Introduction
Il est établi que la motilité des cellules cancéreuses est un facteur prédictif de potentiel métastatique, étant donné qu'un tel comportement facilite invasion à travers la membrane basale et l'entrée dans le système circulatoire 1. La plupart des recherches sur la motilité a mis l'accent sur la façon dont les cellules se comportent dans un (2D) paramètre à deux dimensions, mais il est en plus largement reconnu que le mouvement des cellules dans une matrice tridimensionnelle (3D) est plus représentatif de la façon dont ces mêmes cellules seront effectivement se comporter deux in vivo. Des systèmes de culture 3D de plus en plus utilisées pour étudier les comportements cellulaires qui vont de la morphologie cellulaire, de la cinétique de croissance et la sensibilité aux médicaments 3. Le désir de contrôler l'invasion de cellules cancéreuses dans le cadre d'un milieu 3D a conduit à la synthèse des techniques précédemment établies impliquant la génération d'agrégats de cellules 3D (sphéroïdes) via le procédé de culture de goutte suspendue 4, suivie de l'incorporation de ces sphéroïdes dans un extracellulaire 3D matrice (ECM), composée de collagène et de la membrane basale matériaux 5. Cette méthode vise à améliorer ces techniques précédemment établies en fournissant une approche simplifiée qui peut être facilement utilisé pour comparer l'invasion sous une variété de conditions expérimentales.
Plus méthodes traditionnelles pour évaluer la motilité cellulaire in vitro comprennent le dosage d'anti-enroulé et le dosage de 6 Transwell. Le premier essai montre la motilité des cellules dans un milieu en 2D, et est donc indépendante d'une variété de caractéristiques critiques pour l'invasion in vivo, par exemple une activité de protease 7. Le dosage Transwell peut mieux modèle invasion cellulaire lorsque les inserts de puits sont revêtues avec des substrats de ECM, mais, seulement un seul paramètre, à savoir l'apparition de cellules sur la surface opposée de la membrane est mesurée, et de nombreuses nuances de l'invasion des cellules ne sont donc pas facilement observable. Contrairement à ces techniques, le dosage cellulaire de cancer du sphéroïde invasion (figure 1 </ strong>) permet la surveillance en temps réel de l'invasion des cellules dans un cadre qui est non seulement physiologiquement pertinente, mais permet également des caractéristiques importantes de cellules spécifiques aux lignes à visualiser, tels que la migration de cellule individuelle vs 8 collective. Cette méthode offre également des avantages sur les essais de croissance de la culture 3D standard. La production d'agrégats cellulaires par la méthode de la goutte suspendue contraint initialement le mouvement des cellules, de sorte que les cellules sont incités à envahir après cette contrainte est levée. En outre, une fois que la contrainte est levée, la sortie de la cellule se déroulera dans une direction uniforme qui peuvent ensuite être facilement quantifiée.
Les matériaux d'ECM les plus populaires utilisés pour cellulaires de cancer sphéroïdes dosages sont Matrigel et collagène de type I, où chacune de ces composantes a des rôles importants et distincts à influencer le comportement métastatique. Matrigel est un mélange sécrétée de protéines produites par des cellules de sarcome Engelbreth-Holm Swarm souris, et est enrichie en améprotéines membranaires nt comme la laminine, entactine et collagène de type IV 9. Pour cette raison Matrigel est désormais appelé «matériaux de la membrane basale." Ces matériaux de la membrane basale fournissent ligands essentiels nécessaires pour intégrine adhérence lors de cancer invasion de la cellule 10, en plus de nombreuses autres protéines qui exercent une gamme d'effets sur le comportement de la cellule 11. En comparaison, collagène de type I, couramment préparé à partir de produits de digestion acide de tendons et d'autres structures de collagène dense 12, est un matériau de matrice beaucoup plus simple qui sert en tant qu'élément structurel principal de tissus tissulaires et du stroma de support conjonctifs et organes du corps. Il a été démontré que les caractéristiques physiques du collagène peuvent réguler un certain nombre de caractéristiques de la motilité des cellules; par exemple, l'alignement des fibrilles de collagène à l'interface de la tumeur du stroma permet aux cellules cancéreuses de migrer par la suite le long de ces fibrilles lors de l'invasion dans le stroma 13. Dans l'essai présenté ici, à la fois du collagène de type I et les matériaux de la membrane basale sont utilisés comme outils pour étudier les interactions cellule-cancer du stroma 3D.
