Summary
توضح هذه المخطوطة طريقة بسيطة والإنتاجية العالية لتجميع البروتينات للذوبان في الماء مع أصباغ مسعور التي تقوم على مستحلبات الماء في الزيت. علينا أن نبرهن فعالية الأسلوب في تجميع الكلوروفيل الأم مع أربعة أنواع من المؤتلف للذوبان في الماء، الكلوروفيل ملزم البروتينات (WSCPs) من النباتات الكرنب وأعرب في E. القولونية.
Abstract
الكلوروفيل (CHLS) ويخضور جرثومي (BChls) هي العوامل المساعدة الأولية التي تنفذ حصاد ضوء الضوئي ونقل الإلكترون. وظائفها يعتمد بشكل كبير على منظمة معينة في إطار مجمعات البروتين multisubunit الغشاء كبيرة ومعقدة. من أجل فهم على المستوى الجزيئي كيف تسهل هذه المجمعات تحويل الطاقة الشمسية، فمن الضروري أن نفهم البروتين الصباغ، والتفاعلات الصباغ الصباغ، وتأثيرها على ديناميات متحمس. طريقة واحدة لكسب هذا الفهم هو من خلال بناء ودراسة المجمعات من CHLS مع البروتينات المؤتلف بسيطة للذوبان في الماء. ومع ذلك، والذي يتضمن CHLS دهون وBChls إلى بروتينات قابلة للذوبان في الماء أمر صعب. وعلاوة على ذلك، ليس هناك طريقة عامة، والتي يمكن أن تستخدم لتجميع البروتينات للذوبان في الماء مع أصباغ مسعور. هنا، علينا أن نظهر نظام الإنتاجية بسيط وارتفاع على أساس مستحلبات الماء في الزيت، والتي تمكن الحمارembly من البروتينات للذوبان في الماء مع CHLS مسعور. تم التحقق من صحة الطريقة الجديدة عن طريق تجميع الإصدارات المؤتلف من الكلوروفيل البروتين للذوبان في الماء ملزما من كرنبية النباتات (WSCP) مع كلوروفيل أ. ونحن لشرح التجمع الناجح لكلوروفيل لاستخدام لست] الخام من WSCP معربا عن E. خلية كولاي، والتي يمكن استخدامها لتطوير نظام شاشة الجيني للبروتينات ملزمة كلوروفيل جديدة للذوبان في الماء، وللدراسات التفاعلات كلوروفيل البروتين وعمليات التجميع.
Introduction
أصباغ مسعور مثل الكلوروفيل (CHLS)، يخضور جرثومي (BChls) والكاروتينات هي العوامل المساعدة الأولية في مراكز رد فعل الضوئي والبروتينات حصاد الخفيفة التي تنفذ نقل الإلكترون، والتقاط الطاقة الضوئية ونقلها. مراكز التفاعل ومعظم المجمعات حصاد ضوء ملزم كلوروفيل هي بروتينات الغشاء. البروتين Fenna-ماثيوز أولسون (FMO) من بكتيريا التمثيل الضوئي الأخضر الكبريت غير الاوكسجينية 1،2، والبروتين peridinin-كلوروفيل (PCP) من دينوفلاجيليت 3 أمثلة استثنائية من المياه القابلة للذوبان البروتينات حصاد الضوء. الكلوروفيل ملزم البروتينات للذوبان في الماء (WSCPs) من كرنبية، بطباطية، سرمقية والنباتات قطيفية 4، 5 ومثال فريد آخر، ولكن في المقابل لFMO وحزب المؤتمر الشعبي، وهذه هي ليست متورطة في ضوء حصاد ولا في أي من رد فعل الضوئي الأساسي وفيز على وجه الدقةوظائف siological غير واضحة 5-8 بعد. أدت بهم عالية تقارب ملزم كلوروفيل إلى وظيفة اقترح كحاملات عابرة من CHLS ومشتقاتها كلوروفيل 9،10. بدلا من ذلك، كان الافتراض بأن WSCP يلعب دورا في مسح CHLS في الخلايا التالفة ويحمي ضد يسببها كلوروفيل-الضرر photooxidative 7،11-13. وفي الآونة الأخيرة، اقترح أن ظائف WSCP كمانع البروتيني، ويلعب دورا خلال مقاومة عاشب كذلك ينظم موت الخلية أثناء التطور زهرة 14. وتنقسم WSCPs إلى فئتين الرئيسية وفقا لخصائصها بالفوتونات. الدرجة الأولى (الصف الأول، على سبيل المثال. من سرمق أبيض) قد تخضع photoconversion على الإضاءة. الدرجة الثانية WSCPs من النباتات الكرنب، التي لا تخضع photoconversion 5،10، وتنقسم الى مزيد من الدرجة الداخليين (على سبيل المثال، من OLERACEA الكرنب، Raphanus SATIVUS) وبنك الاستثمار الدولي (على سبيل المثال، من رشاد virginicum رشاد virginicum من البلورات بالأشعة السينية في دقة 2.0 Å 8. أنه يكشف عن homotetramer متماثل التي مفارز البروتين تشكل نواة مسعور. كل فرعية تشد كلوروفيل واحد مما يؤدي الى ترتيب ضيق من أربعة CHLS معبأة بشكل وثيق داخل core.This بسيطة عن ترتيب كلوروفيل يجعل WSCPs نظام نموذجي يمكن أن تكون مفيدة لدراسة ملزمة وتجميع المجمعات كلوروفيل البروتين، وآثار CHLS المجاورة وبيئات البروتين على الخصائص الطيفية والإلكترونية للCHLS فرد. وعلاوة على ذلك، فإنه يمكن أن توفر نماذج لبناء البروتينات الاصطناعية ملزم كلوروفيل التي يمكن أن تستخدم لوحدات ضوء حصاد في أجهزة الضوئي الاصطناعي.
دراسات دقيقة من WSCPs مواطن ليست مجدية لأن المجمعات تنقيته من النباتات تحتوي دائما خليط غير متجانس من tetramers مع مجموعات مختلفة من كلوروفيل لوكلوروفيل ب 9. وبالتالي، لا بد من طريقة لتجميع WSCPs أعرب recombinantly مع CHLS في المختبر. والتحدي الذي يواجه هذا من قبل لا يذكر المياه للذوبان من CHLS مما يجعل من المستحيل لتجميع المجمع في المختبر ببساطة عن طريق خلط apoproteins للذوبان في الماء مع أصباغ في المحاليل المائية. في المختبر التجمع عن طريق خلط apoproteins مع الأغشية الثايلاكويد وقد تجلى 15، ولكن يقتصر هذا الأسلوب لالأصلي CHLS موجودة في ثايلاكويد. شميت وآخرون. تقارير عن تجميع عدة كلوروفيل وBChl المشتقات مع WSCP من القرنبيط (CaWSCP) بالإعراب عن recombinantly بروتين الموسومة الحامض الاميني في E. القولونية شل حركة وضعها على عمود ني تقارب وإدخال مشتقات شيلي بالفاعلات في المنظفات 11. إعادة بنجاح من WSCPs المؤتلف من أ. thaliana 6، وبراعم بروكسل (BoWSCP)، الفجل البري الياباني (RshWSCP) لوذكرت أيضا د فرجينيا pepperweed (LvWSCP) بطريقة مشابهة.
هنا، نقدم رواية، عام، طريقة مباشرة لتجميع CHLS مع WSCP التي لا تتطلب وضع علامات أو شل حركة البروتينات. وهي تعتمد على إعداد مستحلبات من المحاليل المائية على من apoproteins للذوبان في الماء في الزيوت المعدنية. وبالتالي مغلفة البروتينات في الماء في النفط (W / O) microdroplets مع سطح عالية جدا إلى نسبة حجم 16. ثم يتم حله العوامل المساعدة مسعور في مجال النفط وأدخلت بسهولة إلى قطرات من مرحلة النفط. نحن تقريرا عن استخدام طريقة لتجميع من عدة أنواع من apoproteins WSCP أعرب recombinantly في E. القولونية مع كلوروفيل أ. ونحن لشرح التجمع من المحللة الخام من البكتيريا overexpressing WSCP التي يمكن استخدامها كنظام فحص لتطوير البروتينات ملزمة كلوروفيل جديدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد كلوروفيل والحلول المالية
- خطوة حاسمة: تنفيذ جميع خطوات إعداد الكلوروفيل في غطاء الكيميائية، تحت الضوء الأخضر (520 نانومتر) أو في الظلام من أجل تقليل photodamage. دائما إضافة النيتروجين أو الأرجون قبل تجميد أصباغ للتخزين. التأكد من أن جميع المذيبات هي درجة التحليلي.
- تزن حوالي 5 ملغ من خلايا سبيرولينا الفطور مجفف بالتجميد أو خلايا cyanobacterium أخرى تحتوي على كلوروفيل الوحيد لفي الأغشية الثايلاكويد وسحقها باستخدام هاون ومدقة.
- تحميل خلايا سحق على عمود الزجاج ويغسل مع حوالي 50-100 مل من 100٪ الأسيتون لإزالة الكاروتينات. تجاهل البرتقال / جزء الأخضر مزال.
ملاحظة: إذا لم يتم مزال جزء البرتقال مع 100 مل من الاسيتون تواصل غسل الخلايا مع الأسيتون حتى يبدأ جزء الأخضر للأزل. - صرف الأسيتون مع الميثانول بنسبة 100٪ وجمع جزء الأخضر التي تحتوي على كلوروفيل أ. حجم fract مزالأيون قد تختلف بين 50-100 مل. في البداية، جزء مزال لها لون الأخضر الداكن، والذي يتغير إلى الأخضر الشاحب في نهاية شطف. عندما يتحول لون جزء مزال إلى الأخضر الشاحب وقف شطف.
- يتبخر الميثانول باستخدام المبخر الدوار حتى استخراج جاف تماما. لا تنطبق الحرارة إلى حل. تأكد من أن درجة حرارة حمام الماء المبخر لا تتجاوز 30 درجة مئوية.
ملاحظة: الساعة التبخر يعتمد على حجم جزء الميثانول التي تبخرت وقد تختلف بين 10-60 دقيقة. ومن المهم أن تجف استخراج تماما. - حل أصباغ من استخراج المجففة في كمية صغيرة من ايثر (حوالي 5-10 مل)، وتصفية من خلال القطن والصوف. تأكد من أن الصبغات يذوب تماما في الأثير قبل الترشيح.
- تتبخر ايثر حتى أصباغ جافة تماما (10-30 دقيقة).
ملاحظة: يمكن تطهير والأصباغ الجافة مع وأبقى تحت النيتروجين أو الأرجون في -20 درجة مئوية، في الظلام حتى مزيد من المعالجة. - حل الأصباغ الجافة في أصغر حجم ممكن من الميثانول بنسبة 100٪ (حوالي 1 مل)، حتى إذا علقت ليس كل شيء تماما. إضافة 4 مل من الأسيتون إلى الحل، ونفض الغبار الزجاج بلطف من أجل حل تماما أصباغ.
- باستخدام ماصة باستور، تحميل عينة بلطف على عمود من DEAE سيفاروز معايرتها في 100٪ الأسيتون.
- الكاروتينات أزل (فرقة البرتقالي والأصفر) مع 100٪ الأسيتون. ثم، أزل كلوروفيل ل(الفرقة الخضراء) مع 3: 1 ت / ت الأسيتون / الميثانول الخليط.
ملاحظة: حجم الأسيتون وخليط الأسيتون / الميثانول ما يعادل تقريبا حجم DEAE سيفاروز تحميلها على العمود. - تحقق من كلوروفيل نقاء كتبها رقيقة اللوني طبقة باستخدام 68: 25: 5: 2 ثنائي كلورو ميثان / ن الهكسان / الأيسوبروبانول / الميثانول (ت / ت) خليط كما شاطف 17.
- تتبخر المذيب باستخدام المبخر الدوار حتى كلوروفيل وجافة تماما (10-60 دقيقة).
ملاحظة: كلوروفيل الجاف ويمكن تطهير مع النيتروجين أو الأرجون وتخزينها في جو من الأرجون -20 درجة مئوية في الظلام. - إعداد كلوروفيل حل الأسهم عن طريق إعادة تذويب الجاف كلوروفيل لفي 2-4 مل من الإيثانول بنسبة 100٪.
ملاحظة: معامل انقراض كلوروفيل لفي 663 نانومتر هي 74400 سم -1 م -1 (83.3 سم -1 (ملغ / مل) -1) في الإيثانول. يجب أن يكون هناك حل الأسهم نموذجي لOD من 1860 الموافق تركيز 25 ملم (23 ملغ / مل). إضافة 20 ميكرولتر من هذا المخزون إلى مستحلب تحتوي على 5 مل من المرحلة العضوية، و 1 ملغ من WSCP في 1 مل من نتائج المرحلة المائية في خليط مع 10 فائض الرحى أضعاف من كلوروفيل في مقابل WSCP.
2. إعداد المرحلة العضوية من مستحلب
ملاحظة: وتتكون المرحلة العضوية من مستحلب من الزيوت المعدنية التي تحتوي على 4.5٪ (ت / ت) سبان 80، و 0.4٪ (ت / ت) توين 80.
- في وزن 50 مل أنبوب 0.2 غرام من تيوين 80، 1.8 غرام من سبان 80، و 38 غراما من الزيوت المعدنية. تخلط جيدا جميع المكونات ويبرد على الجليد.
ملاحظة: يمكن تخزين المرحلة العضوية في 4 درجات مئوية تصل إلى أسبوع واحد.
3. إعداد المرحلة مائي من مستحلب
ملاحظة: قد تتكون المرحلة المائية من مستحلب إما WSCP تنقيته، أو استخراج النفط الخام من البكتيريا overexpressing WSCP.
- إعداد المرحلة المائية التي تحتوي على WSCP تنقيته.
- تنمو البكتيريا القولونية BL21 التي تحتوي على البلازميد WSCP 12 في 1 لتر من LB المتوسطة عند 37 درجة مئوية حتى OD من 0.3-0.6.
- حمل بروتين تعبير بإضافة 1 ملم IPTG. بعد تحريض نمو البكتيريا عند 30 درجة مئوية لمدة 12-16 ساعة.
- البكتيريا الحصاد بواسطة الطرد المركزي في 5000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- حل بيليه في ملزمة العازلة ويصوتن على الجليد (30 ثانية في 15 ثانية من خمس مرات). استخدام 10 مل من العازلة لبيليه تم الحصول عليها من الطرد المركزي من 250 مل منمتوسطة LB مع الخلايا overexpressing البروتين.
ملاحظة: اعتمادا على طريقة تنقية، قد تكون مؤلفة من العازلة ملزمة من 100 ملي العازلة الفوسفات، ودرجة الحموضة 7.2 أو 50 ملي تريس، ودرجة الحموضة 7.5، 500 مم كلوريد الصوديوم، و 5 ملي EDTA. - تدور أسفل الخلايا المحللة في 12000 x ج لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- تنقية WSCP بواسطة اللوني تقارب. اعتمادا على العلامة تنصهر WSCP، تنقية البروتينات المؤتلف باستخدام المتاحة تجاريا نظام تقارب اللوني المناسب لتنقية البروتين باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
- لتحضير مستحلب، استخدم WSCP تنقيته في 50 ملي العازلة الفوسفات، ودرجة الحموضة 7.8. تأكد من أن كمية البروتين النهائي تستخدم لإعادة هو 0،5-1،0 ملغ لكل 1 مل من العازلة.
- إعداد المرحلة المائية التي تحتوي على البكتيريا المحللة الخام مع WSCP.
- زراعة خلايا القولونية BL21 تحتوي على WSCP، معربا عن البلازميد في 250 مل من LB المتوسطة عند 37 درجة مئوية حتى OD 0،3-0،6.
- حمل تعبير البروتين مع1 ملم IPTG وتنمو البكتيريا بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية.
- الخلايا البكتيرية الحصاد بواسطة الطرد المركزي في 5000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- حل بيليه في 1-2 مل من 50 ملي العازلة فوسفات الصوديوم الهيدروجيني 7.8، يصوتن (30 ثانية على، 15 ثانية قبالة، ثلاث مرات) وأجهزة الطرد المركزي في 12000 x ج لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- إعداد المرحلة المائية من مستحلب عن طريق خلط 0.125 مل من طاف مع 0.875 مل من 50 ملي فوسفات الصوديوم العازلة درجة الحموضة 7.8.
4. جمعية WSCP مع كلوروفيل لفي مستحلب
- نقل 5 مل من مزيج النفط بالسطح في قارورة زجاجية وتبريده على الجليد. قبل pipetting ل، تحقق من أن جميع مكونات المرحلة العضوية مختلطة تماما وليس هناك فصل بين مرحلة السطحي والزيوت المعدنية.
- إضافة 1 مل من المرحلة المائية المثلج أعد كما في القسم 3-5 مل من المرحلة العضوية.
- مزيج مرحلتي باستخدام الخالط الأنسجة لمدة 2 دقيقة في 9500 دورة في الدقيقة على الجليد.
- خطوة حاسمة: من هذه المرحلة على، أداء جميع خطوات أخرى تحت الضوء الأخضر (520 نانومتر) من أجل تقليل photodamage. إضافة 20 ميكرولتر من 25 ملي كلوروفيل حل الأوراق المالية (انظر القسم 1.13) إلى مستحلب. تفريق عبها وعكس القارورة الزجاجية. تأكد من أن كلوروفيل يتم توزيعها بالتساوي في مستحلب.
- احتضان مستحلب لمدة 1-2 ساعة على الجليد في الظلام.
- من أجل كسر مستحلب وقطرات الماء منفصلة عن المرحلة العضوية نقل مستحلب لأنابيب البلاستيك 1.5 مل وأجهزة الطرد المركزي في 14000 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: إذا كان التجمع ناجحا، يجب أن يكون المرحلة المائية السفلى خضراء اللون. - التخلص من مرحلة النفط العليا وإضافة 1 مل من الزيوت المعدنية. تخلط جيدا الزيوت المعدنية مع مستحلب مكعبات من دوامة أو عن طريق التقليب أنبوب دقيق. تدور باستمرار العينة في 14000 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. كرر هذه الخطوة حتى هلالة واضحة تفصل بين مائي والتعدينيتم الحصول على مراحل النفط الله، دون أي مستحلب المتوسط.
- تنفيذ هذه الخطوة في غطاء الكيميائية. بعد يتم فصل مراحل النفط المائية والمعدنية بشكل واضح، وإزالة الزيوت المعدنية وإضافة 1 مل من ايثر المشبعة بالمياه. دوامة وتدور باستمرار العينة في 14000 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. كرر هذه الخطوة مرتين.
- بعد الطرد المركزي الثاني، وإزالة ايثر وترك الأنابيب مفتوحة ل5-20 دقيقة في غطاء محرك السيارة.
- وأخيرا، تحميل المرحلة المائية التي تحتوي على WSCP / كلوروفيل مجمع على عمود تحلية وأزل مع العازلة المناسبة لمزيد من التجارب.
ملاحظة: البروتين هو مستقر في مخازن الفوسفات وتريس في مجموعة واسعة من درجة الحموضة (6،0-7،5). ويمكن تخزين العينة عند 4 درجات مئوية محمية من الضوء تصل إلى شهر واحد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم تجميعها apoproteins WSCP المؤتلف مع كلوروفيل لفي W المستحلبات / O وفقا للبروتوكول وصفها في القسم السابق. تم تنفيذ بروتوكول باستخدام المراحل المائية التي تحتوي إما WSCPs نقية، أو لست] خلايا القولونية overexpressing WSCP (الشكل 1). بروتوكول بسيط وسريع ولا يتطلب أي معدات خاصة باستثناء الخالط الأنسجة.
الامتصاصية وCD أطياف كلوروفيل ترد مجمعات من أربعة أنواع WSCP المؤتلف، وهي RshWSCP، CaWSCP، BoWSCP وLvWSCP في الشكل 2. وهذه هي مماثلة في شكل الفرقة ويمكنها من أطياف ذكرت سابقا من المجمعات المحلية منها 10،18، 19. هذه النتائج تظهر بوضوح أن WSCP / المجمعات شيلي تشكيلها في W نظام / O مستحلب تشبه المجمعات المحلية.
ن الصفحات = "1"> لإظهار إمكانات W / O مستحلب كنظام فحص سريع لتجميع الإيجابي للWSCPs مع CHLS، استخدمت لست] الخام من خلايا القولونية التعبير عن WSCPs كمرحلة المائية للمستحلب. واستخدمت لست] من البكتيريا التي لم يبد WSCPs كما المراقبة السلبية. لوحظ التجمع الإيجابي للWSCP مع كلوروفيل وبسهولة عن طريق اللون الأخضر من المرحلة المائية، ولكن فقط في لست] من WSCP معربا عن الخلايا (الشكل 3). قطرات تحتوي على هذه لست] سمة مميزة كلوروفيل مضان في صور المجهر مبائر. وهذا يعني أن التجمع الناجح لمجمعات WSCP / كلوروفيل يمكن الكشف عنها مباشرة في قطرات الماء، والتي قد تكون أساسا لأنظمة الفرز على أساس مستحلب-W / O.
الشكل 1: جمعية WSCP مع CHLS في W / O مستحلب (A. القولونية التعبير عن WSCP. عندما مستحلب جاهز، تضاف CHLS إلى مستحلب. بعد إعادة، يتم فصل قطرات الماء من المرحلة العضوية بواسطة الطرد المركزي. (ب) W نظام مستحلب / O يمكن أن تستخدم لسرعة وارتفاع فحص الإنتاجية لإعادة الإيجابية للWSCPs مع CHLS. مضان من WSCP / كلوروفيل مجمع يمكن أن يتم الكشف عن مباشرة من microdroplets المياه عن طريق المجهر متحد البؤر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الامتصاصية وCD أطياف WSCP / كلوروفيل ومجمعات Apoproteins من أربعة.وقد أعيد المتغيرات WSCP مع 10 أضعاف الزيادة المولي من كلوروفيل أ. وكانت أطياف الامتصاص (أ) تطبيع إلى 1 في 673nm لBoWSCP (أسود)، CaWSCP (الأخضر)، وRshWSCP (الأزرق) و663nm لLvWSCP (الحمراء). تم تطبيق عوامل تطبيع نفسها على مؤتمر نزع السلاح (ب). مستنسخة بإذن من 16. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (3): المسح الضوئي مضان المجهر والفحص البصري للجمعية مجمع WSCP / كلوروفيل (أ) SDS-PAGE هاء. لست] خلية كولاي BL21 قبل وبعد إعادة مع كلوروفيل لفي المستحلبات W / O. حارة 1: خلايا BL21 دون البلازميد WSCP، 2 لين: خلايا BL21 مع جيش التحرير الشعبى الصينى WSCPSMID دون تحريض من قبل IPTG، حارة 3: خلايا BL21 مع البلازميد WSCP الناجم مع IPTG. حارة 4 و 5 و 6 هي نفس العينات والممرات 1 و 2 و 3، على التوالي، ولكن بعد فصل للمرحلة المياه من المرحلة العضوية من مستحلب. تم تشغيل قسامات صغيرة من كل عينة على هلام SDS-بروتين. حارة M: بروتين حجم علامة. وتظهر الصور من العينات قبل وبعد الانفصال المرحلة على رأس كل حارة. (ب) وصور المجهر متحد البؤر W قطرات / O أعدت مع كلوروفيل لفي مرحلة النفط. لم قطرات على الصورة اليسرى لا تحتوي على أي بروتين في حين أن تلك التي على الصورة الصحيحة الواردة البروتين WSCP. تم رصد مضان في 682 نانومتر. مستنسخة بإذن من 16. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هدفنا هو تطوير نظام عام جديد لتجميع البروتينات للذوبان في الماء ملزم الكلوروفيل مع أصباغ مسعور. ومن هنا يظهر أن نظام إعادة جديد يقوم على W / O مستحلب هو النهج العام ثبت للعمل لتجميع apoproteins WSCP من براعم بروكسل والقنبيط والفجل الياباني وفرجينيا pepperweed أعرب recombinantly في E. القولونية. هنا يتم عرض النتائج من إعادة من 1 ملغ من WSCP مع زيادة الرحى 10 أضعاف من كلوروفيل أ. ومع ذلك فإنه من الممكن أيضا استخدام تركيزات أقل من WSCP لreconstitutions ومختلفة كلوروفيل / البروتين النسب المولية. وكان الحد الأدنى من البروتين، والتي تمكنا من تجميع في W المستحلبات / O 100 ميكروغرام، في حين أن الصباغ إلى نسبة البروتين يمكن أن تختلف من 5: 1 وحتى 20: 1. أيضا، يمكن خفض حجم المرحلة المائية وصولا الى 50 ميكرولتر. في هذا العمل قدم التجمع من WSCP مع كلوروفيل أ. بعد ذلك، فمن الممكن أيضا لتجميعWSCP مع CHLS مسعور البعض، BChls ومشتقاتها. حاليا، نحن اختبار نظامنا مع بروتينات ملزمة الصباغ للذوبان في الماء الأخرى مثل FMO وحزب المؤتمر الشعبي.
وعلى الرغم من أسلوبنا هو سريعة وبسيطة هناك بعض الخطوات الهامة التي يجب أخذها في الاعتبار أثناء إعداد W / O وإعادة تشكيل WSCP مع كلوروفيل. تحتاج قارورة الزجاج، والتي تستخدم لإعداد مستحلب، أن تكون نظيفة وخالية من المنظفات. وحتى آثار صغيرة من المنظفات في قارورة يؤثر على إعداد مستحلب ويؤدي إلى تدني نوعية مستحلب. أيضا، يجب أن تكون قارورة جافة تماما. خطوة حاسمة أخرى، والتي قد تؤثر على كفاءة إعادة، هو تماما تشتت كلوروفيل في المرحلة العضوية من مستحلب. وبالتالي، فمن المهم تماما مزيج كمية صغيرة من كلوروفيل في 5 مل من مستحلب. من المهم أن تفعل العديد من الخطوات اللازمة لكسر مستحلب وإزالة الزيوت المعدنية من المرحلة المياه أيضا. أي آثار الزيوت المعدنية في المياه الرقم الهيدروجينيبورصة عمان قد تؤثر على تجارب أخرى.
W / O مستحلب، وهو نهج بديل للطريقة التي وضعتها شميت وآخرون. 11، الذي يقوم على شل حركة WSCP صاحب الموسومة على عمود اللوني تقارب واحتضان مع CHLS. على الرغم من أن طريقة شميت وآخرون، وثبت للعمل من أجل WSCPs مختلفة، فإنه يتطلب البروتينات صاحب الموسومة وقد يؤدي في غير محددة وملزمة من CHLS بواسطة ربط إلى histidines من العلامة. وعلاوة على ذلك، شل حركة البروتينات على سطح صلب قد تؤثر على بنية البروتين، وبالتالي التأثير على عملية التجميع مع أصباغ. وبالإضافة إلى ذلك، كلوروفيل، والتي كانت تستخدم لتجميع WSCPs في هذا النظام تم حله إما في العازلة التي تحتوي على المنظفات أو 40٪ الميثانول 11،12. قد يؤدي مثل هذه المذيبات في تجميع الصباغ و / أو غير محددة كلوروفيل ملزمة لWSCP. لا يعتمد نظامنا إعادة جديد يقوم على W / O مستحلب على شل حركة البروتينات إلى دعم قوي. Therefoإعادة، مطلوب أي علامة تنقية تنصهر WSCPs، والبروتينات المؤتلف مع تسلسل الأصلي يمكن تجميعها. ميزة أخرى هامة من طريقة W / O هي في التقليل من أصباغ التجميع التي قد تؤثر على كفاءة إعادة، oligomerization ورياضيات الكيمياء الصباغ / البروتين. وذلك لأن حل أصباغ مسعور في مرحلة النفط ويتم تمكين بدء العمل بها في قطرات / O W من السطح العالي لنسبة حجم هذا الأخير. وعلاوة على ذلك، فإن التحايل غير محددة ملزمة من CHLS التي كتبها WSCP منذ أصباغ مسعور لا يمكن منتشر بين المراحل العضوية والمائية للمستحلب. فقط الصبغات التي يتم تجميعها بنشاط WSCP خلال إعادة يمكن أن يدخل في microdroplets المياه من مستحلب.
طريقة تجميع WSCP مع أصباغ عن طريق خلط WSCP مع ثايلاكويد معزولة 10 مشابه لنظام مستحلب W / O المقدمة هنا. أنها لا تتطلب المنظفات أو المذيبات العضوية لسولubilizing وCHLS، ولا وضع علامات على البروتينات. ومع ذلك، فإن طريقة W / O يمكن استخدامها مع أي أصباغ غير قابل للذوبان في مرحلة النفط في حين يقتصر الطريقة السابقة لCHLS التي تكون موجودة في الأغشية الثايلاكويد أصلا. وبالتالي، هو التجمع مع خالص كلوروفيل لأو كلوروفيل د محتمل من لأن هذه متوفرة من ثايلاكويد السيانوبكتيريا من مثل. Synechocystis PCC 6803 أو Acaryochloris مارينا، على التوالي. ومع ذلك، فإنه من غير الممكن إعادة WSCP مع كلوروفيل ب منذ ويرافق هذا الصباغ دائما كلوروفيل لفي ثايلاكويد. على النقيض من ذلك، والتجمع WSCP في W / O مستحلب يمكن اختبار مع أي كلوروفيل، BChl أو بورفيرين مشتقات طبيعية أو اصطناعية. أنها لا تتطلب استخدام الأغشية الضوئي وبالتالي فهو حر من أي تدخل من عناصر خارج غشاء مثل phycobilisome التي يمكن أن تعلق على الأغشية السيانوبكتيريا. يقتصر طريقة W / O فقط من قبل ذوبان الأصباغ في مرحلة النفطالثانية بالتالي مناسبة لتجميع WSCP مع أي كلوروفيل، BChl أو بورفيرين مشتقات طبيعية أو اصطناعية.
وباختصار، قدمنا هنا طريقة عامة لتجميع البروتينات للذوبان في الماء مع أصباغ مسعور. مزاياه من ويتضح من التجمع الناجح لكلوروفيل لمع WSCPs المؤتلف مختلفة من النباتات الكرنب كما هو مبين بوضوح من قبل الطيفية والنتائج البيوكيميائية. وبالإضافة إلى ذلك، أثبتنا كيف أن بروتوكول التجمع W / O يمكن أن تستخدم لفحص سريع من WSCP / كلوروفيل التجمع معقدة باستخدام الخلية لست] القولونية overexpressing WSCPs المؤتلف ومقتطفات شيلي الخام. وبهذه الطريقة نتمكن من تخطي تستغرق وقتا طويلا خطوات تنقية البروتين وضرورة كسر المستحلبات من أجل فصل قطرات الماء من المرحلة العضوية يمكن أيضا تجنب باستخدام المجهر مضان لتصور مباشرة التجميع في قطرات الماء. انطباق العام للطريقة جديدة يجعل من استخدامأداة فول لدراسة العامل المساعد ملزمة والتجمع، وآليات بالطاقة ونقل الإلكترون في الغشاء المجمعات البروتين العامل المساعد من خلال تصميم وبناء مبسطة الاصطناعية متناظرة البروتين للذوبان في المياه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
يعترف DN بدعم من الاتحاد الأوروبي FP7 مشاريع PEPDIODE (GA 256672) وREGPOT-2012-2013-1 (GA 316157)، ومنحة بحثية شخصية (رقم 268/10) من مؤسسة العلوم اسرائيل. نشكر البروفيسور شموئيل روبنشتاين، كلية الهندسة والعلوم التطبيقية، جامعة هارفارد، كامبردج، الولايات المتحدة الأمريكية لأخذ الصور المجهري متحد البؤر.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mineral oil | Sigma | M5904 | |
| Span80 | Sigma | 85548 | |
| Tween80 | Sigma | P8074 | |
| Bio-Scale Mini Profinity eXact Cartridges | Bio Rad | 10011164 | Affinity chromatography for WSCP purification with native sequence. |
| His Trap HF column | GE Healthcare Life Science | 17-5248-02 | Affinity chromatography for WSCP purification with His-tag |
| DEAE Sepharose Fast Flow | GE Healthcare Life Science | 17-0709-01 | Chromatography medium for chlorophyll purification |
References
- Bryant, D. A., Frigaard, N. -U. Prokaryotic photosynthesis and phototrophy illuminated. Trends Microbiol. 14, 488-496 (2006).
- Tronrud, D. E., Wen, J. Z., Gay, L., Blankenship, R. E. The structural basis for the difference in absorbance spectra for the FMO antenna protein from various green sulfur bacteria. Photosynth. Res. 100, 79-87 (2009).
- Schulte, T., Johanning, S., Hofmann, E. Structure and function of native and refolded peridinin-chlorophyll-proteins from dinoflagellates. Eur. J. Cell Biol. 89, 990-997 (2010).
- Renger, G., et al. Water soluble chlorophyll binding protein of higher plants: a most suitable model system for basic analyses of pigment-pigment and pigment-protein interactions in chlorophyll protein complexes. J. Plant Physiol. 168, 1462-1472 (2011).
- Satoh, H., Uchida, A., Nakayama, K., Okada, M. Water-soluble chlorophyll protein in Brassicaceae plants is a stress-induced chlorophyll-binding protein. Plant Cell Physiol. 42, 906-911 (2001).
- Bektas, I., Fellenberg, C., Paulsen, H. Water-soluble chlorophyll protein (WSCP) of Arabidopsis is expressed in the gynoecium and developing silique. Planta. 236, 251-259 (2012).
- Damaraju, S., Schlede, S., Eckhardt, U., Lokstein, H., Grimm, B. Functions of the water soluble chlorophyll-binding protein in plants. J. Plant Physiol. 168, 1444-1451 (2011).
- Horigome, D., et al. Structural mechanism and photoprotective function of water-soluble chlorophyll-binding protein. J. Biol. Chem. 282, 6525-6531 (2007).
- Reinbothe, C., Satoh, H., Alcaraz, J. -P., Reinbothe, S. A Novel Role of Water-Soluble Chlorophyll Proteins in the Transitory Storage of Chorophyllide. Plant Physiol. 134, 1355-1365 (2004).
- Satoh, H., Nakayama, K., Okada, M. Molecular cloning and functional expression of a water-soluble chlorophyll protein, a putative carrier of chlorophyll molecules in cauliflower. J. Biol. Chem. 273, 30568-30575 (1998).
- Schmidt, K., Fufezan, C., Krieger-Liszkay, A., Satoh, H., Paulsen, H. Recombinant water-soluble chlorophyll protein from Brassica oleracea var. Botrys binds various chlorophyll derivatives. Biochemistry. 42, 7427-7433 (2003).
- Takahashi, S., et al. Molecular cloning, characterization and analysis of the intracellular localization of a water-soluble Chl-binding protein from Brussels sprouts (Brassica oleracea var. gemmifera). Plant Cell Physiol. 53, 879-891 (2012).
- Takahashi, S., Ono, M., Uchida, A., Nakayama, K., Satoh, H. Molecular cloning and functional expression of a water-soluble chlorophyll-binding protein from Japanese wild radish. J. Plant Physiol. 170, 406-412 (2013).
- Boex-Fontvieille, E., Rustgi, S., von Wettstein, D., Reinbothe, S., Reinbothe, C. Water-soluble chlorophyll protein is involved in herbivore resistance activation during greening of Arabidopsis thaliana. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 7303-7308 (2015).
- Hughes, J. L., et al. Magneto-optic spectroscopy of a protein tetramer binding two exciton-coupled chlorophylls. J. Am. Chem. Soc. 128, 3649-3658 (2006).
- Bednarczyk, D., Takahashi, S., Satoh, H., Noy, D. Assembly of water-soluble chlorophyll-binding proteins with native hydrophobic chlorophylls in water-in-oil emulsions. BBA - Bioenergetics. 1847, 307-313 (2015).
- Fiedor, L., Rosenbach-Belkin, V., Scherz, A. The stereospecific interaction between chlorophylls and chlorophyllase. Possible implication for chlorophyll biosynthesis and degradation. J. Biol. Chem. 267, 22043-22047 (1992).
- Kamimura, Y., Mori, T., Yamasaki, T., Katoh, S. Isolation, properties and a possible function of a water-soluble chlorophyll a/b-protein from brussels sprouts. Plant Cell Physiol. 38, 133-138 (1997).
- Murata, T., Itoh, R., Yakushiji, E. Crystallization of water-soluble chlorophyll-proteins from Lepidium virginicum. Biochim. Biophys. Acta. 593, 167-170 (1980).
