при рН выше 8, таким образом, чтобы подготовить высокой концентрации ЭДТА-КОН маточного раствора (0,5 М рекомендуется), добавляют 5 N КОН до рН выше 8 раз, чтобы растворить его. После титрования до рН 7,4.
    6. Подготовка 20x маточного раствора буфера В, содержащего 100 мМ Трис-HCl (рН 7,4), 400 мМ KCl, 400 мМ ЭДТА-KOH (рН 7,4) и 5 ​​мм спермидинсинтазу тригидрохлорид. Буфер Как можно хранить в тех же условиях, буфером А.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте рабочие растворы я IV (см в следующих шагов), глицерина градиент и коллоидных частиц кремнезема растворы, содержащие частицы диоксида кремния (от 15 до 30 диаметра нм), покрытых с не-диализатного поливинилпирролидона (ПВП) недавно как раз перед изоляции Процедура (ФМСФ и дигитонин должны быть добавлены непосредственно перед использованием, как это ФМСФ лабильным в водных растворах и дигитонин имеет тенденцию к осаждению на длительном хранении на льду).
    7. Приготовьте 100 мл раствора I добавлением буфера А 0.5x,1 мМ ДТТ, 1: 100 в смеси ингибитора протеазы и 0,1 мМ PMSF в автоклаве, деионизированной водой. Подготовка 50 мл раствора II (для лизиса клеток) путем добавления 1x буфера А, 1 мМ ДТТ, 1: 100 в смеси ингибитора протеазы, 0,1 мМ ФМСФ, 0,1% дигитонин и 10% глицерина в автоклаве, деионизированной водой.
    8. Приготовьте 200 мл раствора, содержащего III 0.25X буфером А, 1 мМ DTT, 1: 100 в смеси ингибитора протеазы, 0,1 мМ PMSF и 0,05% дигитонина в автоклаве, деионизированной водой. Подготовка 40 мл раствора IV, содержащие 1x буфер В, 1 мМ DTT, 1: 100 в смеси ингибитора протеазы, 0,1 мМ PMSF и 0,1% дигитонин в автоклаве, деионизированной водой.
    9. Приготовьте 120 мл глицерина градиент раствора добавлением 25% глицерина и 0,1% дигитонина к раствору I.
    10. Приготовьте 150 мл коллоидного раствора кремнезема, содержащие частицы 60% об / об (объем на объем) суспензии, содержащей частицы диоксида кремния (диаметр от 15 до 30 нм), покрытых без диализатного поливинилпирролидон (ПВП), 15% глицерина, 2 мМ овpermidine тригидрохлорид и 0,8 мМ спермин тетрагидрохлорид в растворе IV.
    11. Подготовка кластера буфер для хранения, содержащего 250 мМ сахарозы, 15 мМ HEPES (рН 7,4), 0,5 мМ спермидинсинтазу тригидрохлорид, 0,2 мМ спермин тетрагидрохлорид, 1: 100 в смеси ингибитора протеазы, 0,3% BSA и 30% глицерина. Буфер хранения данных кластера можно хранить при -20 ° С.
    12. Подготовьте для игры в сквош исправить раствор, содержащий 10% формальдегида (ВНИМАНИЕ! Работать под капотом химической, носить перчатки), 50% глицерина, двукратному модифицированным буфером Марка Рингера (КМС см 4.5.) И 0,2 мкг / мл DAPI (ВНИМАНИЕ! Надевать перчатки). Хранить при 4 ° С в защищенном от света реакционных труб. Это не важно для эксперимента, чтобы использовать эту сквош исправить рецепт, альтернативные рецепты также будет работать.

2. Синхронизация клеток

  1. На День 1: Семенной HeLa клетки в пяти 75 см 2 (250 мл) колб со средствами массовой информации и инкубировать при 37 ° С в 5% CО 2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это даст примерно 18 в 10 х 6 клеток в день изоляции хроматина кластера.
  2. На 2-й день: Когда клетки, по крайней мере 50% сливной (примерно половина поверхности покрыта клетками и есть еще возможности для клеток расти), добавить тимидина до конечной концентрации 2 мМ (тимидина блок) и культуры клеток для 24 ч при 37 ° С в 5% СО 2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это будет арестовать клетки в G1 / S границе фаз.
  3. На 3-й день: Аспирируйте среде, содержащей тимидин и добавить стерильную PBS. Вымойте клеток с нежной промывки стерильной PBS. Аспирируйте PBS и осторожно добавить 15-20 мл свежей, теплой полных DMEM среднего и культуры клеток в течение от 3 ​​до 4 ч при 37 ° С в 5% СО 2, чтобы освободить их от G1 / S-фазы блока.
  4. На день 3 (продолжение): После выпуска клеток из G1 / S-фазы блока, добавить нокодазолом до конечной концентрации 100 нг / мл. Развести нокодазолом добавлением 2 мкл исходного раствора (5 мг / мл) до 98мкл свежей DMEM в среде, и добавить 1 мкл разбавленного нокодазолом на каждые мл клеточной культуре. Культуры клеток в течение приблизительно 12 часов при 37 ° С в 5% СО 2. Это будет блокировать клетки в митоз.

3. Митотические Кластеры Изоляция

  1. На 4-й день: Изолировать митотических кластеров. Использование светлого поля микроскопию, проверьте, если большинство клеток митотической. Если менее 50% клеток являются митотический ждать, пока больше клеток не достигают митоза. Сбор митотических клеток, нажав энергично на стороне колбы (или осторожно распыления с пипеткой), это будет отделить остальные митотических клеток. Передача клеточной суспензии до 50 мл конических центрифужных пробирках.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Митотические клетки становятся круглыми и могут быть легко отделены от колбы снизу (так же, как клетки после обработки трипсином), в отличие от клеток других стадиях клеточного цикла, которые являются плоскими и прочно прикреплены к колбе.
  2. Заготавливают митотических клеток, крутя трубы на 1500 мкг в течение 10 мин (476; С или РТ) и удалением супернатанта после этого. Ресуспендируют осадок клеток в 8 мл PBS, бассейн в один 50 мл коническую центрифужную пробирку, пробирку заполнить полностью с PBS и спина снова в течение 10 мин при 1500 х г в. Повторите эту процедуру промывки три раза в общей сложности.
  3. Отныне выполнить все шаги на льду с холодными решений. Энергично ресуспендируют осадок в 37 мл холодного раствора II. Перевести суспензии в 40 мл охлажденной стеклянной стеклянном гомогенизаторе с помощью 25 мл пипетки и лизировать клетки на льду douncing с плотно пестиком до митоза кластеры не свободны от цитоплазмы материала. Количество ударов в значительной степени зависит от дигитониновым складе и может варьироваться от 3 до 20 раз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гомогенизация может быть довольно энергичная, но должна считаться полной, если почти все митоза клетки лизируют и кластеры видел, чтобы быть свободным от цитоплазмы материала (см 3.4).
  4. Через пару ходов смешать 5-10 мкл клеточной суспензии 1: 2 с трипановым синим и проверить, MICRoscopy в камере Neubauer. Когда клетки лизируют хроматина окрашивают синий и бесплатно клеточных мембран (ПРИМЕЧАНИЕ: возможные остатки цитоплазмы будет накапливаться вокруг синего витражного хроматина и будет легко отличить).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Митотические клетки лизировать, прежде чем интерфазовыми клеток, тем не менее быть, но не переусердствуйте гомогенизации, чтобы избежать загрязнения с интерфазовыми ядер и изуродованного хроматина.
  5. Сразу слой весь клеточный лизат над холодными шаг градиентов (5 мл 60% коллоидных частиц кремнезема раствора на дне, с наложенным 19,5 мл глицерина градиент решения каждой) в пяти из поликарбоната труб центрифугирования (28,8 х 107,0 мм, рекомендуется поместить пробирки на лед, прежде чем охладить) с использованием 10 мл пипетки. Не держите клеток в растворе II в течение длительного времени, поэтому рекомендуется подготовить трубки и градиента заранее (например, во время этапов промывки).
  6. Центрифуга градиентов для 30 мильп 1000 мкг в при 4 ° С в роторе с фиксированным углом.
    Примечание: Ядра, unlysed клетки и кластеры извлекают вместе на стыке глицерина и коллоидных частиц кремнезема слоев.
  7. Удалить жидкость над интерфазы с помощью пипетки и передачи остальное холодной гомогенизатора. Re-Гомогенизируют смесь по 3-15 ударов (опять же в зависимости от дигитониновым складе) с жесткой пестиком, чтобы устранить агрегаты и снять цитоскелета волокна из кластеров. После каждой пары штрихов проверить эффективность гомогенизации. Смешайте 1 мкл образца с 1 мкл сквош исправить с добавлением DAPI и изучить под флуоресцентным микроскопом.
    Примечание: число ударов важно, наличие кластера агрегатов средства, что число ударов недостаточна, а подогнаны хроматина и ядра мусора, показывают, что гомогенизация была слишком сильна.
  8. Распределите решение среди четырех новых поликарбонат центрифугирования труб (28,8 х107,0 мм) (ок. 10 мл раствора на трубке) и заполнить их полностью с 60% -ным раствором частиц коллоидного диоксида кремния (прибл. 30 мл коллоидных частиц кремнезема решение на пробирку).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте перегрузки коллоидных частиц кремнезема градиент так кластеры могут быть легко ловушке, если есть слишком много мусора в цитоплазматической градиента.
  9. Спин в течение 5 мин при 3000 х г, после чего 30 минут при 45,440 мкг при 4 ° С в роторе с фиксированным углом.
    Примечание: Как и прежде, межфазных ядра будут сохранены от входа градиент (если гомогенизации не было сделано слишком сильно, который выпускает ядра из цитоплазматической мусора), но кластеры будут накапливаться около 1,5 см от дна пробирки, часто, как свободный шар.
  10. Снимите выше кластеров с использованием пипетки жидкость, бассейн остальное в одну трубу, ресуспендируют также и распространять двух поликарбонатных труб центрифугирования (28,8 х 107,0 мм). Развести кластера подвески 1: 4 раствором III в каждую пробирку и хорошо перемешать. Марк-йе сайте были осадок будет вращаться и 1000 х г в течение 15 мин при 4 ° С в роторе с фиксированным углом.
  11. Ресуспендируют гранул в растворе III, бассейн в один 50 мл коническую центрифужную пробирку и залейте Solution III. Центрифуга только на 300 мкг в течение примерно 10 мин. Не центрифуге при высокой скорости - это может привести к необратимым агрегации кластеров.
  12. Вымойте снова Solution III в 1,5 или 2 мл реакционных труб (ресуспендируйте гранул и заполнить трубы полностью вверх) и центрифуги при 300 х г. Удалить супернатант осторожно пипеткой. Ресуспендируют осадок тщательно в 250 мкл буфера для хранения кластера (если у вас есть несколько гранулы использовать 250 мкл для всех вместе и объединить их). Развести 5-10 мкл образца 1: 2 с трипанового синего и рассчитывать в камере Neubauer. Если применимо разбавленный более, чтобы получить концентрацию примерно 500 кластеров / мкл.
  13. Нажмите суспензии через сито 100 мкм клеток, чтобы убедиться, чтобы удалить агрегации кластеровс в результате неправильного ресуспендированием. Кластеры могут быть сохранены в течение нескольких месяцев в -80 ° С. Чтобы избежать многократного повторное замерзание сделать соответствующие аликвоты и оснастки заморозить в жидком азоте.

4. Подготовка буфера для межфазных Xenopus Laevis яйцо экстракт

ПРИМЕЧАНИЕ: Xenopus Laevis лягушки поддерживается и обрабатывается в соответствии с руководящими принципами и правилами, установленными Конвенцией Совета Европы о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других целей (ЕС ратифицировали в 1998 году) и германский закон, относящихся к использование позвоночных животных в научных исследованиях.

  1. Подготовьте DTT и 100-кратное ингибитор протеазы смесь в соответствии с 1.2.3 и 1.2.4. Растворите цитохалазином до конечной концентрации 10 мг / мл в ДМСО, аликвоты (10 мкл или 20 рекомендуется) и хранят при -20 ° С.
  2. Растворите циклогексимид до конечной концентрации 20 мг / мл в этаноле, аликвоты (500 мклрекомендуемый) и хранят при -20 ° С. Растворить кальциевый ионофор А23187 в конечной концентрации 2 мг / мл в этаноле аликвоты и хранят при -20 ° С.
    ПРИМЕЧАНИЕ: PI, DTT, цитохалазин, циклогексимид и А23187 может быть повторно замораживать и оттаивать.
  3. Подготовка 20x модифицированным буфером Марка Рингера (MMR), содержащий 2 М NaCl, 40 мМ KCl, 20 мМ MgCl 2, 40 мМ CaCl 2, 2 мМ ЭДТА и 100 мМ Hepes, доведения рН до 8,0 с 5 N КОН.
    Примечание: 20x MMR может быть в течение длительного времени при комнатной температуре. В зависимости от количества яиц, в течение одного подготовки интерфазовыми экстракт яйцо 1 л 1x MMR в закачиваемой лягушки и дополнительных 5-10 литров для этапов промывки необходимо. Отрегулируйте рН 1x MMR до 8,0 с 5 N КОН. 1x MMR готовы держать лягушек в O / N х 1 должны быть при комнатной температуре. 1x MMR готовы для приготовления экстракта должна быть холодной, пока он не используется, однако это не критично для эксперимента, что 1x MMR очень холодно.
  4. Подготовка 1 л Sucвыросли буфера, содержащего 250 мМ сахарозы, 50 мМ KCl, 2,5 мМ MgCl 2 и 10 мМ Hepes, рН 7,5. Сахароза буфера должен быть подготовлен день перед использованием стерильной воде и должны храниться при температуре 4 ° С.
  5. Подготовка dejellying решение недавно утром эксперимента путем растворения 2% L-цистеин в 0.25x MMR. Отрегулируйте рН до 7,8 с 5 N КОН. Хранить при температуре 4 ° С до тех пор, пока используется.

5. Protocolfor интерфазовыми Xenopu сек Laevis Яйцо экстракт

  1. Вводите 120 IE беременной кобылы сыворотке гонадотропина (PMSG) в спинной лимфатический мешок каждого лягушки 3-10 дней до начала эксперимента (5 мл шприцы, 27 G ¾ '' иглы).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта инъекция будет вызывать овуляцию. Количество яиц одной лягушки лежит зависит многое. Хорошо укладки лягушка может производить яйца, занимающих объем до 7 мл после де-jellynated что соответствует до 3,5 мл сырого экстракта. Тем не менее, считают, что некоторые лягушки не может лежать или будет лау плохих яйца.
  2. Вводите 500 IE хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) за лягушки вечером перед экспериментом (5 мл шприцев, 27G ¾ '' иглы). Это будет стимулировать выпуск яиц. Держите лягушек для 13-17 ч при 18 ° С в отдельных резервуарах, содержащих 1,2 л 1x MMR (рН 8).
  3. Сбор яиц путем заливки их в 600-1000 мл стеклянные стаканы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Возьмите только хорошие партии яиц, которые индивидуально установленными, аналогичных по размеру и четко пигментированных темно и светло-цветной половине. Не принимайте яйца, которые образуют строки или что смотреть одутловатым и белый. Они должны быть отсортированы по всей процедуры с использованием пластиковой пипетки Пастера. Для более подробного описания хороших против плохого яиц видеть Гиллеспи и др. 6
  4. Вымойте яйца интенсивно, примерно в 4 раза, с 1x MMR декантацией супернатант, когда яйца успокоился и заправки стакан свежей буфера впоследствии.
    Обратите вниманиеЯйца являются стабильными, прежде чем они dejellynated и промывочный буфер могут быть непосредственно применены на яйца.
  5. Dejellynate яйца путем инкубации в 2% -ном растворе цистеина. Изменить буфер сразу же после 2-4 мин отстаивают буфер и тщательно заполняя стакан свежей буфера. Considerdejellying завершена, когда объем яиц резко падает, и яйца становятся более плотно упакованы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: dejellying нуждается примерно 5-7 мин и должна быть остановлена, когда видно, но не позднее чем через 10 мин.
  6. Вымойте яйца примерно в 4 раза с 1x MMR декантацией и заправки буфера супернатант.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Яйца являются более хрупкими после того, dejellynated и, следовательно, шаги стиральные необходимо сделать более тщательно. КМС следует промыть, а на стенке стакана, а не непосредственно на яйца.
  7. Активация яйца в 100 мл 1x MMR добавлением 8 мкл ионофора кальция (2 мг / мл в этаноле). Стоп активации, когда сокращение животное крышка будетприходит видимым или через 10 мин.
    Примечание: Сокращение животное колпачок может быть идентифицирована путем уплотнения черного половине яйца.
  8. Вымойте тщательно 4 раза 1x MMR декантацией и заправки буфера супернатант.
  9. Выдержите яйца в течение 20 мин в 1x MMR при комнатной температуре.
  10. Подготовка центрифужные пробирки в течение времени инкубации: Место 50 мкл сахарозы буферные, 50 мкл 100-кратного смесь ингибиторов протеаз, 5 мкл 1 М ДТТ, 12,5 мкл циклогексимид (чтобы предотвратить перевод, особенно циклин B) и 2,5 мкл цитохалазином (с предотвращения полимеризации актина) в 5 мл центрифужные пробирки (13 х 51 мм). Кроме того, для более чем 30 мл яйца, 14 мл пробирки (14 х 95 мм) могут быть использованы, в этом случае объемы увеличения в 2,4 раза.
  11. Вымойте яйца дважды холодной сахарозы буфера (сцеживать и пополнения буфера в стеклянный стакан) и передать их в центрифужные пробирки с помощью пластиковой пипетки Пастера с широким отверстием (отрезать узкий конец).
  12. Пакетяйца на спиннинг в течение 1 мин при 130 х г. Поместите трубы в 15 мл конических центрифужных пробирках для этой цели (поместить в 14 мл пробирки в 50 мл конических центрифужных пробирках, соответственно). Цель состоит в том, чтобы удалить как можно больше буфер, насколько это возможно, чтобы предотвратить разбавление экстракта. После центрифугирования, удалить избыток буфера с помощью пластиковой пипетки Пастера и в конечном итоге заполнить больше яиц на вершине.
  13. Спина в 6 х 5 мл качели ротора в течение 20 мин при 21000 мкг при 4 ° С.
  14. Удалить низкую скорость, используя экстракт 5 мл шприц с 16 G 1 ½ '' иглы, между желтым желтком сверху и темно-Разбитое яйцо мусора на дне. Для этого, нажмите на иглу шприца через стенку центрифужную пробирку чуть выше слоя сломанной яйцо мусора в нижней части. Держите трубку против сопротивления при нажатии с иглой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Заполненный 5 мл центрифугирования трубку дает между 1,8-2,5 мл экстракта.
  15. За 1 мл экстракта добавить 10 мкл 100-кратного ингибитор протеазы смеси, 1 мкл1 М DTT, 2,5 мкл циклогексимид (20 мг / мл) и 0,5 мкл цитохалазином (10 мг / мл). Держите экстракт на льду.
    Примечание: Экстракт может быть либо непосредственно использовать для эксперимента или аликвоты, быстро замораживают и хранят в жидком азоте в течение нескольких месяцев. Замораживание экстракт снизится свою деятельность. Для тонких экспериментов, как immunodepletion настоятельно рекомендуется немедленно использовать свежий экстракт.

6. Подготовка буферов для In Vitro восстановление хроматина деконденсацию

  1. Подготовьте энергетическом балансе исходного раствора, содержащего 25 мМ АТФ, 25 мМ GTP, 127,5 мг / мл креатина фосфата и 2,5 мг / мл креатинкиназы в буфере, содержащем 250 мМ сахарозы, 1,2 мМ Hepes, 5,9 мМ KCl и 0,3 мМ MgCl 2. Алиготе и хранить при температуре -80 ° C. Используйте недавно после оттаивания, не замораживать.
  2. Растворить 0,2 г / мл гликогена в деионизированной воде. Хранить при -20 ° C. Растворить 6-диметил аминопурином (DMAP) до конечной концентрации0,25 М в ДМСО. Алиготе и хранить при температуре -20 ° C. Используйте недавно после оттаивания, не замораживать.
  3. Готовят 30% (вес / объем) сахарозы в PBS, фильтруют и хранят при температуре 4 ° С. Подготовьте 4% раствор, содержащий 80 VikiFix мм Трубы рН 6,8, 1 мМ MgCl 2, 150 мМ сахарозы и 4% параформальдегида (PFA) (ВНИМАНИЕ! Работать под капотом химической, носить перчатки и защиту рту).
    ПРИМЕЧАНИЕ: PFA трудно растворим, поэтому рекомендуется делать это так: На 1 л Вики-Fix распустить 24,2 г труб и 40 г PFA в отдельных стаканах, как в горячей (почти кипяток) деионизированной воды. Оба будут растворяться путем добавления 10 N NaOH, но будьте осторожны, чтобы не добавлять слишком много. Добавить 51,4 ​​г сахарозы и 1 мл 1 М MgCl 2 в растворе PFA. Добавить трубы решение другой смеси. Заполните до 1 л конечного объема и доведения рН до нейтрального путем добавления NaOH.
  4. Растворите 10 мг / мл 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) в воде (Внимание! В перчатках). Хранить втемноте при -20 ° С.

7. Протокол In Vitro восстановление хроматина деконденсацию

  1. Спин низкой скорости интерфазовыми экстракт в течение 12 мин при 386000 х г в фиксированным углом 20 х 0,2 мл или 355 мкг 000 в роторе 10 х 2,0 мл.
  2. Осторожно удалить липидный слой поверх с помощью вакуумного насоса или пипетки и принимать супернатант (далее называемый высокой скорости экстракт) предотвращения загрязнения мембраны из нижнего слоя и отбросить гранул.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для уменьшения возможного загрязнения мембраны желательно, чтобы спина экстракт дважды или разбавить экстракта 20% от объема буфера с сахарозой до центрифугирования. Тем не менее, разбавление и дополнительные стадии центрифугирования может уменьшить активность экстракта.
  3. Внесите 18 мкл экстракта высокой скорости в 1,5 мл реакционную трубку, добавить 0,7 мкл митотического кластера (количество может быть слегка изменяться в зависимости от хроматина фондовом концентрации), 0,5 мкл гликогена, 0,5 мклсмесь энергии и 0,3 мкл ДМАП. Использование подсказки с широким отверстием для смешивания реакцию, как только хроматина добавляется для предотвращения сдвиг в decondensing хроматина.
    Примечание: Эту реакцию можно проводить в присутствии или в отсутствие мембраны (смотри рисунок 3). Чтобы decondense хроматина в присутствии мембран, добавить 2 мкл размещенных мембран, полученных в соответствии с протоколом, описанным Eisenhardt др. 16
  4. Инкубируют реакционную смесь в течение 2 ч, чтобы (или меньше, чтобы изучить ранние сроки процесса деконденсацию) при 20 ° С.
  5. Закрепить образец добавлением охлажденного льдом 0,5 мл Viki-Фикс, содержащий 0,5% глутарового альдегида и 0,1 мг / мл DAPI и инкубации в течение 20-30 мин на льду.
    Примечание: Если образцы будут дополнительно обработаны для иммунофлуоресценции, фиксация должно быть сделано без глутаральдегида как это часто мешает окрашивания антител. Однако, если только окрашивание DAPI будут проанализированы, добавление перенасыщенияaraldehyde будет сохранить приятнее структуру хроматина.
  6. Инкубируйте покровные круглые (диаметр 12 мм) в течение 5 мин с поли-L-лизин раствора для увеличения аффинности покровные с хроматином. Высушите покровные на фильтровальной бумаге после этого.
  7. Сборка с плоским дном трубки центрифугированием (6 мл, 16/55 мм), поставив покровные с сайтом покрытием на верхней по нижней части центрифужную пробирку. Добавить 800 мкл 30% сахарозы подушке и слой установленного образца на вершине.
  8. Спин в течение 15 мин при 2500 х г при 4 ° С.
    ПРИМЕЧАНИЕ: плоским дном центрифугирования пробирки впору роторов, которые принимают по 15 мл конические центрифужные пробирки.
  9. Слейте супернатант, затем снимите покровные из труб, тыкая тщательно дно центрифужную пробирку с 16 г 1 ½ '' иглы шприца. Для этого ленту крышка иглы и сама вместе своими днищами иглы и сократить передний конец крышки так, чтобы игла палочки примерно 3мм из. Когда покровное поднял иглой на одном сайте, использовать пинцет, чтобы удалить покровное.
  10. Вымойте покровное быстро опуская его в деионизированной воде, высушить его нежно касаясь его сторону фильтровальной бумаги и поместите его на предметное стекло на капли монтажных средств массовой информации. Печать его с лаком для ногтей, сухость и держать в темноте.
    Примечание: Образцы фиксированные без глутарового альдегида могут быть сохранены в PBS в 24-луночный планшет и используется в дальнейшем для иммунофлуоресцентного. При хранении в течение нескольких дней, добавить 0,05% азида натрия (осторожно!) В перчатках к PBS, чтобы избежать загрязнения с бактериями.
  11. Анализ образцов от флуоресцентной микроскопии сигнала DAPI (с использованием, например, конфокальной микроскопии с 405 нм лазером).

8. Подготовка буфера для окрашивания ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНТНОГО в пробирке восстановленного хроматина деконденсацию образцов

  1. Подготовка PBS в соответствии с 1.1.1. Растворите NH 4 Cl в плавникааль концентрации 50 мМ в PBS. Держите это решение при 4 ° С. Растворите 5 мкг / мл DAPI в PBS (подготовить свежий). Добавить 0,1% Тритон Х-100 до PBS. Хранить при 4 ° С. Подготовка блокирующего буфера свеже перед использованием путем разбавления 3% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в PBS + 0,1% Тритон Х-100.

9. Протокол иммунофлюоресцентного окрашивания в пробирке восстановленного хроматина деконденсацию образцов

ПРИМЕЧАНИЕ:. Все следующие инкубации на покровные сделаны в 24-луночного планшета, по крайней мере, 250 мкл раствора на лунку, если не указано иное В пробирке деконденсированным образцы хроматина более чувствительны, чем фиксированные клетки, поэтому будьте осторожны при добавлении или удалении решения. Рекомендуется использовать пластиковые пипетки Пастера сократить угловой. Для стиральных шаги и инкубации вторичного антитела место пластину при комнатной температуре на раскачивание или поворотную платформу, двигаясь не быстрее, чем 100 оборотов в минуту.

  1. Quench образцы путем инкубации покровноес с 1 мл NH 4 Cl в PBS в течение 5 мин. Образцы Блок по инкубации их с 1мл блокирующем буфере в течение по крайней мере 30 мин.
  2. Собирают влажную камеру для инкубации с первичным антителом: Поместите мокрой ткани на дне закрываемое коробки и крышки пластины 24-луночного вниз на верхней части мокрой ткани. Поместите парафильмом в крышку и добавить 70 мкл раствора антител в образце по парафином. Для раствора антител, разбавленной антисыворотки или очищенных по принципу сродства антител 1: 100 в блокирующем буфере.
  3. Поместите покровные вниз на верхней части раствора антител и инкубируют их в течение от 1 до 2 ч. Поместите покровные обратно в 24-луночный планшет с боковой образца вверх и мыть образцы трижды в течение 10 мин с 1 мл 0,1% Triton X-100 в PBS.
  4. Инкубируйте покровные в течение 1 ч при комнатной температуре в 250 мкл вторичного флуоресцентного меченного антитела, разведенного в блокирующем буфере до концентрации, рекомендованной производителем. Защищать от света. Вымойте Четраза EE в течение 10 мин с 1 мл 0,1% Triton X-100 в PBS.
  5. Инкубируйте образцы в течение 10 мин с 1 мл 5 мкг / мл DAPI в ФБР. Промыть три раза в течение 5 мин с 1 мл 0,1% Triton X-100 в PBS.
  6. Вымойте покровное быстро опуская его в деионизированной воде, высушить его нежно касаясь его сторону фильтровальной бумаги и поместите его на предметное стекло в верхней части капли монтажных средств массовой информации. Печать его с лаком для ногтей, сухость и держать при температуре 4 ° С в темноте, пока не используется. Анализ образцов с помощью флуоресцентной микроскопии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Временная зависимость реакции деконденсацию

На рисунке 1 показана типичная временной ход деконденсацию анализа. Кластер хромосом видимых в начале реакции decondenses и сливается в единую, круглые и гладкой ядра. Когда экстракт яйца заменяется сахарозой буфер кластер хромосома остается сгущенное, которые предполагают, что деконденсация активность присутствует в экстракте яиц.

Хроматина деконденсация является зависимым процессом энергия

Реакционную деконденсация в пробирке можно удобно манипулировать, например, путем добавления ингибиторов. В эксперименте, показанном на фиг.2, негидролизуемый АТФ или ГТФ аналоги, ATPγS или GTPγS, были добавлены к реакции. Оба подавляют деконденсацию показ, что это АТФ и ГТФ зависит, активный процесс (Рисунок 2).

Деконденсация Анализ проводили в присутствии или в отсутствие мембраны (рисунок 3). Пожалуйста, обратите внимание, что в обоих условиях хроматина подвергается деконденсацию, однако добавление мембран результатов в больших ядер. Скорее всего, реформирование ядерной оболочки вызывает вторичную шаг деконденсацию по еще одним механизмом в зависимости от ядерного транспорта.

Рисунок 1
Рисунок 1. Время курс й е в пробирке деконденсация реакция. Митотическое хроматина кластеры из HeLa клеток инкубировали с межфазной Xenopus яиц экстракта. Образцы были зафиксированы на указанные моменты времени с 4% PFA и 0,5% глутарового альдегида, окрашивали DAPI и анализировали с помощью CO nfocal микроскопии. Re-печатается Magalska др. 8. Масштабная линейка 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2. хроматина деконденсация требует гидролиза АТФ и ГТФ. Хроматина деконденсация проводили в присутствии 10 мМ ATPγS, 10 мМ буфера GTPγS или управления. Образцы фиксировали в 4% PFA и 0,5% глутарового альдегида в указанные моменты времени и анализируют с помощью конфокальной микроскопии. Re-печатается Magalska др. 8. Масштабная линейка 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3 "SRC =" / файлы / ftp_upload / 53407 / 53407fig3.jpg "/>
Рисунок 3. хроматина деконденсация в присутствии и в отсутствие мембраны. Хроматина деконденсация проводили в отсутствие (А) или в присутствии (Б) флотационных очищают мембраны в течение 120 мин. Образцы фиксировали в 4% PFA и 0,5% глутарового альдегида и анализировали с помощью конфокальной микроскопии. Хроматин окрашивали DAPI, мембраны с DiIC 18 (1,1'-диоктадецил-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine перхлората). Масштабная линейка 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Xenopus Laevis яйцо экстракты являются очень полезным инструментом для точного воспроизведения клеточные процессы в пробирке, и эта система была успешно использована в характеристике клеточного цикла и деления клеток событий 2, 3,5,6,17. В связи с большими запасами ядерных компонентов поглощенных в яйце во время оогенеза, яичные экстракты являются отличным источником клеточных компонентов. По сравнению с другими подходами, как RNAi на млекопитающих ткани клеточных линий или генетических манипуляций, что дает несколько преимуществ: Система бесклеточной системе можно исследовать клеточные процессы, в которых жизнеспособность клеток было бы в противном случае ограничение. Кроме того Отдельные стадии сложных процессов могут быть проанализированы в простых анализов. ЗДЕСЬ представлены деконденсация анализ позволяет изучать молекулярные механизмы постмитотичности деконденсации без помех от других митотических событий, соответственно. Xenopus яйцо экстракты легко манипулировать истощения специфических белкови добавление ингибиторов или мутантный белков 8. Например, на рисунке 2 показан результат добавления негидролизуемый АТФ или GTP аналогов, ATPγS и GTPγS к деконденсацию анализа. Разбавлением и дифференциальным центрифугированием Xenopus яйца компонентов, таких как мембраны и цитозоле может быть отделена 16. Рисунок 3 показывает деконденсацию анализа осуществляют в присутствии или в отсутствие мембраны. Наконец, бесклеточной анализ также может быть использован для идентификации новых факторов, например, с помощью фракционирования подхода. Использование такой стратегии мы определили AAA + -ATPases RuvBL1 / RuvBL2 в решающий деконденсации факторы 8.

