Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Environment

בידוד פיזי של Endospores מדגימות סביבתיות על ידי תמוגה ממוקדת של תאים גטטיבי

Published: January 21, 2016 doi: 10.3791/53411

Introduction

המטרה של עבודה זו היא לספק פרוטוקול להפרדת endospores חיידקים מתאי חיידקים וגטטיבי בדגימות סביבתיות. ההיווצרות של endospores חיידקים היא אסטרטגיית הישרדות, בדרך כלל מופעל על ידי רעב, שנמצאה במספר קבוצות חיידקים המשתייכות למשפחה החסרה 1 Firmicutes. חיידקי יוצרי Endospore נלמדים היטב, בעיקר בגלל מספר זני פתוגנים ומכאן חשיבות רפואית (למשל, anthracis Bacillus או קלוסטרידיום). זני סביבה של חיידקי יוצרי endospore היו מבודדים מכמעט כל סביבה (קרקע, מים, משקעים, בטן חיות אוויר, קרח, מעיים אנושיים, ועוד) 1-3. לכן, Firmicutes הוא המערכה הזאת השנייה בשכיחותו באוספי תרבות 4.

בגלל חלבוני הקליפה חיצונית וליבת מגן הקשוח שלהם, endospores יכול לשרוד בתנאי הסביבה קיצוני החל frהתייבשות אום לקרינה גבוהה, טמפרטורות קיצוניות וכימיקלים מזיקים 5. התנגדות יוצאת דופן זה עושה את זה אתגר לחלץ DNA מendospores 6-8. זה סביר מסביר מדוע הם התעלמו במחקרי רצף סביבתי 9,10. שיטות אחרות, כגון מיקוד של endospores בדגימות סביבתיות על ידי נוגדני ניאון 11, כימות של חומצת dipicolinic (DPA) בקרקע 12 ומשקעים 13, cytometry זרימת 14 או פסטור וטיפוח לאחר מכן 15,16 כבר משמשים לאחזור או לכמת endospores ב דגימות סביבתיות. בשנים האחרונות, שיטות מיצוי DNA מותאם כמו גם פריימרים ספציפיים מולקולריים למקד רצפי גני endospore ספציפי פותחו 10,17-20. זה עזר לחשוף יותר מגוון ביולוגי בקרב קבוצה זו של חיידקים 21 וגם הוביל ליישומים בתעשייה וברפואה לצורך זיהוי של endospores, למשל באבקת חלב 19.

הפרוטוקול המובא כאן מבוסס על ההבדל בהתנגדות לתנאי physicochemical מזיקים (כגון חום וחומרי ניקוי) של endospores חיידקים ביחס לתאים של צמח. להשמיד תאים של צמח במדגם, שנתקיים ברצף להחיל חום, יזוזים וריכוזים נמוכים של חומרי ניקוי. הזמן והכוח של טיפולים אלה כבר מותאמים כדי לא להרוס את הנבגים, אבל לlyse כל תאי הצמח. תאים מסוימים בבריכת תא סביבתית הם עמידים יותר מאחרים, ולכן כדי להגדיל את ההסתברות של השמדת כל התאים של הצמח, אנו מיישמים את שלושה טיפולים שונים. היתרון והחידוש של שיטה זו הוא שendospores לאחר הטיפול הוא עדיין שלם ויכול לשמש לניתוח נוסף במורד הזרם. אלה כוללים מיצוי DNA, PCR (qPCR) וamplicon או רצף metagenomic (מיקוד במיוחד הקבוצה של endospores וכך להקטין דiversity, תוך הגדלת כיסוי). Endospores יכול לשמש גם לטיפוח או כימות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי במורד הזרם, cytometry זרימה, או זיהוי של DPA. תכונה חשובה של שיטה זו היא שעל ידי השוואת מדגם שלא טופל עם מדגם מטופלים, אחד יכול להסיק את הכמות ומגוון של endospores במדגם סביבתי בנוסף לרכיב המקביל לשל צמח תאים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת כימיקלים וציוד

  1. הפוך 500 מיליליטר של 1% hexametaphosphate נתרן (SHMP) (Napo 3) n פתרון ולעקר ידי מעוקר.
  2. מסננים לעקר nitrocellulose (NC) (גודל נקבובית 0.22 מיקרומטר, בקוטר 47 מ"מ) על ידי מעוקר בצלחות פטרי זכוכית סגורה.
  3. לעקר מסנני NC (גודל נקבובית 0.22 מיקרומטר, בקוטר 25 מ"מ) על ידי מעוקר בצלחות פטרי זכוכית סגורה.
  4. לשקול ולב המשקל הריק של 50 מיליליטר צינורות סטרילי (עם כובע על) (צינור אחד לדגימה).
  5. הכן טריס-EDTA-חיץ 1x (TE-חיץ): להפוך את הפתרון של 10 מ"מ טריס (טריס aminomethane (hydroxymethyl)) וחיץ 1 mM EDTA. התאם ל- pH 8 ולעקר ידי מעוקר.
  6. הכן פתרון יזוזים (20 מ"ג / מיליליטר) על ידי המסת 0.02 גרם של יזוזים ב 1 מיליליטר TE-חיץ. באופן אידיאלי, לעשות טרי בכל פעם. חנות ב 4 מעלות צלזיוס במשך לא יותר מ 1 בשבוע.
  7. הכן פתרון פיסיולוגי על ידי המסת 8 גרם נתרן כלורי / L(NaCl) במים מזוקקים. לעקר ידי מעוקר.

2. הפרדה של ביומסה ממשקעים

  1. הוסף 3 גרם של מדגם משקעים מראש שקל סטרילי 50 מיליליטר צינורות באמצעות סקופים מתכת-בער אתנול. לבצע את זה ב, ארון בטיחות ביולוגית UV מעוקר נקי, כדי למנוע זיהום.
  2. להוסיף 15 מיליליטר של פתרון 1% סטרילי (autoclaved) SHMP למדגם באמצעות סטרילי סיים ביורטה. פתרון SHMP גם יכול להיות מסונן כדי למנוע זיהום.
  3. Homogenize המשקעים ופתרון SHMP עם disperser הנוזלית / homogenizer (למשל, homogenizer-Turrax Ultra). 70% אתנול לעקר או החיטוי הרוטור הפיזור לפני השימוש. הפעל את המגון 1 דקות ב17,500 סל"ד. תן את שאר המדגם למשך 2 דקות ולחזור על הומוגניות דקות 1 באותה מהירות הרוטור.
  4. בואו המדגם לעמוד במשך 10 דקות. בשלב זה, החלקיקים הכבדים ביותר (מינרלים) יישבו. התאים וכל רכיבים אורגניים של המדגם עם זאת wחולה יישאר בפתרון. לאחר מכן, להעביר את פתרון supernatant (ביומסה תא המכיל) לתוך צינור 50 מיליליטר נקי, תוך הקפדה שלא להפריע גלולה המשקעים.
  5. לגלולת המשקעים להוסיף שוב 15 מיליליטר של פתרון 1% סטרילי (autoclaved) SHMP באמצעות סטרילי סיים ביורטה. אז חזור על שלבים 2.3 ו -2.4. חזרה זו מבטיחה את ההפרדה מהסכום המרבי של תאים וחלקיקים אורגניים ממרכיב המינרלים של המשקעים. Supernatant של הפרדה שנייה זה יכול להיות התמזג עם supernatant מההפרדה הראשונה.
    הערה: כל השלבים הבאים נעשים על supernatant (המכילים ביומסה תא). רכיב המינרלים (גלולה משקעים) יכול להיות מושלך.
  6. צנטריפוגה המדגם ב 20 XG דקות 1. צעד זה מגדיל את G-Force מספיק כדי ליישב חלקיקים מינרליים קטנים בעוד שחומר התא הביולוגי עדיין בפתרון. לאחר צנטריפוגה, להעביר את פתרון supernatant (ביומסה תא המכיל) לשפופרת 50 מיליליטר נקי. זורק את כדור המינרלים.
  7. לקבוע את הנפח הסופי של התמיסה המכילה ביומסה על ידי שקילת המדגם. קביעת המשקל נמנעה צורך להעביר את הדגימה לגליל סיים ומפחיתה את הסיכון לזיהום.

3. אוסף של ביומסה בממברנה הסינון

  1. הכן יחידת סינון (47 מ"מ קרומי קוטר) ומשאבת ואקום. לעקר את יחידת הסינון או על ידי מעוקר או (אם פיירקס זכוכית) על ידי ריסוס אותו עם 70% אתנול ובוער זה עם מבער בונזן. תן לזה להתקרר לפני שימשיך בפרוטוקול.
  2. להוסיף קרום NC סטרילי ליחידת הסינון באמצעות מלקחיים מעוקרים-בער אתנול.
  3. להוסיף מחצית ממדגם supernatant (משלב 2.6) על גבי יחידת סינון קרום ולאסוף תאים בקרום באמצעות משאבת הוואקום.
  4. כאשר הנוזל עבר באופן מלא דרך המסנן, לעצור את משאבת הוואקום ולהסיר בזהירות את הקרום באמצעות איתןol-להבה מעוקרת מלקחיים. מניחים את הקרום לצלחת פטרי סטרילית.
    1. חותך את הקרום במחצית באמצעות מספריים מעוקרים-בער אתנול. להוסיף כל מחצית של הקרום לצינור נפרד 2 מיליליטר. מחצית מהקרום תשמש להפקת DNA וניתוח של קהילת החיידקים כולה. החצי השני של מסנן יאוחסן ב -80 ° C ומשמש כגיבוי.
  5. מקום קרום NC החדש על יחידת הסינון ולאסוף ביומסה מהמחצית השנייה של נפח דגימה (משלב 2.6) תוך שימוש במשאבת הוואקום.
  6. כאשר הנוזל עבר באופן מלא דרך המסנן, לעצור את משאבת הוואקום ולהסיר בזהירות את הקרום באמצעות מלקחיים מעוקרים-בער אתנול. מניחים את כל הקרום לתוך צינור נפרד 2 מיליליטר. מדגם זה ישמש לטיפול להפריד endospores מתאי צמח. המדגם ניתן לאחסן ב -20 ° C עד לשימוש.

4. תמוגה של תאים גטטיבי

  1. בצעטיפול להפריד endospores מהתאים של צמח ביומסה שנאספו בעבר על קרום NC (שלב 3.6).
    1. אם הקרום הוקפא, להשאיר אותו על RT במשך 10 דקות כדי להפשיר. לאחר מכן למקם את הקרום בצלחת פטרי סטרילי ולחתוך אותו (כ 4 פעמים) לחתיכות קטנות יותר באמצעות מספריים מעוקרים-בער אתנול. אז למקם את כל חלקי מסנן הקרום לתוך צינור 2 מיליליטר סטרילי.
  2. להוסיף 900 ​​μl של חיץ 1x TE (טריס-EDTA) (ראה 1.5) לצינור המכיל קרום המדגם ומערבבים היטב על ידי מערבולת. בשלב זה, ביומסה היא להסיר את הקרום לפתרון TE-החיץ.
  3. מניחים את הצינור בחממה על 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ו -80 סל"ד. לאחר מכן להסיר את הצינור מהחממה ולתת לו להתקרר במשך 15 דקות.
  4. להוסיף של ליזוזים מוכן טרי (ראה 1.5) 100 μl להגיע לריכוז סופי של 2 מ"ג / מיליליטר. אל תוסיף יזוזים לפני המדגם התקרר עד 37 ° C, כמו זה יכול מעלותRade האנזים.
  5. דגירה המדגם ב 37 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות ו -80 סל"ד, התנאים אופטימליים ליזוזים לlyse תאי צמח.
  6. לאחר תמוגה הושלמה, להוסיף 250 μl של 3 הידרוקסיד N נתרן (NaOH) ו -250 μl של 6% פתרון סולפט dodecyl נתרן (SDS) לדוגמא. על ידי הוספה זו, נפח הדגימה מגיע 1.5 מיליליטר ויש ריכוז סופי של 0.5 N NaOH וריכוז סופי של 1% SDS.
  7. דגירה זו תערובת על RT במשך 60 דקות ו -80 סל"ד. הוספת הבסיס וחומרי הניקוי תעזור בתמוגה תא סופית. הריכוז של חומרי ניקוי אלה כבר מותאם כדי לא לפגוע בendospores, בעוד lysing תאי צמח.
  8. הכן יחידת סינון סטרילי שמחזיקה קרומי קוטר 25 מ"מ על ידי מעוקר, או (אם פיירקס זכוכית) ריסוס זה עם 70% אתנול ובוער זה עם מבער בונזן. תן לזה להתקרר.
  9. הנח קרום 0.2 מיקרומטר NC (25 מ"מ קוטר) על יחידת הסינון באמצעות מלקחיים אתנול-להבה מעוקרת. </ Li>
  10. הוסף את המדגם מהצעד 4.7 על הממברנה ולסנן את הנוזל באמצעות משאבת הוואקום. כאשר הנוזל עבר דרך, לכבות את משאבת ואקום. בשלב זה, את חומר התא וגטטיבי lysed מוסר, כפי שהוא לא שמר על הממברנה. רק endospores יישאר על הממברנה.
  11. הוסף 2 מיליליטר של תמיסה פיזיולוגית סטרילי כדי לשטוף את חומרי ניקוי שיורית ולסנן את הנוזל באמצעות משאבת הוואקום.
  12. כאשר נוזל מסונן באופן מלא, לכבות את משאבת הוואקום. השאר את הקרום ביחידת הסינון.

