Introduction
Se establece que la motilidad de células de cáncer es predictivo de potencial metastásico, dado que tal comportamiento facilita la invasión a través de la membrana basal y la entrada en el sistema circulatorio 1. Mayoría de las investigaciones sobre la motilidad se ha centrado en cómo las células se comportan en un entorno de dos dimensiones (2D), a pesar de que se está ampliamente reconocido que el movimiento de las células en una matriz (3D) tridimensional es más representativo de cómo estas mismas células en realidad comportarse 2 in vivo. Sistemas de cultivo en 3D se utilizan cada vez más para estudiar comportamientos celulares que van desde la morfología celular, a la cinética de crecimiento y la sensibilidad de drogas 3. El deseo de supervisar la invasión de células de cáncer dentro del contexto de un entorno 3D ha llevado a la síntesis de las técnicas previamente establecidas que implican la generación de agregados de células 3D (esferoides) a través del método de cultivo gota colgante 4, seguido por la incorporación de estos esferoides en un extracelular 3D matriz (ECM) compuesto de colágeno y de la membrana basal materiales 5. Este método tiene por objeto mejorar en estas técnicas establecidas anteriormente proporcionando un método simplificado que se puede utilizar fácilmente para comparar invasión bajo una variedad de condiciones experimentales.
Más formas tradicionales para evaluar la motilidad celular in vitro son el ensayo de rayado de la herida y el ensayo transwell 6. El primero representa ensayo de la motilidad celular en un entorno 2D, y es por lo tanto independiente de una variedad de características críticas para la invasión in vivo, por ejemplo, actividad de la proteasa 7. El ensayo transwell puede invasión de células modelo mejor cuando los insertos así se recubren con sustratos de ECM, pero sólo un único parámetro, es decir, la aparición de células en la superficie de la membrana opuesta se mide, y muchos matices de la invasión de células por lo tanto no son fácilmente observables. En contraste con estas técnicas, el ensayo de invasión de esferoides de células del cáncer (Figura 1 </ strong>) permite la monitorización en tiempo real de la invasión de células en un entorno que no sólo es fisiológicamente relevante, sino que también permite que las características de la línea específica de células importantes para ser visualizados, como la migración de células individuales vs. colectiva 8. Este método también ofrece ventajas sobre los ensayos de crecimiento de cultivo 3D estándar. La generación de agregados celulares a través del método de la gota colgando limita inicialmente el movimiento celular, por lo que las células serán incentivados para invadir después de que se levantó esta restricción. Además, una vez que se levanta restricción, la salida de células procederá en una dirección uniforme que luego pueden ser convenientemente cuantificó.
Los materiales de ECM más populares utilizados para esferoides ensayos de células del cáncer son Matrigel y colágeno tipo I, en donde cada uno de estos componentes tiene un papel importante y distintas en influir en el comportamiento metastásico. Matrigel es una mezcla secreta de las proteínas producidas por las células del sarcoma Engelbreth-Holm Swarm ratón, y se enriquece en sótano ocupandoproteínas de membrana nt como laminina, entactina, y el colágeno tipo IV 9. Por esta razón Matrigel se denomina de aquí en adelante como "materiales de la membrana basal." Estos materiales proporcionan ligandos de la membrana basal esenciales necesarios para integrina adherencia durante la invasión de células de cáncer 10, además de muchas otras proteínas que ejercen una variedad de efectos sobre el comportamiento celular 11. En comparación, el colágeno tipo I, comúnmente preparada a partir de las digestiones ácidas de tendones y otras estructuras colágenas densas 12, es un material de matriz mucho más simple que sirve como un elemento estructural importante de los tejidos tejidos y estroma de sostén conectivos y órganos del cuerpo. Se ha demostrado que las características físicas de colágeno pueden regular una serie de características de la motilidad celular; por ejemplo, la alineación de las fibrillas de colágeno en la interfase tumor estromal permite las células cancerosas para migrar posteriormente a lo largo de las fibrillas al invadir el estroma 13 en. En el ensayo que aquí se presenta, tanto colágeno tipo I y los materiales de la membrana basal se utilizan como herramientas para estudiar el cáncer 3D interacciones célula-estroma.
El efecto de la inhibición o estimulación de las vías que controlan la invasión se puede controlar después de que las células se han incrustado en la matriz 3D. Las células pueden ser pretratadas durante el crecimiento en las gotas colgantes o después de la transferencia a la cultura 3D, dependiendo de si se requiere un tratamiento prolongado para modular la invasión. Para los tratamientos más cortos, se recomienda que el fármaco se mezcla con la suspensión esferoide después de la recogida, así como los medios de comunicación que rodeará los cultivos 3D, para facilitar la exposición adecuada al fármaco a las células. A continuación, las células normales o asociados a tumores estromales se pueden mezclar con el material de matriz para evaluar su papel en la modulación de invasión de células tumorales, o para determinar cómo el comportamiento celular influencias de señalización paracrina y autocrina. Esta idea se demostró en un estudio en el que el co-cultivo de la colsobre el cáncer y las células endoteliales en gotas colgantes conducido a una red vascular dentro de los esferoides 14. Finalmente, los componentes de ECM también pueden ser alterados, como la invasión de células de cáncer se ve afectado por diferentes sustratos 15. El método presentado a continuación será por lo tanto proporcionar un marco para evaluar la invasión de células de cáncer bajo una variedad de condiciones. En general se encontró que no todas las líneas celulares crearán esferoides en las gotas colgantes y líneas de células epiteliales de aspecto típicamente formar esferas regulares.
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Protocol
1. Generación de esferoides
- Preparar la suspensión de una sola célula para colgar culturas gota a separar los cultivos de células adherentes cáncer de ~ 70% de confluencia usando un lavado con PBS seguido de exposición a solución de tripsina-EDTA 0,05%.
- Neutralizar la solución de tripsina con medio de cultivo celular y contar las células usando una parte alícuota de la suspensión celular. Nota: El medio de cultivo celular específica dependerá de la línea celular se está probando. Siga ATCC recomendaciones de los medios, donde el medio de cultivo celular es típicamente DMEM + 10% FBS. Más información se puede encontrar en la Tabla de Materiales.
- Realizar una dilución para permitir la siembra de 500-1.000 células por 20 l gota de medio de cultivo celular.
- Adquirir placa de 10 cm y añadir 5 ml de PBS estéril hasta el fondo. Nota: Este paso protege el ahorcamiento cae de evaporación. Bajo costo "grado bacteriológicos" platos puede ser usado en lugar de platos de grado de cultivo de células, como las células no lo hará contactuar de la superficie de cultivo.
- Usar una pipeta multicanal para transferir 20 l gotitas de la suspensión celular diluida a la superficie interior de la tapa.
- Pipetear 40 gotas (5 filas de 8 gotas) en la tapa de la placa de 10 cm.
- Invierta la tapa y colocar en la placa de cultivo. Incubar los cultivos gota colgante a 37 ° C durante 72 horas para generar esferoides.
- Voltear la tapa de una manera segura, pero controlada. Nota: La inversión de la tapa demasiado rápido o demasiado lento puede hacer que las gotas se desplacen. Algunas líneas de células pueden formar esferoides en 48 horas o menos, mientras que otros pueden requerir más de 72 horas para producir agregados compactos.
2. Incorporación de esferoides en Matrix 3D
- Descongelar una alícuota del sótano materiales de membrana del factor de crecimiento reducido a 4 ° C durante la noche antes de la incorporación de los esferoides.
- Opcional: pozos de capa con ECM de antelación para evitar posibles interacciones esferoide con la cultu tejidovolver a emerger.
- Pipeta 200 l de ECM por pocillo en una placa de 24 pocillos.
- Inclinar la placa para asegurarse de que el ECM cubre toda la superficie del pocillo.
- Eliminar cuidadosamente el exceso de ECM con una pipeta.
- Incubar la placa hasta que los pocillos están secos: 3 hr a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C.
- Opcional: pozos de capa con ECM de antelación para evitar posibles interacciones esferoide con la cultu tejidovolver a emerger.
- Recoger los esferoides por la inclinación de la tapa de la placa de cultivo tisular y puesta en común de los medios de comunicación. La transferencia de los medios de comunicación con los esferoides en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Permitir 10 min para los esferoides para ubicarse en la parte inferior del tubo de microcentrífuga. Esferoides deben ser visibles a simple vista.
- Mezclar 100 l de los materiales de la membrana del sótano con 100 l de frío (4 ° C) de colágeno tipo I en un tubo de pre-enfriado por separado. Mantenga la mezcla a 4 ° C para prevenir ya sea en gel se solidifique antes de tiempo.
- Utilice puntas de pipeta pre-refrigerados si la transferencia de pequeños volúmenes.
- Dar cuidado almezclar el material de la membrana basal y el colágeno de tipo I, que impiden la formación de burbujas de aire. Nota: Las burbujas de aire pueden obstaculizar las imágenes más tarde en el protocolo si se incrustan en el gel.
- Aspirar los esferoides de la porción inferior 40 l de la tubo de microcentrífuga, y se combinan con el material de la membrana basal / colágeno tipo I mezcla. Tenga cuidado para evitar la formación de burbujas de aire cuando la mezcla. Nota: La solución que contiene de 100 l material de la membrana basal, 100 colágeno tipo l I, y 40 l de los esferoides crearé material suficiente para 4 culturas 3D independientes. Esto se puede escalar hacia arriba o hacia abajo.
- Pipetear 40 mu l gotas de la mezcla viscosa en los centros de los pozos en una placa de 24 pocillos. Mantenga el nivel de placa para evitar que la mezcla se ejecuta en el lado del pozo. Nota: Una sola columna de la placa de 24 pocillos - se recomienda para cada condición a ensayar - 4 pozos.
- Coloque la placa de intOA 37 ° C incubadora y dejar en reposo durante 30 min. La cultura 3D polimeriza durante este período.
- Lentamente sumergir las culturas 3D en 1 ml de medio de cultivo celular.
- Asegúrese de que los medios de comunicación es cálido al agregar que en los pocillos para promover aún más la polimerización del gel.
- PASO CRÍTICO: añadir con cuidado los medios de comunicación a las culturas 3D. Pipetear los medios de comunicación demasiado rápido en los pocillos puede dar lugar a la separación de las culturas 3D a partir de la superficie de cultivo de tejidos.
3. Seguimiento y análisis de esferoide Invasion
- Invasión de la imagen de los esferoides en la matriz 3D que rodea a los puntos de tiempo decidido por el investigador. Adquirir fotografías utilizando un microscopio invertido con la lente de objetivo de 20x. Nota: Los puntos de tiempo Ideal serán diferentes dependiendo de la línea celular que se está probando. Líneas celulares más invasivos comenzarán su egreso de los esferoides, poco después de la siembra y, por tanto, tomar fotografía inicials dentro de un par de horas después de la siembra. Generalmente, las fotografías se toman a 0 h (después de la siembra), las 24 horas, y 48 horas. Invasión normalmente concluye 24 a 48 horas después de la siembra.
- Cuantificar la capacidad invasiva utilizando el software de análisis de imagen como imagen J.
- Analizar la invasión como la distancia celular desde el borde del esferoide.
- Utilice la herramienta Draw recta para marcar el radio y / o la distancia invasivo máxima.
- Haga clic en "Analizar" en el menú superior y haga clic en "Medir" para mostrar la medición de longitud.
- Analizar la invasión como la zona invasivo totales fuera del esferoide.
- Utilice la herramienta de dibujo a mano alzada para trazar la frontera del esferoide y / o área invasivo totales.
- Haga clic en "Analizar" en el menú superior y haga clic en "Medir" para mostrar la medición de área.
- Use un plugin como herramientas del Administrador de retorno de la inversión para crear mediciones para una pila de imágenes.
- Analizar la invasión como la distancia celular desde el borde del esferoide.
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Representative Results
Usando el ensayo de invasión esferoide (Figura 1), un panel de líneas celulares de cáncer se ensayó para determinar su capacidad para formar esferoides, así como para la cantidad de egreso celular exhibido después de la implantación en una matriz 3D que consiste en materiales membrana basal y colágeno tipo I (Tabla 1). Estos resultados demuestran que no todas las línea celular de cáncer creará esferoides bien formadas, donde las líneas celulares que poseen una morfología epitelial in vitro tendían a producir agregados regulares y lisas. La capacidad de diferentes líneas de células para invadir en el ensayo también fue variable. Las líneas celulares que se establecen como invasivo como 4T1, E0771, y U-87 MG mostraron un alto grado de egreso esferoide en el ensayo. Líneas celulares menos agresivos, como el MCF-7, BT474, y MCF10DICS.com no invaden, como se había previsto. Inesperado, sin embargo, fue la falta de invasión mostrada por A-431 y COLO 357 células PL. Un ejemplo de los datos para algunos de estoslíneas se muestra (Figura 2). Para 4T1 y E0771 células, la invasión ya se pronunció 24 horas después de la incorporación de los esferoides en la matriz en 3D y, por U-87 MG, la invasión se inició inmediatamente después de la implantación en la matriz.
La evaluación cualitativa de la invasión celular puede ser apoyado además por la cuantificación en el software de análisis de imagen. Dos estrategias diferentes para cuantificar la extensión de la invasión se incluyen (Figura 3), y la estrategia seleccionada depende del tipo de la invasión testigo. En ImageJ, distancia invasivo o área invasiva se demarcaron primero usando la herramienta de extracción del software, después de lo cual los valores comparativos se generan como mediciones de píxeles. Imágenes de microscopía se pueden importar como una pila para permitir la adquisición de datos más eficientes, pero, si al hacerlo, se recomienda un plugin como Herramientas del Gestor de ROI para facilitar la medición eficiente.
| Línea celular | Tipo de cáncer | Esfera-Formación de Capacidad | Ensayo de invasión | |
| 4T1 | Mamario | Ratón | +++ | ++ |
| A-431 | Epidermoide | Humano | +++ | - |
| BT-474 | Pecho | Humano | ++ | - |
| COLO 357 PL | Páncreas | Humano | ++ | - |
| E0771 | Mamario | Ratón | +++ | +++ |
| LNCaP | Próstata | Humano | + | - |
| MCF-7 | Pecho | Humano | +++ | - |
| MCF10DCIS.com | Pecho | Humano | ++ | - |
| MDA-MB-231 | Pecho | Humano | - | ? |
| PANC-1 | Páncreas | Humano | + | ++ |
| PC-3 | Próstata | Humano | - | ? |
| SK-BR-3 | Pecho | Humano | - | ? |
| U-87 MG | Glioblastoma | Humano | +++ | +++ |
Tabla 1:. Esfera-formación y la invasión de las diferentes líneas celulares Las líneas celulares ensayadas se califican de acuerdo a su capacidad y la invasión de formación de esferas.
Figura 1:. Visual flujo de trabajo del ensayo de invasión esferoide esferoides son generadas en gotas de medios de comunicación que cuelgan de la tapa de una placa de cultivo tisular de 72 hr. A continuación, las gotas se reúnen, y los esferoides son transf errado a un 4 ° C la mezcla de materiales de la membrana basal y colágeno tipo I. Después de la resuspensión esferoide, la mezcla viscosa se pipetean en los pocillos de una placa de 24 pocillos, después de lo cual se le da 30 minutos a 37 ° C para solidificar en una cultura en 3D. Medios cálidos se añade entonces a los pocillos. La salida de la célula a partir de los esferoides se controla luego con el tiempo.
Figura 2:. Ejemplo de datos de ensayo El 4T1, E0771, y U-87 células MG muestran invasión de los esferoides mientras que la A-431 y MCF-7 células no. La invasión de las células U-87 es más pronunciado después de 24 hr, mientras que la invasión máxima por las células 4T1 y E0771 se produce más tarde. Para el E0771 más invasivo y U-87 líneas celulares mg, egreso celda aparece para compensar el aumento en el tamaño observado de otra forma esferoide con las líneas menos invasivos. Barra de escala, 200 micras.om / archivos / ftp_upload / 53409 / 53409fig2large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3:. La cuantificación de la invasión Invasion se puede cuantificar mediante análisis de imagen, por ejemplo, utilizando software Image J. (a) Cálculo de la invasión como una función de la distancia más larga invasivo que emana del esferoide. (b) El área total invadida por células que salen del esferoide. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este estudio evaluó el rendimiento de un panel de líneas celulares de cáncer en un ensayo de invasión esferoide (Tabla 1). En general, nos encontramos con que la formación de esferoides es mayor en los más líneas de células epiteliales de aspecto, donde la presencia de uniones célula-célula promueve la formación de una arquitectura esferoide similar. Líneas celulares conocidos que se han sometido a una transición epitelial-mesenquimal, como MDA-MB-231 células no forman esferoides en el cultivo gota colgante más probable debido a su reducida E-, N- y P-cadherina expresión 16.
Algunos de los pasos en el ensayo de invasión esferoide requieren cerca de adhesión al protocolo. Es absolutamente fundamental para trabajar con rapidez al pipetear la mezcla de la membrana basal y el colágeno, y es crucial que se tiene la mezcla de cerca de 4 ° C durante el trabajo, ya que comenzará a solidificar a temperatura ambiente. Además, las preparaciones de colágeno solubles son ácidos, y se inducen a gel por el Addition de una pequeña cantidad de hidróxido de sodio y la sal, seguido por calentamiento a 37 ° C. En nuestras manos, simplemente mezclando volúmenes iguales de colágeno con los materiales de la membrana basal hace que sea competente a-gel calentando porque el componente de la membrana basal es capaz de neutralizar el colágeno. Si proporciones más pequeñas de la membrana basal: se han previsto colágeno, el colágeno debe ser neutralizado antes de añadir la mezcla de la membrana basal para facilitar la polimerización. Una vez formada, la mayoría de los esferoides son resistentes a la disociación y sobrevivirán resuspensión en esta mezcla viscosa que comprenderá la cultura 3D. Durante las etapas de resuspensión, también se debe ejercer cuidado para restringir la formación de burbujas de aire, ya que estos pueden obstaculizar formación de imágenes. Cuando la adición de medios de cultivo a los pocillos después de la gel se ha solidificado, es importante que uno pipetas lentamente para evitar los cultivos 3D se separe del plato.
La salida de las células de cáncer en la matriz 3D circundante es generally correlacionada con la capacidad invasiva de las líneas, donde el E0771 y U-87 MG células demostraron la mayor invasión en el panel de líneas celulares examinados aquí (Figura 2). Curiosamente, estas dos líneas también muestran diferentes modos de invasión. Considerando que las células E0771 invaden de manera gradual y colectiva, las células MG U-87 muestran la salida individual y rápida de los esferoides. Así pues, el ensayo de invasión esferoide permite comparar los diferentes modos utilizados por las líneas de invadir el sustrato.
Diferentes métodos de análisis de la invasión se presentan en la Figura 3 y la manera preferida de análisis pueden depender de la modalidad de la invasión. Independientemente del tipo de análisis empleado, este ensayo fue diseñado para permitir la rápida cuantificación de la invasión de un gran número de esferoides. La puesta en común de esferoides en una mezcla de cultivo 3D y, a continuación alícuotas de esta mezcla para crear 4 cultivos replicados independientes, conduce a la establishment de múltiples esferoides que se puede controlar para que una determinada condición experimental (Figura 1). El ensayo es, por tanto, fácilmente modificable para la comparación estadística debido al gran potencial "n", y el fenotipo compartida por esferoides del mismo tipo parece exhibir una variabilidad mínima. Tenga en cuenta que las líneas celulares menos agresivas como las células BT-474 y MCFDCIS forman esferas lisas, compactas que tienen un tamaño mucho menor que las líneas más agresivas. Como consecuencia, durante la siembra de células inicial en las gotas colgantes, el número de células de partida tiene que ser ajustada en consecuencia.
Algunas líneas de células metastásicas realizaron en contra de nuestras expectativas y no mostraron un comportamiento invasor en este ensayo. Los ejemplos notables incluyen el las células COLO 357 PL A-431 y. Es posible que la falta de invasión mostrada por estas líneas se debe al tipo de sustrato ECM que los esferoides se incrustan en. De hecho, otros han demostrado que compañero de membrana basalriales (por ejemplo Matrigel) y colágeno pueden tener efectos dispares en la invasión de las células 17 tal vez debido a las diferentes necesidades de metaloproteasas de matriz para la migración 18. Por lo tanto, ajustar la proporción de colágeno: los materiales de la membrana basal es otra forma de modificar los resultados de ensayo, donde la reducción de la componente de material de membrana basal a un tercio de la mezcla total, de tal modo que permite un aumento en la cantidad de colágeno, podría mejorar aún más la invasión de algunos tipos de células. Esta idea se ejemplifica en un estudio reciente que encontró una correlación positiva entre la capacidad invasiva de organoides mamarias y el número de colágeno de tipo I fibrillas presente, donde la formación de fibrillas de colágeno fue promovida mediante la ampliación del 4 ° período de C preincubación de pH neutralizado colágeno 19.
El descubrimiento de que algunas líneas celulares actuaron contrariamente a lo esperado muestra algunas de las limitaciones de este ensayo. Aunque la invasión de células de cáncer de monitoreo a cabo ofa esferoide en una mezcla 3D que consiste en materiales de colágeno de la membrana basal y es fisiológicamente más relevante que un ensayo de la motilidad 2D, todavía es un sistema modelo que omite algunas complejidades biológicos que se encuentran de otra forma in vivo. Por ejemplo, la capacidad metastásica puede ser modulada por los distintos microambientes que apoyan el crecimiento del tumor ectópico vs. ortotópico 20 y, como tal, es importante reconocer que una variedad de factores estromales puede influir profundamente en el proceso metastásico. Algunos de estos factores están ausentes en el ensayo de invasión que se presenta aquí y podría explicar algunas de las inconsistencias observadas.
En resumen, el ensayo de invasión de esferoides de células de cáncer que aquí se presenta proporciona un marco flexible para el seguimiento de invasión en un entorno biológicamente relevante, es compatible con el descubrimiento de los mecanismos de invasión de células, y potencialmente puede ayudar en el desarrollo de terapias anti-metastáticos novedosos.
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Acknowledgments
Apoyado por el NIH subvenciones CA051008 P30 y T32 CA009686 (ATR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel Growth Factor Reduced | Corning | CB-40234 | |
| Collagen Type I, Rat Tail, 100 mg | Millipore | 08-115 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | |
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11875-093 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-12 | |
| 100 mm TC-treated Dishes | Corning Incorporated | 430167 | |
| 24-well TC-treated Plates | NEST Biotechnlology | 702001 | |
| Olympus IX-71 Inverted Microscope | |||
| Cell lines were maintained in DMEM + 10% FBS, with the expection of BT-474 and LNCaP cells, which were mantained in RPMI + 10% FBS. |
References
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