Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Environment

العزلة المادية من الأبواغ من العينات البيئية التي تستهدف تحلل من الخلايا النباتية

Published: January 21, 2016 doi: 10.3791/53411

Introduction

والهدف من هذا العمل هو توفير بروتوكول لفصل الأبواغ الجرثومية من الخلايا البكتيرية الخضري في العينات البيئية. تشكيل الأبواغ البكتيرية هي استراتيجية البقاء على قيد الحياة، تسبب عادة عن طريق التجويع، وجدت في عدد من المجموعات البكتيرية التي تنتمي إلى الأسرة في اللغات افيرميكوتس 1. ومدروسة البكتيريا المكونة للأبواغ، وذلك بسبب عدد من سلالات هي مسببات الأمراض، وبالتالي من الأهمية الطبية (على سبيل المثال، عصيات الجمرة الخبيثة أو المطثية العسيرة). وقد تم عزل سلالات من البكتيريا البيئية تشكيل أبواغ من كل تقريبا البيئة (التربة والمياه والرواسب والهواء والجليد وأمعاء الإنسان والحيوان الأمعاء، وأكثر) 1-3. ولذلك، افيرميكوتس هي الثانية الأسرة في اللغات الأكثر وفرة في مجموعات ثقافة 4.

بسبب هاردي قشرة خارجية ولب واقية البروتينات، ويمكن البقاء على قيد الحياة الأبواغ الظروف البيئية القاسية الاب تتراوحام جفاف للإشعاع عالية، ودرجات الحرارة القصوى والمواد الكيميائية الضارة 5. هذه المقاومة الرائعة يجعل من التحدي لاستخراج الحمض النووي من الأبواغ 6-8. هذا على الأرجح ما يفسر لماذا تم التغاضي عنها في دراسة التسلسل البيئي 9،10. أساليب أخرى، مثل استهداف الأبواغ في عينات بيئية من قبل الأجسام المضادة الفلورسنت 11، الكمي للحمض dipicolinic (د ب أ) في التربة والرواسب 12 13، وتدفق الخلوي 14 أو استخدمت البسترة وزراعة اللاحقة 15،16 لاسترداد أو تحديد الأبواغ في العينات البيئية. في السنوات الأخيرة، وقد وضعت تسلسل الجينات أبواغ محددة 10،17-20 طرق استخراج الحمض النووي الأمثل وكذلك الاشعال الجزيئية محددة لاستهداف. وقد ساعد ذلك للكشف عن المزيد من التنوع البيولوجي بين هذه المجموعة من البكتيريا 21، وأدى أيضا إلى تطبيقات في الصناعة والطب للكشف عن الأبواغعلى سبيل المثال في الحليب المجفف 19.

ويستند بروتوكول المقدمة هنا على الاختلاف في مقاومة الظروف الفيزيائية الضارة (مثل الحرارة والمنظفات) من الأبواغ الجرثومية قريبة الإنباتي الخلايا. لتدمير الخلايا النباتية في عينة، ونحن نطبق التوالي الحرارة، والليزوزيم وتركيزات منخفضة من المنظفات. وقد تم تحسين الوقت وقوة هذه المعالجات حتى لا تدمر الجراثيم، ولكن لليز جميع الخلايا النباتية. بعض الخلايا في تجمع الخلايا البيئي هي أكثر مقاومة من غيرها، وذلك من أجل زيادة احتمال تدمير كل الخلايا النباتية، ونحن نطبق ثلاثة علاجات مختلفة. ميزة والجدة من هذا الأسلوب هو أن الأبواغ بعد العلاج لا تزال على حالها، ويمكن استخدامها لإجراء المزيد من التحليلات المصب. وتشمل هذه استخراج الحمض النووي، PCR الكمي (QPCR) وamplicon أو التسلسل metagenomic (تستهدف على وجه التحديد على مجموعة من الأبواغ وبالتالي تقليل دiversity، في حين أن زيادة التغطية). ويمكن أيضا أن تستخدم الأبواغ لزراعة المصب أو الكمي بواسطة المجهر مضان، التدفق الخلوي، أو الكشف عن اتفاق سلام دارفور. سمة هامة من سمات هذا الأسلوب هو أنه بمقارنة عينة غير المعالجة مع عينة المعالجة، يمكن للمرء أن يستنتج كمية وتنوع الأبواغ في عينة بيئية بالإضافة إلى عنصر الموافق الإنباتي الخلايا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد مواد كيميائية ومعدات

  1. جعل 500 مل من 1٪ فوسفات الصوديوم (SHMP) (نابو 3) ن الحل وتعقيم بواسطة التعقيم.
  2. تعقيم نتروسليلوز (NC) مرشحات (حجم المسام 0.22 ميكرون، وقطره 47 ملم) من خلال التعقيم في أطباق بتري الزجاج مغلقة.
  3. تعقيم الفلاتر NC (حجم المسام 0.22 ميكرون، وقطره 25 ملم) من خلال التعقيم في أطباق بتري الزجاج مغلقة.
  4. وزن ولاحظ الوزن الفارغ العقيمة 50 مل أنابيب (مع سقف) (أنبوب واحد لكل عينة).
  5. إعداد تريس، EDTA العازلة (TE-عازلة) 1X: جعل الحل من 10 ملي تريس (تريس (hydroxymethyl) aminomethane) و 1 ملي EDTA العازلة. ضبط درجة الحموضة إلى 8 وتعقيم بواسطة التعقيم.
  6. يعد حل الليزوزيم (20 ملغ / مل) عن طريق إذابة 0.02 غرام من الليزوزيم في 1 مل TE-العازلة. من الناحية المثالية، وجعل جديدة في كل مرة. تخزين عند 4 درجات مئوية لمدة لا تزيد عن 1 في الاسبوع.
  7. يعد حل الفسيولوجية عن طريق إذابة 8 ز / L كلوريد الصوديوم(كلوريد الصوديوم) في الماء المقطر. تعقيم بواسطة التعقيم.

2. فصل الكتلة الحيوية من الرواسب

  1. إضافة 3 غرام من عينة الرواسب إلى وزنه مسبقا معقمة 50 مل أنابيب باستخدام المجارف المعدنية ملتهب الإيثانول. تنفيذ هذا في نظيفة، والأشعة فوق البنفسجية تعقيم الوزراء للسلامة الأحيائية لتجنب التلوث.
  2. إضافة 15 مل من 1٪ معقم (تعقيمها) حل SHMP إلى العينة باستخدام تخرج العقيمة السحاحة. ويمكن أيضا أن الحل SHMP تتم تصفيته لتجنب التلوث.
  3. التجانس الرواسب وحل SHMP مع المفرق السائل / الخالط (على سبيل المثال، الترا Turrax الخالط). 70٪ من الإيثانول تعقيم الأوتوكلاف أو الدوار تشتت قبل استخدامها. تشغيل التجانس لمدة 1 دقيقة في 17500 دورة في الدقيقة. السماح للعينة راحة لمدة 2 دقيقة، وتكرار التجانس لمدة 1 دقيقة في نفس السرعة الدوار.
  4. اسمحوا الوقوف العينة لمدة 10 دقيقة. في هذه الخطوة، فإن أثقل الجسيمات (المعادن) تسوية. الخلايا وأي مكون من مكونات العضوية من العينة ولكن ثتبقى سوء في الحل. بعد ذلك، نقل الحل طاف (التي تحتوي على الكتلة الحيوية الخلية) إلى نظيفة أنبوب 50 مل، مع الحرص على عدم تعكير صفو بيليه الرواسب.
  5. لبيليه الرواسب إضافة مرة أخرى 15 مل من 1٪ معقم (تعقيمها) حل SHMP باستخدام تخرج العقيمة السحاحة. ثم كرر الخطوات من 2.3 و 2.4. هذا التكرار يضمن الفصل بين أكبر قدر ممكن من الخلايا والجزيئات العضوية من المكون المعدنية في الرواسب. طاف من هذا الفصل الثاني يمكن دمجها مع طاف من الفصل الأول.
    ملاحظة: الخطوات التالية تتم كل يوم طاف (التي تحتوي على الكتلة الحيوية الخلية). المكون المعدني (الرواسب بيليه) يمكن التخلص منها.
  6. الطرد المركزي العينة في 20 x ج لمدة 1 دقيقة. هذه الخطوة تزيد من ز-ما يكفي من القوة لتسوية الجزيئات المعدنية الصغيرة في حين أن المواد خلية بيولوجية لا يزال في الحل. بعد الطرد المركزي، ونقل الحل طاف (التي تحتوي على الكتلة الحيوية الخلية) إلىنظيفة أنبوب 50 مل. تجاهل بيليه المعدنية.
  7. تحديد الحجم النهائي من محلول يحتوي على الكتلة الحيوية عن طريق وزن العينة. تحديد الوزن يتجنب الحاجة إلى نقل العينة إلى الاسطوانة، ويقلل من مخاطر التلوث.

3. جمع من الكتلة الحيوية على تصفية غشاء

  1. تحضير وحدة الترشيح (47 ملم الأغشية قطر) ومضخة فراغ. تعقيم وحدة الترشيح إما عن طريق التعقيم أو (إذا بيركس زجاج) عن طريق الرش مع الايثانول 70٪ والمشتعلة ذلك مع موقد بنسن. ندعه يبرد قبل الاستمرار في البروتوكول.
  2. إضافة غشاء NC العقيمة إلى وحدة الترشيح باستخدام ملقط ملتهب الإيثانول تعقيمها.
  3. إضافة نصف العينة طاف (من الخطوة 2.6) على وحدة الترشيح الغشائي وجمع الخلايا في الغشاء باستخدام مضخة فراغ.
  4. عندما اجتاز السائل بالكامل من خلال التصفية، ووقف ضخ فراغ وإزالة الغشاء بعناية باستخدام إيثانرأ اللهب تعقيم الملقط. وضع الغشاء في طبق بتري معقمة.
    1. قطع الغشاء في نصف باستخدام مقص ملتهب الإيثانول تعقيمها. إضافة كل نصف الغشاء إلى منفصل أنبوب 2 مل. وسيتم استخدام نصف من الغشاء لاستخراج الحمض النووي وتحليل المجتمع البكتيريا بكامله. سيتم تخزين النصف الآخر من مرشح في -80 ° C وبمثابة نسخة احتياطية.
  5. وضع غشاء NC الجديد على وحدة الترشيح وجمع الكتلة الحيوية من النصف الثاني من حجم العينة (من الخطوة 2.6) باستخدام مضخة فراغ.
  6. عندما اجتاز السائل بالكامل من خلال التصفية، ووقف ضخ فراغ وإزالة الغشاء بعناية باستخدام ملقط ملتهب الإيثانول تعقيمها. وضع الغشاء بأكمله إلى منفصل أنبوب 2 مل. وسوف تستخدم هذه العينة لعلاج لفصل الأبواغ من الخلايا النباتية. يمكن تخزين العينة عند -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.

4. تحلل من الخلايا النباتية

  1. أداءالعلاج لفصل الأبواغ من الخلايا النباتية على الكتلة الحيوية التي تم جمعها سابقا على غشاء NC (الخطوة 3.6).
    1. إذا تم تجميد الغشاء، وترك الأمر في RT لمدة 10 دقيقة إلى ذوبان الجليد. ثم وضع الغشاء في طبق بتري معقمة وقطع عليه (ما يقرب من 4 مرات) إلى أجزاء أصغر باستخدام مقص ملتهب الإيثانول تعقيمها. ثم ضع كل قطعة فلتر الغشاء في أنبوب معقم 2 مل.
  2. إضافة 900 ميكرولتر من 1X TE (تريس، EDTA) العازلة (انظر 1.5) إلى الأنبوب الذي يحتوي على غشاء عينة ومزيج دقيق من قبل دوامة. في هذه الخطوة، تتم إزالة الكتلة الحيوية من الغشاء في حل TE-العازلة.
  3. وضع أنبوب في حاضنة عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة و 80 دورة في الدقيقة. بعد ذلك إزالة أنبوب من الحاضنة وندعه يبرد لمدة 15 دقيقة.
  4. إضافة 100 ميكرولتر من الطازجة الليزوزيم (انظر 1.5) للوصول إلى تركيز النهائي من 2 ملغ / مل. لا تقم بإضافة الليزوزيم قبل أن تبرد العينة إلى 37 درجة مئوية، وهذا يمكن أن تنكسرادي الانزيم.
  5. احتضان العينة على 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة و 80 دورة في الدقيقة، والظروف المثلى لالليزوزيم إلى ليز الخلايا النباتية.
  6. بعد تحلل كامل، إضافة 250 ميكرولتر من 3 هيدروكسيد الصوديوم N (هيدروكسيد الصوديوم) و 250 ميكرولتر من 6٪ سلفات الصوديوم دوديسيل (SDS) حل للعينة. بإضافة هذه، وحجم عينة يبلغ 1.5 مل، وهناك تركيز النهائي من 0.5 N هيدروكسيد الصوديوم وتركيز النهائي من 1٪ SDS.
  7. احتضان هذا المزيج في RT لمدة 60 دقيقة و 80 دورة في الدقيقة. مضيفا القاعدة والمنظفات تساعد في تحلل الخلايا النهائي. وقد تم تحسين تركيز هذه المنظفات حتى لا تضر الأبواغ، بينما الناشر الخلايا النباتية.
  8. تحضير وحدة الترشيح العقيمة التي تملك 25 مم الأغشية قطر قبل التعقيم، أو (إذا بيركس زجاج) الرش مع الايثانول 70٪ والمشتعلة ذلك مع موقد بنسن. ندعه يبرد.
  9. وضع 0.2 ميكرون NC غشاء (25 مم) على وحدة الترشيح باستخدام ملقط الإيثانول اللهب تعقيمها. </ لى>
  10. إضافة عينة من الخطوة 4.7 على الغشاء وتصفية السائل باستخدام مضخة فراغ. عندما اجتاز السائل من خلال إيقاف مضخة فراغ. في هذه الخطوة، تتم إزالة المواد الخلية النباتية هي lysed، كما لا يتم الاحتفاظ على الغشاء. فقط سوف تبقى الأبواغ على الغشاء.
  11. إضافة 2 مل من محلول معقم الفسيولوجية ليغسل المنظفات المتبقية وتصفية السائل باستخدام مضخة فراغ.
  12. عندما السائل تمت تصفيتها بالكامل، إيقاف مضخة فراغ. ترك غشاء على وحدة الترشيح.

5. الدناز العلاج

ملاحظة: إجراء العلاج الدناز مباشرة على الغشاء التصفية. من المهم أن وحدة الترشيح لا تسرب ويتم تشغيل المضخة فراغ قبالة.

  1. إضافة 450 ميكرولتر من الماء المعقم، 50 ميكرولتر من رد فعل العازلة الدناز (1X) و 0.5 ميكرولتر انزيم الدناز مباشرة على الغشاء مرشح والسماح لها الوقوف لمدة 15 دقيقة. إذا كان ذلك ممكنا، القيام بذلك الهضم في الغرفة التي هو قليلا الحربمير من المتوسط ​​RT، منذ انزيم يعمل بشكل أفضل عند درجة حرارة 25 درجة مئوية وما فوق.
    ملاحظة: الحفاظ على موقد بنسن جانبا وحدة الترشيح أيضا يزيد من درجة الحرارة وله فائدة إضافية تتمثل في الحفاظ على البيئة المحيطة عقيمة، وبالتالي تقليص خطر التعرض للتلوث العينات.
  2. عند الانتهاء من عملية الهضم الدناز، بدوره على مضخة فراغ لإزالة الانزيم من العينة.
  3. يغسل انزيم المتبقية عن طريق إضافة وتصفية 1 مل من محلول فيزيولوجي.
  4. إذا اجتاز السائل تماما، إيقاف مضخة الفراغ وإزالة غشاء فلتر تحتوي على الأبواغ باستخدام ملقط معقم ووضعه في طبق بتري معقمة.
    ملاحظة: عينة من الأبواغ فصل مستعدة الآن لتحليل المصب. مخزن في -20 درجة مئوية إذا استخدمت لاستخراج الحمض النووي أو بدلا من ذلك في 4 درجات مئوية إذا تم استخدامها لإنبات وزراعة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وقد نشرت النتائج المقدمة هنا في وقت سابق 10،21. يرجى الرجوع إلى تلك المواد لتفسير البيئي ومناقشة البيانات.

وتتلخص إجراءات الشامل في الشكل (1) ويتوافق مع ثلاث خطوات رئيسية: أولا، وفصل من الكتلة الحيوية من الرواسب أو أي مصفوفة البيئية الأخرى. الثانية، وتدمير الخلايا النباتية. وثالثا، تحليل المصب من الأبواغ فصل. يمكن أن تتكون تحليل المصب، على سبيل المثال، لاستخراج الحمض النووي وamplicon التسلسل لتحديد التنوع. يحتاج استخراج الحمض النووي ليكون الأمثل لضمان تحلل من الأبواغ. في عينات الرواسب، وحققنا ذلك عن طريق استخدام الحمض النووي المتسلسل إجراءات استخراج قوي 10. يوضح تطبيق طريقة في الرواسب زيادة كبيرة في جزء من تشكيل أبواغ افيرميكوتس بعد الانفصال. في amplicon تسلسل الريباسي 16Sالجينات، افيرميكوتس في العينات غير المعالجة (المجتمع كله) تقابل فقط إلى 8.0 و 19.0٪ من تسلسل (الجدول 1). في المقابل، بعد العلاج ممثلة افيرميكوتس 90.6٪ و 83.9٪ من العينة التخصيب أبواغ. أوامر الرئيسيان من تشكيل أبواغ افيرميكوتس، Bacilliales وClostridiales، وقد أثرى مع أسلوب، المتناقضة مع عدم وجود أوامر مثل Lactobacilliales التي هي غير افيرميكوتس تشكيل أبواغ. من أجل إثبات أن الأسلوب هو مناسبة خاصة لإثراء الأبواغ الحقيقية، كما تم تحليل مجموعات أخرى قادرة على إنتاج هياكل شبيهة بوغ. وفقا لذلك، انخفضت وتيرة شعاويات، والبكتيريا الزرقاء Myxococcales بعد العلاج لليز الخلايا.

وقد تجلى كفاءة العلاج أيضا باستخدام ثقافات نقية. لإعداد أبواغ (> 95٪ الأبواغ) من Paenibacillus النخروبية، العصوية الرقيقة والعصوية الضارية الإشريكية القولونية، تم علاج كما هو موضح في بروتوكول لتحلل الخلايا النباتية. ثم تم تحضين جميع الثقافات في المرق المغذي عند 37 درجة مئوية وتم قياس النمو باستخدام الكثافة البصرية في 600 نانومتر الطول الموجي. وقد لوحظ نمو الثقافات أبواغ في حين لم يلاحظ أي نمو في E. المعالجة ثقافة القولونية، مما يثبت أن الخلايا النباتية معطوبة لا رجعة فيه (الشكل 2).

الشكل 1
الشكل 1. نظرة عامة على إجراء التجارب. تستخدم الإجراءات لإثراء البكتيريا المكونة للأبواغ في العينات البيئية. الخطوة فصل الخلايا والأبواغ من المصفوفة البيئية يمكن حذف اعتمادا على نوع العينة (أي عينة المياه). في الشكل الطرق المصب تطبق على التخصيب بوغ جزء كوربشر تستجيب لاستخراج الحمض النووي وعالية الإنتاجية التسلسل. هذه الخطوات يمكن الاستعاضة عن زراعة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
الشكل 2. التحقق من العلاج على ثقافات نقية. منحنيات النمو تحقق من نمو البكتيريا المكونة للأبواغ من تعليق الأبواغ من العصوية الرقيقة، العصوية الضارية، وPaenibacillus النخروبية وثقافة خلية من الإشريكية القولونية تعامل مع طريقة للتحلل من الخلايا. تعامل = ○. غير المعالجة = ●. أشرطة الخطأ من ثلاث ثقافات مستقلة. وقد تم قياس نمو الثقافات السيطرة وإعادة نمو الثقافات يعامل الكثافة البصرية في 600 نانومتر الطول الموجي. وقد تم هذا الرقم إعادة طبع ومدمج Wunderlin وآخرون. 2014 بإذن. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرواسب 1 الرواسب 2
المجتمع كله التخصيب أبواغ المجتمع كله التخصيب أبواغ
افيرميكوتس ثمانية 90.6 19.0 83.9
عصيات 0.5 10.0 5.7 15.1
كلوستريديا 7.4 76.9 12.5 63.2
شعاويات 2.4 1.0 4.4 2.1
البكتيريا الزرقاء 1.1 0.1 0.7 0.1
Myxococcales 0.7 0.0 0.2 0.0
بكتيريا أخرى 87.8 8.3 75.7 13.9
<ص الطبقة = "jove_content"> الجدول 1. وفرة من الأبواغ والمجموعات البكتيرية الأخرى لتشكيل بوغ. التردد النسبي للافيرميكوتس (ابواغ المتألق) والمجموعات البكتيرية الأخرى المنتجة للهياكل شبيهة بوغ في عينتين الرواسب الموافق كلها (غير المعالجة) وأبواغ التخصيب (المعالجة) المجتمعات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

واستخدمت المقاومة من الأبواغ إلى العوامل الفيزيائية العدوانية الخارجية (على سبيل المثال، درجة الحرارة أو المنظفات) إلى ابتكار طريقة لفصل الأبواغ الجرثومية من الخلايا النباتية في عينات بيئية. هذا هو الأسلوب الشامل الأول لعزل الأبواغ من العينات البيئية بطريقة غير مدمرة. واستندت الطرق السابقة لتحديد وكشف تحليل أو الأبواغ في عينات على قياس الوكلاء محدد لالأبواغ مثل حمض dipicolinic أو الجينات علامة معينة. في المقابل، مع بروتوكول المعروضة هنا، تتم إزالة مكونات عينة أخرى من الأبواغ وهكذا تبقى الأبواغ في نهاية المطاف باعتبارها الوحيدة والنقاء بقايا العينة. على الرغم من أن وسائل أخرى مثل البسترة أو التدرج الكثافة الطرد المركزي وقد اقترحت لإثراء لالأبواغ 22، أظهرت تجاربنا أن كثافة التدرج الطرد المركزي غير مناسب كوسيلة العام للعينات البيئية، وذلك بسبب الاختلافات الفسيولوجية وكثافات مختلفة الأنواع المختلفة من أبواغ المتألق (لا تظهر البيانات). على النقيض من ذلك، يمكن لدينا بروتوكول بسهولة أن تطبق على جميع أنواع العينات البيئية وغير مناسبة لتطبيقات المصب بما في ذلك الطرق الجزيئية أو زراعة.

هناك نوعان من الخطوات الحاسمة في البروتوكول. الأول هو فصل الكتلة الحيوية من عينة مصفوفة (أي جزيئات الرسوبيات). ومن الضروري أن عدد الخلايا وفصلها عن مصفوفة إلى أقصى، حتى لا نغفل جزءا من التنوع. للحصول على عينات الرواسب، كما تستخدم هنا، واحدة من القيود الرئيسية للبروتوكول هو حقيقة أن بعض الخلايا أو جراثيم قد لا يكون قد فصل من المصفوفة الرواسب وبالتالي لم تدرج في تحليل المصب، وهو الحد المحتمل للطريقة . اعتمادا على نموذج مصفوفة (على سبيل المثال إذا كان هناك الأحماض الدبالية)، والخلايا يمكن بإحكام لذلك، وبالتالي من الصعب أن يفرج عنه.استخدام عازلة أورثو فوسفات وكذلك التجانس جيدة مع الخالط أو خلاط مهمة في هذه الخطوة. لتعزيز الانتعاش، ويتكرر هذا الإجراء من التجانس وإزالة الكتلة الحيوية مرتين كما هو مكتوب في البروتوكول. وقد تم تطوير بروتوكول صفها هنا والأمثل للحصول على عينات من الرواسب بحيرة للمياه العذبة. قد لا تكون بعض المعلمات الأمثل لأنواع أخرى من العينات. وثمة طريقة لتحليل الكسر المجتمع الذي يحتمل التغاضي عنها في عملية تكون لإخضاع مصفوفة الرواسب لاستخراج الحمض النووي وamplicon التسلسل. كما التعديلات الممكنة لهذه التقنية، فإن الخطوة من فصل الكتلة الحيوية من عينة مصفوفة يمكن حذف. لا سيما إذا لا يحتوي على العينات البيئية المواد المعدنية أو الجزيئات العضوية التي يمكن أن تتداخل مع بروتوكول المصب (على سبيل المثال، الماء والسوائل الأخرى أو الثقافات النقاء)، قد لا تكون هناك حاجة إلى الفصل السابق. للحصول على عينات السائل بروتوكول يمكن أن تبدأ مباشرة في الفصل 3(مجموعة من الكتلة الحيوية على غشاء فلتر).

الخطوة الثانية الهامة من البروتوكول هو العلاج مع الليزوزيم والحرارة وهيدروكسيد الصوديوم وSDS لتدمير الخلايا النباتية. درجة الحرارة ومدة فضلا عن تركيز المواد الكيميائية كانت جميعها الأمثل حتى لا تضر الأبواغ، بينما هو يدمر الخلايا. ولذلك ينبغي أن تبقى هذه المعايير بدقة كما هي. كان استخدام خطوة هي الأولى من تسخين العينة عند 65 درجة مئوية فعالة جدا لتحديد خصيصا لالأبواغ مقارنة مع أنواع أخرى من الجراثيم البكتيرية أو هياكل تشبه الجراثيم التي تحدث بين من الكائنات الحية البكتيرية من شعاويات، Myxobacteria، البكتيريا الزرقاء، التي هي عموما ليست مقاوم للحرارة. كما رأينا في الجدول 1، غير بوغ للبكتيريا تشكيل لا تزال موجودة بعد العلاج (8.3٪ إلى 14٪). بعض التفسيرات لذلك هي أن عينات الرواسب معقدة للغاية ويمكن أيضا تؤوي خلايا غير بوغ المقاوم. بالإضافة إلى ذلك، قد المواد العضوية المتبقية تسمح معين ل خلايا ttached البقاء على قيد الحياة العلاج. من أجل مواصلة خفض النسبة المئوية للخلايا تشكيل غير بوغ في العينات المعالجة، ينبغي أن يكون الأمثل والأسلوب على أساس فردي نوع العينة.

يمثل طريقة أداة جديدة لدراسة المستهدفة من أبواغ المتألق في العينات البيئية. علاج لتدمير الخلايا النباتية يمكن اختبارها على ثقافات نقية من الخلايا والأبواغ وتكييفها لتتناسب مع المقاومة الفردية من الخلايا. يمكن أن ينظر إلى تدمير الخلايا في منحنيات الثقافات المعالجة هو مبين في الشكل (2). وتأخر النمو الثقافات المعالجة يمكن أن يكون راجعا إلى الوقت الذي تحتاج الأبواغ لإعادة الإنبات والانتقال إلى مرحلة النمو الأسي. يمكن أن التفسيرات المحتملة الأخرى لهذا التأخير أيضا أن يكون ضعف ثقافة أبواغ أو أرقام الهواتف المحمولة أقل بعد العلاج. إذا لم يتم استخدام الأبواغ فصل لاستخراج الحمض النووي، والخطوة الأخيرة من العلاج الدناز يمكن حذفها.

الإقليم الشمالي "> التطبيقات المستقبلية لهذه التقنية يمكن التفكير في الصناعات التي تحتاج الأبواغ الممرضة ليتم الكشف. ومن الأمثلة على ذلك في الصناعات الغذائية والبحوث السريرية، حيث كشف وتحليل (لتحديد) من الأبواغ، والتمايز في الفترة من الخلايا النباتية (على سبيل المثال، من منتجات الأغذية مثل الحليب أو القائمة على منتجات الألبان) أمر حيوي. وهذا قد يكون خاصا صلة معتبرا أن ترى العديد من الإجراءات القياسية استخراج الحمض النووي المباشر من عينة باستخدام أنزيمات التحللي التي لا تتكيف مع ليز الأبواغ، والتي سوف بالتالي يمكن تجاهلها. ومع الطريقة المعروضة هنا، والخلايا يمكن إزالتها وسوف التحليل اللاحق توفر إجابات على وجود أو عدم وجود الأبواغ على عكس الخلايا. تطبيقات أخرى تشمل تحليل المجتمعات أبواغ في عينات بيئية مختلفة (على سبيل المثال الثلج أو الرواسب النوى ) أنه لا المحفوظات التاريخية من الظروف البيئية في العديد من بيئات مع بالبيءه مستقرة نسبياشروط التل (على سبيل المثال البحيرة سطح الرواسب) افيرميكوتس لا يمكن أن تزدهر في شكل الخلايا النباتية المكونة للأبواغ. عندما تتدهور الأوضاع (على سبيل المثال عن طريق استنزاف المواد الغذائية خلال دفن الرواسب أو التحول نحو الظروف اللاهوائية) خلايا تتحرك في أبواغ الدولة. لذلك، لا يمكن للمجتمعات أبواغ استردادها من قلوب الرسوبيات تعكس الظروف البيئية في وقت الدفن، وبالتالي يمكن استخدامها كمؤشر paleoecological من الشروط المسبقة لدفنها. ومع ذلك، ما زلنا جمع المعلومات لدعم هذا الادعاء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

المؤلفون تعترف مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية للمنحة رقم 31003A-132358/1، 31003A_152972 ورقم 151948، والمباركيه بيير مرسييه صب لا العلم.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Whatman nitrocellulose membrane filters, 0.2 μm pore size, 47 mm diameter Sigma-Aldrich WHA7182004 Aldrich 
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Sigma-Aldrich 252859 Sigma-Aldrich CAS 77-86-1
EDTA Sigma-Aldrich E9884 Sigma-Aldrich CAS  60-00-4 
Lysozyme from chicken egg white Sigma-Aldrich 62971 Fluka powder, CAS  12650-88-3 
Ultra-Turrax homogenizer T18 basic IKA 3720000
Glass filter holders for 47 mm membranes, Pyrex glass EMD Millipore XX10 047 00
Chemical duty vacuum pump Millipore WP6122050 220 V/50 Hz
Manifold sampling filtration for 25 mm membranes Millipore 1225 Sampling Manifold polypropylene
Dnase New England Biolabs M0303S Rnase free
NaOH Sigma-Aldrich S5881 Sigma-Aldrich CAS  1310-73-2 
Sodium dodecyl sulfphate (SDS) Sigma-Aldrich L3771 Sigma 
Whatman nitrocellulose membrane filters, 0.2 μm pore size, 25 mm diameter Sigma-Aldrich WHA7182002 Aldrich

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nicholson, W. L. Roles of Bacillus endospores in the environment. Cell Mol Life Sci. 59 (3), 410-416 (2002).
  2. Lester, E. D., Satomi, M., Ponce, A. Microflora of extreme arid Atacama Desert soils. Soil Biol Biochem. 39 (2), 704-708 (2007).
  3. Wilson, M. S., Siering, P. L., White, C. L., Hauser, M. E., Bartles, A. N. Novel archaea and bacteria dominate stable microbial communities in North America's Largest Hot Spring. Microb Ecol. 56 (2), 292-305 (2008).
  4. Hugenholtz, P. Exploring prokaryotic diversity in the genomic era. Genome Biol. 3 (2), (2002).
  5. Onyenwoke, R. U., Brill, J. A., Farahi, K., Wiegel, J. Sporulation genes in members of the low G+C Gram-type-positive phylogenetic branch (Firmicutes). Arch Microbiol. 182 (2-3), 182-192 (2004).
  6. Delmont, T. O., et al. Accessing the soil metagenome for studies of microbial diversity. Appl Environ Microbiol. 77 (4), 1315-1324 (2011).
  7. Ricca, E., Henriques, A. O., Cutting, S. M. Bacterial spore formers: probiotics and emerging applications. , Horizon Bioscience. (2004).
  8. Kuske, C. R., et al. Small-Scale DNA Sample Preparation Method for Field PCR Detection of Microbial Cells and Spores in Soil. Appl Environ Microbiol. 64 (7), 2463-2472 (1998).
  9. von Mering, C., et al. Quantitative phylogenetic assessment of microbial communities in diverse environments. Science. 315 (8515), 1126-1130 (2007).
  10. Wunderlin, T., Junier, T., Roussel-Delif, L., Jeanneret, N., Junier, P. Stage 0 sporulation gene A as a molecular marker to study diversity of endospore-forming Firmicutes. Environ Microbiol Rep. 5 (6), 911-924 (2013).
  11. Siala, A., Hill, I. R., Gray, T. R. G. Populations of spore-forming bacteria in an acid forest soil, with special reference to Bacillus subtilis. J General Microbiol. 81 (1), 183-190 (1974).
  12. Brandes Ammann, A., Kolle, L., Brandl, H. Detection of bacterial endospores in soil by terbium fluorescence. Int J Microbiol. , 435281 (2011).
  13. Fichtel, J., Koster, J., Rullkotter, J., Saas, H. High variations in endospore numbers within tidal flat sediments revealed by quantification of dipicolinic acid. Geomicrobiol J. 25 (7-8), (2008).
  14. Cronin, U. P., Wilkinson, M. G. The potential of flow cytometry in the study of Bacillus cereus. J Appl Microbiol. 108 (1), 1-16 (2010).
  15. de Rezende, J. R., et al. Dispersal of thermophilic Desulfotomaculum endospores into Baltic Sea sediments over thousands of years. ISME J. 7 (1), 72-84 (2013).
  16. Hubert, C., et al. Thermophilic anaerobes in Arctic marine sediments induced to mineralize complex organic matter at high temperature. Environ Microbiol. 12 (4), 1089-1104 (2010).
  17. Garbeva, P., van Veen, J. A., van Elsas, J. D. Predominant Bacillus spp. in agricultural soil under different management regimes detected via PCR-DGGE. Microb Ecol. 45 (3), 302-316 (2003).
  18. Brill, J. A., Wiegel, J. Differentiation between spore-forming and asporogenic bacteria using a PCR and southern hybridization based method. J Microbiol Methods. 31 (1-2), 29-36 (1997).
  19. Rueckert, A., Ronimus, R. S., Morgan, H. W. Development of a real-time PCR assay targeting the sporulation gene, spo0A., for the enumeration of thermophilic bacilli in milk powder. Food Microbiol. 23 (3), 220-230 (2006).
  20. Bueche, M., et al. Quantification of endospore-forming firmicutes by quantitative PCR with the functional gene spo0A. Appl Environ Microbiol. 79 (17), 5302-5312 (2013).
  21. Wunderlin, T., Junier, T., Roussel-Delif, L., Jeanneret, N., Junier, P. Endospore-enriched sequencing approach reveals unprecedented diversity of Firmicutes in sediments. Environ Microbiol Rep. 6 (6), 631-639 (2014).
  22. Nicholson, W. L., Law, J. F. Method for purification of bacterial endospores from soils: UV resistance of natural Sonoran desert soil populations of Bacillus spp. with reference to B. subtilis strain 168. J Microbiol Methods. 35 (1), 13-21 (1999).

Tags

العلوم البيئية، العدد 107، الأبواغ، والانفصال، الخلايا النباتية والبكتيريا المكونة للأبواغ، تحلل الخلية، والتنوع، والبيئة الميكروبية
العزلة المادية من الأبواغ من العينات البيئية التي تستهدف تحلل من الخلايا النباتية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wunderlin, T., Junier, T., Paul, C., More

Wunderlin, T., Junier, T., Paul, C., Jeanneret, N., Junier, P. Physical Isolation of Endospores from Environmental Samples by Targeted Lysis of Vegetative Cells. J. Vis. Exp. (107), e53411, doi:10.3791/53411 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter