Summary
Dit manuscript beschrijft een eenvoudige en high-throughput werkwijze voor het samenstellen in water oplosbare eiwitten met hydrofobe pigmenten die is gebaseerd op water-in-olie-emulsies. We tonen de effectiviteit van de werkwijze voor de assemblage van natieve chlorofyl vier varianten van recombinant water oplosbare chlorofyl-bindende eiwitten (WSCPs) van Brassica planten tot expressie gebracht in E. coli.
Abstract
Chlorofyl (Chls) en bacteriochlorofylen (BChls) zijn de primaire co-factoren die fotosynthetische licht oogsten en elektron transport uit te voeren. Hun functionaliteit kritisch afhankelijk van hun specifieke organisatie in grote en ingewikkelde multisubunit transmembraaneiwit complexen. Om te begrijpen op moleculair niveau hoe deze complexen vergemakkelijken zonne-energie conversie, is het essentieel om eiwit-pigment en pigment pigment-interacties en hun effect op opgewonden dynamiek begrijpen. Een manier van het verkrijgen van een dergelijk begrip is door de aanleg en het bestuderen van complexen van Chls met eenvoudige water oplosbare recombinante eiwitten. Echter, waarin de lipofiele Chls en BChls in water oplosbare eiwitten is moeilijk. Bovendien is er geen algemene methode, die kan worden gebruikt voor montage van in water oplosbare eiwitten met hydrofobe pigmenten. Hier tonen we een eenvoudige en high throughput systeem op basis van water-in-olie emulsies, die mogelijk maakt assembly van in water oplosbare eiwitten met hydrofobe Chls. De nieuwe werkwijze werd gevalideerd door het samenvoegen van recombinant versies van de in water oplosbare chlorofyl bindingeiwit Brassicaceae planten (WSCP) met een Chl. We tonen de succesvolle montage van Chl een met behulp van ruwe lysaten van WSCP uitdrukken E. coli cellen, die kunnen worden gebruikt voor het ontwikkelen van een genetische screen voor nieuwe wateroplosbare Chl-bindende eiwitten en voor studies van Chl-eiwit interacties en assemblageprocessen.
Introduction
Hydrofobe pigmenten zoals chlorofyl (Chls), bacteriochlorofylen (BChls) en carotenoïden zijn de primaire co-factoren in fotosynthetische reactie centra en lichte harvesting eiwitten die elektronentransport, en licht energie op te vangen en de overdracht uit te voeren. Het reactiemengsel centra en de meeste van de Chl-bindende light harvesting complexen transmembraan eiwitten. De Fenna-Matthews-Olson (FMO) eiwit van niet-oxygenic fotosynthetische groene zwavel bacteriën 1,2, en de peridinin-Chl eiwit (PCP) van dinoflagellaten 3 zijn uitzonderlijke voorbeelden van water oplosbare licht harvesting eiwitten. De in water oplosbare chlorofyl bindende eiwitten (WSCPs) van Brassicaceae, Polygonaceae, Chenopodiaceae en Amaranthaceae installaties 4, 5 zijn een uniek voorbeeld, maar in tegenstelling tot FMO en PCP, deze zijn niet betrokken in light harvesting of in een van de primaire fotosynthetische reactie , en hun precieze physiological functies zijn nog onduidelijk 5-8. Hun hoge Chl-bindingsaffiniteit hebben geleid tot een voorgestelde functie als tijdelijke dragers van Chls Chl en derivaten 9,10. Als alternatief werd de hypothese dat WSCP speelt een rol in het wegvangen Chls in beschadigde cellen en beschermt tegen Chl-geïnduceerde oxidatieve schade 7,11-13. Recenter werd gesuggereerd dat WSCP functioneert als een proteaseremmer en speelt een rol bij herbivore weerstand en reguleert celdood bij bloemontwikkeling 14. WSCPs worden onderverdeeld in twee hoofdklassen volgens hun fotofysische eigenschappen. De eerste klasse (klasse I, bijv. Uit Chenopodium album) kan photoconversion ondergaan bij belichting. II WSCPs van Brassica planten, die niet photoconversion 5,10 ondergaan, worden verder onderverdeeld in klasse IIa (bijv., Uit Brassica oleracea, Raphanus sativus) en IIb (bijv., Van Lepidium virginicum Lepidium virginicum werd opgelost door röntgenkristallografie bij 2,0 Å resolutie 8. Het openbaart een symmetrische homotetrameer waarin het eiwit subeenheden vormen een hydrofobe kern. Elke subeenheid bindt één Chl die resulteert in een strakke regeling van vier dicht opeengepakte Chls binnen core.This eenvoudige all Chl opstelling maakt WSCPs een nuttig model voor het bestuderen binding en assemblage van Chl-eiwitcomplexen, en de effecten van aangrenzende Chls en eiwit omgevingen op de spectrale en elektronische eigenschappen van individuele Chls. Bovendien kan het sjablonen voor het construeren van kunstmatige Chl-bindende eiwitten die kunnen worden gebruikt voor lichte oogsten modules in kunstmatige fotosynthetische nicatieapparatuur.
Rigoureuze studies van natief WSCPs niet haalbaar omdat de complexen gezuiverd uit planten een heterogeen mengsel van tetrameren met verschillende combinaties van een Chl bevatten altijden Chl b 9. Aldus wordt een werkwijze voor het assembleren van recombinant tot expressie WSCPs met Chls in vitro vereist. Dit wordt uitgedaagd door de verwaarloosbare wateroplosbaarheid van Chls waardoor het onmogelijk om het complex in vitro assembleren door eenvoudig mengen van het wateroplosbare apoproteins met pigmenten in waterige oplossingen. In vitro assemblage door mengen van de apoproteïnen met thylakoïdmembranen 15 werd aangetoond, maar deze methode wordt beperkt tot de natieve Chls in de thylakoiden. Schmidt et al. rapporteerde over het monteren van een aantal Chl en BChl derivaten met WSCP van bloemkool (CaWSCP) door recombinant expressie brengen van een histidine-tag eiwit in E. coli immobiliseren deze op een Ni-affiniteitskolom en invoering Chl derivaten opgelost in 11 detergentia. Succesvol reconstitutie van recombinant WSCPs van A. thaliana 6, en spruitjes (BoWSCP), Japans wilde radijs (RshWSCP) eend Virginia pepperweed (LvWSCP) op een dergelijke manier werden ook gemeld.
Hier presenteren we een nieuwe, algemene, eenvoudige werkwijze voor het assembleren Chls met WSCP die geen tagging vereist of immobiliseren van de eiwitten. Het berust op het bereiden van emulsies van de waterige oplossingen van de wateroplosbare apoproteïnen in minerale olie. De eiwitten worden aldus ingekapseld in water-in-olie (W / O) microdruppeltjes met zeer hoog oppervlak volumeverhouding 16. De hydrofobe cofactoren worden vervolgens opgelost in de olie en worden gemakkelijk geïntroduceerd in de druppeltjes van de oliefase. We rapporteren volgens de werkwijze voor het samenstellen van verschillende varianten van WSCP apoproteïnen recombinant tot expressie gebracht in E. coli met Chl a. We tonen het samenstel uit ruw lysaat van WSCP overexpressie bacteriën die kunnen worden gebruikt als een screening voor de ontwikkeling van nieuwe Chl eiwitten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding Chl a Stock Solutions
- Kritische stap: Voer alle stappen van chlorofyl voorbereiding in een chemische kap, onder groen licht (520 nm) of in het donker om photodamage een minimum te beperken. Voeg altijd stikstof of argon voor het bevriezen van de pigmenten voor opslag. Zorg ervoor dat alle oplosmiddelen zijn analytische kwaliteit.
- Weeg ongeveer 5 mg gelyofiliseerde Spirulina platensis cellen of andere cellen die slechts cyanobacterie Chl een in thylakoïdmembranen doppen en met een mortier en stamper.
- Laad gebroken cellen op een glazen kolom en was met ongeveer 50-100 ml 100% aceton om carotenoïden te verwijderen. Gooi de geëlueerde oranje / groene fractie.
Opmerking: Als de oranje fractie niet wordt geëlueerd met 100 ml aceton blijven de cellen te wassen met aceton tot de groene fractie begint te elueren. - Exchange aceton met 100% methanol en laat de groene fractie die een Chl. Het volume geëlueerd fraction kan variëren tussen 50-100 ml. In het begin, de geëlueerde fractie een donkergroene kleur, die verandert in lichtgroen eind elutie. Wanneer de kleur geëlueerde fractie verandert in lichtgroen stopt de elutie.
- Damp de methanol met een rotatieverdamper totdat het extract volledig droog. Heeft warmte niet van toepassing zijn op de oplossing; waarborgen dat de verdamper waterbad temperatuur niet boven 30 ° C.
Opmerking: De tijd van verdamping is afhankelijk van de hoeveelheid methanol fractie verdampt en variabel tussen 10-60 min. Het is belangrijk om het extract drogen. - Lossen de pigmenten van de droge stof in een klein volume diethylether (ongeveer 5-10 ml) en gefiltreerd door watten. Zorg ervoor dat de pigmenten volledig voordat filtering worden opgelost in ether.
- Damp de diethylether totdat de pigmenten zijn volledig droog (10-30 min).
Opmerking: De droge pigmenten kan worden gespoeld met en onder stikstof of argon gehouden op -20 ° C, in het donker totdat zij worden verwerkt. - Los de droge pigmenten in het kleinst mogelijke volume van 100% methanol (ongeveer 1 ml), zelfs indien niet alles volledig is gesuspendeerd. Voeg 4 ml aceton aan de oplossing en veeg het glas voorzichtig om de pigmenten volledig op te lossen.
- Met een Pasteur-pipet, plaatst het monster voorzichtig op een kolom van DEAE SEPHAROSE geëquilibreerd in 100% aceton.
- Elueer carotenoïden (een oranje-gele band) met 100% aceton. Dan, elueren Chl een (groene band) met 3: 1 v / v aceton / methanol mengsel.
Opmerking: Het volume aceton en aceton / methanolmengsel is ongeveer gelijk aan de hoeveelheid DEAE SEPHAROSE geladen op de kolom. - Verifiëren Chl een zuiverheid dunnelaagchromatografie onder toepassing van een 68: 25: 5: 2 dichloormethaan / n-hexaan / isopropanol / methanol (v / v) mengsel als elutiemiddel 17.
- Damp het oplosmiddel met een rotatieverdamper totdat de Chl een volledig droog (10-60 min).
Opmerking: De droge Chl a kan worden gespoeld met stikstof of argon en onder argonatmosfeer opgeslagen bij -20 ° C in het donker. - Bereid Chl een voorraadoplossing door het opnieuw oplossen van het droge Chl een in 2-4 ml 100% ethanol.
Noot: De extinctiecoëfficiënt van Chl een bij 663 nm 74.400 cm -1 -1 M (83,3 cm -1 (mg / ml) -1) in ethanol. Een typische stockoplossing moet een OD van 1860 overeenkomend met een concentratie van 25 mM (23 mg / ml) zijn. Toevoegen van 20 ui van deze voorraad tot een emulsie die 5 ml organische fase, en 1 mg WSCP in 1 ml waterige fase resulteert in een mengsel met 10-voudige molaire overmaat van Chl a vs. WSCP.
2. Voorbereiden Organische fase van de emulsie
Opmerking: De organische fase van de emulsie bestaat uit minerale olie die 4,5% (v / v) Span 80 en 0,4% (v / v) Tween 80.
- Weeg in een 50 ml buis 0,2 g Tween 80, 1,8 g Span 80 en 38 g minerale olie. Meng goed alle componenten en afkoelen op ijs.
Opmerking: De organische fase kan in 4 ° C worden bewaard tot een week.
3. bereiding van de waterige fase van de emulsie
Opmerking: De waterfase van de emulsie kan zijn samengesteld uit ofwel gezuiverd WSCP of ruwe extract van bacteriën tot overexpressie WSCP.
- Het voorbereiden van een waterige fase die gezuiverde WSCP.
- Kweek E. coli BL21 bacteriën bevattende WSCP plasmide 12 in 1 liter LB-medium bij 37 ° C tot OD van 0,3-0,6.
- Induceren eiwitexpressie door toevoeging van 1 mM IPTG. Na inductie bacteriën groeien bij 30 ° C gedurende 12-16 uur.
- Oogst bacteriën door centrifugeren bij 5000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
- Los de pellet in bindingsbuffer en ultrasone trillingen op ijs (30 sec op 15 sec off, vijf keer). Gebruik 10 ml buffer voor de pellet verkregen door centrifugeren van 250 mlLB-medium met overexpressie van het eiwit.
Opmerking: Afhankelijk van de zuiveringswerkwijze kan het bindende buffer samengesteld uit 100 mM fosfaatbuffer, pH 7,2 of 50 mM Tris, pH 7,5, 500 mM NaCl, 5 mM EDTA. - Spin down het cellysaat bij 12.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C.
- Zuiver WSCP door affiniteitschromatografie. Afhankelijk van het label gefuseerd aan WSCP, zuiveren recombinante eiwitten onder toepassing van de geschikte commercieel verkrijgbare affiniteitschromatografie voor eiwitzuivering volgende instructies van de fabrikant.
- Voor emulsiebereiding Gebruik gezuiverd WSCP in 50 mM fosfaatbuffer, pH 7,8. Zorg ervoor dat de uiteindelijke eiwit bedrag dat wordt gebruikt voor de oplossing is 0,5-1,0 mg per 1 ml buffer.
- Het voorbereiden van een waterige fase die ruwe bacteriële lysaat met WSCP.
- Kweek E. coli BL21 cellen bevattende plasmide dat WSCP in 250 ml LB-medium bij 37 ° C tot OD 0,3-0,6.
- Induceren eiwit expressie met1 mM IPTG en groei van bacteriën overnacht bij 30 ° C.
- Oogst bacteriecellen door centrifugeren bij 5000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
- Los het pellet in 1-2 ml 50 mM natriumfosfaatbuffer pH 7,8, ultrasone trillingen (30 sec op, 15 seconden af, drie keer) en centrifugeer bij 12.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C.
- Bereid de waterfase van de emulsie door mengen 0,125 ml supernatant met 0,875 ml van 50 mM natriumfosfaatbuffer pH 7,8.
4. Montage van WSCP met Chl een in Emulsion
- Transfer 5 ml olie-oppervlakteactieve mengsel in een glazen flesje en afkoelen op ijs. Voordat pipetteren, controleren of alle componenten van de organische fase grondig gemengd en er geen fasescheiding tussen oppervlakteactieve stoffen en minerale olie.
- Voeg 1 ml ijskoude waterige fase bereid zoals in hoofdstuk 3-5 ml organische fase.
- Meng beide fasen met een tissue homogenisator gedurende 2 minuten bij 9500 rpm op ijs.
- Kritische stap: Uit deze fase op, voeren alle verdere stappen onder groen licht (520 nm) om photodamage een minimum te beperken. Voeg 20 ul van 25 mM Chl een voorraad-oplossing (zie paragraaf 1.13) aan de emulsie. Verspreiden door de knop en het omkeren van de glazen flacon. Zorg ervoor dat de Chl gelijkmatig wordt verdeeld in de emulsie.
- Incubeer de emulsie gedurende 1-2 uur op ijs in het donker.
- Om breken de emulsie en afzonderlijke druppeltjes van de organische fase overdracht van de emulsie 1,5 ml plastic buizen en centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
Opmerking: Als de assemblage succesvol is, moet de onderste waterfase een groene kleur hebben. - Gooi de bovenste oliefase en voeg 1 ml van minerale olie. Meng goed de minerale olie met het ingehulde emulsie door vortex of door het wegknippen van de buis grondig. Spin down het monster bij 14.000 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Herhaal deze stap tot een heldere meniscus het scheiden van de waterige en mijnwerkeral oliefase, zonder enige intermediaire emulsie wordt verkregen.
- Voer deze stap in een chemische kap. Nadat de waterige en oliehoudende fasen duidelijk gescheiden, mineraal- olie en voeg 1 ml met water verzadigde diethylether. Vortex en spin neer het monster bij 14.000 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Herhaal deze stap twee keer.
- Na de tweede centrifugeren, verwijder de diethylether en laat de buizen geopend voor 5-20 min in de kap.
- Tenslotte plaatst de waterige fase die het WSCP / Chl complex op een ontzoutingskolom en elueer met buffer geschikt voor verdere experimenten.
Opmerking: Het eiwit is stabiel in Tris buffers fosfaten in een breed pH (6,0-7,5). Het monster kan worden opgeslagen bij 4 ° C beschermd tegen licht maximaal een maand.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Recombinante WSCP apoproteins werden geassembleerd met Chl in een W / O-emulsies volgens de in de vorige paragraaf beschreven protocol. Het protocol werd uitgevoerd met behulp waterfasen dat hetzij zuiver WSCPs of lysaten E.coli overexpressie WSCP (figuur 1). Het protocol is eenvoudig, snel en vereist geen speciale apparatuur nodig, behalve een tissue homogenisator.
De absorptie en CD spectra van een Chl complexen vier recombinante WSCP varianten, namelijk RshWSCP, CaWSCP, BoWSCP en LvWSCP zijn weergegeven in figuur 2. Deze zijn vergelijkbaar in bandvorm en positie met eerder gerapporteerde spectra van de respectievelijke natieve complexen 10,18, 19. Deze resultaten tonen duidelijk dat WSCP / Chl complexen gereconstitueerd in W / O-emulsie systeem lijkt het natieve complexen.
E. coli cellen die WSCPs werden gebruikt als de waterfase van de emulsie. Lysaten van bacteriën die niet WSCPs heeft uitgesproken werden gebruikt als negatieve controle. Positieve samenstel van WSCP met een Chl wordt gemakkelijk waargenomen door de groene kleur van de waterfase, maar alleen in lysaten van WSCP expressie brengende cellen (Figuur 3). De druppeltjes van die deze lysaten beschikken over verschillende Chl een fluorescentie in confocale microscoop beelden. Dit impliceert dat succesvolle montage van WSCP / Chl complexen direct in de waterdruppels, die de basis voor W / O-emulsie gebaseerde screening systemen kunnen worden gedetecteerd.
Figuur 1: Assemblage van WSCP met Chls in W / O emulsies (A. E.coli cellysaten expressie WSCP bevat. Als de emulsie bereid wordt Chls aan de emulsie toegevoegd. Na bereiding worden waterdruppels gescheiden van de organische fase door centrifugeren. (B) W / O-emulsie kan worden gebruikt voor snelle en high throughput screening op positieve reconstitutie van WSCPs met Chls. De fluorescentie van de WSCP / Chl complex kan direct uit het water microdruppels door een confocale microscoop worden gedetecteerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Absorptie en CD spectra van WSCP / Chl een Complexen apoproteins van vier.WSCP varianten werden gereconstitueerd met 10-voudige molaire overmaat van een Chl. De absorptie spectra (a) werden genormaliseerd tot 1 op 673nm voor BoWSCP (zwart), CaWSCP (groen), en RshWSCP (blauw) en 663nm voor LvWSCP (rood). Dezelfde normalisatiefactoren werden aangebracht op de CD (b). Overgenomen met toestemming van 16. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Scanning fluorescentiemicroscopie en Visual Screening van WSCP / Chl Complex Samenstel (A) SDS-PAGE van E.. coli BL21 cellysaten voor en na reconstitutie met Chl een in de W / O emulsies. Laan 1: BL21 cellen zonder plasmide WSCP, laan 2: BL21 cellen met de WSCP plasmid zonder inductie door IPTG, laan 3: BL21 cellen met het plasmide WSCP geïnduceerd met IPTG. Laan 4, 5 en 6 zijn dezelfde monsters als lanen 1, 2 en 3, respectievelijk, maar na afscheiding van de waterfase van de organische fase van de emulsie. Kleine hoeveelheden van elk monster liet men lopen op een SDS-gel eiwit. Lane M: eiwit grootte marker. Afbeeldingen van de monsters voor en na fasescheiding weergegeven boven elke baan. (B) Confocale microscoop foto van W / O druppels bereid met Chl een in de olie-fase. De druppels op de linker afbeelding geen eiwit bevatten dat deze op het juiste beeld bevat WSCP eiwit. De fluorescentie werd gevolgd bij 682 nm. Overgenomen met toestemming van 16. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ons doel was om een nieuw algemeen stelsel samenstel van in water oplosbare chlorofyl-bindende eiwitten met hydrofobe pigmenten ontwikkelen. Hier wordt aangetoond dat de nieuwe reconstructie op basis van W / O-emulsie is een algemene benadering bewezen te werken voor de montage WSCP apoproteïnen van spruitjes, bloemkool, Japanse mierikswortel en Virginia pepperweed recombinant tot expressie gebracht in E. coli. Hier resultaten gepresenteerd van reconstitutie van 1 mg WSCP met 10-voudige molaire overmaat van een Chl. Het is echter ook mogelijk lagere concentraties WSCP gebruiken voor reconstructies en verschillende Chl / eiwit molaire verhoudingen. De minimale hoeveelheid eiwit, waarvan we konden monteren in W / O-emulsies was 100 ug, terwijl het pigment eiwitverhouding kan variëren van 5: 1 en tot 20: 1. Ook kan het volume van waterfase te worden verlaagd tot 50 ul. In dit werk de assemblage van WSCP met Chl een wordt gepresenteerd. Toch is het ook mogelijk te monterenWSCP met andere hydrofobe Chls, BChls en hun derivaten. Momenteel testen we ons systeem met andere in water oplosbare pigment-bindende eiwitten zoals FMO en PCP.
Hoewel onze werkwijze is snel en eenvoudig er enkele kritische stappen, waarmee bij W / O preparaat en reconstitutie van WSCP met Chl beschouwd. De glazen flesjes, die worden gebruikt voor emulsiebereiding moeten schoon en vrij van detergens zijn. Zelfs kleine sporen van wasmiddelen in flesjes van invloed op de emulsie voorbereiding en resulteren in een lage kwaliteit van de emulsie. Ook moet de injectieflacons volledig droog zijn. Andere belangrijke stap, die de reconstructie efficiëntie kan beïnvloeden, is door en door dispersie van Chl in de organische fase van de emulsie. Daarom is het belangrijk om een klein volume Chl volledig mengen in 5 ml van emulsie. Het is ook belangrijk om zoveel stappen te doen die nodig zijn om af te breken emulsie en minerale olie volledig te verwijderen uit waterfase. Sporen van minerale olie in water phase kunnen beïnvloeden verdere experimenten.
W / O-emulsie is een alternatieve benadering voor de werkwijze die door Schmidt et al. 11, die was gebaseerd op het immobiliseren His gemerkte WSCP op affiniteit kolomchromatografie en incuberen met Chls. Hoewel de werkwijze van Schmidt et al., Bleek te werken voor verschillende WSCPs, vereist His-gemerkte eiwitten en kunnen leiden tot niet-specifieke binding van Chls door ligatie aan de histidines van de tag. Bovendien, het immobiliseren van eiwitten op een stevige ondergrond kan eiwitstructuur beïnvloeden, waardoor het assemblageproces met pigmenten beïnvloeden. Bovendien Chl, die voor de montage WSCPs werd gebruikt in dit systeem werd opgelost in buffer die ofwel detergentia of 40% methanol 11,12. Dergelijke oplosmiddelen kunnen leiden tot pigment aggregatie en / of aspecifieke binding aan Chl WSCP. Onze nieuwe reconstructie op basis van W / O-emulsie is niet afhankelijk van het immobiliseren van eiwitten op vaste drager. Therefoopnieuw, geen zuivering tag gefuseerd met WSCPs vereist en recombinante eiwitten met natieve sequentie kunnen worden geassembleerd. Een ander belangrijk voordeel van de W / O werkwijze voor het minimaliseren pigmenten aggregatie die reconstitutie efficiëntie, oligomerisatie en pigment / eiwit stoichiometrie kunnen beïnvloeden. Dit komt omdat de hydrofobe pigmenten in de oliefase opgelost en zij in het W / O druppels wordt mogelijk gemaakt door de hoge oppervlakte tot volumeverhouding van laatstgenoemde. Bovendien aspecifieke binding van Chls door WSCP wordt omzeild aangezien hydrofobe pigmenten niet diffunderen tussen de organische en waterige fasen van de emulsie. Alleen pigmenten die actief door WSCP worden geassembleerd tijdens de reconstructie kan in het water microdruppels van de emulsie in te voeren.
Werkwijze voor het samenstellen WSCP met pigmenten door mengen WSCP met geïsoleerde thylakoiden 10 is vergelijkbaar met de W / O emulsiesysteem hier gepresenteerd. Het vereist reinigingsmiddelen of organische oplosmiddelen voor solubilizing de Chls, noch tagging de eiwitten. Echter, de W / O-werkwijze worden gebruikt met elk pigmenten die oplosbaar is in de oliefase terwijl de vorige methode wordt beperkt tot Chls die standaard aanwezig thylakoïdmembranen zijn. Dus, montage met pure Chl a of Chl d is mogelijk vanaf, omdat deze zijn verkrijgbaar bij cyanobacteriën thylakoiden van bv. Synechocystis PCC 6803 of Acaryochloris jachthaven, respectievelijk. Het is echter niet haalbaar om WSCP reconstitueren met Chl b aangezien dit pigment altijd moet worden Chl een in thylakoiden. Daarentegen kan WSCP montage in W / O-emulsie worden getest met een natuurlijke of kunstmatige Chl, BChl of porfyrinederivaten. Het vereist geen gebruik van fotosynthetische membranen en is daardoor zonder inmenging van extra membraan componenten zoals phycobilisome dat voor cyanobacteriën membranen zijn bevestigd. De W / O methode wordt alleen beperkt door de oplosbaarheid van pigmenten in de oliefase eennd daarom geschikt voor WSCP montage met een natuurlijke of kunstmatige Chl, BChl of porfyrine derivaten.
Kortom, wij hier gepresenteerde algemene werkwijze voor het assembleren in water oplosbare eiwitten met hydrofobe pigmenten. De voordelen zijn aangetoond door het succes samenstel Chl een verschillende recombinant WSCPs van Brassica planten zoals duidelijk blijkt uit spectroscopische en biochemische resultaten. Bovendien toonden we aan hoe de W / O-eenheid protocol voor snelle screening van WSCP / Chl complex samenstel kan worden gebruikt met E.coli overexpressie cellysaten recombinante WSCPs en Chl ruwe extracten. Zo kunnen we tijd doorgaan beslag eiwitzuivering stappen en de noodzaak van het breken van emulsies om de waterdruppels te scheiden van de organische fase kan ook worden voorkomen door fluorescentiemicroscopie voor het direct visualiseren van het samenstel in waterdruppels. De algemene toepasbaarheid van de nieuwe methode maakt het een gebruikful hulpmiddel voor het bestuderen van cofactor binding en assemblage, en energie- en elektron overdracht mechanismen transmembraaneiwit-cofactor complexen door het ontwerpen en bouwen van hun vereenvoudigde kunstmatig in water oplosbare proteïne-analogen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
DN erkent de steun van EU FP7-projecten PEPDIODE (GA 256.672) en REGPOT-2012-2013-1 (GA 316.157), en een persoonlijke onderzoeksbeurs (nr 268/10) van het Israël Science Foundation. Wij danken Prof. Shmuel Rubinstein, School of Engineering and Applied Sciences, Universiteit van Harvard, Cambridge MA, Verenigde Staten voor het nemen van de confocale microscopie beelden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mineral oil | Sigma | M5904 | |
| Span80 | Sigma | 85548 | |
| Tween80 | Sigma | P8074 | |
| Bio-Scale Mini Profinity eXact Cartridges | Bio Rad | 10011164 | Affinity chromatography for WSCP purification with native sequence. |
| His Trap HF column | GE Healthcare Life Science | 17-5248-02 | Affinity chromatography for WSCP purification with His-tag |
| DEAE Sepharose Fast Flow | GE Healthcare Life Science | 17-0709-01 | Chromatography medium for chlorophyll purification |
References
- Bryant, D. A., Frigaard, N. -U. Prokaryotic photosynthesis and phototrophy illuminated. Trends Microbiol. 14, 488-496 (2006).
- Tronrud, D. E., Wen, J. Z., Gay, L., Blankenship, R. E. The structural basis for the difference in absorbance spectra for the FMO antenna protein from various green sulfur bacteria. Photosynth. Res. 100, 79-87 (2009).
- Schulte, T., Johanning, S., Hofmann, E. Structure and function of native and refolded peridinin-chlorophyll-proteins from dinoflagellates. Eur. J. Cell Biol. 89, 990-997 (2010).
- Renger, G., et al. Water soluble chlorophyll binding protein of higher plants: a most suitable model system for basic analyses of pigment-pigment and pigment-protein interactions in chlorophyll protein complexes. J. Plant Physiol. 168, 1462-1472 (2011).
- Satoh, H., Uchida, A., Nakayama, K., Okada, M. Water-soluble chlorophyll protein in Brassicaceae plants is a stress-induced chlorophyll-binding protein. Plant Cell Physiol. 42, 906-911 (2001).
- Bektas, I., Fellenberg, C., Paulsen, H. Water-soluble chlorophyll protein (WSCP) of Arabidopsis is expressed in the gynoecium and developing silique. Planta. 236, 251-259 (2012).
- Damaraju, S., Schlede, S., Eckhardt, U., Lokstein, H., Grimm, B. Functions of the water soluble chlorophyll-binding protein in plants. J. Plant Physiol. 168, 1444-1451 (2011).
- Horigome, D., et al. Structural mechanism and photoprotective function of water-soluble chlorophyll-binding protein. J. Biol. Chem. 282, 6525-6531 (2007).
- Reinbothe, C., Satoh, H., Alcaraz, J. -P., Reinbothe, S. A Novel Role of Water-Soluble Chlorophyll Proteins in the Transitory Storage of Chorophyllide. Plant Physiol. 134, 1355-1365 (2004).
- Satoh, H., Nakayama, K., Okada, M. Molecular cloning and functional expression of a water-soluble chlorophyll protein, a putative carrier of chlorophyll molecules in cauliflower. J. Biol. Chem. 273, 30568-30575 (1998).
- Schmidt, K., Fufezan, C., Krieger-Liszkay, A., Satoh, H., Paulsen, H. Recombinant water-soluble chlorophyll protein from Brassica oleracea var. Botrys binds various chlorophyll derivatives. Biochemistry. 42, 7427-7433 (2003).
- Takahashi, S., et al. Molecular cloning, characterization and analysis of the intracellular localization of a water-soluble Chl-binding protein from Brussels sprouts (Brassica oleracea var. gemmifera). Plant Cell Physiol. 53, 879-891 (2012).
- Takahashi, S., Ono, M., Uchida, A., Nakayama, K., Satoh, H. Molecular cloning and functional expression of a water-soluble chlorophyll-binding protein from Japanese wild radish. J. Plant Physiol. 170, 406-412 (2013).
- Boex-Fontvieille, E., Rustgi, S., von Wettstein, D., Reinbothe, S., Reinbothe, C. Water-soluble chlorophyll protein is involved in herbivore resistance activation during greening of Arabidopsis thaliana. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 7303-7308 (2015).
- Hughes, J. L., et al. Magneto-optic spectroscopy of a protein tetramer binding two exciton-coupled chlorophylls. J. Am. Chem. Soc. 128, 3649-3658 (2006).
- Bednarczyk, D., Takahashi, S., Satoh, H., Noy, D. Assembly of water-soluble chlorophyll-binding proteins with native hydrophobic chlorophylls in water-in-oil emulsions. BBA - Bioenergetics. 1847, 307-313 (2015).
- Fiedor, L., Rosenbach-Belkin, V., Scherz, A. The stereospecific interaction between chlorophylls and chlorophyllase. Possible implication for chlorophyll biosynthesis and degradation. J. Biol. Chem. 267, 22043-22047 (1992).
- Kamimura, Y., Mori, T., Yamasaki, T., Katoh, S. Isolation, properties and a possible function of a water-soluble chlorophyll a/b-protein from brussels sprouts. Plant Cell Physiol. 38, 133-138 (1997).
- Murata, T., Itoh, R., Yakushiji, E. Crystallization of water-soluble chlorophyll-proteins from Lepidium virginicum. Biochim. Biophys. Acta. 593, 167-170 (1980).