L'effet de l'inhibition ou la stimulation des voies qui contrôlent l'invasion peut être surveillée après que les cellules ont été noyées dans la matrice 3D. Les cellules peuvent être prétraitées pendant la croissance dans les gouttes de suspension ou lors du transfert de la culture 3D, selon que le traitement de longue durée sera nécessaire pour moduler invasion. Pour les traitements plus courts, il est recommandé que le médicament est mélangé à la suspension de sphéroïde après la collecte, ainsi que le support qui entourent les cultures 3D, afin de faciliter l'exposition au médicament adéquat pour les cellules. Ensuite, les cellules stromales normales ou associés à une tumeur peuvent être mélangés avec le matériau de matrice afin d'évaluer leur rôle dans la modulation de l'invasion des cellules tumorales, ou pour déterminer le comportement des cellules influences de signalisation autocrine et paracrine. Cette idée a été montré dans une étude où la co-culture de colsur le cancer et les cellules endothéliales dans des gouttes suspendues conduit à un réseau vasculaire dans les sphéroïdes 14. Enfin, les constituants de l'ECM peuvent aussi être modifiées, comme l'invasion des cellules cancéreuses est influencée par différents substrats 15. La méthode présentée ci-dessous sera donc de fournir un cadre pour évaluer l'invasion des cellules cancéreuses dans une variété de conditions. En général, il a été trouvé que toutes les lignées de cellules vont créer des sphéroïdes dans les gouttes suspendues et des lignées de cellules epitheliales d'aspect forment typiquement des sphères régulières.
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Protocol
1. Génération de Sphéroïdes
- Préparer une suspension de cellules isolées pour accrocher des cultures de goutte à détacher des cultures de cellules adhérentes cancer de ~ 70% de confluence en utilisant un WASH PBS suivi par l'exposition à la solution de trypsine-EDTA à 0,05%.
- Neutraliser la solution de trypsine avec des milieux de culture de cellules et compter les cellules en utilisant une aliquote de la suspension cellulaire. Remarque: Les milieux de culture cellulaire spécifique dépendra de la lignée cellulaire testée. Suivre ATCC recommandations de média, où le milieu de culture cellulaire est généralement DMEM + 10% de FBS. Plus d'informations peuvent être trouvées dans le tableau des matériaux.
- Effectuer une dilution pour permettre l'ensemencement de 500-1000 cellules par goutte 20 ul de milieu de culture cellulaire.
- Acquérir de 10 cm et ajouter 5 ml de PBS stérile vers le bas. Remarque: Cette étape protège la pendaison chute de l'évaporation. Basse-coût »bactériologiques de qualité" plats peut être utilisé à la place de plats de qualité de culture de cellules, comme les cellules ne sera pas suiteagir la surface de culture.
- Utiliser une pipette à canaux multiples pour transférer 20 pi de gouttelettes de la suspension cellulaire diluée à la surface intérieure du couvercle.
- Pipet 40 gouttes (5 rangées de 8 gouttes) sur le couvercle de la boîte de 10 cm.
- Inversez le couvercle et la placer sur la boîte de culture. Incuber les cultures de goutte suspendue à 37 ° C pendant 72 heures pour générer sphéroïdes.
- Retournez le couvercle d'une manière confiante, mais contrôlée. Remarque: L'inversion du couvercle trop rapide ou trop lent peut causer des gouttelettes pour décaler. Certaines lignées de cellules peuvent former des sphéroïdes 48 h ou moins, tandis que d'autres peuvent nécessiter plus de 72 heures pour produire des agrégats compacts.
2. Embedding de Sphéroïdes en 3D Matrix
- Décongeler une aliquote de sous-sol matériaux membranaires facteur réduit la croissance à 4 ° C pendant la nuit avant de l'intégrer sphéroïdes.
- Facultatif: puits de couche avec ECM à l'avance pour éviter l'interaction sphéroïde potentiel avec le tissu de culture surface.
- Pipet 200 pi de ECM par puits sur une plaque de 24 puits.
- Incliner la plaque pour que le ECM couvre la surface du puits tout entier.
- Retirez délicatement l'excès ECM avec une pipette.
- Incuber la plaque jusqu'à ce que les puits sont à sec: 3 heures à température ambiante ou une nuit à 4 ° C.
- Facultatif: puits de couche avec ECM à l'avance pour éviter l'interaction sphéroïde potentiel avec le tissu de culture surface.
- Recueillir les sphéroïdes en inclinant le couvercle de la boîte de culture de tissus et de mutualiser les médias. Transférer les médias avec les sphéroïdes dans un tube de 1,5 ml.
- Autoriser 10 min pour les sphéroïdes à se déposent au fond du tube à centrifuger. Sphéroïdes devraient être visibles à l'œil nu.
- Mélanger 100 pi des matériaux de la membrane basale avec 100 pi de froid (4 ° C) collagène de type I dans un tube pré-réfrigéré séparé. Gardez le mélange à 4 ° C pour éviter la gel de se solidifier prématurément.
- Utilisez les embouts de pipettes pré-réfrigérées si le transfert de petits volumes.
- Donner des soins quandmélanger les matières de la membrane basale et de collagène de type I pour empêcher la formation de bulles d'air. Remarque: Les bulles d'air peuvent entraver imagerie plus tard dans le protocole si elles deviennent intégrés dans le gel.
- Aspirer les sphéroïdes de la partie inférieure de 40 ul du tube de microcentrifugeuse, et de combiner avec les matériaux de la membrane basale / collagène de type I mélange. Soyez prudent pour éviter la formation de bulles d'air lors du mélange. Remarque: La solution contenant des matières de la membrane basale 100 pi, 100 pi de collagène de type I, ainsi que 40 ul de sphéroïdes vais créer suffisamment de matière pour 4 3D cultures indépendantes. Cela peut être agrandie ou réduite.
- Pipet 40 Les gouttes ul du mélange visqueux dans les centres de puits sur une plaque de 24 puits. Maintenir le niveau de la plaque pour empêcher le mélange de courir dans le côté du puits. Remarque: Une seule colonne sur la plaque de 24 puits - 4 puits - est recommandé pour chaque condition à tester.
- Placer la plaque into 37 ° C incubateur et laisser reposer pendant 30 min. La culture 3D va polymériser pendant cette période.
- Plonger lentement les cultures 3D dans 1 ml de milieu de culture cellulaire.
- Assurez-vous que les médias est chaud quand l'ajouter dans les puits afin de promouvoir davantage la polymérisation de gel.
- Étape critique: Ajouter délicatement les médias aux cultures 3D. Pipetage des médias trop vite dans les puits peut conduire au détachement des cultures 3D de la surface de culture de tissus.
3. Suivi et analyse de Spheroid Invasion
- L'invasion de l'image dans les sphéroïdes dans la matrice 3D environnante aux points de contrôle décidées par l'enquêteur. Acquérir des photos en utilisant un microscope inversé avec l'objectif 20x. Remarque: points de temps Idéal diffèrent en fonction de la lignée cellulaire testée. Lignées cellulaires plus invasives vont commencer leur sortie des sphéroïdes peu après placage et, par conséquent, de prendre la photo initiales au sein d'un couple d'heures après placage. Généralement, les photos sont prises à 0 h (après le placage), 24 h et 48 h. Invasion conclut généralement 24 à 48 heures après l'étalement.
- Quantifier la capacité invasive en utilisant un logiciel d'analyse d'image comme J. Image
- Analyser invasion comme étant la distance de la cellule à partir du bord de la sphéroïde.
- Utilisez l'outil Dessiner droite pour marquer le rayon et / ou de la distance maximale invasive.
- Cliquez sur "Analyser" dans le menu du haut, puis cliquez sur "mesure" pour afficher la mesure de longueur.
- Analyser invasion comme la superficie totale invasive en dehors de la sphéroïde.
- Utilisez l'outil de dessiner à main levée pour tracer la frontière du sphéroïde et / ou de la zone invasive totale.
- Cliquez sur "Analyser" dans le menu du haut, puis cliquez sur "mesure" pour afficher la mesure de la superficie.
- Utilisez un plugin comme Manager Tools ROI pour créer des mesures pour une pile d'images.
- Analyser invasion comme étant la distance de la cellule à partir du bord de la sphéroïde.
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Representative Results
En utilisant le dosage d'invasion sphéroïde (figure 1), un panel de lignées cellulaires du cancer a été testé pour leur aptitude à former des sphéroïdes, ainsi que pour la quantité de sortie de la cellule exposée après l'implantation dans une matrice 3D constitué de matériaux de membrane de sous-sol et de collagène de type I (Tableau 1). Ces résultats démontrent que chaque lignée cellulaire de cancer va créer sphéroïdes bien formés, où les lignes de cellules possédant une morphologie épithéliale in vitro avaient tendance à produire des agrégats réguliers et lisses. La capacité des différentes lignées de cellules d'envahir dans l'essai était également variable. Les lignées cellulaires qui sont établis comme étant invasive comme 4T1, E0771, et U-87 MG présentaient un degré élevé d'évacuation sphéroïde dans le dosage. Lignées de cellules moins agressives, comme le MCF-7, BT474, et MCF10DICS.com ne envahissent, comme cela a été prévu. Inattendue, cependant, est l'absence d'invasion affichée par-431 A et 357 cellules COLO PL. Un exemple des données pour certaines d'entre elleslignes est affichée (Figure 2). Pour les cellules 4T1 et E0771, invasion a déjà été prononcé 24 heures après l'enrobage des sphéroïdes dans la matrice en 3D, et pour U-87 MG, invasion a commencé directement après l'implantation dans la matrice.
L'évaluation qualitative de l'invasion cellulaire peut être encore supporté par la quantification dans un logiciel d'analyse d'image. Deux stratégies différentes pour quantifier l'ampleur de l'invasion sont inclus (Figure 3), et la stratégie choisie dépend du type d'invasion témoin. Dans ImageJ, la distance ou de la zone invasive invasive est d'abord délimitées en utilisant l'outil de tirage du logiciel, après quoi les valeurs comparatives sont générés comme mesures de pixels. Images de microscopie peuvent être importés comme une pile pour permettre l'acquisition de données plus efficaces, mais, si cela, comme un plugin Manager Tools ROI est recommandé pour faciliter la mesure efficace.
| Cell Line | Type de cancer | Sphère-capacité de formation | Invasion Assay | |
| 4T1 | Mammaire | Souris | +++ | ++ |
| A-431 | Épidermoïde | Humain | +++ | - |
| BT-474 | Sein | Humain | ++ | - |
| COLO 357 PL | Pancréas | Humain | ++ | - |
| E0771 | Mammaire | Souris | +++ | +++ |
| LNCaP | La prostate | Humain | + | - |
| MCF-7 | Sein | Humain | +++ | - |
| MCF10DCIS.com | Sein | Humain | ++ | - |
| MDA-MB-231 | Sein | Humain | - | ? |
| PANC-1 | Pancréas | Humain | + | ++ |
| PC-3 | La prostate | Humain | - | ? |
| SK-BR-3 | Sein | Humain | - | ? |
| U-87 MG | Glioblastome | Humain | +++ | +++ |
Tableau 1:. Sphère-formation et l'invasion par différentes lignées cellulaires lignées cellulaires testées sont notés en fonction de leur capacité et l'invasion sphère formation.
Figure 1:. Visual Workflow de l'essai d'invasion sphéroïde Sphéroïdes sont générés sous forme de gouttes de médias qui pendent du couvercle d'une boîte de culture de tissu pendant 72 heures. Ensuite, les gouttes sont mis en commun, et les sphéroïdes sont transf commis une erreur à un mélange C 4 ° des matériaux de la membrane basale et collagène de type I. Après la remise en suspension sphéroïde, le mélange visqueux est pipette dans les puits d'une plaque de 24 puits, après quoi il est donné 30 minutes à 37 ° C pour se solidifier en une culture 3D. Médias chaud est ensuite ajoutés aux puits. Sortie de la cellule des sphéroïdes est ensuite suivi dans le temps.
Figure 2:. Exemple de données de test Le 4T1, E0771, et les cellules U-87 MG montrent invasion des sphéroïdes que l'A-431 et MCF-7 cellules non. Invasion des cellules U-87 est le plus prononcé après 24 h, alors que l'invasion maximale par les cellules 4T1 et E0771 se produit plus tard. Pour la plus invasive et E0771 U-87 lignées de cellules MG, la sortie de la cellule apparaît à compenser l'augmentation de la taille sphéroïde autrement observé avec les lignes moins invasives. La barre d'échelle, 200 um.om / files / ftp_upload / 53409 / 53409fig2large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3:. La quantification de l'invasion Invasion peut être quantifiée par analyse d'image, par exemple en utilisant le logiciel Image J. (a) Calcul de l'invasion, en fonction de la distance la plus longue invasive émanant du sphéroïde. (b) la superficie totale envahie par les cellules quittent le sphéroïde. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Cette étude a évalué la performance d'un panel de lignées cellulaires cancéreuses dans un test d'invasion sphéroïde (tableau 1). En règle générale, nous constatons que la formation sphéroïde est renforcée dans les plus lignées de cellules épithéliales prospectifs, où la présence de jonctions cellule-cellule favorise la formation d'une architecture sphéroïde-like. Connus lignes de cellules qui ont subi une transition épithélio-mésenchymateuse, comme MDA-MB-231 cellules ne forment pas des sphéroïdes dans la culture de la goutte pendante la plus probable en raison de leur E-, N-, P-cadhérine et expression 16 réduite.
Certaines des étapes dans le dosage de l'invasion sphéroïde exigent un respect fidèle au protocole. Il est absolument essentiel de travailler rapidement lors du pipetage du mélange de la membrane basale et de collagène, et il est crucial que l'on garde le mélange de près de 4 ° C tout en travaillant comme il va commencer à se solidifier à la température ambiante. Aussi, préparations de collagène solubles sont acides, et sont amenés à gel par l'Addition d'une petite quantité d'hydroxyde de sodium et le sel, suivi par un chauffage à 37 ° C. En nos mains, simple mélange des volumes égaux de collagène avec les matériaux de la membrane basale rend gel compétente sur réchauffe parce que le composant de la membrane basale est capable de neutraliser le collagène. Si plus petits rapports de membrane basale sont prévues: collagène, le collagène doit être neutralisé avant l'addition du mélange de la membrane basale pour faciliter la polymérisation. Une fois formée, la plupart des sphéroïdes sont résistants à la dissociation et survivront remise en suspension dans ce mélange visqueux qui comprendra la culture 3D. Au cours des étapes de remise en suspension, il faut aussi faire très attention à limiter la formation de bulles d'air, car ils peuvent nuire à l'imagerie. Lors de l'ajout des milieux de culture dans les puits après le gel est solidifié, il est important que l'on pipettes lentement pour éviter les cultures 3D de se détacher de la capsule.
La sortie des cellules cancéreuses dans la matrice environnante 3D est généralitésy corrélée avec la capacité invasive des lignes, et où le E0771 cellules U-87 MG ont démontré la plus invasion dans le panneau de lignées cellulaires examinées ici (figure 2). Fait intéressant, ces deux lignes présentent également différents modes d'invasion. Alors que les cellules E0771 envahissent d'une manière progressive et collective, les cellules MG-87 affichent U sortie individuelle et rapide des sphéroïdes. Le dosage d'invasion sphéroïde permet ainsi de comparer les différents modes utilisés par les lignes à envahir le substrat.
Différentes méthodes d'analyse de l'invasion sont présentés dans la figure 3 et de la manière préférée d'analyse peuvent dépendre du mode d'invasion. Quel que soit le type d'analyse employée, ce test a été conçu pour permettre la quantification rapide pour l'invasion d'un grand nombre de sphéroïdes. La mise en commun des sphéroïdes dans un mélange de culture 3D, puis aliquotage ce mélange pour créer 4 cultures réplicats indépendants, conduit à la establicréat on de plusieurs sphéroïdes pouvant être surveillée pendant une condition expérimentale donnée (figure 1). Le dosage est donc facilement modifiable à la comparaison statistique en raison du grand potentiel "n", et le phénotype partagée par sphéroïdes du même type semble présenter une variabilité minimale. A noter que les lignées cellulaires comme les cellules moins agressives BT-474 et forment MCFDCIS, des sphères lisses compactes qui ont une taille beaucoup plus petite que les lignes les plus agressifs. En conséquence, lors de l'ensemencement initial de cellules dans les gouttes de suspension, le nombre de cellules de départ doit être ajustée en conséquence.
Certaines lignées de cellules métastatiques effectués contre nos attentes et ne présentent pas de comportement envahissant dans cet essai. Parmi les exemples notables comprennent l'A-431 et les cellules COLO 357 PL. Il est possible que l'absence d'invasion affichée par ces lignes est due à la nature du support de l'ECM que les sphéroïdes ont été intégrés dans. En effet, d'autres ont montré que la membrane basale compagnonrials (par exemple Matrigel) et de collagène peuvent avoir des effets disparates sur l'invasion des cellules 17 peut-être dues à des exigences différentes de métalloprotéases matricielles pour les migrations 18. Ainsi, ajustant le rapport du collagène: Les matériaux de la membrane de sous-sol est un autre moyen de modifier les résultats d'analyse, où la réduction du composant de matériau de la membrane basale à un tiers du mélange total, permettant ainsi à une augmentation de la quantité de collagène, peut en outre améliorer l'invasion par certains types de cellules. Cette idée est illustrée par une étude récente qui a trouvé une corrélation positive entre la capacité invasive des organites mammaires et le nombre de collagène de type I fibrilles présente, où la formation des fibrilles de collagène a été promu en prolongeant la période C de pré-incubation de 4 ° de pH neutralisé collagène 19.
La découverte que certaines lignées cellulaires ont agi contre toute attente montre certaines des limites de ce test. Bien que l'invasion des cellules du cancer de la surveillance des ofa sphéroïde dans un mélange 3D constituée de matériaux de collagène et de la membrane basale est physiologiquement plus pertinente qu'une analyse de la motilité 2D, il est encore un système modèle qui omet certaines complexités biologiques trouvés autrement in vivo. Par exemple, la capacité métastatique peut être modulée par les micro-environnements distincts qui soutiennent la croissance de la tumeur ectopique vs orthotopique 20 et, comme tel, il est important de reconnaître que une variété de facteurs stromales peut influencer profondément le processus métastatique. Un certain nombre de ces facteurs sont absents dans le dosage d'invasion présenté ici et pourrait expliquer certaines des incohérences observées.
En résumé, la cellule cancéreuse invasion sphéroïde analyse présentée ici fournit un cadre souple pour la surveillance de l'invasion dans un cadre biologiquement pertinente, soutient la découverte des mécanismes de l'invasion des cellules, et peut potentiellement aider dans le développement de thérapies anti-métastatiques nouveaux.
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Acknowledgments
Pris en charge par le NIH subventions P30 CA051008 et CA009686 T32 (ATR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel Growth Factor Reduced | Corning | CB-40234 | |
| Collagen Type I, Rat Tail, 100 mg | Millipore | 08-115 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | |
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11875-093 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-12 | |
| 100 mm TC-treated Dishes | Corning Incorporated | 430167 | |
| 24-well TC-treated Plates | NEST Biotechnlology | 702001 | |
| Olympus IX-71 Inverted Microscope | |||
| Cell lines were maintained in DMEM + 10% FBS, with the expection of BT-474 and LNCaP cells, which were mantained in RPMI + 10% FBS. |
References
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