В системах на основе лабораторных X. Laevis яйца были использованы с различных шаблонов ДНК:. Форбс др показали, что инъекции ДНК фага в неоплодотворенных X. Laevis яйца индуцированной сборки хроматина на НАКЭд фага ДНК. В инъекции вирусной ДНК активируется яйцо, сборка хроматина последовало образованию ядра-подобную структуру 18 и аналогично λ-ДНК фага может быть использован в сочетании с экстрактах яиц для генерации ядро структуры в пробирке 19. Магнитные шарики, покрытые ДНК были использованы для изучения chromatinization ДНК 20 и набор ядерных мембран 21, а также сборку ядерной оболочки и поровых комплексов 22, хотя остается открытым, в какой степени это напоминало истинного процесса ядерного повторной сборки , Протокол, представленные здесь позволяет деконденсацию изолированных митоза хроматина кластеров из HeLa клеток, используя экстракт сгенерированный из активированных Xenopus яиц. Это тщательно реконструирует события, ведущие к реформированию в межфазной ядра 8. По сравнению с широко применяется ядерной реакции сборки, используемой для изучения формирования ядерной оболочки иядерные поры комплексы в конце митоза, в деконденсация анализа HeLa митотический хроматин кластеров, а не ДНК спермы используются. Сперма ДНК могут быть собраны в митотической хроматина или даже отдельных хромосом при инкубации с активностью экстракта, полученного из неоплодотворенных и неактивированных яиц 3. Мы решили использовать митотических кластеров в качестве источника хроматина, чтобы упростить процедуру и избежать помех от конденсации хроматина. Кроме того, препарат экстракта яиц немного изменен: Для хроматина деконденсацию низкой скорости экстракта очищенной от двух высокоскоростных шагов центрифугирования в угловым ротором используются. Низкая скорость экстракт может храниться до 6 месяцев, чтобы в жидком азоте, не теряя свою активность. В противоположность этому, в реакциях ядерного сборки, цитозоль и плавали мембраны, полученные от низких скоростей экстрактов разбавлением и дифференциальное высокоскоростной центрифугированием, прежде чем можно замораживания (см Эйзенхардт др. 16 для Detaiпривело протокол). В нашей системе анализа, добавление мембран позволяет формирование замкнутого ядерного конверта в том числе ядерного поровых комплексов. Полученные ядра компетентны для ядерной импортом и экспортом 8. Таким образом, эта система поддерживает хроматина деконденсацию и реформирование ядерной оболочки. Интересно, что хроматин деконденсация также возможно при отсутствии мембран (фиг.3). Однако добавление мембран приводит несколько крупных ядер. Скорее всего, реформирование ядерной оболочки вызывает вторичную шаг деконденсацию по еще неопределенным механизмов, которая зависит от импорта ядерного.

Для выделения кластеров митоза хроматина из клеток HeLa, была использована модифицированная версия протокола, установленном Гассер и Laemmli 15. Синхронные митоза клетки лизируют в буфере, содержащем неионный детергент дигитонина и механических сил. Хроматина выделяют в виде кластеров, содержащихвсе хромосомы от одного ядра. Принципиальная разница по сравнению с одиночными протоколов изоляции хромосома является тот факт, что клетки не hypotonically опухшие, но охлаждают до 4 ° С перед лизисом. Это предотвращает отключение отдельных хромосом 15, 23. По сравнению с протоколом, опубликованной JR Paulson 23, который признали преимущества изоляции целых кластеров хроматина, Гассер и Лэммли использованы ЭДТА содержащих полиаминовые буферы вместо Mg 2+ на основе буферов для уменьшения активности киназ, нуклеаз, протеаз и фосфатаз и под этим уменьшить количество белка и ДНК модификаций, происходящих в процессе изоляции 15. Кроме того, с помощью коллоидных частиц кремнезема градиент во дифференциальным центрифугированием высокой уменьшает цитоплазматический загрязнения. Протокол также может быть использован для изоляции митотических кластеров хроматина из клеток яичника китайского хомячка и мышиных клеток 15.

в пробирке хроматина деконденсации может быть по крайней мере частично объясняется привлечением RuvBL1 / 2, но и другим ААА + -АТФазы, р97, который удаляет митотическую киназы Aurora B из хроматина во выхода из митоза 24. Почему процесс требует GTP гидролиз является одним из открытых вопросов, которые мы намерены ответить с помощью этой установки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Немецкого исследовательского фонда и ERC (AN377 / 3-2 и 309528 CHROMDECON в Вашингтон) и PhD Братство Берингер Ингельхайм Fonds к АКС Рисунок 1 & 2 перепечатаны с Developmental Cell 31 (3), Magalska и др., RuvB, как функция АТФазы хроматина деконденсации в конце митоза, 305-318, 2014, с любезного разрешения Elsevier.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
spermine tetrahydrochloride Fluka analytical 85610-25G
spermidine trihydrochloride Sigma  S2501-5G
high-purity digitonin Millipore 300410-1GM toxic
PMSF Applichem A0999,0100 toxic
thymidine Calbiochem 6060
nocodazole Calbiochem 487928 toxic
37% formaldehyde solution Roth 7398-1 toxic
trypan blue solution (0.4%) Sigma T8154 toxic
1,4-dithiothreitol (DTT) Roth 6908.2
AEBSF hydrochloride Applichem A1421,0001
pepstatin Roth 2936.1/2/3
leupeptin Roth CN334
aprotinin Roth A162.3
Percoll (colloidal silica particles solution) GE Healthcare 17-0891-01
glutamine Gibco 25030-024
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
75 cm² tissue culture flasks Greiner Bio-one 658175
heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) Gibco 10500-064
Homogenizer (40 ml tissue grinder) Wheaton 357546
Neubauer chamber Assistent 441/1
 Oak Ridge Centrifuge Tubes, polycarbonate (50 ml) Nalgene 3118-0050
100 µm cell strainer, nylon BD Falcon 352360
cytochalasin B Applichem A7657,0010 toxic
cycloheximide Roth 8682.3 toxic
L-cystein Merck 1,028,381,000
hCG available as Ovogest MSD 1431593
PMSG available as Intergonan MSD 1431015
A23187 (mixed calcium-magnesium-salt) Enzo ALX-450-002-M010 toxic
syringe needles (1.20 x 40 mm, 18 G x 1 1/2") Braun 4665120
ATP Serva 10920.03
GTP, 2 Na x 3 H20 Roth K056.1/2/3/4
creatine phosphat disodium salt Calbiochem 2380
creatine phosphokinase Sigma C3755-35KU
DMAP Sigma D2629-1G
DAPI  Roche 10236276001
PFA Sigma P-6148 toxic
centrifugation tubes for TLA 100 (7 x 10 mm, 5/16 x 13/16 in.) Beckman Coulter 343775
"Cell-Saver" (tips with wide opening, 1,000 µl) Biozym 729065
50% glutaraldehyde solution, grade I Sigma alderich G7651-10 ml toxic
0.1% (w/v) poly-L-lysine solution Sigma P8920-100 ml
flat-bottom tubes (6 ml, 16.0/55 mm) Greiner Bio-one 145211
Vectashield mounting medium Vector laboratories H1000
tubes for TLA120 (11 x 34 mm, 7/16 x 1 3/8 in.) Beckman Coulter 343778
"Cell-Saver" (tips with wide opening, 200 µl) Biozym 729055
12 mm coverslips Thermo Scientific 0784 #1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lohka, M. J., Masui, Y. Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components. Science. 220, 719-721 (1983).
  2. de la Barre, A. E., Robert-Nicoud, M., Dimitrov, S. Assembly of mitotic chromosomes in Xenopus egg extract. Methods Mol Biol. 119, 219-229 (1999).
  3. Maresca, T. J., Heald, R. Methods for studying spindle assembly and chromosome condensation in Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 459-474 (2006).
  4. Galy, V., et al. A role for gp210 in mitotic nuclear-envelope breakdown. J Cell Sci. 121, 317-328 (2008).
  5. Chan, R. C., Forbes, D. I. In vitro study of nuclear assembly and nuclear import using Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 289-300 (2006).
  6. Gillespie, P. J., Gambus, A., Blow, J. J. Preparation and use of Xenopus egg extracts to study DNA replication and chromatin associated proteins. Methods. 57, 203-213 (2012).
  7. Gant, T. M., Wilson, K. L. Nuclear assembly. Annu Rev Cell Dev Biol. 13, 669-695 (1997).
  8. Magalska, A., et al. RuvB-like ATPases function in chromatin decondensation at the end of mitosis. Developmental Cell. 31, 305-318 (2014).
  9. Belmont, A. S. Mitotic chromosome structure and condensation. Curr Opin Cell Biol. 18, 632-638 (2006).
  10. Lavoie, B. D., Tuffo, K. M., Oh, S., Koshland, D., Holm, C. Mitotic chromosome condensation requires Brn1p, the yeast homologue of Barren. Mol Biol Cell. 11, 1293-1304 (2000).
  11. Philpott, A., Leno, G. H. Nucleoplasmin remodels sperm chromatin in Xenopus egg extracts. Cell. 69, 759-767 (1992).
  12. Philpott, A., Leno, G. H., Laskey, R. A. Sperm decondensation in Xenopus egg cytoplasm is mediated by nucleoplasmin. Cell. 65, 569-578 (1991).
  13. Burglin, T. R., Mattaj, I. W., Newmeyer, D. D., Zeller, R., De Robertis, E. M. Cloning of nucleoplasmin from Xenopus laevis oocytes and analysis of its developmental expression. Genes Dev. 1, 97-107 (1987).
  14. Whitaker, M. Calcium at fertilization and in early development. Physiological reviews. 86, 25-88 (2006).
  15. Gasser, S. M., Laemmli, U. K. Improved methods for the isolation of individual and clustered mitotic chromosomes. Exp Cell Res. 173, 85-98 (1987).
  16. Eisenhardt, N., Schooley, A., Antonin, W. Xenopus in vitro assays to analyze the function of transmembrane nucleoporins and targeting of inner nuclear membrane proteins. Methods Cell Biol. 122, 193-218 (2014).
  17. Wignall, S. M., Deehan, R., Maresca, T. J., Heald, R. The condensin complex is required for proper spindle assembly and chromosome segregation in Xenopus egg extracts. J Cell Biol. 161, 1041-1051 (2003).
  18. Forbes, D. J., Kirschner, M. W., Newport, J. W. Spontaneous formation of nucleus-like structures around bacteriophage DNA microinjected into Xenopus eggs. Cell. 34, 13-23 (1983).
  19. Hartl, P., Olson, E., Dang, T., Forbes, D. J. Nuclear assembly with lambda DNA in fractionated Xenopus egg extracts: an unexpected role for glycogen in formation of a higher order chromatin intermediate. J Cell Biol. 124, 235-248 (1994).
  20. Sandaltzopoulos, R., Blank, T., Becker, P. B. Transcriptional repression by nucleosomes but not H1 in reconstituted preblastoderm Drosophila chromatin. EMBO J. 13, 373-379 (1994).
  21. Ulbert, S., Platani, M., Boue, S., Mattaj, I. W. Direct membrane protein-DNA interactions required early in nuclear envelope assembly. J Cell Biol. 173, 469-476 (2006).
  22. Zhang, C., Clarke, P. R. Chromatin-independent nuclear envelope assembly induced by Ran GTPase in Xenopus egg extracts. Science. 288, 1429-1432 (2000).
  23. Paulson, J. R. Isolation of chromosome clusters from metaphase-arrested HeLa cells. Chromosoma. 85, 571-581 (1982).
  24. Ramadan, K., et al. Cdc48/p97 promotes reformation of the nucleus by extracting the kinase Aurora B from chromatin. Nature. 450, 1258-1262 (2007).

Tags

Молекулярная биология выпуск 106 Бесклеточный анализ митотический выход хроматина изоляции, хроматина деконденсация ядерная реформирование конденсации хроматина
Сотовый бесплатно Анализ по изучению хроматина деконденсацию в конце митоза
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schellhaus, A. K., Magalska, A.,… More

Schellhaus, A. K., Magalska, A., Schooley, A., Antonin, W. A Cell Free Assay to Study Chromatin Decondensation at the End of Mitosis. J. Vis. Exp. (106), e53407, doi:10.3791/53407 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter