Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Bir Kanseri Hücre Sfero Testi 3D ortamda Invasion Değerlendirmek için

Published: November 20, 2015 doi: 10.3791/53409

Introduction

Kanser hücre hareketi gibi davranışlar dolaşım sistemi 1 içine bazal membran ve giriş yoluyla işgali kolaylaştırır göz önüne alındığında, metastatik potansiyelin belirleyici olduğu bilinmektedir. Motilite üzerinde en çok araştırma yaygın bir üç boyutlu (3D) matris içinde hücrelerin hareketi olacak aslında nasıl bu aynı hücrelerin daha fazla temsilcisi olduğunu olma yolunda hızla ilerliyor olsa hücreler, iki boyutlu (2D) ayarında nasıl davrandığını odaklanmıştır vivo 2 davranır. 3D kültür sistemleri giderek büyüme kinetikleri ve ilaç duyarlılık 3, hücre morfolojisi değişir hücresel davranışları incelemek için kullanılır. 3D ortamın kapsamında kanser hücre işgali izlemek için arzu 3D hücre dışı içine bu parçacıklarının gömerek ardından asılı damla kültür yöntemiyle 4 aracılığıyla 3D hücre agrega (sferoidler) üretimini kapsayan daha önce kurulmuş tekniklerin sentezine yol açmıştır Matris (ECM) kolajen ve bazal membran malzemelerinin 5 oluşur. Bu yöntem, kolaylıkla deneysel koşullar altında çeşitli işgali karşılaştırma için kullanılabilir akıcı bir yaklaşım sağlayarak bu, daha önce bilinen teknikler geliştirmek için çalışmaktadır.

In vitro hücre motilitesini değerlendirmek için daha geleneksel yolları çizilmeye yara tahlil ve transwell tahlil 6 bulunmaktadır. Eski deney 2B ortamda hücre motilitesini tasvir ve in vivo işgali için kritik çeşitli özellikler, örneğin, bir proteaz aktivitesi 7 bağımsızdır. Transwell tahlil de ekler ters membran yüzeyinde hücre görünümü, yani ECM yüzeylerde ancak, yalnızca tek bir parametre ile daha iyi bir model hücre işgali kaplanır zaman ölçülen ve hücre işgali birçok nüanslar böylece kolaylıkla gözlemlenebilir değildirler. Bu teknikler, kanser hücresi sferoid yayılması deneyinin (Şekil 1 <aksine/ strong>) Sadece fizyolojik ilgili olmayan bir ortamda hücre işgali gerçek zamanlı izleme sağlar, fakat aynı zamanda kolektif vs bireysel hücre göçü 8 olarak görüntülenebilir önemli hücre çizgisi özgü özellikleri, izin verir. Bu yöntem aynı zamanda, standart 3D kültürü büyüme tahlilleri fazla avantaj elde edilir. Hücreler bu kısıtlama kaldırdı sonra işgal etmeye teşvik edilecektir böylece asılı damla yöntemi ile hücresel agrega üretimi başlangıçta hücre hareketi kısıtlar. Bu kısıtlama kaldırdı kez Dahası, hücre çıkış sonra uygun quantitated edilebilir bir üniforma yönde devam edecektir.

Kanser hücresi sferoidler deneyleri için kullanılan en popüler ECM malzeme Matrigel ve bu bileşenlerin her biri metastatik davranışını etkileyen önemli ve farklı rolleri vardır burada tip I, hücre oranında yerleştirilmiştir. Matrigel Engelbreth-Holm Swarm fare sarkoma hücreleri tarafından üretilen proteinlerin salgılanan karışımıdır ve baseme içinde zenginleştirilmiş olanBöyle laminin, Entactin ve tip IV kollajen 9 olarak nt zar proteinleri. Bu nedenle, Matrigel bundan böyle adlandırılır "bazal membran malzemeler". Bu bazal zar malzemeleri hücre davranışı 11 üzerindeki etkileri bir dizi gösterirler sayıdaki başka protein ek olarak, kanser hücresi yayılımını tamamen 10 boyunca yapışma integrin için gerekli temel ligandı sunar. Buna karşılık, genellikle tendon ve diğer yoğun kollajen yapılar 12 asit sindirimleri hazırlanabilir I kolajen türü, vücut bağ dokusu ve stromanın destekleyici dokuların ve organların büyük bir yapısal elemanı olarak hizmet eden daha basit bir dolgu maddesi. Bu kollajen fiziksel özellikleri, hücre motilitesinin bir dizi özellik düzenleyen ortaya konmuştur; örneğin tümör-stroma arayüzünde kolajen fibrilleri hizalama stroma 13 içine işgalci, sonradan bu fibriller boyunca geçirmek için kanser hücrelerinin izin verir. Burada yer alan deneyinde, hem tip I kolajen ve bazal zar malzemeleri 3D kanser hücresi-stroma etkileşimleri incelemek için bir araç olarak kullanılır.

Hücreler 3 boyutlu bir matris içine gömülü edildikten sonra işgal izlenebilir kontrol yollarının engellenmesi veya stimülasyon etkisi. Hücreler, asılı damla ya da uzun bir işleme işgali modüle etmek için gerekli olacaktır bağlı olarak 3D kültür, transfer üzerine büyüme sırasında ön muameleye tabi tutulabilir. Kısa tedaviler için, ilacın alımından sonra küremsi süspansiyon, hem de hücrelere yeterli ilaç maruziyeti kolaylaştırmak için, 3D kültürleri saracak ortamı ile karıştırılabilir önerilir. Daha sonra, normal veya tümör bağlantılı stromal hücreleri, tümör hücresi istilasını modüle edilmesinde rolünü değerlendirmek için, ya da ne kadar parakrin ve otokrin sinyal etkiler, hücre davranışını tespit etmek matris malzemesi ile karıştırılabilmektedir. Bu fikir bir çalışmada gösterilmiştir nerede col Coculturekanser ve asılı damla endotelyal hücreler üzerinde sferoidler 14 içinde damar ağı yol açtı. Kanser hücre istilası farklı alt-tabaka 15 tarafından temas edilmesinin Son olarak, ECM bileşenleri, aynı zamanda, değiştirilebilir. Aşağıda sunulan durumda, yöntem, çeşitli koşullar altında kanser hücresi invazyonunu değerlendirilmesi için bir çerçeve sağlar. Genel olarak, tüm hücre kuşakları asılı damla parçacıklarının yaratacak ve epitel dönük hücre hatları genellikle, normal küre formunda olduğu belirlendi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Sferoidlerin 1. Üretim

  1. Bir PBS kullanarak 70% konfluansa ~ adherent kanseri hücre kültürleri ayırarak damla kültürleri asılı tek hücre süspansiyonu hazırlamak% 0.05 tripsin-EDTA solüsyonuna maruz bırakılarak, ardından yıkama.
    1. Hücre kültür ortamı ile tripsin solüsyonu nötralize ve hücre süspansiyonu, bir kısım kullanarak hücreleri sayın. Not: Hücre hattı bağlıdır belirli bir hücre kültür ortamı, test edilen. Hücre kültür ortamı genellikle DMEM +% 10 FBS olduğu, ATCC medya önerileri uygulayın. Daha fazla bilgi Malzemeleri Tablo bulunabilir.
    2. Hücre kültür ortamı 20 ul damla başına 500-1000 hücre ekimi için izin vermek için bir seyreltme gerçekleştirin.
  2. 10 cm çanak Edinme ve alt steril PBS 5 ml ekleyin. Not: Bu adım asılı buharlaşma damla korur. Düşük maliyetli "bakteriyolojik notu" yemekleri, hücre kültürü sınıf yemekleri yerine kullanılabilecek kadar hücreler devamı olmazKültür yüzey hareket ederler.
  3. Kapağın iç yüzeyine seyreltilmiş hücre süspansiyonu, 20 ul damlalar aktarmak için bir çok kanallı pipet kullanın.
    1. Pipet 40 10 cm çanak kapağı üzerine (8 damla 5 satır) düşer.
  4. Kültür çanak üzerinde kapağı ve yer ters çevirin. Sferoidler oluşturmak için 72 saat boyunca 37 ° C 'de asılı damla kültürleri inkübe edin.
    1. Kendine güvenen, henüz kontrollü bir şekilde kapağı çevirin. Not: Çok hızlı veya çok yavaş kapağı Inverting damlacıklar kaydırmaya neden olabilir. Diğerleri, kompakt agrega üretilmesi için fazla 72 saat gerekebilir Bazı hücre hatları, 48 saat ya da daha az parçacıklarının oluşturabilir.

3D Matrix içine sferoitlerin 2. gömülmesi

  1. Gece boyunca sferoidler, gömme işlemi öncesinde 4 ° C'de büyüme faktörü azaltılmış bazal membran malzeme bir kısım çözülme.
    1. İsteğe bağlı: Önceden ECM ile Katman kuyu doku kültürlerdeki potansiyel sfero etkileşimi önlemek içinyüzeye yeniden.
      1. 24 oyuklu bir plaka üzerinde oyuk başına ECM'nin pipetleyin 200 ul.
      2. ECM tüm kuyu yüzeyini kaplayan emin olmak için plakayı eğin.
      3. Dikkatle bir pipet ile aşırı ECM çıkarın.
      4. 3 saat oda sıcaklığında ya da gece boyunca 4 ° C'de: kuyu kuruyana kadar plaka inkübe edin.
  2. Doku kültürü çanak kapağı devirme ve medyayı bir araya getirerek parçacıklarının toplayın. 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içine sferoidlerle medya aktarın.
  3. Sferoidler mikrosantrifüj tüp dibinde yerleşmek için 10 dakika bekleyin. Sferoidler gözle görünür olmalıdır.
  4. . Soğuk (4 ° C) 100 ul bir ayrı ön-soğutulmuş bir tüp içinde kollajen tip ile bazal membran malzeme 100 ul karıştırın erken katılaşmasını önlemek için ya da bir jel, 4 ° C 'de karışımı tutun.
    1. Küçük hacimli transfer eğer önceden soğutulmuş pipet ipuçlarını kullanın.
    2. Dikkatli verBen hava kabarcığı oluşumunu önlemek için bazal membran malzeme ve kollajen tip karıştırma. Not: jel gömülü hale eğer Hava kabarcıkları protokolde daha sonra görüntüleme engelleyebilir.
  5. Mikrosantrifüj tüp 40 ul alt kısmından parçacıklarının aspire ve ben karışımı kollajen bazal membran malzemeleri / tip ile birleştirir. Karıştırma sırasında hava kabarcığı oluşumunu önlemek için dikkatli olun. Not: Çözelti 100 ul kollajen tip I ve sferoitlerin 40 ul 4 bağımsız 3D kültürler için yeterli malzeme yaratacak, 100 ul bazal membran malzemelerinin içeren. Bu büyütülüyor veya aşağı olabilir.
  6. Pipet, 24 oyuklu bir plaka üzerinde kuyuların merkezlerine viskoz karışımın 40 ul düşer. Kuyunun tarafına çalışmasını karışımı önlemek için plaka düz tutun. Not: 24 oyuklu bir plaka üzerinde bir tek sütun - 4 kuyu - Her bir durumda test edilecek için tavsiye edilir.
  7. Plaka int yerleştirinoa 37 ° C inkübatör ve 30 dakika boyunca rahatsız edilmeden bırakın. 3D kültür bu dönemde polimerize olur.
  8. Yavaş yavaş hücre kültür ortamının 1 ml 3D kültürleri daldırın.
    1. Ayrıca jel polimerizasyonu teşvik etmek kuyular içine eklerken medya sıcak olduğundan emin olun.
    2. KRİTİK ADIM: yavaşça 3D kültürlere medya ekleyebilirsiniz. Kuyulara çok hızlı bir şekilde ortam Pipetleme doku kültürü yüzeyinden 3D kültürlerin ayrılması yol açabilir.

3. İzleme ve Sfero Invasion Analizi

  1. Araştırmacı tarafından karar zaman noktalarında çevredeki 3D matris içine sferoitlerin Image işgali. 20x objektif lens bir ters mikroskop kullanılarak fotoğraf elde edin. Not: İdeal zaman noktaları test edilen hücre hattı bağlı olarak farklılık gösterecektir. Daha invaziv hücre hatları kısa bir süre sonra kaplama sferoidler kendi dışarı çıkmasını başlar ve bu nedenle, ilk fotoğrafı alacakkaplama sonrası birkaç saat içinde s. Genel olarak, fotoğraf (kaplama) sonra 0 saat, 24 saat ve 48 saat sonra alınmıştır. Invasion genellikle kaplama sonrası 24 saat 48 varmıştır.
  2. Görüntü J. gibi görüntü analiz yazılımı kullanarak invaziv yeteneklerini ölçmek
    1. Sfero kenarından hücre mesafe olarak işgali analiz edin.
      1. Yarıçapı ve / veya maksimal invaziv mesafeyi işaretlemek için Düz Beraberlik Aracı'nı kullanın.
      2. Uzunluk ölçümünü görüntülemek için "Tedbir" üst menüde "Analiz", ve sonra tıklatın.
    2. Sfero dışında toplam invaziv alanı olarak işgal edilmesi.
      1. Sfero ve / veya toplam invaziv alanın sınırını izlemek için Freehand Beraberlik Aracı'nı kullanın.
      2. Alan ölçümünü görüntülemek için "Tedbir" üst menüde "Analiz", ve sonra tıklatın.
    3. Görüntülerin bir yığın için ölçümler oluşturmak için ROI Yöneticisi Araçları gibi bir eklenti kullanın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Sferoid invazyon testi kullanılarak (Şekil 1), kanser hücre soylarının bir paneli, hem de bazal membran malzemeleri ve tip I kolajen oluşan 3 boyutlu bir matris içinde implantasyon sonrası sergilenen hücre egress miktarı için küreler oluşturma kabiliyetleri için test edildi (Tablo 1). Bu sonuçlar, her kanser hücre çizgisi, in vitro olarak bir epitel morfolojisi sahip hücre çizgileri düzenli ve düzgün agrega üretme eğilimindeydi iyi biçimli sferoidler, yaratacaktır göstermektedir. Tahlilinde işgal farklı hücre çizgilerinin yeteneği de değişkendir. 4T1, E0771, ve U-87 MG gibi invaziv olarak kurulmuştur hücre çizgileri deneyde küremsi egress yüksek derecede sergiledi. Beklenen gibi daha az agresif hücre hatları, MCF-7 gibi, BT474 ve MCF10DICS.com, işgal etmedi. Beklenmeyen Ancak, A-431 ve COLO 357 PL hücreleri tarafından görüntülenen işgali eksikliği oldu. Bunlardan bazıları için verilerin bir örneğihatlar (Şekil 2) gösterilmektedir. 4T1 ve E0771 hücreleri için, işgal zaten işgal matrisi içine implantasyon sonrası doğrudan başlamış, U-87 MG, 3D matriks içine parçacıklarının gömme 24 saat sonra belirgin ve daha.

Hücresel yayılmada niteliksel değerlendirmesi daha fazla görüntü analiz yazılımı nicelendirilmesi ile desteklenebilir. Işgali kapsamını ölçülmesi için iki farklı stratejileri (Şekil 3) dahil edilir ve seçilen strateji işgali tipine tanık bağlıdır. ImageJ, invazif mesafe veya invaziv alan ilk karşılaştırmalı değerler piksel ölçümlerinin olarak üretilen sonra yazılımın beraberlik aracını kullanarak çizilmiş edilir. Mikroskopi görüntüleri bunu yaparken eğer, ROI Yöneticisi Araçları gibi bir eklenti verimli ölçüm kolaylaştırmak için tavsiye edilir, daha verimli veri toplama etkinleştirmek için bir yığın olarak ithal edilebilir ama.

Hücre Çizgisi Kanser Türü Küre-Şekillendirme yeteneği Tahlil Invasion
4T1 Meme Fare +++ ++
A-431 Epidermoid İnsan +++ -
BT-474 Meme İnsan ++ -
COLO 357 PL Pankreas İnsan ++ -
E0771 Meme Fare +++ +++
LNCaP Prostat İnsan + -
MCF-7 Meme İnsan +++ -
MCF10DCIS.com Meme İnsan ++ -
MDA-MB-231 Meme İnsan - ?
PANC-1 Pankreas İnsan + ++
PC-3 Prostat İnsan - ?
SK-BR-3 Meme İnsan - ?
U-87 MG Glioblastoma İnsan +++ +++

Tablo 1:. Test edilen farklı hücre hatları ile Sphere-oluşumu ve işgali Hücre hatları kendi küre oluşturma yeteneği ve işgali göre puanlanır.

figür 1
Şekil 1:. Sfero yayılması deneyinin görsel akışı olan sferoitler hususiyetlerini 72 saat boyunca bir doku kültür kabı kapağı sarkan ortam damlalar meydana getirilir. Sonra, damla havuzda toplanır ve sferoidler transf vardır bazal membran malzeme ve tip I kollajenin bir 4 ° C karışımına de tercih edilir. Sferoid süspansiyon haline getirilmesinden sonra, zor akışlı kanşım 3 boyutlu bir kültür içine katılaşmaya 37 ° C'de 30 dakikada bir, bundan sonra, bir 24-kuyucuklu plaka oyuklarına pipetle. Sıcak medya sonra oyuklara ilave edilir. Kürelerinden Celi çıkış sonra zaman zarfında izlenmiştir.

Şekil 2,
Şekil 2:. A-431 ve MCF-7 hücreleri yok ise deney verileri Örnek 4T1, E0771, ve U-87 MG hücreleri kürelerinden invazyonu. 4T1 ve E0771 hücreleri tarafından maksimum istilası sonra ortaya çıkar ise U-87 hücrelerinin invazyonu en 24 saat sonra belirgin hale gelir. En invaziv E0771 ve U-87 MG hücre çizgileri için, hücre çıkış aksi takdirde daha az invaziv hatlarında elde edilen küremsi boyut artışı telafi etmek için görünür. Ölçek çubuğu, 200 mikron.om / files / ftp_upload / 53409 / 53409fig2large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3:. Invazyon kantitasyonu Invasion örneğin Resim J yazılımı kullanılarak, görüntü analizi ile kantifiye edilebilir. sfero kaynaklanan uzun invazif mesafenin bir fonksiyonu olarak istilası (a) hesaplanması. (b) sfero bırakarak hücreleri tarafından işgal Toplam alan. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu çalışma, bir küremsi yayılması deneyinin (Tablo 1) kanser hücre soylarının bir paneli performansını değerlendirildi. Genel olarak, sferoid oluşumu hücre-hücre birleşme varlığı küremsi benzeri mimari oluşumunu teşvik fazla epitelyal dönük hücre hatları, gelişmiş olduğunu fark. MDA-MB-231 hücreleri gibi, bir epitelyal mezenkimal geçiş geçirmiş bilinen hücre hatları, dolayı azaltılmış E-, N- ve P-kadherin ifadesi 16 büyük olasılıkla Asılı damla kültüründe parçacıklarının oluşturmazlar.

Sfero işgali tayininde adımlardan bazıları protokole yakın bağlılık gerektirir. Bu bazal membran ve kollajen karışımı pipetleme yaparken hızlı çalışmak kesinlikle kritik olduğunu ve tek oda sıcaklığında katılaşmaya başlayacaktır olarak çalışırken 4 ° C yakın karışımı tutması çok önemlidir. Ayrıca, çözünebilir kollajen preparasyonlar asidik olan ve addit ile jel uyarılmaktadırsodyum hidroksit ve tuz küçük bir miktarının iyonu, 37 ° C'ye kadar ısıtılarak, ardından. Bizim ellerde, sadece bazal membran malzeme ile kollajen eşit hacimlerde karıştırılması bazal membran bileşeni kollajen nötralize etmek mümkün, çünkü ısınma üzerine bu jel-yetkin hale getirir. Daha küçük bazal membran oranları ise: kolajen planlanmıştır, kollajen polimerizasyonunun kolaylaştırmak için bazal membran karışımının eklemeden önce nötralize edilmesi gerekmektedir. Oluştuktan sonra, en küremsiler ayrışma dirençli olan ve 3B kültür içerecektir, bu yapışkan bir karışım içinde yeniden süspansiyon hayatta kalacaktır. Bu görüntüleme sürebiliyor olarak tabanda adımları sırasında, bir de hava kabarcıklarının oluşumunu sınırlamak için özen sarfetmek gerekir. Jel katılaşmış sonra kuyulara kültür ortamı eklerken, yavaş yavaş tek pipetler çanak ayırma 3D kültürleri önlemek için önemlidir.

Çevredeki 3D matris içine kanser hücrelerinin çıkış generall olany E0771 ve U-87 MG hücreleri burada incelenen hücre hatları (Şekil 2) panelinin en işgali göstermiştir hatlarının invaziv yeteneği ile ilişkilidir. İlginçtir, bu iki satır da işgalin farklı modlar gösterirler. E0771 hücreleri kademeli ve kolektif bir şekilde işgal Oysa, U-87 MG hücreleri sferoitlerin bireysel ve hızlı bir çıkış gösterir. Sfero işgali tahlil böylece bir alt tabaka işgal etmeye hatlarında kullanılan farklı modlar karşılaştırmanızı sağlar.

Işgali analiz farklı yöntemler Şekil 3'te sunulmuştur ve analiz Tercih edilen uygulama şekli invazyon moduna bağlı olabilir. Ne olursa olsun analizi kullanılan tipinden bağımsız olarak, bu deney, parçacıklarının çok sayıda üzerinden istilası hızlı miktar tayini için izin verecek şekilde tasarlanmıştır. Ve daha sonra, 4 bağımsız suret kültürleri oluşturmak için bu karışım aliquoting 3B, kültür karışımına sferoidlerin havuzu establi yol açarBelirli bir deneysel koşul (Şekil 1) takip edilebilir çok sayıda küremsi shment. Tahlil ", n" nedeniyle büyük bir potansiyel dolayısıyla istatistiksel karşılaştırma kolayca iyileştirilebilir ve aynı tip sferoidler tarafından paylaşılan fenotip en az değişkenlik gösterirler görünüyor. BT-474 ve MCFDCIS hücreleri gibi daha az agresif hücre çizgileri daha agresif hatlara göre çok daha küçük bir boyuta sahip düzgün, kompakt küreler oluşturmak unutmayın. Bunun bir sonucu olarak, asılı damla halinde başlangıç ​​hücre sırasında başlangıç ​​hücre sayısı buna göre ayarlanması gerekir.

Bazı metastatik hücre hatları beklentileri karşı gerçekleştirilen ve bu testte invazif davranışlar değil. Önemli örnekler A-431 ve COLO 357 PL hücrelerini içerir. Bu nedeniyle sferoidler gömülmüş ECM alt-tabaka tipine, bu çizgiler ile gösterilir işgal olmaması mümkündür. Gerçekten de, diğerleri bu bazal membran eş göstermiştirmenin (örneğin Matrigel) ve kollajen göç 18 için farklı matris metaloproteaz gereksinimlerine belki de hücrelerin 17 istilası farklı etkileri olabilir. Bu nedenle, kolajen oranı verdiği: bazal membran malzeme deney sonuçlarını değiştirmek için başka bir yol, burada daha tarafından işgal arttırabilir, böylece, toplam karışımın üçte bazal membran malzemesi bileşenini azaltmak kolajen miktarında bir artışa izin veren Bazı hücre tipleri. Bu fikir kollajen fibril oluşumu kolajen 19 nötralize pH 4 ° C preinkübasyon süresini uzatarak terfi etti ben bugünkü fibriller kollajen meme organoids invaziv yetenek ve tipi sayısı, arasında pozitif bir korelasyon bulundu yeni bir çalışmada örneklenmiştir.

Bazı hücre hatları beklenti aykırı hareket keşif bu testin sınırlamaları bazılarını gösterir. O dışarı izleme kanseri hücre işgali olmasına rağmenfa daha fazla fizyolojik olarak uygun 2B motilite ölçümüne göre, bu, aksi takdirde, in vivo olarak bulunan bazı biyolojik karmaşıklığını atlar, bir model sistem hala kolajen ve bazal zar malzemeleri kapsayan 3B karışımına küremsi. Örneğin, metastatik yeteneği gibi, bu stromal çeşitli faktörlere derinden metastatik süreci etkileyebilir olduğunu kabul etmek önemlidir, ortotopik vs ektopik tümör büyümesini destekleyen 20 farklı mikroçevrelerde modüle edilebilir. Bu faktörlerin bir kısmı burada sunulan işgali tayininde bulunmadığına ve gözlemlenen tutarsızlıklar bazı açıklayabilir.

