Summary
该原稿描述用于装配与基于水包油乳液的疏水颜料的水溶性蛋白质的简单和高通量方法。我们证明该方法在本地叶绿素大会的有效性与重组水溶性叶绿素的四种变体结合蛋白（WSCPs）的芸苔属植物在大肠杆菌中表达大肠杆菌 。
Abstract
叶绿素（的Chls）和菌绿素（BChls）是进行光合作用的光捕获和电子传递的主要辅助因子。其功能主要取决于他们的大而复杂的多亚基跨膜蛋白复合体中的特定组织。为了在分子水平上，这些配合物如何促进太阳能转换了解，重要的是要了解蛋白质颜料，和颜料颜料的相互作用，以及它们对兴奋动力学效果。获得这样的理解的一种方式是通过构建和学习的Chls的配合物与简单的水溶性的重组蛋白。然而，掺入亲脂性的Chls和BChls成水溶性蛋白是困难的。此外，不存在一般的方法，它可以用于与疏水性颜料的水溶性蛋白质的组装。在这里，我们证明根据水包油乳剂的简单和高通量系统，能使屁股疏水的Chls水溶性蛋白质的embly。的新方法，通过组装与叶绿素a 十字花科植物（WSCP）的水溶性叶绿素结合蛋白的重组形式的验证。我们证明叶绿素的成功组装表达E. WSCP 的使用原油裂解大肠杆菌细胞，其可以用于开发遗传筛选系统，用于新的水溶性叶绿素结合蛋白，以及叶绿素-蛋白相互作用和装配过程的研究。
Introduction
疏水性颜料如叶绿素（的Chls），菌绿素（BChls）和类胡萝卜素在光合作用反应中心，捕光蛋白是进行电子传输和光能量采集和传输的主要辅助因子。反应中心和大部分叶绿素结合光收获物是跨膜蛋白。非氧光合绿硫细菌1,2的Fenna -马修斯-奥尔森（FMO）的蛋白质，和甲藻3的甲藻素-叶绿素蛋白（PCP）是水溶性的捕光蛋白的特殊例子。水溶性叶绿素结合蛋白十字花科 ， 蓼 ， 藜科 （WSCPs）和苋植物4,5另一个独特的例子，但在对比FMO和PCP，这些既不参与捕光也不在任何主光合反应的和它们的精确的physiological功能还不清楚5-8。它们的高叶绿素结合亲和力，导致一个建议的功能的Chls瞬态载体和叶绿素衍生物9,10。另外，有人推测WSCP起着受损细胞清除的Chls作用和防止叶绿素引起的光氧化损伤7,11-13。最近，有人提出WSCP用作蛋白酶抑制剂和播放食草动物性过程中的作用，以及花的发育过程中14调节细胞死亡。 WSCPs根据其光物理性质分为两大类。第一类（I类， 如 ：从藜 ）可根据照明进行光转化。类从芸苔属植物，即不发生光转化5,10-二WSCPs，被进一步细分为IIa类（ 例如 ， 甘蓝，萝卜 ）和Ⅱb族（ 例如 ，来自北美独行菜 北美独行菜的结构用X射线晶体学的2.0 A分辨率8解决。它揭示了一个对称的同源四聚体，其中所述蛋白质亚基形成疏水核心。每个亚基结合的单个叶绿素，这导致在四个紧密堆积的Chls的简单所有叶绿素布置使得WSCPs潜在有用的模型系统用于研究叶绿素 - 蛋白复合物的结合和组装core.This内紧密排列，且相邻的Chls的影响和对个人的Chls的光谱和电子特性蛋白的环境中。此外，其可提供用于构建可用于人工光合作用设备捕光模块人工叶绿素结合蛋白的模板。
天然WSCPs的严谨的研究是不可行的，因为从植物中纯化复合物总是含有与叶绿素a的不同组合四聚体的异质混合物和叶绿素b 9。因此，需要一种用于组装具有的Chls 体外重组表达WSCPs的方法。这是通过的Chls的可忽略的水溶解度，这使得它不可能通过简单地与在水溶液中的颜料混合水溶性脱辅基蛋白聚集在体外复通过混合15被证明与类囊体膜的脱辅基蛋白的挑战。 在体外组装，但这种方法仅限于原生的Chls存在于类囊体的。 Schmidt 等人 。报告了在大肠杆菌中重组表达组氨酸标记的蛋白质组装与来自花椰菜（CaWSCP）WSCP几个Chl和Bchl衍生物大肠杆菌它固定到一个镍亲和柱和引进洗涤剂溶解11叶绿素衍生物。成功复溶从A重组WSCPs的拟南芥 6，和球芽甘蓝（BoWSCP），日野萝卜（RshWSCP）的还报道ð弗吉尼亚pepperweed（LvWSCP）类似的方法由被。
在这里，我们提出了一个新颖，装配与WSCP的Chls不需要标记或固定蛋白质一般情况下，直接的方法。它依赖于从在矿物油中的水溶性脱辅基蛋白的它们的水溶液制备乳液。因此蛋白质被封装在水包油（W / O）具有非常高的表面微滴体积比16。然后疏水辅因子被溶解在油中并且容易引入到从油相的液滴。我们使用方法报到WSCP脱辅基蛋白的几个变体在大肠杆菌重组表达的组装大肠杆菌与叶绿素a。我们证明从中可以用作用于开发新颖叶绿素结合蛋白筛选系统WSCP过表达的细菌粗裂解物的装配。
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Protocol
1.准备叶绿素a股票方案
- 关键步骤：执行叶绿素准备的所有步骤在化学罩，在绿光（520纳米），或在黑暗中，以尽量减少光损伤。始终冻结颜料存放前添加氮气或氩气。确保所有的溶剂均为分析纯。
- 称取约5mg仅含有叶绿素a在类囊体膜冻干螺旋藻细胞或其它蓝藻细胞，并使用研钵和杵粉碎它。
- 加载破碎细胞到玻璃柱以除去类胡萝卜素用约50-100毫升100％丙酮洗涤。丢弃洗脱橙/绿色部分。
注意：如果橙级分没有与100ml丙酮洗脱继续用丙酮洗涤该细胞直至绿色分数开始洗脱。 - 用100％甲醇交换丙酮并收集含有叶绿素a的绿色部分。洗脱FRACT的体积离子可以50-100毫升之间变化。在开始时，将洗脱级分具有深绿颜色，这在洗脱结束时变成浅绿色。当洗脱馏分的颜色变成浅绿色停止洗脱。
- 使用旋转蒸发器，直到萃取液完全干燥蒸发甲醇。不要使用热到解决方案;确保蒸发器的水浴温度不超过30℃。
注：蒸发的时间取决于甲醇馏分的体积被蒸发上，并且可以为10-60分钟之间变化。它完全干燥的提取物是很重要的。 - 溶解从干燥的提取物中的颜料的乙醚（约5-10毫升）的小体积，并通过脱脂棉过滤。确保颜料过滤前完全溶于乙醚。
- 蒸发乙醚，直至颜料完全干燥（10-30分钟）。
注意：干颜料可以与吹扫和氮气或氩气下保持在-20℃下，在黑暗中，直到进一步处理。 - 溶于最小音量可能100％的甲醇（约1毫升）的干颜料，即使不是一切都完全暂停。 4毫升丙酮添加到溶液中，并以完全溶解该色素轻轻拂去玻璃。
- 使用巴斯德吸管轻轻装载样品到DEAE柱在100％丙酮琼脂糖平衡。
- 洗脱类胡萝卜素（橙黄色带）用100％丙酮。然后，洗脱叶绿素a（绿色带）以3：1体积/体积的丙酮/甲醇混合物。
注意：丙酮和丙酮/甲醇混合物的体积是大约相当于DEAE的体积琼脂糖装在柱上。 - 验证叶绿素使用68用薄层色谱纯度 ：25：5：2二氯甲烷/正-己烷/异丙醇/甲醇（体积/体积）混合物作为洗脱液17。
- 使用旋转蒸发器蒸发溶剂，直至叶绿素a是完全干燥（10-60分钟）。
注意：干叶绿素a可以用氮气或氩气吹扫，并在黑暗中在-20℃氩气氛下贮存。 - 通过再溶解干燥的叶绿素a在2-4毫升100％乙醇的制备叶绿素原液 。
注：叶绿素a的在663纳米的消光系数是74400厘米-1 M -1（83.3 -1（毫克/毫升）-1）的乙醇。一个典型的库存溶液应具有1860对应于25mM的（23毫克/毫升）的浓度的OD。加入20微升这股到含有5ml有机相，并在1ml的水相的结果1毫克WSCP中的混合物与10倍摩尔过量的叶绿素的对比乳液WSCP。
2.准备乳液的有机相
注意：该乳液的有机相由含有4.5％（体积/体积）跨度80的矿物油，和0.4％（体积/体积）吐温80。
- 称重在50ml管0.2克的T吐温80，1.8克司盘80的，与38克矿物油。拌匀所有组件和降温冰上。
注意：将有机相可被存储在4℃至一周。
3.准备乳液的水相
注意：该乳液的水相可由任何纯化WSCP，或细菌过度WSCP的粗提取物。
- 制备含有纯化WSCP水相。
- 生长含WSCP质粒12在1升的LB培养基中，在37℃，直至0.3-0.6 OD 大肠杆菌 BL21细菌。
- 通过添加1mM的IPTG诱导蛋白质的表达。诱导后细菌生长在30℃，12〜16小时。
- 收获细菌离心5000 xg离心在4℃下10分钟。
- 溶解在冰上的结合缓冲液和超声颗粒（30秒时，15秒关，五次）。使用10个毫升缓冲液从250毫升离心获得的沉淀LB培养基与细胞过度的蛋白质。
注意：根据纯化方法，该结合缓冲液可以由的100mM磷酸缓冲液，pH 7.2或的50mM Tris，pH值7.5，500 mM氯化钠，5mM的EDTA中。 - 降速细胞裂解物在12000×g离心30分钟，在4℃下。
- 通过亲和层析纯化WSCP。取决于融合到WSCP标签，使用适当的可商购的亲和层析系统的蛋白质纯化按照生产商的说明纯化重组蛋白。
- 于乳液制剂中，使用在50mM纯化WSCP磷酸盐缓冲液，pH 7.8。确保用于重建的最终蛋白量为0.5-1.0毫克每1ml缓冲液中。
- 制备含有与WSCP粗细菌裂解液的水相。
- 生长含于250毫升LB培养基的质粒表达WSCP在37℃，直到OD 0.3-0.6 大肠杆菌 BL21细胞。
- 诱导与蛋白表达1mM的IPTG，在30℃过夜生长的细菌。
- 收获细菌细胞通过离心5000 xg离心在4℃下10分钟。
- 溶解沉淀在1-2毫升的50mM磷酸钠缓冲液pH 7.8，声处理（在30秒钟，15秒关，三次）和离心机以12,000 xg离心在4℃下30分钟。
- 通过混合0.125毫升上清液与0.875毫升50mM磷酸钠缓冲液pH 7.8的制备乳液的水相。
4. WSCP的大会在乳液叶绿素a
- 转印5毫升油 - 表面活性剂混合物到玻璃小瓶中，并冷却在冰上。移液之前，验证该有机相的所有组分充分混合并有表面活性剂和矿物油之间没有相分离。
- 加入1毫升冰冷的水相的如第3制备至5ml有机相。
- 在9500转在冰上混合使用2分钟组织匀浆两个阶段。
- 关键的一步：从这个阶段上，执行以尽量减少光损伤下绿光（520纳米）的所有进一步的步骤。加入20μl的25mM叶绿素的储备液（见1.13），以该乳液。通过轻弹和反相的玻璃小瓶分散。确保叶绿素均匀地分布在乳液中。
- 孵育乳剂在黑暗中在冰上1-2小时。
- 为了打破从有机相中的乳液和单独的水滴转移乳剂1.5毫升的塑料管和离心机在14,000rpm xg离心在室温下5分钟。
注意：如果组件是成功的，下层水相应该具有绿色。 - 配置上油相和加入1 ml矿物油。由涡或彻底翻转管沉淀的乳液拌匀矿物油。降速样品以14,000 xg离心在室温下5分钟。重复此步骤，直到一个明确的半月板分离水和矿工人油相，而没有任何中间的乳液得到的。
- 执行在化学罩此步骤。水性和矿物油相清楚地分离后，除去矿物油和加入1ml水饱和的乙醚。涡旋并在14000 xg离心降速样品在室温下5分钟。重复此步骤两次。
- 第二次离心后，除去乙醚，留下打开引擎盖5-20分钟的管子。
- 最后，装载包含WSCP /叶绿素复合水相到脱盐柱上，用适当的进一步的实验缓冲液洗脱。
注：蛋白质是在宽范围的pH（6.0-7.5）的磷酸盐和Tris缓冲液稳定。样品可以储存在避光长达一个月4℃。
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Representative Results
重组WSCP载脂蛋白组装与根据上一节中描述的方案的W / O乳剂叶绿素a。该协议使用含有任一纯WSCPs，或裂解物的大肠杆菌细胞过度WSCP（ 图1）的水相来实现。该协议是简单，快速，不需要任何特殊的设备，除了组织匀浆。
吸光度和叶绿素的CD谱四个重组WSCP变体，即RshWSCP，CaWSCP，BoWSCP和LvWSCP 一个复合物在图2所示，这些都在带的形状和位置，以各自的天然复合物10,18的以前报道的光谱类似， 19。这些结果清楚地表明，WSCP / W / O型乳化体系重构叶绿素配合物酷似天然复合物。
大肠杆菌细胞的粗裂解物用作乳液的水相。不表达WSCPs细菌裂解物用作阴性对照。与叶绿素a WSCP的正面组件很容易通过水相的绿色观察到的，但仅在表达细胞（ 图3）WSCP的裂解物。含有这些液滴裂解鲜明特色的叶绿素共聚焦显微镜图像的荧光。这意味着，WSCP /叶绿素配合物的成功的组件可直接在水滴，这可能是基于乳液W / O型的筛选系统的基础来检测。
图1：大会提供的Chls W / O型乳液WSCP的（A。 大肠杆菌细胞裂解物混合。当乳剂是准备好了，的Chls都加入到乳液中。重建后，将水液滴从有机相离心分离。 （B）的W / O乳液系统可用于与的Chls WSCPs的阳性重组快速高通量筛选。在WSCP /叶绿素复杂的荧光可以直接从共聚焦显微镜的微细水滴被检测到。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：吸光度和WSCP /叶绿素的CD谱的四个 配合载脂蛋白。WSCP变体与10倍摩尔过量的叶绿素a的重构。吸收光谱（ 一 ）标准化为1在673nm为BoWSCP（黑色），CaWSCP（绿），和RshWSCP（蓝色）和663nm为LvWSCP（红色）。相同的归一化因子被应用到CD（b）中 。从16转载。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3： 扫描荧光显微镜和WSCP /叶绿素复杂装配体视觉筛选 E.（ 一 ）SDS-PAGE。之前和在W / O型乳剂叶绿素a重构后菌 BL21细胞裂解物。第1道：BL21细胞无WSCP质粒，泳道2：BL21细胞与WSCP解放军SMID而不经IPTG诱导，泳道3：BL21细胞用IPTG诱导的WSCP质粒。泳道4，5和6是相同的样品作为泳道1，2和3，分别，但之后，从该乳液的有机相中的水相的分离。各样品的小等分试样在SDS蛋白质凝胶上运行。泳道M：蛋白大小标记。样品之前和相分离后的图像显示在每个泳道的顶部。 （B）与叶绿素a的油相制备W / O液滴的共聚焦显微镜图像。左图像上的液滴不含有，而那些在右图像上载WSCP蛋白的任何蛋白质。荧光在682处监测。从16转载。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
我们的目标是开发用于与疏水性颜料的水溶性叶绿素结合蛋白的组装一个新的通用系统。这表明，基于W / O乳液的新重组系统是被证明为从球芽甘蓝，花椰菜，日本辣根和弗吉尼亚pepperweed在大肠杆菌中重组表达WSCP脱辅基蛋白的组装工作的一般方法大肠杆菌 。这里的结果是从1毫克WSCP的重构带有10倍摩尔过量的叶绿素a的。然而也可以使用较低浓度WSCP用于reconstitutions和不同的Chl /蛋白质的摩尔比。蛋白的最小量，这是我们能够在W / O型乳剂组装为100微克，而颜料对蛋白质比可以从5变化：1和高达20:1。此外，水相的体积可以降低到50微升。在这项工作中与叶绿素a WSCP大会提出。然而，它也可以组装WSCP与其它疏水性的Chls，BChls和它们的衍生物。目前，我们正在测试我们的系统与其他水溶性色素结合蛋白，如FMO和PCP。
虽然，我们的方法是快速，简单的有一些关键步骤，这就需要WSCP与叶绿素W / O准备和重建过程中加以考虑。的玻璃小瓶中，其被用于乳剂制备，需要清洁，无洗涤剂。在小瓶洗涤剂即使是很小的痕迹会影响乳液的制备，并导致乳液的低质量。另外，小瓶应完全干燥。其它关键步骤，这可能会影响到重建效率，是彻底乳液的有机相叶绿素的分散。因此，重要的是要在5ml乳液的充分混合叶绿素的小体积。也做许多步骤根据需要打破乳液和完全从水相除去矿物油重要。在水的pH值的矿物油的任何痕迹日月光可能影响进一步的实验。
W / O乳液是由Schmidt 等 11建立的方法，该方法是基于固定的亲和层析柱His标记WSCP并用的Chls孵育的另一种方法。虽然，的Schmidt 等人的方法，被证明为不同WSCPs工作，它要求His标记的蛋白质，并且可以通过连接到标签的组氨酸导致非特异性结合的Chls的。此外，在固体表面上固定蛋白质可能影响蛋白质结构，从而影响与颜料的组装过程。此外，叶绿素，其用于WSCPs的装配在该系统中溶解或者在含有洗涤剂或40％甲醇11,12缓冲器。这些溶剂可能导致颜料聚集和/或非特异性叶绿素结合WSCP。基于W / O型乳液我们新的重构体系不依赖于固定的蛋白质坚实的支持。 Therefo再融合，以WSCPs没有纯化标记是必需的，并与天然序列的重组蛋白可组装。在W / O的方法的另一个重要的优点是在最小化可能影响重建效率，低聚和颜料/蛋白质化学计量颜料聚集。这是因为疏水性的颜料溶解在油相和它们引入的W / O微滴是由高表面使后者的体积比。此外，通过WSCP的Chls的非特异性结合被规避，因为疏水性颜料不能乳液的有机相和水相之间扩散。仅正在积极由WSCP重建期间组装色素可以进入该乳液的水微滴。
通过用分离的类囊体10混合WSCP组装与颜料WSCP的方法类似于这里提出的W / O乳液系统。它要求对溶胶清洁剂或有机溶剂ubilizing的的Chls，也没有标记的蛋白质。但是，在W / O的方法可以与，而以前的方法仅限于的Chls是本身存在于类囊体膜可溶于油相中的任何颜料一起使用。因此，装配与纯叶绿素a或叶绿素d为可能的，因为这些都可以从例如 ， 集胞藻6803或分别Acaryochloris码头 ，蓝藻类囊体。然而，这是不可行的与叶绿素b来重建WSCP因为在类囊体这种色素总是伴随着叶绿素a。与此相反，在W / O乳液WSCP组件可与任何天然或人造的叶绿素，BCHL或卟啉衍生物进行测试。它不需要使用光合膜，从而它是从外膜成分，例如藻胆体可以连接到蓝藻膜的干涉。在W / O的方法是通过颜料在油相中的溶解度只有有限第二因此适合WSCP组件与任何天然或人造的叶绿素，BCHL或卟啉衍生物。
总之，我们在这里提出用于组装水溶性蛋白具有疏水颜料的一般方法。它由叶绿素a与来自芸苔属植物的明确光谱和生化结果表明，不同的重组WSCPs的成功组装进行了论证的优势。此外，我们演示了如何在W / O部件协议，可以通过使用大肠杆菌细胞裂解液过量表达重组WSCPs和原油提取叶绿素用于WSCP /叶绿素复杂装配体的快速筛选。以这种方式，我们可以跳过耗时蛋白质纯化步骤，并且也通过使用荧光显微镜在水滴直接可视化的组件来避免需要以水滴从有机相分离打破乳液。新方法的普遍适用性使得它的使用通过设计和建造的人工简化水溶性蛋白的类似物研究跨膜蛋白复合物的辅因子结合辅助因子和装配，以及能源和电子转移机制的工具。
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Disclosures
作者宣称，他们没有竞争的经济利益。
Acknowledgments
DN承认欧盟FP7项目PEPDIODE（GA 256672）和REGPOT-2012-2013-1（GA 316157），并从以色列科学基金会个人研究资助（编号十分之二百六十八 ）的支持。我们感谢什穆埃尔·鲁宾斯坦教授，工程学院和应用科学，哈佛大学，马萨诸塞州剑桥，美国采取的共聚焦显微镜图像。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mineral oil | Sigma | M5904 | |
| Span80 | Sigma | 85548 | |
| Tween80 | Sigma | P8074 | |
| Bio-Scale Mini Profinity eXact Cartridges | Bio Rad | 10011164 | Affinity chromatography for WSCP purification with native sequence. |
| His Trap HF column | GE Healthcare Life Science | 17-5248-02 | Affinity chromatography for WSCP purification with His-tag |
| DEAE Sepharose Fast Flow | GE Healthcare Life Science | 17-0709-01 | Chromatography medium for chlorophyll purification |
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