Introduction
इस काम का लक्ष्य पर्यावरण के नमूनों में वनस्पति बैक्टीरियल कोशिकाओं से बैक्टीरियल endospores के विभाजन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करना है। बैक्टीरियल endospores के गठन जाति Firmicutes 1 से संबंधित बैक्टीरियल समूहों की एक संख्या में पाए जाने वाले एक जीवन रक्षा रणनीति है, आमतौर पर भुखमरी से शुरू हो रहा है। Endospore के गठन बैक्टीरिया अच्छी तरह से उपभेदों के एक नंबर रोगजनकों और इसलिए चिकित्सा महत्व (जैसे, बेसिलस anthracis या क्लोस्ट्रीडियम बेलगाम) के हैं, जिसका मुख्य कारण अध्ययन कर रहे हैं। Endospore के गठन बैक्टीरिया के पर्यावरण उपभेदों लगभग हर पर्यावरण (मिट्टी, पानी, तलछट, हवा, बर्फ, मानव आंत, जानवरों के पेट, और अधिक) 1-3 से पृथक किया गया है। इसलिए, Firmicutes संस्कृति संग्रहों 4 में दूसरा सबसे प्रचुर मात्रा में जाति हैं।
क्योंकि उनके हार्डी बाहरी कोर्टेक्स और सुरक्षात्मक कोर प्रोटीन की, endospores fr लेकर चरम पर्यावरण की स्थिति जीवित रह सकते हैंउच्च विकिरण, अत्यधिक तापमान और हानिकारक रसायनों से 5 ओम सुखाना। यह उल्लेखनीय प्रतिरोध यह endospores 6-8 से डीएनए निकालने के लिए एक चुनौती बना देता है। वे पर्यावरण अनुक्रमण के अध्ययन 9,10 में अनदेखी की गई है कि क्यों यह संभावना बताते हैं। जैसे फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी 11 से पर्यावरण के नमूनों में endospores के लक्षित कर के रूप में अन्य तरीकों, मिट्टी 12 और तलछट 13 में dipicolinic एसिड की मात्रा का ठहराव (डीपीए), 14 प्रवाह cytometry या pasteurization और बाद में खेती 15,16 में endospores पुनः प्राप्त या यों इस्तेमाल किया गया है पर्यावरण के नमूनों। हाल के वर्षों में, अनुकूलित डीएनए निष्कर्षण तरीकों के साथ ही विशिष्ट आणविक प्राइमरों endospore विशिष्ट जीन दृश्यों 10,17-20 विकसित किया गया है लक्षित करने के लिए। इस बैक्टीरिया 21 के इस समूह के बीच और अधिक जैव विविधता प्रकट करने के लिए मदद की है और यह भी endospores का पता लगाने के लिए उद्योग और चिकित्सा के क्षेत्र में आवेदन करने के लिए प्रेरित किया हैदूध पाउडर 19 में, उदाहरण के लिए।
यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल कोशिकाओं वनस्पति के सापेक्ष बैक्टीरियल endospores (जैसे गर्मी और डिटर्जेंट के रूप में) हानिकारक भौतिक परिस्थितियों के प्रतिरोध में अंतर पर आधारित है। एक नमूने में वनस्पति कोशिकाओं को नष्ट करने के लिए, हम लगातार गर्मी, लाइसोज़ाइम और डिटर्जेंट की कम मात्रा लागू होते हैं। बीजाणुओं को नष्ट करने के लिए है, लेकिन सभी वनस्पति कोशिकाओं lyse करने के रूप में नहीं तो इन उपचार के समय और शक्ति अनुकूलित किया गया है। एक पर्यावरण सेल पूल में कुछ कक्षों में दूसरों की तुलना में अधिक प्रतिरोधी रहे हैं, तो सभी वनस्पति कोशिकाओं को नष्ट करने की संभावना को बढ़ाने के लिए, हम तीन अलग उपचार लागू होते हैं। इस विधि के लाभ और नवीनता उपचार के बाद endospores अभी भी बरकरार हैं और आगे बहाव के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। ये घ को कम करने, इस प्रकार डीएनए निष्कर्षण, मात्रात्मक पीसीआर (qPCR) और amplicon या विशेष endospores के समूह को लक्षित metagenomic अनुक्रमण (और शामिलiversity,) कवरेज में वृद्धि करते हुए। endospores भी नीचे की ओर खेती या प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा मात्रा का ठहराव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, प्रवाह cytometry, या डीपीए का पता लगाने। इस पद्धति का एक महत्वपूर्ण विशेषता एक इलाज नमूना के साथ एक अनुपचारित नमूना तुलना करके, एक कोशिकाओं वनस्पति के लिए इसी घटक के अलावा एक पर्यावरणीय नमूने में endospores की मात्रा और विविधता परिणाम निकालना कर सकते हैं।