Özet olarak, burada sunulan kanser hücresi sferoid işgali tahlil bir biyolojik ilgili bir ortamda istila izlenmesi için esnek bir çerçeve hücresi istilasını mekanizmaları keşfini destekler içerir ve potansiyel olarak, yeni anti-metastatik tedavilerin geliştirilmesine yardımcı olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

NIH hibe P30 CA051008 ve T32 CA009686 (ATR) tarafından desteklenir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Matrigel Growth Factor Reduced Corning CB-40234
Collagen Type I, Rat Tail, 100 mg Millipore 08-115
DMEM Life Technologies 11995-065
RPMI 1640 Medium  Life Technologies 11875-093
PBS Life Technologies 10010-023
0.05% Trypsin-EDTA Life Technologies 25300-054
Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated Omega Scientific FB-12
100 mm TC-treated Dishes Corning Incorporated 430167
24-well TC-treated Plates NEST Biotechnlology 702001
Olympus IX-71 Inverted Microscope
Cell lines were maintained in DMEM + 10% FBS, with the expection of BT-474 and LNCaP cells, which were mantained in RPMI + 10% FBS.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Metastasis: Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev. Cancer. 2 (8), (2002).
  2. Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. J Cell Sci. 116 (12), 2377-2388 (2003).
  3. Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), (2007).
  4. Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J Vis Exp. 51, (2011).
  5. Del Duca,, Werbowetski, D., T,, Del Maestro,, F, R. Spheroid preparation from hanging drops: characterization of a model of brain tumor invasion. J Neuro-Oncol. 67 (3), (2004).
  6. Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. J Vis Exp. 88, (2014).
  7. Ramos-DeSimone, N., Hahn-Dantona, E., Sipley, J., Nagase, H., French, D. L., Quigley, J. P. Activation of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) via a converging plasmin/stromelysin-1 cascade enhances tumor cell invasion. J Bio Chem. 274 (19), Forthcoming.
  8. Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Rev. Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
  9. Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: Basement membrane matrix with biological activity. Semin Cancer Biol. 15 (5), 378-386 (2005).
  10. Shaw, L. M., Chao, C., Wewer, U. M., Mercurio, A. M. Function of the integrin α6β1 in metastatic breast carcinoma cells assessed by expression of a dominant-negative receptor. Cancer Res. 56 (5), 959-963 (1996).
  11. Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), (2010).
  12. Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. -F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat Protoc. 1 (6), (2006).
  13. Provenzano, P. P., Eliceiri, K. W., Campbell, J. M. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4 (1), (2006).
  14. Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Methods Mol Med. 140, 141-151 (2007).
  15. Brenner, W., Groß, S., Steinbach, F., Horn, S., Hohenfellner, R., Thüroff, J. W. Differential inhibition of renal cancer cell invasion mediated by fibronectin, collagen IV and laminin. Cancer Lett. 155, 199-205 (2000).
  16. Nieman, M. T., Prudoff, R. S., Johnson, K. R., Wheelock, M. J. N-cadherin promotes motility in human breast cancer cells regardless of their E-cadherin expression. J Cell Biol. 147 (3), Forthcoming.
  17. Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), (2013).
  18. Sodek, K. L., Brown, T. J., Ringuette, M. J. Collagen I but not Matrigel matrices provide an MMP-dependent barrier to ovarian cancer cell penetration. BMC Cancer. 8 (1), 223-2210 (2008).
  19. Nguyen-Ngoc, K. V., Ewald, A. J. Mammary ductal elongation and myoepithelial migration are regulated by the composition of the extracellular matrix. J Microsc. 251 (3), 212-223 (2013).
  20. Glinskii, A. B., Smith, B. A., Jiang, P., Li, X., Yang, M., Hoffman, R. M., Glinsky, G. V. Viable circulating metastatic cells produced in orthotopic but not ectopic prostate cancer models. Cancer Res. 63 (14), 4239-4243 (2003).

Tags

Tıp Sayı 105 Kanser Sfero Küre Metastaz Drop Asma Invasion 3D Matrigel Kolajen Bodrum Membran.
Bir Kanseri Hücre Sfero Testi 3D ortamda Invasion Değerlendirmek için
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel,More

Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting. J. Vis. Exp. (105), e53409, doi:10.3791/53409 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter