Introduction
Det er fastslået, at kræftcellen motilitet er prædiktiv for metastatisk potentiale, idet en sådan adfærd letter invasion gennem basalmembranen og ibrugtagning kredsløbssystemet 1. De fleste forskning om motilitet har fokuseret på, hvordan celler opfører sig i en to-dimensionel (2D) indstilling, selv om det er ved at blive almindeligt anerkendt, at bevægelsen af celler i et tredimensionelt (3D) matrix er mere repræsentativ for, hvordan disse samme celler rent faktisk vil opfører in vivo 2. 3D-kultur-systemer anvendes i stigende grad til at studere cellulære adfærd, der spænder fra cellemorfologi, til vækst kinetik og narkotika følsomhed 3. Ønsket om at overvåge cancercelle invasion inden for rammerne af en 3D-miljø har ført til syntesen af tidligere etablerede teknikker involverer dannelsen af 3D-celleaggregater (sfæroider) via den hængende dråbe dyrkningsmetode 4, efterfulgt af indlejring af disse sfæroider i en 3D ekstracellulære matrix (ECM) bestående af kollagen og kælder membranmaterialer 5. Metoden anvendes til at forbedre disse tidligere etablerede teknikker ved at tilvejebringe en strømlinet tilgang, der let kan anvendes til at sammenligne invasion under en række eksperimentelle betingelser.
Mere traditionelle måder at vurdere cellemotilitet in vitro er scratch-viklet assay og transwell assay 6. Den tidligere assay viser cellemotiliteten i en 2D indstilling, og er derfor uafhængig af en række funktioner kritiske for in vivo invasion, f.eks proteaseaktivitet 7. Transwell assay kan invasion bedre modelcelle når brønden skær er belagt med ECM substrater, men kun en enkelt parameter, dvs. udseendet af celler på den modsatte membranoverfladen måles, og mange nuancer af celleinvasion er således ikke umiddelbart kan. I modsætning til disse teknikker, cancercellen klumpformet invasion assay (figur 1 </ strong>) giver mulighed for tidstro overvågning af celleinvasion i en indstilling, der ikke kun fysiologisk relevant, men også tillader vigtige cellelinje-specifikke funktioner, der skal visualiseres, såsom individuelle vs. kollektiv cellemigration 8. Denne fremgangsmåde giver også fordele i forhold til standard 3D vækstkultur assays. Frembringelsen af cellulære aggregater via hængende dråbe metoden oprindeligt begrænser celle bevægelse, således at celler vil blive tilskyndes til at invadere efter denne begrænsning løftes. Endvidere når denne begrænsning er løftet, vil cellen afstigning fortsætte på en ensartet retning, kan derefter hensigtsmæssigt kvantificeres.
De mest populære ECM materialer, der anvendes til kræft celle sfæroider analyser er Matrigel og type I collagen, hvor hver af disse komponenter har vigtige og adskilte roller i at påvirke metastatisk adfærd. Matrigel er en blanding af udskilte proteiner produceret af Engelbreth-Holm Swarm muse sarcoma celler og er beriget i basement membranproteiner, såsom laminin, entactin, og type IV-collagen 9. Af denne grund Matrigel er herefter benævnt "kælderen membranmaterialer." Disse basalmembran materialer giver væsentlige ligander er nødvendige for integrin adhæsion under cancercelle invasion 10 foruden mange andre proteiner, der udøver en række effekter på celleadfærd 11. I sammenligning type I collagen, der almindeligvis fremstilles ud fra syre fordøjelser af sener og andre tætte kollagene strukturer 12, er en meget enklere matrix, der tjener som et vigtigt strukturelt element af bindevæv og stroma støtte væv og organer i kroppen. Det er blevet påvist, at de fysiske egenskaber af kollagen kan regulere en række funktioner i cellemotilitet; for eksempel tilpasningen af kollagenfibriller ved tumor-stromal grænseflade tillader kræftceller efterfølgende migrerer langs disse fibriller, når invaderer stroma 13. I assayet præsenteres her, både type I collagen og kælder membranmaterialer anvendes som redskaber til undersøgelse 3D cancercelle-stroma interaktioner.
Effekten af hæmning eller stimulering af veje, der styrer kan overvåges invasion efter at cellerne er blevet indlejret i 3D matrix. Celler kan forbehandles under vækst i de hængende dråber eller ved overførsel til 3D kultur, afhængigt af om en langvarig behandling vil være nødvendigt at modulere invasion. For kortere behandlinger, anbefales det, at lægemidlet blandes med klumpformet suspensionen efter indsamling, samt medier, der vil omgive 3D kulturer, til at fremme passende lægemiddeleksponering til cellerne. Dernæst kan normale eller tumor-associerede stromaceller blandes med matrixmaterialet for at vurdere deres rolle i modulering tumorcelleinvasion eller at bestemme, hvordan parakrin og autokrin signalsystemer påvirkninger celle adfærd. Denne idé blev vist i en undersøgelse, hvor cokultur af colpå cancer og endotelceller i hængende dråber førte til en vaskulære netværk inden sfæroiderne 14. Endelig kan ECM bestanddele også ændres, som kræftcelle invasion er påvirket af forskellige substrater 15. Den nedenfor metode vil dermed skabe en ramme for vurdering af kræftcellen invasion under en række betingelser. Det blev generelt konstateret, at ikke alle cellelinjer vil skabe sfæroider i hængende dråber og epitelceller udseende cellelinjer typisk danner regelmæssige sfærer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generering af Sfæroider
- Forbered encellede suspension hængende dråbe kulturer ved at udsende adhærente cancer cellekulturer af ~ 70% konfluens ved hjælp af en PBS vask efterfulgt af udsættelse for 0,05% trypsin-EDTA-opløsning.
- Neutralisere trypsin løsning med celledyrkningsmedier og tælle cellerne under anvendelse af en alikvot af cellesuspensionen. Bemærk: Den specifikke celledyrkningsmedier vil afhænge af cellelinjen, der testes. Følg ATCC medier anbefalinger, hvor cellekulturmediet er typisk DMEM + 10% FBS. Mere information kan findes i Materialer tabel.
- Foretages en fortynding for at tillade podning af 500-1000 celler pr 20 pi dråbe celledyrkningsmedier.
- Erhverve 10 cm skål og tilsættes 5 ml sterilt PBS til bunden. Bemærk: Dette trin beskytter hængende dråber fra fordampning. Lavere omkostninger "bakteriologiske kvalitet" retter kan bruges i stedet for cellekultur kvalitet retter, som celler vil ikke fortshandle kulturen overflade.
- Brug en multikanals pipette til at overføre 20 dråber af den fortyndede cellesuspension pi til den indre overflade af låget.
- Pipetter 40 dråber (5 rækker med 8 dråber) på låget af 10 cm skål.
- Vend låget og sted over dyrkningsskålen. Inkubér hængende dråbe kulturer ved 37 ° C i 72 timer for at generere sfæroider.
- Flip låget i en sikker, men alligevel kontrolleret måde. Bemærk: inverterende låget for hurtigt eller for langsomt kan medføre dråberne til at flytte. Nogle cellelinjer kan danne kugler i 48 timer eller mindre, mens andre kan kræve mere end 72 timer at producere kompakte aggregater.
2. Indlejring af Sfæroider til 3D Matrix
- Tø en portion af vækstfaktor-reduceret basalmembran materialer ved 4 ° C natten over, før indlejring af sfæroider.
- Valgfrit: Lag brønde med ECM på forhånd at forhindre potentielle klumpformet interaktion med vævet culture overflade.
- Pipetter 200 pi ECM per brønd på en 24-brønds plade.
- Vip pladen for at sikre, at ECM dækker hele brøndens overflade.
- Fjern forsigtigt overskydende ECM med en pipette.
- Inkubér pladen, indtil brøndene er tørre: 3 timer ved stuetemperatur eller natten over ved 4 ° C.
- Valgfrit: Lag brønde med ECM på forhånd at forhindre potentielle klumpformet interaktion med vævet culture overflade.
- Indsamle sfæroider ved at vippe låget af vævskulturskål og samle medierne. Overfør mediet med den sfæroider i et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Tillad 10 min for sfæroiderne at afvikle på bunden af mikrocentrifugerør. Sphæroider skal være synlig med det blotte øje.
- Bland 100 pi af membranmaterialer kælder med 100 pi kold (4 ° C) type I collagen i en separat præ-kølet rør. Hold blandingen ved 4 ° C for at forhindre enten gel størkner for tidligt.
- Brug pre-kølede pipettespidser hvis overføre små mængder.
- Giv forsigtig, nårblanding basalmembranen materialer og collagen type I at forhindre luft bobledannelse. Bemærk: Luftbobler kan hindre billedbehandling senere i protokollen, hvis de bliver indlejret i gelen.
- Aspirer sfæroider fra 40 pi bunddelen af mikrocentrifugerør, og kombinere med basalmembranen materialer / type I collagen blanding. Vær omhyggelig med at undgå luftbobler dannes ved blanding. Bemærk: Opløsningen indeholdende i kælderen membranmaterialer 100 pi, 100 pi collagen type I, og 40 pi af sfæroider vil skabe nok materiale til 4 uafhængige 3D kulturer. Dette kan skaleres op eller ned.
- Pipetter 40 pi dråber af den viskose blanding i centrene af brønde på en 24-brønds plade. Hold pladen for at forhindre blandingen i at løbe ind i siden af brønden. Bemærk: En enkelt kolonne på 24-brønds plade - anbefales for hver betingelse, der skal testes - 4 brønde.
- Pladen intOA 37 ° C inkubator og henstår i 30 minutter. 3D kultur vil polymerisere i denne periode.
- Langsomt nedsænkes 3D kulturer i 1 ml cellekulturmedier.
- Sørg for, at mediet er varmt, når du tilføjer den i brøndene for yderligere at fremme gel polymerisation.
- Afgørende skridt: tilføje forsigtigt medier til 3D kulturer. Pipettering medierne for hurtigt i brøndene kan føre til frigørelse af 3D kulturer fra vævskultur overflade.
3. Overvågning og analyse Sfæroide Invasion
- Billede invasion fra sfæroiderne i den omgivende 3D-matrix ved tidspunkter besluttet af investigator. Erhverve fotografier under anvendelse af et inverteret mikroskop med 20x objektiv. Bemærk: Ideelle tidspunkter vil variere afhængigt af cellelinje, der testes. Mere invasive cellelinjer vil begynde deres udgang fra sfæroiderne kort efter udpladning, og derfor tager oprindelige fotografis inden for et par timer efter udpladning. Generelt er fotografier taget ved 0 timer (efter udpladning), 24 timer og 48 timer. Invasion konkluderer typisk 24 til 48 timer efter plating.
- Kvantificere invasiv evne ved hjælp af billedanalyse software som Billede J.
- Analyser invasion som cellen afstanden fra kanten af sfæroide.
- Brug straight draw Tool til at markere radius og / eller maksimal invasiv afstand.
- Klik på "Analyser" i topmenuen, og klik derefter på "Mål" for at vise målingen af længden.
- Analyser invasion som det samlede invasive området uden for klumpformet.
- Brug Freehand Draw Tool til at spore grænsen til klumpformet og / eller total invasiv område.
- Klik på "Analyser" i topmenuen, og klik derefter på "Mål" for at vise målingen området.
- Brug en plugin som ROI udlejer Værktøjer til at skabe målinger til en stak billeder.
- Analyser invasion som cellen afstanden fra kanten af sfæroide.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Brug af klumpformet invasion assay (figur 1), et panel af cancercellelinier blev testet for deres evne til at danne sfæroider, samt for størrelsen af cellen egress udviste efter implantation i en 3D matrix bestående af basalmembran materialer og type I collagen (Tabel 1). Disse resultater viser, at ikke alle cancercellelinie vil skabe velformede kugler, hvor cellelinjer besidder en epitelial morfologi in vitro tendens til at producere regelmæssige og glatte aggregater. Evnen af forskellige cellelinier til at invadere i assayet var også variabel. Cellelinier, der er etableret som værende invasive som 4T1, E0771, og U-87 MG udviste en høj grad af klumpformet udgang i assayet. Mindre aggressive cellelinier, ligesom MCF-7, BT474 og MCF10DICS.com ikke invadere, som var forventet. Uventet, var imidlertid manglen på invasionen vises af A-431 og COLO 357 PL celler. Et eksempel på data for nogle af disselinjer er vist (figur 2). For 4T1 og E0771 celler blev invasion allerede udtalt 24 timer efter indlejring af sfæroider i 3D matrix og for U-87 MG, invasion påbegyndt umiddelbart efter implantation i matrixen.
Den kvalitative vurdering af cellulær invasion kan yderligere understøttes af kvantificering i billedanalyse software. To forskellige strategier for at kvantificere omfanget af invasion er inkluderet (figur 3), og den valgte strategi afhænger af typen af invasionen oplevet. I ImageJ er invasiv distance eller invasive område først afgrænses ved hjælp af softwarens uafgjort værktøj, hvorefter sammenlignelige værdier genereres som pixel målinger. Mikroskopi billeder kan importeres som en stak for at muliggøre erhvervelse mere effektive data, men, hvis dette, anbefales et plugin som ROI udlejer Værktøjer til at lette en effektiv måling.
| Cellelinie | Kræft type | Sphere evne til at danne | Assay Invasion | |
| 4T1 | Mamma | Mus | +++ | ++ |
| A-431 | Epidermoid | Human | +++ | - |
| BT-474 | Bryst | Human | ++ | - |
| COLO 357 PL | Pancreas | Human | ++ | - |
| E0771 | Mamma | Mus | +++ | +++ |
| LNCaP | Prostata | Human | + | - |
| MCF-7 | Bryst | Human | +++ | - |
| MCF10DCIS.com | Bryst | Human | ++ | - |
| MDA-MB-231 | Bryst | Human | - | ? |
| PANC-1 | Pancreas | Human | + | ++ |
| PC-3 | Prostata | Human | - | ? |
| SK-BR-3 | Bryst | Human | - | ? |
| U-87 MG | Glioblastom | Human | +++ | +++ |
Tabel 1:. Sphere-dannelse og invasion ved forskellige cellelinier testede cellelinjer er scoret i henhold til deres kugle-dannende evne og invasion.
Figur 1:. Visual workflow af klumpformet invasion assay Sfæroider genereres i dråber medier, der hænger ned fra låget på en vævskulturskål i 72 timer. Dernæst dråberne samlet og sfæroiderne er transf begået en fejl til en 4 ° C blanding af basalmembran materialer og type I collagen. Efter resuspension sfæroid, den viskose blanding pipetteret i fordybningerne i en plade med 24 brønde, hvorefter det er givet 30 minutter ved 37 ° C for at størkne i en 3D kultur. Varme medier tilsættes derefter til brøndene. Cell udgang fra sfæroiderne derefter overvåget over tid.
Figur 2:. Eksempel på assaydata The 4T1, E0771, og U-87 MG-celler viser invasion fra sfæroider henviser A-431 og MCF-7-celler ikke. Invasion af U-87-celler er mest udtalt efter 24 timer, mens maksimal invasion af 4T1 og E0771 celler opstår senere. For de mest invasive E0771 og U-87 mg-cellelinjer, synes celle udgang at opveje stigningen i klumpformet størrelse ellers observeret med de mindre invasive linjer. Scale bar, 200 pm.about / filer / ftp_upload / 53409 / 53409fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3:. Kvantificering af invasion invasion kan kvantificeres ved billedanalyse, f.eks hjælp af Image J software. (a) Beregning af invasion som en funktion af den længste afstand invasive stammer fra klumpformet. (b) Samlet areal invaderet af celler, der forlader klumpformet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette studie vurderede effektiviteten af et panel af cancercellelinier i en klumpformet invasion assay (Tabel 1). Generelt finder vi, at sfæroide dannelse forstærkes i de mere epiteliale udseende cellelinjer, hvor tilstedeværelsen af celle-celle kryds fremmer dannelsen af en sfæroid-lignende arkitektur. Kendte cellelinjer, der har undergået en epitel-mesenchymale overgang, som MDA-MB-231-celler ikke danner sfæroider i hængende dråbe kultur sandsynligvis på grund af deres reducerede E-, N- og P-cadherinekspression 16.
Nogle af trinene i klumpformet invasion analysen kræver tæt tilslutning til protokollen. Det er helt afgørende at arbejde hurtigt, når pipettering blanding basalmembranen og kollagen, og det er afgørende, at man holder blandingen nær 4 ° C, mens du arbejder, da det vil begynde at størkne ved stuetemperatur. Også opløselige collagen præparater er sure, og induceres til gel ved addition af en lille mængde natriumhydroxid og salt, efterfulgt af opvarmning til 37 ° C. I vores hænder, blot at blande lige volumener af collagen med basalmembranen materialer gør det gel-kompetent ved opvarmning, fordi basalmembranen komponent er i stand til at neutralisere kollagen. Hvis mindre forhold af basalmembran: planlægges kollagen, bør kollagenet neutraliseres før tilsætning af membranen blandingen kælderen at lette polymerisation. Når det er dannet, de fleste sfæroider er resistente overfor dissociation og vil overleve resuspension i denne viskøs blanding, der omfatter 3D-kultur. Under ophvirvling trin, må man også udøve opmærksom på at begrænse dannelsen af luftbobler, da disse kan hindre billeddannelse. Når der tilføjes dyrkningsmedier til brøndene efter at gelen er størknet, er det vigtigt, at en pipetter langsomt for at forhindre 3D kulturer løsner fra skålen.
Udgangsventilen af cancerceller i den omgivende 3D matrix er generally korrelerede med invasiv evne linjerne, hvor E0771 og U-87 MG-celler demonstrerede mest invasion i panelet af celle- her undersøgte linier (figur 2). Interessant, disse to linjer udviser også forskellige former for invasion. Ud fra følgende betragtninger E0771 celler invaderer i en gradvis og kollektiv måde, vise U-87 mg celler individuel og hurtig exit fra sfæroiderne. Den klumpformet invasion analysen dermed gør det muligt at sammenligne de forskellige transportformer anvendes af linjer til at invadere underlaget.
Forskellige analysemetoder for invasion er vist i figur 3, og den foretrukne måde til analyse kan afhænge af invasion. Uanset hvilken type analysemetode, blev dette assay til formål at muliggøre en hurtig kvantificering af invasion ud af et stort antal sfæroider. Pooling af spheroids ind i en 3D-kultur blanding, og derefter alikvotere denne blanding til at skabe 4 uafhængige replikatkulturer, fører til establishment af flere sfæroider, som kan overvåges for en bestemt eksperimentel betingelse (figur 1). Assayet er således let kunne ændres til statistisk sammenligning på grund af det store potentiale "n", og fænotypen deles af sfæroider af samme type synes at udvise minimal variation. Bemærk, at mindre aggressive cellelinier, såsom BT-474 og MCFDCIS celler danner glatte, kompakte kugler, der har en meget mindre størrelse end de mere aggressive linjer. Som følge heraf, i den indledende cellepodning i hængende dråber, skal justeres udgangs celletal.
Nogle metastatiske cellelinier udføres mod vores forventninger, og udviste ikke invasive adfærd i denne analyse. Bemærkelsesværdige eksempler kan nævnes A-431 og COLO 357 PL celler. Det er muligt, at manglen på invasion vises af disse linjer skyldes typen af ECM substrat, sfæroiderne blev indlejret i. Faktisk har andre vist, at basalmembranen materialer (f.eks Matrigel) og kollagen kan have forskellige virkninger på invasionen af celler 17 måske på grund af forskellige matrixmetalloprotease krav til migration 18. Således tilpasse forholdet mellem kollagen: basalmembran materialer er en anden måde at ændre assay resultater, hvis en nedgang i basalmembranen materiale komponent til en tredjedel af den totale blanding, således at der en stigning i mængden af collagen, yderligere forbedre invasion ved nogle celletyper. Denne idé er eksemplificeret i en nylig undersøgelse, der blev fundet en positiv sammenhæng mellem den invasive evne brystkirtler organoids og antallet af type I collagen fibriller stede, hvor collagen fibrildannelse blev fremmet ved at udvide 4 ° C præinkubationsperiode pH neutraliseret collagen 19.
Opdagelsen af, at nogle cellelinjer handlet mod forventning viser nogle af de begrænsninger af denne analyse. Selv om overvågning cancercelle invasion ud ofa sfæroid i en 3D blanding bestående af kollagen og kælder membranmaterialer er mere fysiologisk relevant end en 2D motilitet assay, er det stadig et modelsystem, der udelader visse biologiske kompleksitet ellers findes in vivo. For eksempel kan metastatisk evne til at blive moduleret af de forskellige mikromiljøer, der understøtter ortotopisk vs. ektopisk tumorvækst 20 og, som sådan, er det vigtigt at erkende, at en række faktorer stromale dybt kan påvirke den metastatiske proces. En række af disse faktorer er fraværende i invasionen assay præsenteret her og kunne forklare nogle af de observerede uoverensstemmelser.
Sammenfattende kræftcellen klumpformet invasion analysen præsenteres her giver en fleksibel ramme for overvågning invasion i et biologisk relevant indstilling, understøtter opdagelsen af mekanismer celleinvasion, og kan potentielt bidrage til udviklingen af nye anti-metastatiske behandlinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Støttet af NIH tilskud P30 CA051008 og T32 CA009686 (ATR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel Growth Factor Reduced | Corning | CB-40234 | |
| Collagen Type I, Rat Tail, 100 mg | Millipore | 08-115 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | |
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11875-093 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-12 | |
| 100 mm TC-treated Dishes | Corning Incorporated | 430167 | |
| 24-well TC-treated Plates | NEST Biotechnlology | 702001 | |
| Olympus IX-71 Inverted Microscope | |||
| Cell lines were maintained in DMEM + 10% FBS, with the expection of BT-474 and LNCaP cells, which were mantained in RPMI + 10% FBS. |
References
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Metastasis: Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev. Cancer. 2 (8), (2002).
- Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. J Cell Sci. 116 (12), 2377-2388 (2003).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), (2007).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J Vis Exp. 51, (2011).
- Del Duca,, Werbowetski, D., T,, Del Maestro,, F, R. Spheroid preparation from hanging drops: characterization of a model of brain tumor invasion. J Neuro-Oncol. 67 (3), (2004).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. J Vis Exp. 88, (2014).
- Ramos-DeSimone, N., Hahn-Dantona, E., Sipley, J., Nagase, H., French, D. L., Quigley, J. P. Activation of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) via a converging plasmin/stromelysin-1 cascade enhances tumor cell invasion. J Bio Chem. 274 (19), Forthcoming.
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Rev. Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: Basement membrane matrix with biological activity. Semin Cancer Biol. 15 (5), 378-386 (2005).
- Shaw, L. M., Chao, C., Wewer, U. M., Mercurio, A. M. Function of the integrin α6β1 in metastatic breast carcinoma cells assessed by expression of a dominant-negative receptor. Cancer Res. 56 (5), 959-963 (1996).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), (2010).
- Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. -F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat Protoc. 1 (6), (2006).
- Provenzano, P. P., Eliceiri, K. W., Campbell, J. M. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4 (1), (2006).
- Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Methods Mol Med. 140, 141-151 (2007).
- Brenner, W., Groß, S., Steinbach, F., Horn, S., Hohenfellner, R., Thüroff, J. W. Differential inhibition of renal cancer cell invasion mediated by fibronectin, collagen IV and laminin. Cancer Lett. 155, 199-205 (2000).
- Nieman, M. T., Prudoff, R. S., Johnson, K. R., Wheelock, M. J. N-cadherin promotes motility in human breast cancer cells regardless of their E-cadherin expression. J Cell Biol. 147 (3), Forthcoming.
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), (2013).
- Sodek, K. L., Brown, T. J., Ringuette, M. J. Collagen I but not Matrigel matrices provide an MMP-dependent barrier to ovarian cancer cell penetration. BMC Cancer. 8 (1), 223-2210 (2008).
- Nguyen-Ngoc, K. V., Ewald, A. J. Mammary ductal elongation and myoepithelial migration are regulated by the composition of the extracellular matrix. J Microsc. 251 (3), 212-223 (2013).
- Glinskii, A. B., Smith, B. A., Jiang, P., Li, X., Yang, M., Hoffman, R. M., Glinsky, G. V. Viable circulating metastatic cells produced in orthotopic but not ectopic prostate cancer models. Cancer Res. 63 (14), 4239-4243 (2003).