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Protocol
रसायन और उपकरण की 1. तैयारी
- एक 1% सोडियम hexametaphosphate (SHMP) (Napo 3) एन समाधान के 500 मिलीलीटर बनाओ और autoclaving द्वारा बाँझ।
- बंद ग्लास पेट्री डिश में autoclaving द्वारा जीवाणुरहित nitrocellulose (नेकां) फिल्टर (ताकना आकार 0.22 माइक्रोन, व्यास 47 मिमी)।
- बंद ग्लास पेट्री डिश में autoclaving द्वारा नेकां फिल्टर (ताकना आकार 0.22 माइक्रोन, व्यास 25 मिमी) जीवाणुरहित।
- वजन और (पर टोपी के साथ) बाँझ 50 मिलीलीटर ट्यूबों के खाली वजन (नमूना प्रति एक ट्यूब) पर ध्यान दें।
- Tris EDTA के बफर (ते बफर) 1x तैयार: 10 मिमी Tris (Tris (hydroxymethyl) aminomethane) और 1 मिमी EDTA बफर का समाधान करें। 8 पीएच को समायोजित करें और autoclaving द्वारा बाँझ।
- 1 मिलीलीटर ते बफर में लाइसोज़ाइम की 0.02 ग्राम भंग द्वारा लाइसोज़ाइम समाधान (20 मिलीग्राम / एमएल) तैयार करें। आदर्श रूप में, हर बार नए सिरे से बनाने। से अधिक नहीं 1 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
- 8 ग्राम / एल सोडियम क्लोराइड भंग द्वारा शारीरिक समाधान तैयारआसुत जल में (सोडियम क्लोराइड)। Autoclaving द्वारा जीवाणुरहित।
तलछट से बायोमास 2. पृथक्करण
- तलछट नमूने की 3 जी इथेनॉल flamed धातु scoops का उपयोग कर 50 मिलीलीटर ट्यूबों बाँझ तौला पूर्व में जोड़े। संक्रमण से बचने के लिए एक साफ, यूवी निष्फल जैव सुरक्षा कैबिनेट में इस प्रदर्शन करना।
- एक बाँझ burette स्नातक की उपाधि प्राप्त का उपयोग नमूना करने के लिए एक 1% बाँझ (autoclaved) SHMP समाधान के 15 मिलीलीटर जोड़ें। SHMP समाधान भी संक्रमण से बचने के लिए फ़िल्टर किया जा सकता है।
- एक तरल disperser / homogenizer (जैसे, अल्ट्रा Turrax homogenizer) के साथ तलछट और SHMP समाधान Homogenize। 70% इथेनॉल बाँझ या उपयोग करने से पहले फैलाव रोटर आटोक्लेव। 17,500 rpm पर 1 मिनट के लिए homogenization चलाएँ। 2 मिनट के लिए नमूना आराम करने दो और एक ही रोटर गति से 1 मिनट के लिए homogenization दोहराएँ।
- नमूना 10 मिनट के लिए खड़े हैं। इस चरण में, सबसे भारी कणों (खनिज) आदी हो जाएगा। कोशिकाओं और हालांकि डब्ल्यू नमूने के किसी भी जैविक घटकोंबीमार समाधान में रहते हैं। तलछट गोली परेशान नहीं ख्याल रख रही है, जबकि बाद में, एक साफ 50 मिलीलीटर ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला समाधान (युक्त सेल बायोमास) हस्तांतरण।
- तलछट गोली एक बाँझ burette स्नातक की उपाधि प्राप्त का उपयोग कर एक 1% बाँझ (autoclaved) SHMP समाधान की फिर से 15 मिलीलीटर जोड़ें। फिर दोहराना 2.3 और 2.4 कदम। इस पुनरावृत्ति तलछट के खनिज घटक से कोशिकाओं और कार्बनिक कणों की अधिकतम राशि की जुदाई सुनिश्चित करता है। इस दूसरे जुदाई की सतह पर तैरनेवाला पहले जुदाई से सतह पर तैरनेवाला के साथ विलय किया जा सकता।
नोट: निम्न चरणों के सभी (सेल बायोमास से युक्त) सतह पर तैरनेवाला पर किया जाता है। खनिज घटक (तलछट गोली) से खारिज किया जा सकता है। - 1 मिनट के लिए 20 XG पर नमूना अपकेंद्रित्र। जैविक सेल सामग्री अभी भी समाधान में रहता है, जबकि यह कदम छोटे खनिज कणों व्यवस्थित करने के लिए पर्याप्त जी-फोर्स बढ़ जाती है। Centrifugation के बाद, एक में सतह पर तैरनेवाला समाधान (युक्त सेल बायोमास) का स्थानांतरणसाफ 50 मिलीलीटर ट्यूब। खनिज गोली त्यागें।
- नमूना वजन द्वारा बायोमास युक्त समाधान के अंतिम मात्रा का निर्धारण करें। वजन दृढ़ संकल्प एक स्नातक सिलेंडर के लिए नमूना हस्तांतरण करने के लिए आ रहा है और संक्रमण के जोखिम को कम कर देता है से बचा जाता है।
फिल्टर झिल्ली पर बायोमास 3. संग्रह
- निस्पंदन यूनिट (47 मिमी व्यास झिल्ली के लिए) और वैक्यूम पंप तैयार करें। Autoclaving द्वारा या 70% इथेनॉल के साथ यह छिड़काव और एक लेम्प बर्नर के साथ यह ज्वलंत द्वारा (Pyrex कांच अगर) या तो निस्पंदन यूनिट जीवाणुरहित। यह प्रोटोकॉल के साथ जारी रखने से पहले ठंडा होने दें।
- इथेनॉल flamed निष्फल संदंश का उपयोग निस्पंदन यूनिट के लिए बाँझ नेकां झिल्ली जोड़ें।
- वैक्यूम पंप का उपयोग झिल्ली पर कोशिकाओं की झिल्ली निस्पंदन यूनिट पर (2.6 कदम से) सतह पर तैरनेवाला नमूना का आधा जोड़ें और इकट्ठा।
- तरल पूरी तरह से फिल्टर के माध्यम से पारित कर दिया गया है, वैक्यूम पंप बंद करो और ध्यान से एतान का उपयोग कर झिल्ली को हटा देंराजभाषा-लौ संदंश निष्फल। एक बाँझ पेट्री डिश में झिल्ली रखें।
- इथेनॉल flamed निष्फल कैंची का उपयोग छमाही में झिल्ली कट। एक अलग 2 मिलीलीटर ट्यूब झिल्ली के प्रत्येक आधा जोड़ें। झिल्ली के एक आधा डीएनए निष्कर्षण और पूरे जीवाणु समुदाय के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जाएगा। फिल्टर के अन्य आधा -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत और एक बैकअप के रूप में कार्य करता है किया जाएगा।
- निस्पंदन यूनिट पर नए नेकां झिल्ली की जगह और वैक्यूम पंप का उपयोग (2.6 कदम से) नमूना मात्रा की दूसरी छमाही से बायोमास इकट्ठा।
- तरल पूरी तरह से फिल्टर के माध्यम से पारित कर दिया गया है, वैक्यूम पंप बंद करो और ध्यान से इथेनॉल flamed निष्फल संदंश का उपयोग झिल्ली को हटा दें। एक अलग 2 मिलीलीटर ट्यूब में पूरे झिल्ली रखें। यह नमूना वनस्पति कोशिकाओं से endospores अलग करने के लिए इलाज के लिए इस्तेमाल किया जाएगा। नमूना उपयोग करें जब तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
वनस्पति कोशिकाओं की 4. Lysis
- प्रदर्शन करोउपचार के पहले एक नेकां झिल्ली (3.6 कदम) पर एकत्र बायोमास पर वनस्पति कोशिकाओं से endospores अलग करने के लिए।
- झिल्ली जम गया था, तो पिघलना करने के लिए 10 मिनट के लिए आरटी पर छोड़ दें। फिर एक बाँझ पेट्री डिश में झिल्ली जगह और इथेनॉल flamed निष्फल कैंची का उपयोग छोटे टुकड़ों में (लगभग 4 बार) काटा। फिर एक बाँझ 2 मिलीलीटर ट्यूब में सभी झिल्ली फिल्टर टुकड़े जगह है।
- नमूना झिल्ली युक्त ट्यूब के लिए 1x ते (Tris-EDTA) बफर के 900 μl (1.5 देखें) जोड़ें और भंवर से अच्छी तरह मिक्स। इस चरण में, बायोमास ते बफर समाधान में झिल्ली से निकाल दिया जाता है।
- 10 मिनट और 80 आरपीएम के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में ट्यूब रखें। बाद में इनक्यूबेटर से ट्यूब को हटाने और इसे 15 मिनट के लिए ठंडा होने दें।
- 2 मिलीग्राम / एमएल के अंतिम एकाग्रता तक पहुँचने के लिए हौसले से तैयार लाइसोज़ाइम (1.5 देखें) के 100 μl जोड़ें। नमूना 37 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा हो गया है इस से पहले डिग्री सकता है, लाइसोज़ाइम न जोड़ेंएंजाइम rade।
- लाइसोज़ाइम के लिए इष्टतम स्थितियों वनस्पति कोशिकाओं lyse करने के लिए, 60 मिनट और 80 आरपीएम के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर नमूना सेते हैं।
- सेल पूर्ण होने पर, 3 एन सोडियम हाइड्रोक्साइड (NaOH) और नमूना करने के लिए 6% सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) समाधान के 250 μl के 250 μl जोड़ें। इस जोड़कर, नमूना मात्रा 1.5 मिलीग्राम तक पहुँचता है और एक 0.5 एन NaOH के अंतिम एकाग्रता और 1% एसडीएस के अंतिम एकाग्रता है।
- 60 मिनट और 80 आरपीएम के लिए आरटी पर इस मिश्रण को सेते हैं। आधार और डिटर्जेंट जोड़ना अंतिम सेल में मदद मिलेगी। वनस्पति कोशिकाओं lysing जबकि इन डिटर्जेंट की एकाग्रता, endospores नुकसान नहीं करने के रूप में अनुकूलित किया गया है।
- (Pyrex कांच अगर) 70% इथेनॉल के साथ यह छिड़काव और एक लेम्प बर्नर के साथ यह ज्वलंत autoclaving द्वारा 25 मिमी व्यास झिल्ली रखती है, या कि एक बाँझ निस्पंदन यूनिट तैयार करें। यह ठंडा होने दें।
- इथेनॉल लौ निष्फल संदंश का उपयोग निस्पंदन यूनिट पर 0.2 माइक्रोन नेकां झिल्ली (25 मिमी व्यास) रखें। </ Li>
- झिल्ली पर कदम 4.7 से नमूना जोड़ें और वैक्यूम पंप का उपयोग तरल फिल्टर। तरल के माध्यम से पारित कर दिया गया है, वैक्यूम पंप बंद कर देते हैं। यह झिल्ली पर बनाए रखा नहीं है के रूप में इस चरण में, lysed वनस्पति सेल सामग्री हटा दिया जाता है। केवल endospores झिल्ली पर ही रहेगा।
- अवशिष्ट डिटर्जेंट से धो लें और वैक्यूम पंप का उपयोग तरल फिल्टर करने के लिए बाँझ शारीरिक समाधान के 2 मिलीलीटर जोड़ें।
- तरल पूरी तरह से फ़िल्टर किया गया है, वैक्यूम पंप बंद कर देते हैं। निस्पंदन यूनिट पर झिल्ली छोड़ दें।
5. DNase उपचार
नोट: फिल्टर झिल्ली पर सीधे DNase उपचार प्रदर्शन करना। यह निस्पंदन यूनिट लीक नहीं करता है कि महत्वपूर्ण है और वैक्यूम पंप बंद कर दिया है।
- फिल्टर झिल्ली पर बाँझ पानी के 450 μl, सीधे DNase प्रतिक्रिया बफर (1x) और 0.5 μl DNase एंजाइम के 50 μl जोड़ें और यह 15 मिनट के लिए खड़े हैं। यदि संभव हो तो, थोड़ा युद्ध है कि एक कमरे में इस पाचन करनाऔसत आरटी से मेर, एंजाइम ऊपर 25 डिग्री सेल्सियस और के तापमान पर बेहतर काम करता है के बाद से।
नोट: लेम्प बर्नर रखते हुए अलग निस्पंदन यूनिट भी तापमान बढ़ जाता है और बाँझ वातावरण रखने के अतिरिक्त लाभ है, इसलिए नमूने के प्रदूषण के खतरे को कम कर दिया। - DNase पाचन समाप्त हो गया है, नमूना से एंजाइम को दूर करने के लिए वैक्यूम पंप पर बारी।
- जोड़ने और शारीरिक समाधान के 1 मिलीलीटर छान कर अवशिष्ट एंजाइम से धो लें।
- तरल पूरी तरह से पारित कर दिया गया है, वैक्यूम पंप बंद कर देते हैं और बाँझ संदंश का उपयोग और एक बाँझ पेट्री डिश में जगह endospores युक्त फिल्टर झिल्ली को हटा दें।
नोट: अलग endospores का नमूना अब नीचे की ओर विश्लेषण के लिए तैयार है। अंकुरण और खेती के लिए इस्तेमाल करता है, तो -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर डीएनए निष्कर्षण के लिए या वैकल्पिक रूप से 4 डिग्री सेल्सियस पर इस्तेमाल किया।
