Summary
Detta manuskript beskriver en enkel och hög genomströmning metod för sammansättning av vattenlösliga proteiner med hydrofoba pigment som är baserade på vatten-i-olja-emulsioner. Vi demonstrera effektiviteten av förfarandet vid montering av nativa klorofyller med fyra varianter av rekombinant vattenlöslig-klorofyll bindande proteiner (WSCPs) av Brassica-växter som uttrycks i E. coli.
Abstract
Klorofyll (CHLS) och bakterioklorofyller (Bchl) är de främsta kofaktorer som utför foto ljus skörd och elektrontransport. Deras funktion beror kritiskt på deras specifika organisation inom stora och komplicerade multisubunit transproteinkomplex. För att förstå på molekylär nivå hur dessa komplex underlättar solenergi konvertering, är det viktigt att förstå protein pigment och pigmentpigment interaktioner och deras inverkan på glada dynamik. Ett sätt att få sådan förståelse är genom att konstruera och studera komplex av Chl med enkla vattenlösliga rekombinanta proteiner. Det är dock svårt att införliva lipofila Chl och Bchl till vattenlösliga proteiner. Dessutom finns det ingen allmän metod, som skulle kunna användas för montering av vattenlösliga proteiner med hydrofoba pigment. Här visar vi en enkel och hög kapacitet system baserat på vatten-i-olja-emulsioner, som gör det möjligt assmonterings av vattenlösliga proteiner med hydrofoba Chl. Den nya metoden har validerats av montering rekombinanta versioner av vattenlösliga klorofyll protein av Brassicaceae växter (WSCP) med Chl a. Vi visar den framgångsrika montering av Chl a med hjälp av råa lysat av WSCP uttrycker E. coli-cell, som kan användas för att utveckla ett genetiskt skärmsystem för nya vattenlösliga Chl-bindande proteiner, och för studier av Chl-proteininteraktioner och monteringsprocesser.
Introduction
Hydrofoba pigment såsom klorofyller (CHLS), bakterioklorofyller (Bchl) och karotenoider är de primära kofaktorer i fotoreaktionscentra och lätta skörd proteiner som utför elektrontransport och lätt fånga energi och överföring. Reaktionscentra och de flesta av CHL-bindande antennkomplexet är transmembranproteiner. Den Fenna-Matthews-Olson (FMO) protein av icke-syrehaltig foto grön svavelbakterier 1,2 och peridinin-Chl protein (PCP) av dinoflagellater 3 är exceptionella exempel på vattenlösliga ljus skörd proteiner. De vattenlösliga klorofyllbindande proteiner (WSCPs) av Brassicaceae, Polygonaceae, Chenopodiaceae och Amaranthaceae växter 4, 5 är ett annat unikt exempel, men i motsats till FMO och PCP, dessa är varken inblandade i ljuset avverkning eller i någon av de primära fotosyntetiska reaktions och deras exakta physiological funktioner är ännu oklart 5-8. Deras höga Chl-bindningsaffiniteten har lett till ett förslag funktion som övergående bärare av Chl och Chl-derivat 9,10. Alternativt framställdes det en hypotes att WSCP spelar en roll vid sophantering Chl i skadade celler och skyddar mot Chl-inducerad fotooxidativ skada 7,11-13. Mer nyligen, föreslogs det att WSCP fungerar som en proteashämmare och spelar en roll under herbivore beständighet samt reglerar celldöd under blomutveckling 14. WSCPs delas in i två huvudklasser beroende på deras fotofysikaliska egenskaper. Den första klassen (klass I, t ex. Från Chenopodium album) kan genomgå photoconversion vid belysning. Klass II WSCPs från Brassica växter, som inte genomgår photoconversion 5,10, ytterligare delas in i klass IIa (eg., Brassica oleracea, Raphanus sativus) och IIb (eg., Från virginiakrassing virginiakrassing löstes genom röntgenkristallografi vid 2,0 Å upplösning 8. Det avslöjar en symmetrisk homotetramer i vilken de proteinsubenheter bilda en hydrofob kärna. Varje underenhet binder en enda Chl, vilket resulterar i en tät anordning av fyra tätt packade Chl inom de core.This enkelt alla Chl arrangemang gör WSCPs ett potentiellt användbart modellsystem för att studera bindning och montering av Chl-proteinkomplex, och effekterna av angränsande Chl och proteinmiljöer på spektrala och elektroniska egenskaperna hos enskilda Chl. Dessutom kan det ge mallar för att konstruera konstgjorda Chl-bindande proteiner som kan användas för ljus skörd moduler i artificiella foto enheter.
Rigorösa studier av nativa WSCPs inte är genomförbara, eftersom komplexen renade från växter innehåller alltid en heterogen blandning av tetramerer med olika kombinationer av Chl aoch Chl B 9. Sålunda erfordras en metod för montering av rekombinant uttryckta WSCPs med Chl in vitro. Detta ifrågasätts av den försumbara vattenlöslighet Chl, vilket gör det omöjligt att montera komplexa in vitro genom att helt enkelt blanda vattenlösliga apoproteiner med pigment i vattenlösningar. In vitro montering genom att blanda apoproteiner med tylakoid membran 15 visades, men denna metod är begränsad till den nativa Chl närvarande i tylakoider. Schmidt et al. rapporterade om montering flera Chl och BChl-derivat med WSCP från blomkål (CaWSCP) genom rekombinant uttrycker en histidin-märkt protein i E. coli immobilisera den på en Ni-affinitetskolonn och införa Chl derivat löstes i tvättmedel 11. Framgångsrikt beredning av rekombinanta WSCPs från A. thaliana 6, och brysselkål (BoWSCP), japanska vild rädisa (RshWSCP) end Virginia pepperweed (LvWSCP) genom en liknande metod har också rapporterats.
Här presenterar vi en ny, generell, enkel metod för montering Chl med WSCP som inte kräver märkning eller immobilisering av proteiner. Det bygger på framställning av emulsioner från deras vattenlösningar av vattenlösliga apoproteiner i mineralolja. Proteinerna är således inkapslade i vatten-i-olja (W / O) mikrodroppar med mycket hög yta till volym 16. De hydrofoba kofaktorer upplöses sedan i oljan och kan lätt införas i de små dropparna från oljefasen. Vi rapporterar om hur du använder metoden för montering av flera varianter av WSCP apoproteiner rekombinant uttryckta i E. coli med Chl a. Vi visar aggregatet från rå lysat av WSCP-överuttryckande bakterier som kan användas som ett screeningssystem för att utveckla nya Chl-bindande proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förbered Chl Ett lager Lösningar
- Kritiskt steg: Utför alla stegen i klorofyll beredning i en kemisk huv, i grönt ljus (520 nm) eller i mörker, för att minimera fotoskador. Tillsätt alltid kväve eller argon före frysning pigmenten för lagring. Se till att alla lösningsmedel är analytisk kvalitet.
- Väga ca 5 mg lyofiliserade Spirulina platensis celler eller andra cyanobakterien celler innehållande endast Chl a i tylakoid membran och krossa det med användning av en mortel och mortelstöt.
- Ladda krossade cellerna på en glaskolonn och tvätta med cirka 50-100 ml 100% aceton i syfte att avlägsna karotenoider. Kassera den eluerade orange / grön fraktion.
Obs: Om den orange fraktion som inte elueras med 100 ml aceton fortsätter tvättning av cellerna med aceton tills den gröna fraktionen börjar eluera. - Utbyte aceton med 100% metanol och samla den gröna fraktionen innehållande Chl a. Volymen av eluerade fractjon kan variera mellan 50-100 ml. I början, har den eluerade fraktionen en mörkgrön färg, som övergår till blekgrön vid slutet av elueringen. När färgen på eluerade fraktionen övergår i ljusgrön stoppa elueringen.
- Indunsta metanol med användning av en rotationsindunstare tills extraktet är helt torr. Applicera inte värme till lösningen; säkerställa att förångarens vattenbadets temperatur inte överstiger 30 ° C.
Obs: Tiden för förångning beror på volymen metanol fraktion förångas och kan variera mellan 10-60 minuter. Det är viktigt att torka extraktet helt. - Upplösa pigment från det torkade extraktet i en liten volym dietyleter (ca 5-10 ml) och filtrera genom bomullsvadd. Säkerställa att pigment är fullständigt upplösta i eter före filtrering.
- Indunsta dietyletern tills pigmenten är fullständigt torra (10-30 min).
Notera: De torra pigment kan spolades med och hölls under kväve eller argon vid -20 ° C, i mörker tills vidare bearbetning. - Upplösa de torra pigment i den minsta volymen möjligt av 100% metanol (ungefär 1 ml), även om inte allt är fullständigt suspenderade. Tillsätt 4 ml aceton till lösningen, och bläddra glaset försiktigt för att helt upplösa pigment.
- Med användning av en pasteurpipett, ladda provet försiktigt på en kolonn av DEAE-Sepharose ekvilibrerad i 100% aceton.
- Eluera karotenoider (en orange-gul band) med 100% aceton. Sedan eluera Chl en (grön band) med 3: 1 v / v aceton / metanol-blandning.
Obs: Den volym aceton och aceton / metanol-blandning är ungefär ekvivalent med volymen av DEAE Sepharose laddades på kolonnen. - Kontrollera Chl en renhet genom tunnskiktskromatografi med användning av en 68: 25: 5: 2 diklormetan / n-hexan / isopropanol / metanol (volym / volym) blandning som elueringsmedel 17.
- Indunsta lösningsmedlet under användning av en rotationsindunstare till dess att Chl a är helt torr (10-60 min).
Obs: Den torra Chl a kan spolas med kväve eller argon och lagrades under argonatmosfär vid -20 ° C i mörker. - Förbereda Chl en stamlösning genom att åter lösa upp den torra Chl a i 2-4 ml 100% etanol.
Obs! Extinktionskoefficienten för Chl a vid 663 nm är 74,400 cm -1 M -1 (83,3 cm -1 (mg / ml) -1) i etanol. En typisk förrådslösning bör ha en OD av 1860 motsvarande en koncentration av 25 mM (23 mg / ml). Tillsats av 20 | il av denna stam till en emulsion innehållande 5 ml organisk fas, och ett mg WSCP i 1 ml vattenfasen resulterar i en blandning med 10-faldigt molärt överskott av Chl en vs. WSCP.
2. Förbered organiska fasen av emulsionen
Obs: Den organiska fasen hos emulsionen är sammansatt av mineralolja innehållande 4,5% (volym / volym) Spän 80 och 0,4% (volym / volym) Tween 80.
- Väger i ett 50 ml rör 0,2 g Tlan 80, 1,8 g av Spän 80, och 38 g mineralolja. Blanda väl alla komponenter och svalna på is.
Obs: Den organiska fasen kan förvaras i 4 ° C upp till en vecka.
3. framställning av den vattenhaltiga fasen i emulsionen
Obs: Vattenfasen av emulsionen kan bestå av antingen renat WSCP, eller råextrakt av bakterier som överuttrycker WSCP.
- Framställning av en vattenhaltig fas innehållande renat WSCP.
- Växer E. coli BL21-bakterier innehållande WSCP plasmid 12 i 1 L LB-medium vid 37 ° C tills OD av 0,3 till 0,6.
- Inducera proteinuttryck genom att tillsätta 1 mM IPTG. Efter induktion växa bakterier vid 30 ° C under 12-16 timmar.
- Skörd bakterier genom centrifugering vid 5000 xg under 10 min vid 4 ° C.
- Lös pelleten i bindningsbuffert och låt ligga på is (30 sek på 15 sek av, fem gånger). Använda 10 ml buffert för pelleten som erhållits från centrifugering av 250 ml avLB-medium med celler som överuttrycker proteinet.
Obs: Beroende på reningsmetoden, kan bindningsbufferten vara sammansatt av 100 mM fosfatbuffert, pH 7,2 eller 50 mM Tris, pH 7,5, 500 mM NaCl, 5 mM EDTA. - Centrifugera ner cellysatet vid 12.000 xg under 30 min vid 4 ° C.
- Rena WSCP genom affinitetskromatografi. Beroende på taggen smält till WSCP, rena rekombinanta proteiner med hjälp av lämpliga kommersiellt tillgängliga affinitetskromatografi system för proteinrening enligt tillverkarens instruktioner.
- För emulsionspreparat, använder renat WSCP i 50 mM fosfatbuffert, pH 7,8. Se till att den slutliga proteinmängden som används för beredning är 0,5-1,0 mg per 1 ml buffert.
- Framställning av en vattenhaltig fas innehållande råa bakterielysat med WSCP.
- Väx E. coli BL21-celler innehållande plasmid-uttryck WSCP i 250 ml LB-medium vid 37 ° C tills OD 0,3-0,6.
- Inducera proteinuttryck med1 mM IPTG och växa bakterier över natten vid 30 ° C.
- Harvest bakterieceller genom centrifugering vid 5000 xg under 10 min vid 4 ° C.
- Lös pelleten i 1-2 ml 50 mM natriumfosfatbuffert pH 7,8, sonikat (30 sek på, 15 sec av, tre gånger) och centrifugera vid 12.000 xg under 30 min vid 4 ° C.
- Framställa den vattenhaltiga fasen i emulsionen genom att blanda 0,125 ml supernatant med 0,875 ml av 50 mM natriumfosfatbuffert pH 7,8.
4. Montering av WSCP med Chl a i emulsion
- Överföring 5 ml olja-tensid blandningen i en glasflaska och kyla den på is. Innan pipettering, kontrollera att alla delar av den organiska fasen blandas noggrant och det finns ingen fasseparation mellan tensider och mineralolja.
- Tillsätt 1 ml iskall vattenfasen framställd som i avsnitt 3 till 5 ml organisk fas.
- Blanda båda faserna med användning av en vävnadshomogenisator under 2 minuter vid 9500 varv per minut på is.
- Kritiskt steg: Från detta stadium, utföra alla ytterligare åtgärder enligt grönt ljus (520 nm) för att minimera fotoskador. Tillsätt 20 | il av 25 mM Chl en stamlösning (se avsnitt 1.13) till emulsionen. Skingra genom att ställa och vända glasflaskan. Kontrollera att Chl är jämnt fördelad i emulsionen.
- Inkubera emulsionen under 1-2 timmar på is i mörker.
- För att bryta ned emulsionen och separata vattendroppar från den organiska fasen överföra emulsionen till 1,5 ml plaströr och centrifugera vid 14.000 xg under 5 min vid rumstemperatur.
Obs: Om enheten är framgångsrik, bör den lägre vattenfasen har en grön färg. - Avyttra den övre oljefasen och tillsätt 1 ml mineralolja. Blanda väl mineraloljan med pelleterat emulsionen genom virvel eller genom att vända röret ordentligt. Centrifugera ner provet vid 14.000 xg under 5 min vid rumstemperatur. Upprepa detta steg tills en klar menisk separera vatten och gruvarbetareal oljefaser, utan någon mellanliggande emulsion erhålles.
- Utför detta steg i en kemisk huva. Efter de vattenhaltiga och mineraloljefaser är klart åtskilda, avlägsna mineralolja och tillsätt 1 ml vattenmättad dietyleter. Virvel och centrifugera ner provet vid 14.000 xg under 5 min vid rumstemperatur. Upprepa detta steg två gånger.
- Efter den andra centrifugeringen, avlägsna dietyletern och lämnar rören är öppna för 5-20 min i huven.
- Slutligen laddar den vattenbaserade fasen innehållande WSCP / Chl ett komplex på en avsaltningskolonn och eluera med buffert lämplig för ytterligare experiment.
Obs: Proteinet är stabil i fosfat- och Tris buffertar i ett brett spektrum av pH (6,0-7,5). Provet kan lagras vid 4 ° C i skydd mot ljus upp till en månad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Rekombinanta WSCP apoproteiner samlades med Chl a i W / O-emulsioner enligt det protokoll som beskrivs i föregående avsnitt. Protokollet genomfördes med användning av vattenhaltiga faser innehållande antingen rena WSCPs eller lysat E.coli-celler som överuttrycker WSCP (Figur 1). Protokollet är enkelt, snabbt och inte kräver någon särskild utrustning förutom en vävnadshomogenisator.
Absorbansen och CD-spektra för Chl a komplex av fyra rekombinanta WSCP varianter, nämligen RshWSCP, CaWSCP, BoWSCP och LvWSCP visas i figur 2. Dessa är liknande i bandet form och position till tidigare rapporterade spektra av de respektive nativa komplexen 10,18, 19. Dessa resultat visar tydligt att WSCP / Chl komplexen rekonstituerade i W / O-emulsionssystem liknar de nativa komplex.
E. coli-celler som uttrycker WSCPs används som den vattenhaltiga fasen hos emulsionen. Lysat av bakterier som inte uttryckte WSCPs användes som negativ kontroll. Positiv montering av WSCP med Chl en lätt observeras av den gröna färgen av vattenfasen, men endast i lysat av WSCP uttryckande celler (Figur 3). Droppar som innehåller dessa lysat har distinkta Chl en fluorescens i konfokala mikroskopbilder. Detta innebär att en framgångsrik montering av WSCP / Chl komplexen kan detekteras direkt i de små vattendropparna, som kan vara basen för W / O-emulsionsbaserad screening system.
Figur 1: Montering av WSCP med Chl i W / O-emulsioner (A. E.coli cellysat uttrycker WSCP. När emulsionen är klar, är Chl till emulsionen. Efter beredning är vattendroppar separeras från organiska fasen genom centrifugering. (B) av W / O-emulsionssystem kan användas för snabb och högeffektiv screening för positiva rekonstitution av WSCPs med Chl. Fluorescens WSCP / Chl komplexet kan upptäckas direkt från vattenmikrodroppar med en konfokalmikroskop. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Absorbans och CD-spektra av WSCP / Chl en komplex apoproteiner av fyra.WSCP varianter rekonstituerades med 10-faldigt molärt överskott av Chl a. Absorptionsspektra (a) normaliserades till 1 vid 673nm för BoWSCP (svart), CaWSCP (grön), och RshWSCP (blå) och 663nm för LvWSCP (röd). Samma normaliseringsfaktorerna applicerades till CD-skivan (b). Återges med tillstånd från 16. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Scanning fluorescensmikroskopi och Visual Screening av WSCP / Chl Complex Montering (A) SDS-PAGE av E.. coli BL21 cellysat före och efter rekonstituering med Chl a i W / O emulsioner. Spår 1: BL21-celler utan WSCP plasmid, bana 2: BL21-celler med WSCP plaSmid utan induktion av IPTG, spår 3: BL21-celler med WSCP plasmiden induceras med IPTG. Lane 4, 5 och 6 är samma prover som banorna 1, 2 och 3, respektive, men efter separation av vattenfasen från den organiska-fasen hos emulsionen. Små alikvoter av varje prov kördes på en SDS-proteingel. Lane M: protein storleksmarkör. Bilder av proven före och efter fasseparation visas på toppen av varje bana. (B) konfokalmikroskop bilder av W / O-droppar som framställts med Chl a i oljefasen. Dropparna på vänstra bilden inte innehåller något protein medan de på den högra bilden innehöll WSCP protein. Fluorescens övervakades vid 682 nm. Återges med tillstånd från 16. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vårt mål var att utveckla en ny generell ordning för montering av vattenlösliga klorofyllbindande proteiner med hydrofoba pigment. Här visas att den nya beredningen system baserat på W / O-emulsion är en allmän riktlinje visat sig fungera för montering av WSCP apoproteiner från brysselkål, blomkål, japansk pepparrot och Virginia pepperweed rekombinant uttryckta i E. coli. Här Resultaten presenteras från rekonstituering av 1 mg av WSCP med 10-faldigt molärt överskott av Chl a. Det är emellertid också möjligt att använda lägre koncentrationer av WSCP för reconstitutions och olika Chl / protein-molförhållanden. Den minsta mängden av protein, som vi skulle kunna samlas i W / O-emulsioner var 100 pg, medan pigment till proteinförhållande kan variera från 5: 1 och upp till 20: 1. Dessutom kan volymen av vattenfasen sänkas ner till 50 pl. I detta arbete montering av WSCP med Chl a presenteras. Ändå är det också möjligt att sätta sammanWSCP med andra hydrofoba Chl, Bchl och deras derivat. För närvarande testar vi vårt system med andra vattenlösliga pigmentbindande proteiner såsom FMO och PCP.
Även vår metod är snabb och enkel finns det några viktiga steg som måste beaktas under W / O förberedelse och beredning av WSCP med Chl. De glasflaskor, som används för emulsionsframställningen, måste vara ren och fri från tvättmedel. Även små spår av rengöringsmedel i flaskor kommer att påverka emulsionsframställningen och resulterar i låg kvalitet emulsion. Dessutom bör flaskorna vara helt torr. Andra avgörande steg, som kan påverka beredning effektivitet, är ordentligt spridning av Chl i organiska fasen av emulsionen. Därför är det viktigt att fullt ut blanda en liten volym av Chl i 5 ml emulsion. Det är också viktigt att göra så många steg som krävs för att bryta ned emulsionen och helt ta bort mineralolja från vattenfasen. Eventuella spår av mineralolja i vatten phASE kan påverka ytterligare experiment.
W / O-emulsion är ett alternativt tillvägagångssätt för den metod som fastställs av et al. Schmidt 11, som baserades på immobilisering His-märkta WSCP på affinitetskromatografikolonn och inkubation med Chl. Även om metoden enligt Schmidt et al., Visat sig fungera för olika WSCPs krävs det His-märkta proteiner och kan resultera i icke-specifik bindning av Chl genom ligering till de histidiner av taggen. Dessutom kan immobilisera proteiner på en fast yta påverkar proteinstruktur och därmed påverka monteringsprocessen med pigment. Dessutom var Chl, vilket användes för montering av WSCPs i detta system upplöst antingen i buffert innehållande detergenter eller 40% metanol 11,12. Sådana lösningsmedel kan resultera i pigment aggregation och / eller icke-specifik Chl bindning till WSCP. Vårt nya rekonstitution system baserat på W / O-emulsions inte förlitar sig på immobilisering av proteiner till fasta bäraren. Therefore, är ingen rening markör fuserad till WSCPs krävs, och rekombinanta proteiner med nativ sekvens kan sättas samman. En annan viktig fördel med W / O-metod är att minimera pigment aggregering som kan påverka rekonstituering effektivitet, oligomerisering och pigment / protein stökiometri. Detta beror på att de hydrofoba pigmenten upplöses i oljefasen och deras införande i de V / O-droppar är aktiverat av den höga förhållandet yta till volym hos den senare. Dessutom ospecifik bindning av Chl från WSCP kringgås eftersom hydrofoba pigment inte kan diffundera mellan organiska och vattenfaser i emulsionen. Endast pigment som aktivt sammansatta av WSCP under beredning kan ingå mikrodroppar vatten av emulsionen.
Den metod för montering WSCP med pigment genom blandning av WSCP med isolerade tylakoider 10 liknar den av W / O-emulsionssystem som presenteras här. Det kräver rengöringsmedel eller organiska lösningsmedel för solubilizing de Chl eller märkning proteinerna. Emellertid kan av W / O-metoden användas med några pigment som är löslig i oljefasen, medan den tidigare metoden är begränsad till Chl som är native närvarande i tylakoid membran. Således är möjlig montering med ren Chl a eller Chl d från eftersom dessa är tillgängliga från blågröna tylakoider av eg. Synechocystis PCC 6803 eller Acaryochloris marina, respektive. Det är dock inte möjligt att rekonstruera WSCP med Chl b eftersom detta pigment är alltid åtföljs av Chl a i tylakoider. Däremot kan WSCP montering i W / O-emulsion testas med alla naturliga eller artificiella Chl, BChl eller porfyrinderivat. Det kräver inte att använda fotosyntetiska membran och därmed är fri från störningar extra membran komponenter såsom phycobilisome som kan knytas till blågrön membran. W / O-metoden är endast begränsad av lösligheten av pigment i oljefasen ennd därför lämplig för WSCP montering med alla naturliga eller artificiella Chl, BChl eller porfyrinderivat.
Sammanfattningsvis, presenterade vi här en generell metod för montering av vattenlösliga proteiner med hydrofoba pigment. Dess fördelar visades av den framgångsrika montering av Chl a med olika rekombinanta WSCPs från Brassica växter tydligt från spektroskopiska och biokemiska resultat. Dessutom visade vi hur W / O-enhetens protokoll kan användas för snabb screening av WSCP / Chl komplex montering med hjälp av E. coli cellysat överuttrycker rekombinant WSCPs och råa Chl extrakt. På detta sätt kan vi hoppa över tidsödande proteinreningssteg och nödvändigheten av att bryta emulsioner i syfte att separera de vattendroppar från den organiska fasen kan också undvikas genom att använda fluorescensmikroskopi för att direkt visualisera aggregatet i vattendroppar. Den allmänna tillämpligheten av den nya metoden gör det en användningful verktyg för att studera kofaktor bindande och montering samt energi- och elektronöverföringsmekanismer i transmembranprotein-kofaktor-komplex genom att utforma och bygga sina förenklade konstgjorda vattenlösliga proteinanalogerna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
DN erkänner stöd från EU FP7 projekt PEPDIODE (GA 256.672) och REGPOT-2012-2013-1 (GA 316.157), och en personlig forskningsanslag (nr 268/10) från Israel Science Foundation. Vi tackar Prof. Shmuel Rubinstein, Institutionen för teknik och tillämpad vetenskap, Harvard University, Cambridge, MA, USA för att ta konfokalmikroskopi bilder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mineral oil | Sigma | M5904 | |
| Span80 | Sigma | 85548 | |
| Tween80 | Sigma | P8074 | |
| Bio-Scale Mini Profinity eXact Cartridges | Bio Rad | 10011164 | Affinity chromatography for WSCP purification with native sequence. |
| His Trap HF column | GE Healthcare Life Science | 17-5248-02 | Affinity chromatography for WSCP purification with His-tag |
| DEAE Sepharose Fast Flow | GE Healthcare Life Science | 17-0709-01 | Chromatography medium for chlorophyll purification |
References
- Bryant, D. A., Frigaard, N. -U. Prokaryotic photosynthesis and phototrophy illuminated. Trends Microbiol. 14, 488-496 (2006).
- Tronrud, D. E., Wen, J. Z., Gay, L., Blankenship, R. E. The structural basis for the difference in absorbance spectra for the FMO antenna protein from various green sulfur bacteria. Photosynth. Res. 100, 79-87 (2009).
- Schulte, T., Johanning, S., Hofmann, E. Structure and function of native and refolded peridinin-chlorophyll-proteins from dinoflagellates. Eur. J. Cell Biol. 89, 990-997 (2010).
- Renger, G., et al. Water soluble chlorophyll binding protein of higher plants: a most suitable model system for basic analyses of pigment-pigment and pigment-protein interactions in chlorophyll protein complexes. J. Plant Physiol. 168, 1462-1472 (2011).
- Satoh, H., Uchida, A., Nakayama, K., Okada, M. Water-soluble chlorophyll protein in Brassicaceae plants is a stress-induced chlorophyll-binding protein. Plant Cell Physiol. 42, 906-911 (2001).
- Bektas, I., Fellenberg, C., Paulsen, H. Water-soluble chlorophyll protein (WSCP) of Arabidopsis is expressed in the gynoecium and developing silique. Planta. 236, 251-259 (2012).
- Damaraju, S., Schlede, S., Eckhardt, U., Lokstein, H., Grimm, B. Functions of the water soluble chlorophyll-binding protein in plants. J. Plant Physiol. 168, 1444-1451 (2011).
- Horigome, D., et al. Structural mechanism and photoprotective function of water-soluble chlorophyll-binding protein. J. Biol. Chem. 282, 6525-6531 (2007).
- Reinbothe, C., Satoh, H., Alcaraz, J. -P., Reinbothe, S. A Novel Role of Water-Soluble Chlorophyll Proteins in the Transitory Storage of Chorophyllide. Plant Physiol. 134, 1355-1365 (2004).
- Satoh, H., Nakayama, K., Okada, M. Molecular cloning and functional expression of a water-soluble chlorophyll protein, a putative carrier of chlorophyll molecules in cauliflower. J. Biol. Chem. 273, 30568-30575 (1998).
- Schmidt, K., Fufezan, C., Krieger-Liszkay, A., Satoh, H., Paulsen, H. Recombinant water-soluble chlorophyll protein from Brassica oleracea var. Botrys binds various chlorophyll derivatives. Biochemistry. 42, 7427-7433 (2003).
- Takahashi, S., et al. Molecular cloning, characterization and analysis of the intracellular localization of a water-soluble Chl-binding protein from Brussels sprouts (Brassica oleracea var. gemmifera). Plant Cell Physiol. 53, 879-891 (2012).
- Takahashi, S., Ono, M., Uchida, A., Nakayama, K., Satoh, H. Molecular cloning and functional expression of a water-soluble chlorophyll-binding protein from Japanese wild radish. J. Plant Physiol. 170, 406-412 (2013).
- Boex-Fontvieille, E., Rustgi, S., von Wettstein, D., Reinbothe, S., Reinbothe, C. Water-soluble chlorophyll protein is involved in herbivore resistance activation during greening of Arabidopsis thaliana. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 7303-7308 (2015).
- Hughes, J. L., et al. Magneto-optic spectroscopy of a protein tetramer binding two exciton-coupled chlorophylls. J. Am. Chem. Soc. 128, 3649-3658 (2006).
- Bednarczyk, D., Takahashi, S., Satoh, H., Noy, D. Assembly of water-soluble chlorophyll-binding proteins with native hydrophobic chlorophylls in water-in-oil emulsions. BBA - Bioenergetics. 1847, 307-313 (2015).
- Fiedor, L., Rosenbach-Belkin, V., Scherz, A. The stereospecific interaction between chlorophylls and chlorophyllase. Possible implication for chlorophyll biosynthesis and degradation. J. Biol. Chem. 267, 22043-22047 (1992).
- Kamimura, Y., Mori, T., Yamasaki, T., Katoh, S. Isolation, properties and a possible function of a water-soluble chlorophyll a/b-protein from brussels sprouts. Plant Cell Physiol. 38, 133-138 (1997).
- Murata, T., Itoh, R., Yakushiji, E. Crystallization of water-soluble chlorophyll-proteins from Lepidium virginicum. Biochim. Biophys. Acta. 593, 167-170 (1980).
