Introduction
Det är klarlagt att cancer cellmotilitet är prediktiva för metastatisk potential, med tanke på att ett sådant beteende underlättar invasion genom basalmembranet och inträde i cirkulationssystemet 1. Den mesta forskningen om rörlighet har fokuserat på hur celler beter sig i en tvådimensionell miljö (2D), men det håller på att bli allmänt erkänt att förflyttning av celler i ett tredimensionellt (3D) matrisen är mer representativ för hur dessa samma celler kommer faktiskt beter sig in vivo 2. 3D kultursystem används alltmer för att studera cellulära beteenden som sträcker sig från cell morfologi, till tillväxt kinetik och läkemedelskänslighet 3. Önskan att övervaka cancercellinvasion inom ramen för en 3D-miljö har lett till syntesen av tidigare etablerade tekniker involverar genereringen av 3D-cellaggregat (sfäroider) via droppe odlingsmetod 4, följt av inbäddning dessa sfäroider till en 3D extracellulär matris (ECM) bestående av kollagen och basalmembranmaterial 5. Denna metod syftar till att förbättra dessa tidigare etablerade tekniker genom att tillhandahålla en rationell metod som lätt kan användas för att jämföra invasion under olika experimentella betingelser.
Mer traditionella sätt att bedöma cellmotiliteten in vitro är scratch lindade analys och transwell analysen 6. Den tidigare analysen visar cellmotiliteten i en 2D-miljö, och är därför oberoende av en mängd funktioner som är kritiska för in vivo invasion, t.ex. proteasaktivitet 7. Den transwell analys kan bättre modell cellinvasion när brunns skären är belagda med ECM substrat men, endast en enda parameter, dvs utseendet på celler på den motsatta membranytan mätes, och många nyanser av cellinvasion är således inte direkt kan observeras. I motsats till dessa tekniker, cancercellen sfäroid invasion analys (Figur 1 </ strong>) gör det möjligt att i realtid övervaka cellinvasion i en miljö som inte bara är fysiologiskt relevant, men tillåter också viktiga celllinjespecifika funktioner som ska visualiseras, såsom individuella kontra kollektiva cellvandring 8. Denna metod ger också fördelar jämfört med vanliga 3D kultur tillväxtanalyser. Genereringen av cellulära aggregat via hängande droppmetoden begränsar initialt cellrörelse, så att celler ska stimuleras att invadera efter denna begränsning lyfts. Dessutom, när denna begränsning lyfts, kommer cell avstigning fortsätta på ett enhetligt riktning som sedan kan enkelt kvantifieras.
De mest populära ECM material som används för cancercell sfäroider analyser är Matrigel och typ I-kollagen, där var och en av dessa komponenter har viktiga och tydliga roller i att påverka metastaserande beteende. Matrigel är en utsöndrade blandning av proteiner som produceras av Engelbreth-Holm Swarm mus sarkomceller, och anrikas i basement membranproteiner såsom laminin, entaktin och kollagen typ IV 9. Av denna anledning Matrigel är hädanefter kallad "basalmembranmaterial." Dessa källarmembranmaterial ger viktiga ligander behövs för grin vidhäftning under cancercellinvasion 10 förutom många andra proteiner som utövar en rad effekter på cellens beteende 11. I jämförelse, typ I-kollagen, som vanligen framställas från syra klyvningar av senor och andra täta kollagen strukturer 12, är en mycket enklare matrismaterial som fungerar som ett viktigt strukturelement av bindväv och stroma stödjande vävnader och organ i kroppen. Det har visats att de fysiska egenskaperna hos kollagen kan reglera ett antal funktioner för cellmotilitet; exempelvis anpassningen av kollagenfibriller vid tumör-stromala gränssnitt tillåter cancercellerna att därefter migrerar längs dessa fibriller när invaderar in i stroman 13. I analysen presenteras här, både typ I-kollagen och basalmembranmaterial används som verktyg för att studera 3D cancercell stroma interaktioner.
Effekten av inhibering eller stimulering av reaktionsvägar som kontrollerar invasionen kan övervakas efter det att cellerna har inbäddade i 3D-matris. Celler kan förbehandlas under tillväxt i de hängande dropparna eller vid överföring till 3D kultur, beroende på om en lång behandling kommer att krävas för att modulera invasionen. För kortare behandlingar, rekommenderas att läkemedlet blandas med sfäroid suspensionen efter samling, liksom den media som kommer att omge de 3D-kulturer, för att underlätta adekvat läkemedelsexponering till cellerna. Därefter kan normala eller tumörassocierade stromaceller blandas med matrismaterialet för att utvärdera deras roll vid modulering av tumörcellinvasion, eller för att fastställa hur parakrin och autokrin signalerings påverkar cellbeteende. Denna idé visades i en studie där samodling av colom cancer och endotelceller i hängande droppar ledde till en vaskulär nätverk inom sfäroiderna 14. Slutligen kan ECM beståndsdelarna också ändras, eftersom cancercellinvasion påverkas av olika substrat 15. Den metod som presenteras nedan kommer således att ge en ram för att bedöma cancercellinvasion under olika förhållanden. I allmänhet konstaterades att inte alla cellinjer skapar spheroids i hängande droppar och epitelceller proffsiga cellinjer bildar typiskt regelbundna sfärer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Framställning av Sfäroider
- Förbered encelliga suspension för hängande droppe kulturer genom att lossa vidhäftande cancercellodlingar av ~ 70% konfluens med användning av en PBS Tvätt följt av exponering för 0,05% trypsin-EDTA-lösning.
- Neutralisera trypsinlösning med cellodlingsmedium och räkna cellerna med hjälp av en alikvot av cellsuspensionen. Obs: Den specifika cellodlingsmedia kommer att bero på cellinjen som testas. Följ ATCC medie rekommendationer, där cellodlingsmediet är typiskt DMEM + 10% FBS. Mer information finns i Material tabell.
- Utför en utspädning för att medge ympning av 500-1000 celler per 20 | il droppe av cellodlingsmedier.
- Förvärva 10 cm skål och tillsätt 5 ml steril PBS till botten. Obs: Detta steg skyddar hängande sjunker från avdunstning. Lägre kostnad "bakteriologiska grade" rätter kan användas i stället för cellodlingskvalitet rätter, som celler kommer inte fortsagera odlingsytan.
- Använd en flerkanalig pipett för att överföra 20 | il droppar av den utspädda cellsuspensionen till den inre ytan av locket.
- Pipettera 40 droppar (5 rader med 8 droppar) på locket av 10 cm skål.
- Vänd locket och placera över odlingsskålen. Inkubera hängande droppe kulturer vid 37 ° C under 72 timmar för att generera sfärer.
- Vänd locket i en självsäker, men kontrollerat sätt. Notera: Invertering locket för snabbt eller för långsamt kan orsaka dropparna att skifta. Vissa cellinjer kan bilda sfäroider i 48 timmar eller mindre, medan andra kan kräva mer än 72 timmar för att producera kompakta aggregat.
2. Inbäddning av Sfäroider till 3D Matrix
- Tina en alikvot av tillväxtfaktor reducerad basalmembranmaterial vid 4 ° C över natten innan inbäddning sfäroiderna.
- Tillval: Layer brunnarna med ECM i förväg för att undvika potentiell sfäroid interaktion med vävnaden Culture yta.
- Pipettera 200 | il ECM per brunn på en 24-brunnsplatta.
- Vippa plattan för att säkerställa att ECM täcker hela brunnens yta.
- Avlägsna noga överskotts ECM med en pipett.
- Inkubera plattan tills brunnarna är torra: 3 h vid rumstemperatur eller över natten vid 4 ° C.
- Tillval: Layer brunnarna med ECM i förväg för att undvika potentiell sfäroid interaktion med vävnaden Culture yta.
- Samla sfäroiderna genom att luta locket på vävnadsodlingsplatta och samla media. Överför media med sfäroiderna i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Tillåt 10 min för sfäroiderna sedimentera på botten av mikrocentrifugrör. Sfäroider bör vara synliga med blotta ögat.
- Blanda 100 pl av källaren membranmaterial med 100 pl av kall (4 ° C) typ I-kollagen i en separat för-kylda rör. Håll blandningen vid 4 ° C för att förhindra antingen gelén från att stelna i förtid.
- Använd pre-kylda pipettspetsar om överföring av små volymer.
- Ge försiktig närblandning av den basalmembranmaterial och kollagen typ I för att förhindra luftbubbelbildning. Obs: Luftbubblor kan hindra avbildning senare i protokollet om de blir inbäddade i gelén.
- Aspirera sfäroiderna från 40 ^ bottendelen av mikrocentrifugrör, och kombinera med basalmembranmaterial / typ I kollagen blandning. Var noga med att förhindra att luft bubbelbildning vid blandning. Anmärkning: Lösningen innehållande av 100 | il basalmembranmaterial, 100 pl kollagen typ I, och 40 | il av sfäroiderna kommer att skapa tillräckligt med material för 4 oberoende 3D kulturer. Detta kan skalas upp eller ner.
- Pipettera 40 | il droppar av den viskösa blandningen i centra brunnarna på en 24-brunnsplatta. Håll plattan nivå för att förhindra blandningen från att rinna in i sidan av brunnen. Obs: En enda kolumn på 24-brunnar - 4 brunnar - rekommenderas för varje tillstånd som skall testas.
- Placera plattan intoa 37 ° C inkubator och lämna ostört under 30 minuter. 3D kultur kommer att polymerisera under denna period.
- Långsamt dränka 3D kulturerna i 1 ml cellodlingsmedia.
- Se till att media är varmt när du lägger den i brunnarna för att ytterligare främja gelpolymerisation.
- Avgörande steg: försiktigt lägga till media till 3D-kulturer. Pipettering media för snabbt i brunnarna kan leda till lösgöring av de 3D-kulturer från vävnadsodlingsytan.
3. Övervakning och analysera Spheroid Invasion
- Bild invasion från sfäroiderna i den omgivande 3D-matrisen vid tidpunkter som beslutas av utredaren. Förvärva fotografier med ett inverterat mikroskop med 20x objektiv. Obs: Ideal tidpunkter kommer att variera beroende på cellinje som testas. Mer invasiva cellinjer kommer att börja sitt utträde från sfäroiderna strax efter plätering och därmed ta första bildens inom ett par timmar efter plätering. Generellt är fotografier tagna vid 0 timmar (efter plätering), 24 timmar och 48 timmar. Invasion avslutar typiskt 24-48 timmar efter plätering.
- Kvantifiera invasiv förmåga att använda bildanalys programvara som Image J.
- Analysera invasion som cell avstånd från kanten av sfäroid.
- Använd stegdrag verktyget för att markera radien och / eller maximal invasiv avstånd.
- Klicka på "Analysera" i toppmenyn, och klicka sedan på "Measure" för att visa mätningen längd.
- Analysera invasion som den totala invasiva området utanför sfäroid.
- Använd Freehand Draw verktyg för att spåra gränsen sfäroiden och / eller total invasiv område.
- Klicka på "Analysera" i toppmenyn, och klicka sedan på "Measure" för att visa mätområdet.
- Använd en plugin som ROI chef Verktyg för att skapa mätningar för en bunt bilder.
- Analysera invasion som cell avstånd från kanten av sfäroid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Använda sfäroid invasionsanalys (figur 1), en panel av cancercellinjer testades med avseende på deras förmåga att bilda sfäroider, liksom för mängden cell avstigning uppvisade efter implantering i en 3D matris bestående av basalmembranmaterial och typ I-kollagen (Tabell 1). Dessa resultat visar att inte alla cancercell linjen kommer att skapa välformulerade sfäroider, där cellinjer som har en epitelial morfologi in vitro tenderade att regelbundet och jämna aggregat. Förmågan hos olika cellinjer att invadera i analysen var också variabel. Cellinjer som är etablerade som att invasiva som 4T1, E0771, och U-87 MG uppvisade en hög grad av sfäroid avstigning i analysen. Mindre aggressiva cellinjer, som MCF-7, BT474, och MCF10DICS.com inte invadera, som var väntat. Oväntat, var dock bristen på invasion visas av A-431 och COLO 357 PL-celler. Ett exempel på uppgifter för vissa av dessalinjer visas (Figur 2). För 4T1 och E0771 celler, invasion redan uttalad 24 timmar efter inbäddning sfäroiderna i 3D matrisen och för U-87 MG, invasion började direkt efter implantation i matrisen.
Den kvalitativ bedömning av cellulär invasion kan understödjas ytterligare genom kvantifiering inom bildanalys mjukvara. Två olika strategier för att kvantifiera omfattningen av invasionen ingår (Figur 3), och den strategi som valts beror på vilken typ av invasionen bevittnat. I ImageJ är invasiv avstånd eller invasiva området först avgränsas med hjälp av programvarans dragverktyg, varefter jämförelsevärden genereras som mätningar pixel. Mikroskopi bilder kan importeras som en bunt för att möjliggöra effektivare datainsamling, men om att göra så, är en plugin som ROI chef verktyg rekommenderas för att underlätta en effektiv mätning.
| Cellinje | Cancertyper | Sphere-bildande förmåga | Analys invasion | |
| 4T1 | Bröst | Mus | +++ | ++ |
| A-431 | Epidermoid | Mänsklig | +++ | - |
| BT-474 | Bröst | Mänsklig | ++ | - |
| COLO 357 PL | Pankreas | Mänsklig | ++ | - |
| E0771 | Bröst | Mus | +++ | +++ |
| LNCaP | Prostata | Mänsklig | + | - |
| MCF-7 | Bröst | Mänsklig | +++ | - |
| MCF10DCIS.com | Bröst | Mänsklig | ++ | - |
| MDA-MB-231 | Bröst | Mänsklig | - | ? |
| PANC-1 | Pankreas | Mänsklig | + | ++ |
| PC-3 | Prostata | Mänsklig | - | ? |
| SK-BR-3 | Bröst | Mänsklig | - | ? |
| U-87 MG | Glioblastom | Mänsklig | +++ | +++ |
Tabell 1:. Sphere bildning och invasion av olika cellinjer testade cellinjer poängsätts enligt deras sfär bildande förmåga och invasion.
Figur 1:. Visuell arbetsflöde av sfäroid invasionsanalys Sfäroider genereras i droppar av medier som hänger från locket av en vävnadskulturskål för 72 timmar. Därefter dropparna samman, och sfäroiderna är transf gjorde fel till en 4 ° C blandning av basalmembranmaterial och typ I kollagen. Efter sfäroid återsuspension, är den viskösa blandningen pipetterades i brunnarna i en 24-brunnsplatta, varefter den ges 30 minuter vid 37 ° C för att stelna till en 3D kultur. Varma medier tillsätts sedan till brunnarna. Cell utträde ur sfäroiderna sedan övervakas under tiden.
Figur 2:. Exempel på analysuppgifter 4T1, E0771, och U-87 MG-celler visar invasion från sfäroiderna, medan A-431 och MCF-7-celler inte gör det. Invasion av U-87-celler är mest uttalad efter 24 timmar, medan maximal invasion av 4T1 och E0771 celler inträffar senare. För de mest invasiva E0771 och U-87 MG-cellinjer, verkar cell avstigning för att kompensera ökningen av sfäroid storlek annars observeras med mindre invasiva linjer. Skal, 200 | j, m.om / filer / ftp_upload / 53409 / 53409fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3:. Kvantifiering av invasions Invasion kan kvantifieras genom bildanalys, till exempel med hjälp av Image J programvara. (a) Beräkning av invasion som en funktion av den längsta invasiv avstånd emanerar från sfäroid. (b) Total areal invaderas av celler lämnar sfäroid. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna studie utvärderade en panel av cancercellinjer i en sfäroid invasion analys (tabell 1). Generellt finner vi att sfäroid formation förstärks i de mer epitelceller proffsiga cellinjer, där närvaron av cell-cell junctions främjar bildandet av en sfäroid liknande arkitektur. Kända cellinjer som har genomgått ett epitelial-mesenkymala omvandlingar såsom MDA-MB-231-celler inte bildar sfäroider i droppe kultur mest sannolikt på grund av deras reducerade E-, N-, och P-cadherin expression 16.
Några av stegen i sfäroid invasionen analysen kräver ett nära anslutning till protokollet. Det är helt avgörande att arbeta snabbt när pipetbasalmembranet och kollagen blandning, och det är viktigt att man håller blandningen nära 4 ° C medan du arbetar eftersom det kommer att börja stelna vid rumstemperatur. Även lösliga kollagenpreparat är sura, och induceras till gel av additjonen av en liten mängd natriumhydroxid och salt, följt av uppvärmning till 37 ° C. I våra händer, att helt enkelt blanda lika stora volymer av kollagen med basalmembranmaterial gör det gelinnehållande behöriga vid uppvärmning eftersom basalmembranet komponent förmår neutralisera kollagenet. Om mindre förhållanden av basalmembranet: kollagen är planerade, bör kollagenet neutraliseras före tillsats av basalmembranblandningen för att underlätta polymerisation. När bildas, de flesta sfäroider är resistenta mot dissociation och kommer att överleva resuspension i denna viskösa blandning som kommer att innefatta den 3D kulturen. Under resuspension steg, måste en också utöva försiktighet för att begränsa bildandet av luftbubblor, eftersom dessa kan hindra avbildning. När tillsats odlingsmedier till brunnarna efter gelén har stelnat, är det viktigt att en pipetter långsamt för att förhindra att 3D-kulturer från att lossna från skålen.
Utträde av cancerceller in i den omgivande 3D matrisen är generally korrelerad med den invasiva förmågan hos linjerna, där E0771 och U-87 MG-celler demonstrerade den mest invasionen i panelen av cellinjer som undersöktes här (figur 2). Intressant nog dessa två linjer uppvisar även olika typer av invasionen. Medan E0771 cellerna invaderar gradvis och kollektivt sätt, U-87 MG-celler visar individuell och snabb exit från sfäroiderna. Sfäroiddiametern invasionen analysen möjliggör således en att jämföra de olika lägena som används av linjer för att invadera substratet.
Olika metoder för att analysera invasion presenteras i figur 3 och den föredragna sättet för analys kan bero på sättet invasionen. Oavsett vilken typ av analys som används, var detta analys utformad för att möjliggöra en snabb kvantifiering av invasion av ett stort antal sfäroider. Sammanslagningen av sfäroider i en 3D-odlingsblandningen, och därefter alikvotering denna blandning för att skapa 4 oberoende replikatodlingar, leder till establishment av multipla sfäroider som kan övervakas för en given experimentell betingelse (Figur 1). Analysen är därmed lätt kan ändras till statistisk jämförelse grund av den stora potential "n", och fenotypen delas av sfäroider av samma typ tycks uppvisa minimal variabilitet. Observera att mindre aggressiva cellinjer som BT-474 och MCFDCIS celler bildar släta, kompakta sfärer som har en mycket mindre storlek än mer aggressiva linjer. Som en konsekvens, under den initiala cellsådd i de hängande dropparna, behöver justeras i enlighet därmed utgångscellantalet.
Vissa metastatiska cellinjer utförs mot våra förväntningar och inte uppvisar invasiva beteende i denna analys. Noterbara exempel inkluderar A-431 och COLO 357 PL-celler. Det är möjligt att avsaknaden av invasionen visas av dessa linjer beror på den typ av ECM substrat som sfäroiderna var inbäddade i. I själva verket har andra visat att basalmembran kompisrial (t.ex. Matrigel) och kollagen kan ha skilda effekter på invasionen av celler 17 kanske på grund av olika matrismetalloproteas krav för migration 18. Således, finjusterar förhållandet av kollagen: basalmembranmaterial är ett annat sätt att modifiera analysresultat, där reducering av basalmembranmaterialkomponenten till tredjedel av den totala blandningen, vilket möjliggör en ökning av mängden kollagen, kunde ytterligare förbättra invasion av vissa celltyper. Denna idé exemplifieras i en färsk studie som fann en positiv korrelation mellan den invasiva förmågan hos bröst organoids och antalet typ I-kollagen fibriller närvarande, där kollagen fibrillbildning främjades genom att förlänga 4 ° C förinkubationsperiod pH neutraliserade kollagen 19.
Upptäckten att vissa cellinjer handlat mot förmodan visar några av begränsningarna med denna analys. Även om övervakning cancercellinvasion ut ofa sfäroiden till en 3D-blandning bestående av kollagen och basalmembranmaterial är mer fysiologiskt relevant än en 2D-motilitet analys är det fortfarande ett modellsystem som utelämnar vissa biologiska komplexiteten i övrigt finns i vivo. Till exempel kan metastaserande förmåga moduleras genom de olika mikromiljöer som stöder orthotopic vs. ektopisk tumörtillväxt 20 och som sådan, är det viktigt att erkänna att en mängd stromala faktorer djupt kan påverka metastaserande process. Ett antal av dessa faktorer är frånvarande i analys invasionen presenteras här och kan förklara några av de observerade inkonsekvenser.
Sammanfattningsvis, cancercellen analysen sfäroid invasion presenteras här ger en flexibel ram för övervakning av invasion i en biologiskt relevant inställning stöder upptäckten av mekanismer för cellinvasion, och kan potentiellt stöd i utvecklingen av nya anti-metastaserande behandlingar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Med stöd av NIH bidrag P30 CA051008 och T32 CA009686 (ATR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel Growth Factor Reduced | Corning | CB-40234 | |
| Collagen Type I, Rat Tail, 100 mg | Millipore | 08-115 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | |
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11875-093 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-12 | |
| 100 mm TC-treated Dishes | Corning Incorporated | 430167 | |
| 24-well TC-treated Plates | NEST Biotechnlology | 702001 | |
| Olympus IX-71 Inverted Microscope | |||
| Cell lines were maintained in DMEM + 10% FBS, with the expection of BT-474 and LNCaP cells, which were mantained in RPMI + 10% FBS. |
References
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Metastasis: Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev. Cancer. 2 (8), (2002).
- Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. J Cell Sci. 116 (12), 2377-2388 (2003).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), (2007).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J Vis Exp. 51, (2011).
- Del Duca,, Werbowetski, D., T,, Del Maestro,, F, R. Spheroid preparation from hanging drops: characterization of a model of brain tumor invasion. J Neuro-Oncol. 67 (3), (2004).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. J Vis Exp. 88, (2014).
- Ramos-DeSimone, N., Hahn-Dantona, E., Sipley, J., Nagase, H., French, D. L., Quigley, J. P. Activation of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) via a converging plasmin/stromelysin-1 cascade enhances tumor cell invasion. J Bio Chem. 274 (19), Forthcoming.
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Rev. Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: Basement membrane matrix with biological activity. Semin Cancer Biol. 15 (5), 378-386 (2005).
- Shaw, L. M., Chao, C., Wewer, U. M., Mercurio, A. M. Function of the integrin α6β1 in metastatic breast carcinoma cells assessed by expression of a dominant-negative receptor. Cancer Res. 56 (5), 959-963 (1996).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), (2010).
- Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. -F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat Protoc. 1 (6), (2006).
- Provenzano, P. P., Eliceiri, K. W., Campbell, J. M. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4 (1), (2006).
- Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Methods Mol Med. 140, 141-151 (2007).
- Brenner, W., Groß, S., Steinbach, F., Horn, S., Hohenfellner, R., Thüroff, J. W. Differential inhibition of renal cancer cell invasion mediated by fibronectin, collagen IV and laminin. Cancer Lett. 155, 199-205 (2000).
- Nieman, M. T., Prudoff, R. S., Johnson, K. R., Wheelock, M. J. N-cadherin promotes motility in human breast cancer cells regardless of their E-cadherin expression. J Cell Biol. 147 (3), Forthcoming.
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), (2013).
- Sodek, K. L., Brown, T. J., Ringuette, M. J. Collagen I but not Matrigel matrices provide an MMP-dependent barrier to ovarian cancer cell penetration. BMC Cancer. 8 (1), 223-2210 (2008).
- Nguyen-Ngoc, K. V., Ewald, A. J. Mammary ductal elongation and myoepithelial migration are regulated by the composition of the extracellular matrix. J Microsc. 251 (3), 212-223 (2013).
- Glinskii, A. B., Smith, B. A., Jiang, P., Li, X., Yang, M., Hoffman, R. M., Glinsky, G. V. Viable circulating metastatic cells produced in orthotopic but not ectopic prostate cancer models. Cancer Res. 63 (14), 4239-4243 (2003).