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Representative Results
यहाँ प्रस्तुत परिणाम पहले 10,21 प्रकाशित किया गया है। डेटा के पर्यावरण व्याख्या और चर्चा के लिए उन लेखों को देखें।
समग्र प्रक्रिया चित्रा 1 में संक्षेप और तीन मुख्य कदम से मेल खाती है: पहला, तलछट या किसी अन्य पर्यावरणीय मैट्रिक्स से बायोमास की जुदाई; दूसरा, वनस्पति कोशिकाओं के विनाश; और तीसरे, अलग endospores के बहाव के विश्लेषण। डाउनस्ट्रीम विश्लेषण विविधता का निर्धारण करने के लिए डीएनए निष्कर्षण और amplicon अनुक्रमण की, उदाहरण के लिए, मिलकर सकता है। Endospores की सेल करने के लिए गारंटी के रूप में डीएनए निष्कर्षण अनुकूलित किया जाना चाहिए। तलछट के नमूनों में, हम एक सशक्त अनुक्रमिक डीएनए निष्कर्षण प्रक्रिया 10 का उपयोग कर यह उपलब्धि हासिल की है। तलछट में विधि के आवेदन जुदाई के बाद endospore के गठन Firmicutes के अंश में एक उल्लेखनीय वृद्धि को दर्शाता है। -16 RRNA की amplicon अनुक्रमण मेंजीन, इलाज के नमूनों में Firmicutes (पूरे समुदाय) केवल 8.0 और दृश्यों की 19.0% (तालिका 1) पत्राचार किया। इसके विपरीत, उपचार के बाद Firmicutes 90.6% और endospore समृद्ध नमूने के 83.9% का प्रतिनिधित्व किया। endospore के गठन Firmicutes, Bacilliales और Clostridiales के दो प्रमुख आदेश, गैर endospore के गठन Firmicutes हैं कि Lactobacilliales तरह के आदेशों के अभाव के साथ विषम, विधि के साथ समृद्ध थे। विधि सच endospores के संवर्धन के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है कि प्रदर्शन करने के लिए, बीजाणु संरचनाओं की तरह उत्पादन में सक्षम अन्य समूहों को भी विश्लेषण किया गया। तदनुसार, Actinobacteria, cyanobacteria और Myxococcales की आवृत्ति कोशिकाओं lyse उपचार के बाद कम किया है।
उपचार की दक्षता भी शुद्ध संस्कृतियों का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया। एक endospore तैयारी Paenibacillus alvei की (> 95% endospores), बेसिलस subtilis और बेसिलस megaterium कोलाई की एक वनस्पति सेल संस्कृति, इलाज किया गया। सभी संस्कृतियों तो 37 डिग्री सेल्सियस पर पोषक तत्व शोरबा में incubated रहे थे और विकास के लिए 600 एनएम तरंगदैर्ध्य पर ऑप्टिकल घनत्व का उपयोग मापा गया था। कोई विकास का इलाज किया ई में मनाया गया, जबकि ग्रोथ endospore संस्कृतियों के लिए मनाया गया कि वनस्पति कोशिकाओं साबित हो कोलाई संस्कृति, अचल (चित्रा 2) क्षतिग्रस्त हो रहे हैं।
प्रयोगात्मक प्रक्रिया चित्रा 1. अवलोकन। प्रक्रिया पर्यावरण के नमूनों में endospore के गठन बैक्टीरिया को बेहतर बनाने के लिए इस्तेमाल किया। पर्यावरण मैट्रिक्स से कोशिकाओं और endospores को अलग करने का कदम नमूना के प्रकार (यानी, पानी का नमूना) के आधार पर छोड़ा जा सकता है। चित्र में नीचे की ओर तरीकों बीजाणु-समृद्ध अंश Corre पर लागूडीएनए निष्कर्षण और उच्च throughput अनुक्रमण के लिए spond। ये कदम संवर्धन द्वारा बदला जा सकता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
शुद्ध संस्कृतियों पर उपचार के चित्रा 2. सत्यापन। बेसिलस subtilis, बेसिलस megaterium, और Paenibacillus alvei और सेल के लिए विधि के साथ इलाज कोलाई की एक सेल संस्कृति के endospores के निलंबन से endospore के गठन जीवाणुओं के विकास की पुष्टि करने के विकास घटता कोशिकाओं की। = ○ इलाज किया। अनुपचारित = ●। तीन स्वतंत्र संस्कृतियों से त्रुटि सलाखों। नियंत्रण संस्कृतियों और इलाज संस्कृतियों का फिर से विकास के विकास के लिए 600 एनएम तरंगदैर्ध्य पर ऑप्टिकल घनत्व के रूप में मापा गया था। यह आंकड़ा च फिर से मुद्रित किया गया हैROM Wunderlin एट अल। 2014 अनुमति के साथ। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| तलछट 1 | तलछट 2 | |||
| पूरे समुदाय | endospore समृद्ध | पूरे समुदाय | endospore समृद्ध | |
| Firmicutes | 8.0 | 90.6 | 19.0 | 83.9 |
| बेसिली | 0.5 | 10.0 | 5.7 | 15.1 |
| Clostridia | 7.4 | 76.9 | 12.5 | 63.2 |
| Actinobacteria | 2.4 | 1.0 | 4.4 | 2.1 |
| साइनोबैक्टीरीया | 1.1 | 0.1 | 0.7 | 0.1 |
| Myxococcales | 0.7 | 0.0 | 0.2 | 0.0 |
| अन्य जीवाणुओं | 87.8 | 8.3 | 75.7 | 13.9 |
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Discussion
बाहरी आक्रामक भौतिक कारकों (जैसे, तापमान या डिटर्जेंट) को endospores के विरोध को पर्यावरण के नमूनों में वनस्पति कोशिकाओं से बैक्टीरियल endospores अलग करने के लिए एक तरीका ईजाद करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। यह एक गैर विनाशकारी तरीके से पर्यावरण के नमूनों से endospores को अलग-थलग करने के लिए पहली व्यापक तरीका है। यों का पता लगाने या नमूनों में endospores का विश्लेषण करने के लिए पिछला तरीकों जैसे dipicolinic एसिड या विशिष्ट मार्कर जीन के रूप में endospores के लिए विशिष्ट परदे के पीछे की माप के आधार पर किया गया। इसके विपरीत, प्रोटोकॉल के साथ, यहाँ प्रस्तुत endospores के अलावा अन्य नमूना घटकों को हटा रहे हैं और इसलिए endospores अंततः नमूना के एकमात्र और शुद्ध अवशेष के रूप में रहते हैं। पास्तुरीकरण या घनत्व ढाल centrifugation के रूप में अन्य तरीकों endospores 22 के लिए बेहतर बनाने के लिए प्रस्तावित किया गया है, हमारे परीक्षण घनत्व ढाल centrifugation पर्यावरण के नमूनों के लिए एक सामान्य विधि के रूप में उचित नहीं है कि पता चला हैकारण, शारीरिक मतभेद और endospore-formers की विभिन्न प्रजातियों के विभिन्न घनत्व के लिए (डेटा) नहीं दिखाया। इसके विपरीत, हमारे प्रोटोकॉल आसानी से पर्यावरण नमूने के सभी प्रकार के लिए आवेदन किया है और आणविक विधियों या संवर्धन सहित बहाव के अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त है जा सकता है।
प्रोटोकॉल में दो महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं। पहला नमूना मैट्रिक्स (यानी, तलछट कण) से बायोमास की जुदाई है। यह विविधता के हिस्से को नजरअंदाज करने के रूप में नहीं तो मैट्रिक्स से अलग कक्षों की संख्या, बड़ा किया जा सकता है कि आवश्यक है। तलछट के नमूनों के लिए, यहां इस्तेमाल किया, के रूप में प्रोटोकॉल के प्राचार्य सीमाओं में से एक कुछ कोशिकाओं या बीजाणुओं तलछट मैट्रिक्स से अलग नहीं किया गया है और इसलिए विधि का एक संभावित सीमा है जो नीचे की ओर विश्लेषण में शामिल नहीं हो सकता है कि इस तथ्य है । (Humic एसिड देखते हैं, तो उदाहरण के लिए) नमूना मैट्रिक्स पर निर्भर करता है, कोशिकाओं को कसकर यह करने के लिए बाध्य है और जारी करने के लिए इसलिए मुश्किल हो सकता है।एक homogenizer या ब्लेंडर के साथ ऑर्थो-फॉस्फेट बफर के उपयोग के साथ ही अच्छा homogenization के इस कदम पर महत्वपूर्ण हैं। प्रोटोकॉल में लिखित रूप में वसूली को बढ़ावा देने के लिए, homogenization और बायोमास को हटाने की प्रक्रिया में दो बार दोहराया है। यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल विकसित और मीठे पानी की झील तलछट के नमूनों के लिए अनुकूलित किया गया है। कुछ मापदंडों के नमूने के अन्य प्रकारों के लिए इष्टतम नहीं हो सकता। संभवतः प्रक्रिया में अनदेखी की थी कि समुदाय अंश का विश्लेषण करने के लिए एक तरह से डीएनए निष्कर्षण और amplicon अनुक्रमण के लिए तलछट मैट्रिक्स अधीन करने के लिए किया जाएगा। तकनीक के लिए संभावित संशोधनों के रूप में, नमूना मैट्रिक्स से बायोमास की जुदाई के कदम छोड़ा जा सकता है। पर्यावरण नमूना नीचे की ओर प्रोटोकॉल (जैसे, पानी, अन्य तरल पदार्थ या शुद्ध संस्कृतियों) के साथ हस्तक्षेप कर सकता है कि जैविक सामग्री या खनिज कणों को शामिल नहीं करता है, खासकर यदि पूर्व के जुदाई जरूरत नहीं जा सकता। तरल नमूने के लिए प्रोटोकॉल अध्याय 3 पर सीधे शुरू कर सकते हैं(फिल्टर झिल्ली पर बायोमास का संग्रह)।
प्रोटोकॉल के दूसरे महत्वपूर्ण कदम लाइसोज़ाइम, गर्मी, NaOH और एसडीएस नष्ट करने के लिए वनस्पति कोशिकाओं के साथ इलाज है। कोशिकाओं को नष्ट करते हुए तापमान, अवधि और साथ ही रसायनों की एकाग्रता, सब endospores नुकसान पहुंचाने के लिए नहीं के रूप में अनुकूलित किया गया है। वे कर रहे हैं के रूप में इन मानकों इसलिए सख्ती से रखा जाना चाहिए। 65 डिग्री सेल्सियस पर नमूना हीटिंग का एक पहला कदम का उपयोग विशेष रूप से आम तौर पर नहीं कर रहे हैं कि Actinobacteria, Myxobacteria, cyanobacteria के जीवाणु संघों में होने वाली बैक्टीरियल बीजाणुओं या बीजाणु संरचनाओं की तरह के अन्य प्रकार की तुलना में endospores के लिए चयन करने के लिए बहुत प्रभावी था ऊष्मा प्रतिरोधी। तालिका 1 में देखा, गैर बीजाणु बनाने बैक्टीरिया अभी भी इलाज (14% करने के लिए 8.3%) के बाद मौजूद हैं। इस के लिए कुछ स्पष्टीकरण तलछट के नमूनों अत्यधिक जटिल कर रहे हैं और यह भी प्रतिरोधी गैर बीजाणु कोशिकाओं बंदरगाह कर सकते हैं कि कर रहे हैं। इसके अलावा, बचे हुए कार्बनिक पदार्थ कुछ एक की अनुमति दे सकता ttached कोशिकाओं उपचार जीवित रहने के लिए। आगे इलाज के नमूने में गैर बीजाणु कोशिकाओं के गठन का प्रतिशत कम करने के लिए, विधि व्यक्तिगत नमूना प्रकार के आधार पर अनुकूलित किया जाना चाहिए।
विधि पर्यावरण के नमूनों में endospore-formers की लक्षित अध्ययन के लिए एक उपन्यास उपकरण प्रतिनिधित्व करता है। वनस्पति कोशिकाओं को नष्ट करने के लिए उपचार कोशिकाओं और endospores का शुद्ध संस्कृतियों पर परीक्षण किया और कोशिकाओं के व्यक्तिगत प्रतिरोध के अनुरूप रूपांतरित किया जा सकता है। कोशिकाओं के विनाश चित्रा 2 में दिखाया इलाज संस्कृतियों का घटता में देखा जा सकता है। इलाज संस्कृतियों की देरी से विकास की वजह से endospores फिर से उगना और तेजी से विकास के चरण में स्थानांतरित करने की जरूरत है कि समय के लिए हो सकता है। इस देरी के लिए अन्य संभावित व्याख्या यह भी उपचार के बाद endospore संस्कृति या कम सेल नंबर के एक कमजोर हो सकता है। अलग endospores डीएनए निष्कर्षण के लिए इस्तेमाल नहीं कर रहे हैं, तो DNase उपचार के अंतिम चरण छोड़ा जा सकता है।
NT "> इस तकनीक का भविष्य अनुप्रयोगों रोगजनक endospores पता लगाया जा करने की जरूरत है, जहां उद्योगों में परिकल्पित किया जा सकता है। एक उदाहरण खाद्य उद्योग और नैदानिक अनुसंधान में है, जहां पता लगाने और endospores की (पहचान के लिए) विश्लेषण, और वनस्पति कोशिकाओं से भेदभाव (उदाहरण के लिए, इस तरह के दूध या दूध आधारित उत्पादों के रूप में खाद्य पदार्थों के उत्पादों से) महत्वपूर्ण है। यह जो इस प्रकार होगा, कई मानक प्रक्रियाओं endospores lyse करने के लिए अनुकूलित नहीं कर रहे हैं कि अपघट्य एंजाइमों का उपयोग करते हुए एक नमूना से प्रत्यक्ष डीएनए निष्कर्षण पर विचार विचार है कि प्रासंगिक विशेष हो सकता है अनदेखी हो। यहाँ प्रस्तुत विधि के साथ, कोशिकाओं से हटाया जा सकता है और बाद के विश्लेषण की कोशिकाओं के लिए विरोध के रूप में endospores की उपस्थिति या अनुपस्थिति के उत्तर प्रदान करेगा। अन्य अनुप्रयोगों उदाहरण बर्फ या तलछट कोर के लिए (विभिन्न पर्यावरणीय नमूनों में endospore समुदायों के विश्लेषण शामिल ) पर्यावरण की स्थिति के ऐतिहासिक अभिलेखागार हैं। अपेक्षाकृत स्थिर पर्यावरणीय साथ कई वातावरण में(उदाहरण झील तलछट सतह के लिए) ताल की स्थिति endospore के गठन Firmicutes वनस्पति कोशिकाओं के रूप में कामयाब होना कर सकते। शर्तों (तलछट दफन या अवायवीय स्थितियों की दिशा में एक पारी के दौरान पोषक तत्वों की कमी से उदाहरण के लिए) बिगड़ना जब कोशिकाओं endospore राज्य में चलते हैं। इसलिए, तलछट कोर से लिया गया endospore समुदायों दफन के समय में पर्यावरण की स्थिति को प्रतिबिंबित कर सकते हैं और इस तरह दफन करने से पहले की स्थिति की एक paleoecological संकेतक के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा। हालांकि, हम अभी भी जानकारी एकत्र कर रहे इस दावे के समर्थन में।Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
लेखकों अनुदान सं 31003A-132358/1, 31003A_152972 और नंबर 151,948 के लिए स्विस राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन को स्वीकार करते हैं, और Fundation पियरे मर्सिए ला विज्ञान डालना।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Whatman nitrocellulose membrane filters, 0.2 μm pore size, 47 mm diameter | Sigma-Aldrich | WHA7182004 Aldrich | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859 Sigma-Aldrich | CAS 77-86-1 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 Sigma-Aldrich | CAS 60-00-4 |
| Lysozyme from chicken egg white | Sigma-Aldrich | 62971 Fluka | powder, CAS 12650-88-3 |
| Ultra-Turrax homogenizer T18 basic | IKA | 3720000 | |
| Glass filter holders for 47 mm membranes, Pyrex glass | EMD Millipore | XX10 047 00 | |
| Chemical duty vacuum pump | Millipore | WP6122050 | 220 V/50 Hz |
| Manifold sampling filtration for 25 mm membranes | Millipore | 1225 Sampling Manifold | polypropylene |
| Dnase | New England Biolabs | M0303S | Rnase free |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 Sigma-Aldrich | CAS 1310-73-2 |
| Sodium dodecyl sulfphate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 Sigma | |
| Whatman nitrocellulose membrane filters, 0.2 μm pore size, 25 mm diameter | Sigma-Aldrich | WHA7182002 Aldrich |
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