5. DNase טיפול

הערה: בצע את טיפול DNase ישירות על קרום המסנן. חשובה שיחידת הסינון לא תדלוף ומשאבת הוואקום כבויה.

  1. להוסיף 450 μl של מים סטריליים, 50 μl של חיץ תגובת DNase (1x) ו -0.5 אנזים DNase μl ישירות על גבי קרום המסנן ולתת לו לעמוד במשך 15 דקות. במידת האפשר, לעשות עיכול זה בחדר שהוא מעט מלחמהmer מ RT הממוצע, מאז האנזים עובד טוב יותר בטמפרטורות של 25 מעלות צלזיוס ומעלה.
    הערה: שמירה על המבער בונזן צד יחידת הסינון גם מעלה את הטמפרטורה ויש יתרון הנוסף של שמירה על הסביבה סטרילית, ולכן הפחית את הסיכון לזיהום של הדגימות.
  2. כאשר עיכול DNase הוא סיים, להפעיל משאבת ואקום כדי להסיר את האנזים מהמדגם.
  3. לשטוף את האנזים שיורית על ידי הוספה וסינון 1 מיליליטר של תמיסה פיזיולוגית.
  4. אם הנוזל עבר באופן מלא, לכבות את משאבת ואקום ולהסיר את הקרום המכיל מסנן endospores באמצעות מלקחיים סטרילי ולמקם אותו לתוך צלחת פטרי סטרילי.
    הערה: המדגם של endospores המופרד מוכן כעת לניתוח במורד הזרם. חנות ב -20 ° C אם משתמשת בו להפקת DNA או לחלופין על 4 מעלות צלזיוס אם משתמש בו לנביטה וטיפוח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

התוצאות שהוצגו כאן כבר פורסמה קודם לכן 10,21. אנא עיין במאמרים אלה לפרשנות והדיון הסביבתיים של נתונים.

ההליך הכולל מסוכם באיור 1 ומתאים לשלושה שלבים עיקריים: ראשון, ההפרדה של ביומסה ממשקעים או כל מטריצה ​​סביבתית אחרת; שני, ההרס של תאים של צמח; והשלישי, הניתוח במורד הזרם של endospores המופרד. ניתוח במורד הזרם יכול להיות מורכב, למשל, של מיצוי DNA ורצף amplicon לקבוע גיוון. מיצוי DNA צריך להיות מותאם כדי להבטיח תמוגה של endospores. בדגימות משקעים, שהשגנו זאת על ידי שימוש בהליך מיצוי DNA רציף כוחני 10. יישום השיטה במשקעים מדגים גידול משמעותי בחלק של Firmicutes יוצרי endospore לאחר הפרדה. ברצף amplicon של 16S rRNAגן, Firmicutes בדגימות מטופל (כל קהילה) תואם רק 8.0 ו19.0% מהרצפים (טבלה 1). לעומת זאת, לאחר הטיפול Firmicutes ייצג 90.6% ו83.9% מהמדגם מועשר endospore. שתי הזמנות הגדולות של יוצרי endospore Firmicutes, Bacilliales וClostridiales, היו מועשרים בשיטה, בניגוד לפקודות כמו היעדר Lactobacilliales שFirmicutes יוצרי endospore שאינו. על מנת להוכיח כי השיטה מתאימה במיוחד להעשרת endospores האמיתי, קבוצות אחרות מסוגלים לייצר מבנים כמו נבג-נותחו גם. בהתאם לכך, את התדר של Actinobacteria, כחוליות וMyxococcales ירד לאחר הטיפול לlyse תאים.

היעילות של הטיפול הייתה גם הפגינה באמצעות תרבויות טהורות. הכנת endospore (> 95 endospores%) של Paenibacillus alvei, Bacillus subtilis ו megaterium Bacillus Escherichia coli, טופלו כמתואר בפרוטוקול לתמוגה של תאי צמח. כל התרבויות אז הודגרו במרק מזין על 37 מעלות צלזיוס וצמיחה נמדדה באמצעות צפיפות אופטית באורך גל של 600 ננומטר. צמיחה נצפתה לתרבויות endospore תוך צמיחה לא נצפתה במטופלי א תרבות coli, מוכיחה כי תאים של צמח הם בלתי הפיך פגומים (איור 2).

איור 1
סקירת איור 1. של ההליך ניסיוני. הליך המשמש להעשרת חיידקי יוצרי endospore בדגימות סביבתיות. ניתן להשמיט את הצעד של הפרדת תאים וendospores מהמטריצה ​​הסביבתית בהתאם לסוג של מדגם (כלומר, דגימת מים). בדמות השיטות במורד הזרם להחיל על קור שבריר מועשר הנבגspond למיצוי DNA ורצף תפוקה גבוה. ניתן להחליף את הפעולות הבאות על ידי culturing. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. אימות של הטיפול בתרבויות טהורות. עקומות גדילה אימות הצמיחה של חיידקי יוצרי endospore מהשעיה של endospores של Bacillus subtilis, megaterium Bacillus, וPaenibacillus alvei ותרבית תאים של Escherichia coli שטופלה בשיטה לתמוגה של תאים. טופל = ○. שלא טופל = ●. ברים שגיאה משלוש תרבויות עצמאיות. צמיחה של תרבויות שליטה וצמיחה מחדש של תרבויות טופלו נמדדה צפיפות אופטית באורך גל של 600 ננומטר. נתון זה כבר מחדש מודפס וROM Wunderlin et al. 2014 עם רשות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

משקעי 1 משקעים 2
קהילה כולה מועשר endospore קהילה כולה מועשר endospore
Firmicutes 8.0 90.6 19.0 83.9
חיידקים 0.5 10.0 5.7 15.1
קלוסטרידיאה.את 7.4 76.9 12.5 63.2
Actinobacteria 2.4 1.0 4.4 2.1
כחוליות 1.1 0.1 0.7 0.1
Myxococcales 0.7 0.0 0.2 0.0
חיידקים אחרים 87.8 8.3 75.7 13.9
<p class = "jove_content"> טבלת 1. שפע של endospores וקבוצות חיידקי יוצרי נבגים אחרות. שכיחות יחסית של Firmicutes (endospore-מעצבים) וקבוצות חיידקים אחרות לייצר מבנים כמו נבג-בשתי דגימות משקעים המתאימים לכל (ללא טיפול) ומועשר endospore קהילות (שטופלו).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ההתנגדות של endospores לגורמים חיצוניים אגרסיביים physicochemical (למשל, טמפרטורה או בדטרגנטים) שימשה כדי להמציא שיטה להפריד endospores חיידקים מהתאים של צמח בדגימות סביבתיות. זוהי השיטה המקיפה הראשונה לבודד endospores מדגימות סביבתיות באופן שאינו הרסני. שיטות קודמות לכמת, לזהות או לנתח endospores בדגימות המבוססות על המדידה של פרוקסי הספציפי לendospores כגון חומצת dipicolinic או גני סמן ספציפיים. לעומת זאת, בפרוטוקול שהוצג כאן, רכיבי מדגם אחרים מאשר endospores יוסרו וכך endospores סופו של דבר יישאר כשרידים היחידים ומטוהרים של המדגם. למרות ששיטות אחרות כגון צנטריפוגה פסטור או שיפוע צפיפות הוצעו להעשרה לendospores 22, הבדיקות שלנו הראו כי צנטריפוגה שיפוע צפיפות היא לא מתאימה כשיטת כללית לדגימות סביבתיות, בשל הבדלים פיסיולוגיים וצפיפויות שונות של מינים שונים של endospore-מעצבים (מידע לא מוצג). בניגוד לכך, הפרוטוקול שלנו יכול בקלות להיות מיושם על כל סוגי דגימות סביבתיות ומתאים ליישומים במורד הזרם כוללים שיטות או culturing מולקולריים.

ישנם שני שלבים קריטיים בפרוטוקול. הראשון הוא ההפרדה של ביומסה ממטריצת מדגם (כלומר, חלקיקי משקעים). זה חיוני כי מספר התאים המופרדים מהמטריצה ​​להיות מוגדל, כדי שלא להתעלם חלק מהגיוון. לדגימות משקעים, כפי שכאן, אחת המגבלות העיקריות של הפרוטוקול היא העובדה כי חלק מהתאים או נבגים שאולי לא היו מנותקים ממטריצת המשקעים ולכן לא נכללו בניתוח במורד הזרם, שהוא הגבלת פוטנציאל של השיטה . בהתאם למטריצת המדגם (לדוגמא, אם יש חומצות הומיות), תאים עשויים להיות כרוך באופן הדוק לזה ולכן קשה לשחרר.השימוש במאגר Ortho-פוספט, כמו גם הומוגניזציה טובה עם homogenizer או בלנדר חשוב בשלב זה. כדי להגביר את ההתאוששות, ההליך של הומוגניות וההסרה של ביומסה חוזר על עצמו פעמיים כפי שנכתב בפרוטוקול. הפרוטוקול המתואר כאן פותח ומותאם במיוחד לדגימות של משקעי אגם מים מתוקים. פרמטרים מסוימים לא יהיו אופטימליים עבור סוגים אחרים של דגימות. דרך אחת לנתח את שבר הקהילה שהפוטנציאל התעלם בתהליך תהיה להכפיף את מטריצת המשקעים למיצוי DNA ורצף amplicon. כשינויים אפשריים לטכניקה, הצעד של הפרדה של ביומסה ממטריצת מדגם עשוי להיות מושמט. במיוחד אם המדגם הסביבתי אינו מכיל חלקיקי חומר או מינרלים אורגניים שיכול להפריע לפרוטוקול במורד הזרם (לדוגמא, מים, נוזלים אחרים או תרבויות מטוהרים), ייתכן שלא תהיה צורך בהפרדה מוקדמת. עבור דגימות נוזל הפרוטוקול יכול להתחיל ישירות בפרק 3(אוסף של ביומסה בקרום מסנן).

הצעד החשוב השני של הפרוטוקול הוא הטיפול עם תאים של צמח יזוזים, חום, NaOH וSDS להרוס. טמפרטורה, משך, כמו גם ריכוז של חומרים כימיים שכל מוטבו לא לפגוע בendospores, תוך השמדת התאים. פרמטרים אלה צריכים להישמר בקפדנות ולכן כפי שהם. השימוש בשלב ראשון של חימום המדגם על 65 מעלות צלזיוס היה יעיל מאוד כדי לבחור במיוחד עבור endospores בהשוואה לסוגים אחרים של נבגי חיידקים או מבנים כמו נבג המתחוללים בין טווח מערכת החיידקים של Actinobacteria, Myxobacteria, כחוליות, שהם בדרך כלל לא עמידות לחום. כפי שניתן לראות בטבלה 1, חיידקי יוצרי נבגים שאינם עדיין קיימים לאחר הטיפול (8.3% עד 14%). כמה הסברים לכך הם שדגימות משקעים הן מורכבות מאוד וגם יכולות נמל תאים שאינם נבג עמידים. בנוסף, חומר אורגני שאריות עשוי לאפשר מסוימים תאי ttached לשרוד הטיפול. על מנת להקטין את אחוז התאים שאינם יוצרי נבגים בדגימות שטופלו נוסף, השיטה צריכה להיות מותאמת המבוססת על סוג מדגם בודד.

השיטה מהווה כלי חדשני למחקר הממוקד של endospore-מעצבים בדגימות סביבתיות. הטיפול להרס תאים של צמח יכול להיבדק על תרבויות טהורות של תאים וendospores ומותאם כדי להתאים התנגדות בודדת של תאים. ההרס של תאים שניתן לראות בעקומות של תרבויות שטופלו מוצגות באיור 2. הצמיחה המאוחרת של התרבויות טופלו יכולה להיות בגלל הזמן שendospores צריך מחדש לנבוט ולעבור לשלב הצמיחה המעריכית. הסברים אפשריים אחרים לעיכוב זה יכול להיות גם היחלשות של תרבות endospore או מספרים סלולריים נמוכים יותר לאחר טיפול. אם endospores המופרד אינו משמש להפקת DNA, ניתן להשמיט את השלב האחרון של טיפול DNase.

NT "> יישומים עתידיים של טכניקה זו יכול להיות בחזונו בתעשיות שבי endospores פתוגניים צריך להיות מזוהה. דוגמא אחת היא בתעשיית המזון ובמחקר קליני, שבו זיהוי וניתוח (לזיהוי) של endospores, ובידולה מהתאים של צמח (לדוגמא, ממוצרי מזון כגון מוצרי חלב או על בסיס חלב) הוא חיוני. זה עשוי להיות רלוונטי במיוחד בהתחשב בכך שרבים נהלים סטנדרטיים לשקול מיצוי DNA ישיר ממדגם באמצעות אנזימי ממס שאינם מותאמים לlyse endospores, שכך יהיה להתעלם. בשיטה שהוצגה כאן, ניתן להסיר תאים וניתוח שלאחר מכן יספק תשובות לנוכחות או עדר של endospores בניגוד לתאים. יישומים אחרים כוללים ניתוח של קהילות endospore בדגימות סביבתיות שונות (לדוגמא ליבות קרח או משקעים ) שהוא ארכיון היסטורי של תנאים סביבתיים. בסביבות רבות עם לסביבה יציבה יחסיתתנאי טל (לדוגמא משטח משקעי אגם) Firmicutes יכול לשגשג בצורה של תאים וגטטיבי יוצרי endospore. כאשר תנאים להתדרדר (לדוגמא על ידי דלדול תזונתי במהלך קבורה משקעים או שינוי כיוון תנאים אנאירוביים) התאים לעבור לendospore מדינה. לכן, קהילות endospore אחזור מליבות משקעים יכולות לשקף את התנאים הסביבתיים בזמן הקבורה ובכך לשמש כאינדיקצית paleoecological של התנאים מוקדמים לקבורה. עם זאת, אנחנו עדיין אוספים מידע כדי לתמוך בטענה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

יש המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

המחברים מודים שוויצרי הקרן הלאומית למדע למענק מס '31003A-132358/1, 31003A_152972 ומס' 151,948, ומרכז המחקר הספרדי פייר מרסייה pour la מדע.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Whatman nitrocellulose membrane filters, 0.2 μm pore size, 47 mm diameter Sigma-Aldrich WHA7182004 Aldrich 
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Sigma-Aldrich 252859 Sigma-Aldrich CAS 77-86-1
EDTA Sigma-Aldrich E9884 Sigma-Aldrich CAS  60-00-4 
Lysozyme from chicken egg white Sigma-Aldrich 62971 Fluka powder, CAS  12650-88-3 
Ultra-Turrax homogenizer T18 basic IKA 3720000
Glass filter holders for 47 mm membranes, Pyrex glass EMD Millipore XX10 047 00
Chemical duty vacuum pump Millipore WP6122050 220 V/50 Hz
Manifold sampling filtration for 25 mm membranes Millipore 1225 Sampling Manifold polypropylene
Dnase New England Biolabs M0303S Rnase free
NaOH Sigma-Aldrich S5881 Sigma-Aldrich CAS  1310-73-2 
Sodium dodecyl sulfphate (SDS) Sigma-Aldrich L3771 Sigma 
Whatman nitrocellulose membrane filters, 0.2 μm pore size, 25 mm diameter Sigma-Aldrich WHA7182002 Aldrich

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nicholson, W. L. Roles of Bacillus endospores in the environment. Cell Mol Life Sci. 59 (3), 410-416 (2002).
  2. Lester, E. D., Satomi, M., Ponce, A. Microflora of extreme arid Atacama Desert soils. Soil Biol Biochem. 39 (2), 704-708 (2007).
  3. Wilson, M. S., Siering, P. L., White, C. L., Hauser, M. E., Bartles, A. N. Novel archaea and bacteria dominate stable microbial communities in North America's Largest Hot Spring. Microb Ecol. 56 (2), 292-305 (2008).
  4. Hugenholtz, P. Exploring prokaryotic diversity in the genomic era. Genome Biol. 3 (2), (2002).
  5. Onyenwoke, R. U., Brill, J. A., Farahi, K., Wiegel, J. Sporulation genes in members of the low G+C Gram-type-positive phylogenetic branch (Firmicutes). Arch Microbiol. 182 (2-3), 182-192 (2004).
  6. Delmont, T. O., et al. Accessing the soil metagenome for studies of microbial diversity. Appl Environ Microbiol. 77 (4), 1315-1324 (2011).
  7. Ricca, E., Henriques, A. O., Cutting, S. M. Bacterial spore formers: probiotics and emerging applications. , Horizon Bioscience. (2004).
  8. Kuske, C. R., et al. Small-Scale DNA Sample Preparation Method for Field PCR Detection of Microbial Cells and Spores in Soil. Appl Environ Microbiol. 64 (7), 2463-2472 (1998).
  9. von Mering, C., et al. Quantitative phylogenetic assessment of microbial communities in diverse environments. Science. 315 (8515), 1126-1130 (2007).
  10. Wunderlin, T., Junier, T., Roussel-Delif, L., Jeanneret, N., Junier, P. Stage 0 sporulation gene A as a molecular marker to study diversity of endospore-forming Firmicutes. Environ Microbiol Rep. 5 (6), 911-924 (2013).
  11. Siala, A., Hill, I. R., Gray, T. R. G. Populations of spore-forming bacteria in an acid forest soil, with special reference to Bacillus subtilis. J General Microbiol. 81 (1), 183-190 (1974).
  12. Brandes Ammann, A., Kolle, L., Brandl, H. Detection of bacterial endospores in soil by terbium fluorescence. Int J Microbiol. , 435281 (2011).
  13. Fichtel, J., Koster, J., Rullkotter, J., Saas, H. High variations in endospore numbers within tidal flat sediments revealed by quantification of dipicolinic acid. Geomicrobiol J. 25 (7-8), (2008).
  14. Cronin, U. P., Wilkinson, M. G. The potential of flow cytometry in the study of Bacillus cereus. J Appl Microbiol. 108 (1), 1-16 (2010).
  15. de Rezende, J. R., et al. Dispersal of thermophilic Desulfotomaculum endospores into Baltic Sea sediments over thousands of years. ISME J. 7 (1), 72-84 (2013).
  16. Hubert, C., et al. Thermophilic anaerobes in Arctic marine sediments induced to mineralize complex organic matter at high temperature. Environ Microbiol. 12 (4), 1089-1104 (2010).
  17. Garbeva, P., van Veen, J. A., van Elsas, J. D. Predominant Bacillus spp. in agricultural soil under different management regimes detected via PCR-DGGE. Microb Ecol. 45 (3), 302-316 (2003).
  18. Brill, J. A., Wiegel, J. Differentiation between spore-forming and asporogenic bacteria using a PCR and southern hybridization based method. J Microbiol Methods. 31 (1-2), 29-36 (1997).
  19. Rueckert, A., Ronimus, R. S., Morgan, H. W. Development of a real-time PCR assay targeting the sporulation gene, spo0A., for the enumeration of thermophilic bacilli in milk powder. Food Microbiol. 23 (3), 220-230 (2006).
  20. Bueche, M., et al. Quantification of endospore-forming firmicutes by quantitative PCR with the functional gene spo0A. Appl Environ Microbiol. 79 (17), 5302-5312 (2013).
  21. Wunderlin, T., Junier, T., Roussel-Delif, L., Jeanneret, N., Junier, P. Endospore-enriched sequencing approach reveals unprecedented diversity of Firmicutes in sediments. Environ Microbiol Rep. 6 (6), 631-639 (2014).
  22. Nicholson, W. L., Law, J. F. Method for purification of bacterial endospores from soils: UV resistance of natural Sonoran desert soil populations of Bacillus spp. with reference to B. subtilis strain 168. J Microbiol Methods. 35 (1), 13-21 (1999).

Tags

מדעי הסביבה גיליון 107 Endospores הפרדה תאים של צמח חיידקי יוצרי endospore תמוגה תא גיוון אקולוגיה של חיידקים
בידוד פיזי של Endospores מדגימות סביבתיות על ידי תמוגה ממוקדת של תאים גטטיבי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wunderlin, T., Junier, T., Paul, C., More

Wunderlin, T., Junier, T., Paul, C., Jeanneret, N., Junier, P. Physical Isolation of Endospores from Environmental Samples by Targeted Lysis of Vegetative Cells. J. Vis. Exp. (107), e53411, doi:10.3791/53411 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter