Introduction
这项工作的目的是提供一种协议，用于细菌内生孢子的从营养细菌细胞环境样品中分离。细菌内生孢子的形成是一个生存策略，通常由饥饿触发，在多个属于脊索动物门厚壁菌门1细菌群体的发现。形成内生孢子的细菌被很好的研究，主要是因为一些菌株是病原体，因此医学重要（例如， 炭疽芽孢杆菌或艰难梭菌 ）。形成内生孢子菌的环境菌株已分离出几乎所有的环境（土壤，水，沉淀物，空气，冰，人体肠道，内脏动物，和更多）1-3。因此，厚壁菌在培养物保藏4第二个最丰富的门。
由于其耐寒外皮层和保护核心蛋白，内生孢子能够生存极端的环境条件范围FROM干燥高辐射，极端温度和有害化学物质5。这一显着性使它成为一个挑战提取芽孢6-8 DNA。这可能解释了为什么他们被忽视了环境测序研究9,10。其他方法，如环境样品中内生孢子的荧光抗体11靶向，吡啶二羧酸的定量（DPA）中土壤12和沉积物13，流式细胞仪14或巴氏灭菌和随后的培养15,16已被用于在检索或量化生孢子环境样品。在最近几年，优化的DNA提取方法以及具体的分子的引物靶向生孢子特异性基因序列已经被开发10,17-20。这有助于揭示这组细菌21之间更多的生物多样性，并且也导致了内生孢子的检测应用在工业和医药中，例如在奶粉19。
这里介绍的协议是基于到有害的物理化学条件（例如热和洗涤剂）相对于营养细胞细菌内生孢子的电阻的差别。以破坏营养细胞的样品中，我们连续施加热，溶菌酶和低浓度的洗涤剂。这些治疗的时间和强度都得到了优化，以便不破坏孢子，但以裂解所有营养细胞。一些细胞在一个环境室池比其它更耐磨，所以为了提高破坏所有营养细胞的概率，我们应用了三种不同的治疗方法。这种方法的优点和新颖性在于仍保持原样，在处理后的内生孢子可用于进一步下游分析。这些包括DNA提取，定量PCR（qPCR的）和扩增子或宏基因组测序（专门针对组内生孢子的，从而减少ðiversity，同时增加覆盖）。的内生孢子也可以用于下行种植或定量由荧光显微镜，流式细胞仪，或检测DPA的。这种方法的一个重要特征是，通过未处理样品与处理过的样品进行比较，可以推断出内生孢子的数量和多样性环境样品中除了对应于营养细胞的组件。
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Protocol
1.制备化学品和设备
- 制成500毫升1％的六偏磷酸钠（SHMP）（磷酸钠3）N溶液和通过高压灭菌消毒。
- 消毒硝化纤维素（NC）的过滤器（孔径0.22μm，直径47个毫米）通过高压灭菌在密闭的玻璃培养皿。
- 通过高压在密闭玻璃培养皿消毒的NC滤波器（孔径0.22μm，直径25毫米）。
- 称量并注意无菌50ml试管的空机重量（含上限）（每个样品一管）。
- 制备的Tris-EDTA缓冲液（TE缓冲液）1×：使10毫摩尔Tris（ 三（羟甲基 ）氨基甲烷）和1mM EDTA缓冲溶液。调节pH至8，并通过高压灭菌消毒。
- 通过在1ml的TE缓冲液中溶解0.02克溶菌酶制备溶菌酶溶液（20毫克/毫升）。理想的情况下，使新鲜每次。存放在4℃下不超过1周。
- 通过将8克/升的氯化钠制备生理溶液（氯化钠）在蒸馏水。高压灭菌。
从沉积物2.分离生物质
- 添加3克沉积物样品，以预先称重无菌使用乙醇火烧金属勺50ml试管。执行此在一个干净，UV消毒生物安全柜，以避免污染。
- 加入15mL 1％的无菌（高压灭菌）SHMP溶液使用无菌刻度滴管样品。该SHMP溶液还可以进行筛选，以避免污染。
- 均化沉渣和SHMP溶液与液体分散器/均化器（例如，超TURRAX均化）。 70％的乙醇 - 消毒或高压灭菌，使用前分散转子。运行同质化1分钟17,500转。让样品休息2分钟，在相同的转子速度重复均质化1分钟。
- 让样品静置10分钟。在该步骤中，最重的粒子（矿物）会沉淀。将细胞和样品然而瓦特任何有机成分病留在溶液中。之后，转移上清液溶液（含有细胞生物量）到一个干净的50ml管中，同时小心不要扰乱沉积的颗粒。
- 向沉淀添加粒料再次将15ml 1％的无菌（高压灭菌）SHMP使用无菌刻度滴管溶液。然后重复步骤2.3和2.4。这种重复可以确保电池和有机粒子的最大量，从沉淀物的矿物组分分离。此第二分离的上清液可以合并与来自第一分离上清液。
注：以下步骤都做对上清（含细胞生物量）。矿物组分（沉淀沉淀）可以被丢弃。 - 离心样品以20×g离心1分钟。这一步增加了G力足以解决小矿粒，而生物细胞物质仍然在溶液中。离心后，转移上清液溶液（含有细胞的生物质）转化为干净的50ml管中。弃矿物颗粒。
- 确定包含生物量通过称重样品溶液的最终体积。权重确定避免了必须将样品转移至量筒并降低污染的风险。
3.生物质收集在滤膜
- 制备过滤单元（47毫米直径的膜）和真空泵。或者通过高压灭菌或（如果派热克斯玻璃）用70％的乙醇喷洒和用本生灯燃烧它消毒过滤单元。让与协议，然后再继续它冷却下来。
- 用乙醇 - 熄火灭菌镊子添加无菌NC膜的过滤单元。
- 加入一半的上清液样品（来自步骤2.6）的到膜过滤单元和收集细胞上使用真空泵膜上。
- 当液体已充分通过过滤器，停止真空泵，小心地用乙除去膜OL火焰消毒镊子。放置膜进入无菌培养皿。
- 使用乙醇火烧消毒剪刀剪膜的一半。该膜的每一半添加到单独的2毫升管。膜的一个半部分将被用于DNA提取和整个细菌群落分析。滤波器的另一半将被保存在-80℃，并作为一个备份。
- 放置新的NC膜到过滤单元，并使用真空泵收集从样品体积（来自步骤2.6）的第二半的生物质。
- 当液体已充分通过过滤器，停止真空泵，并仔细用乙醇 - 熄火灭菌镊子除去该膜。将整个膜到一个单独的2毫升管。该样品将被用于对生孢子从营养细胞分离的治疗。可将样品储存在-20℃直至使用。
4.裂解营养细胞
- 执行处理分离先前在NC膜（步骤3.6）收集的生物量营养细胞内生孢子。
- 如果膜被冻结，离开它在室温10分钟以解冻。然后放置在无菌培养皿的膜和使用乙醇火烧灭菌剪刀剪（约4倍）成更小的碎片。然后将所有的膜过滤片放入一个无菌的ml管。
- 加入900微升1×TE（的Tris-EDTA）缓冲液（见1.5），以含有样品膜管涡旋调匀。在此步骤中，所述生物质从膜进TE-缓冲液的溶液中除去。
- 将管在培养箱在65℃下进行10分钟，80转。然后从孵化器中取出管，让它冷却15分钟。
- 加入100微升新鲜制备的溶菌酶（见1.5），以达到2毫克/毫升的最终浓度。不要添加溶菌酶前将样品冷却到37℃，因为这可能DEG拉德的酶。
- 孵育样品在37℃下60分钟，80转，对于溶菌酶的最佳条件以溶解营养细胞。
- 裂解完成后，加入250微升3当量的氢氧化钠（氢氧化钠）和250微升6％十二烷基硫酸钠（SDS）溶液到样品中。通过添加此，样品体积达到1.5 ml和有0.5N的氢氧化钠的最终浓度和1％SDS的终浓度。
- 孵育这种混合在室温进行60分钟和80转。加入碱和洗涤剂将有助于最终的细胞溶解。这些洗涤剂的浓度进行了优化，以不损害孢子，而裂解营养细胞。
- 准备保存25mm直径的膜通过高压灭菌，或者（如果派热克斯玻璃）喷洒用70％乙醇和用本生灯燃烧它的无菌过滤单元。让它冷却下来。
- 用乙醇 - 火焰灭菌镊子将过滤单元上的0.2微米的NC膜（25毫米直径）。</ LI>
- 从步骤4.7添加示例到膜上，并使用真空泵过滤液体。当液体已通过，关闭真空泵。在该步骤中，裂解营养细胞材料被去除，因为它不保留在膜。只有内生孢子将留在该膜上。
- 加入2毫升无菌生理溶液洗掉残留的清洁剂和用真空泵过滤液体。
- 当液体完全过滤，关闭真空泵。离开过滤单元的膜。
5. DNA酶处理
注意：直接在过滤膜执行DNase处理。重要的是，过滤部不泄漏是重要的，所述真空泵是关闭的。
- 加入450微升无菌水，50微升DNA酶反应直接缓冲液（1x）和0.5微升DNA酶的酶附着在过滤器膜上，静置15分钟。如果可能的话，做到这一点消化，房间里稍微战争聚体比平均室温，由于酶的工作温度为25℃以上更好。
注意：保留本生灯一旁过滤单元也增加的温度和具有保持周围环境的无菌的附加好处，因此降低了样品的污染的风险。 - 当DNA酶消化完成后，开启真空泵以从样品除去酶。
- 通过添加和筛选1 ml的生理溶液洗掉残留的酶。
- 如果液体已全面通过，关闭真空泵，并删除含有使用无菌镊子，并放入无菌培养皿内生孢子的过滤膜。
注意：分离内生孢子的样品现在准备用于下游分析。如果使用储存在-20℃下进行DNA提取或替代地，在4℃下，如果用于发芽和栽培。
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Representative Results
这里介绍的结果前面已经10,21公布。请参阅那些条数据的环境解释和讨论。
整体过程总结在图1中，对应于三个主要步骤：首先，从沉淀物或任何其他环境矩阵生物质的分离;第二，营养细胞的破坏;和第三，分离的内生孢子的下游分析。下游分析可以由，例如，DNA提取和扩增子测序以确定多样性。的DNA提取需要优化以保证内生孢子的裂解。在沉积物样品，我们已经用有力的连续DNA提取方法10做到了这一点。沉积物的方法的应用程序演示中形成内生孢子厚壁菌门的分离后的级分显著增加。在的16S rRNA的扩增子测序基因，厚壁菌门的未经处理的样品中（整个社区）对应仅到8.0和序列的19.0％（ 表1）。与此相反，在处理后厚壁菌为代表90.6％和内生孢子富集样品的83.9％。的形成内生孢子厚壁菌门，Bacilliales和Clostridiales两大订单，富集与方法，与缺少像Lactobacilliales订单对比是非形成内生孢子厚壁菌门。为了证明该方法特别适合于真内生孢子的富集，能够产生孢子样结构的其他组进行了分析。因此，放线菌，蓝细菌和Myxococcales的频率在处理后降低至裂解细胞。
该处理的效率，使用纯培养物也展示。一个孢子制剂（> 95％孢子） 类芽孢杆菌蜂房的，枯草杆菌和巨大芽孢杆菌 大肠杆菌的营养细胞培养，如在该协议描述为营养细胞的溶解治疗。所有培养物孵育在营养肉汤，在37℃，并使用光密度在600nm波长的生长测定。没有观察到孢子培养物的生长而观察到在处理过的大肠杆菌没有增长大肠杆菌培养，证明营养细胞被不可逆地损坏（ 图2）。
的实验程序的图1概述。过程用于富集形成内生孢子的细菌环境样品中。从环境的矩阵分离细胞和内生孢子的步骤可以根据样品的类型（即，水样）被省略。在图中，下游的方法施加在孢子浓缩部分CORREspond到DNA提取和高通量测序。这些步骤可以通过培养来代替。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2.核查 上纯培养的药物。生长曲线来自枯草芽孢杆菌， 巨大芽孢杆菌， 类芽孢杆菌和蜂房和大肠杆菌的方法裂解处理的细胞培养物的内生孢子的悬浮液核实形成内生孢子的细菌的生长的细胞。治疗=○。未处理=●。误差条来自三个独立培养物。对照培养物与处理过的培养物再生长的生长测定为在600nm波长的光密度。这个数字已经重新打印的F-ROM Wunderlin 等人 2014年的许可。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 沙1 | 沙2 | |||
| 整个社会 | 孢子富集 | 整个社会 | 孢子富集 | |
| 厚壁菌门 | 8 | 90.6 | 19.0 | 83.9 |
| 杆菌 | 0.5 | 10.0 | 5.7 | 15.1 |
| 梭状芽胞杆菌 | 7.4 | 76.9 | 12.5 | 63.2 |
| 放线菌 | 2.4 | 1.0 | 4.4 | 2.1 |
| 蓝藻 | 1.1 | 0.1 | 0.7 | 0.1 |
| Myxococcales | 0.7 | 0.0 | 0.2 | 0.0 |
| 其他细菌 | 87.8 | 8.3 | 75.7 | 13.9 |
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Discussion
内生孢子外部攻击性理化因素 （如温度或清洁剂）的电阻来设计一种方法，从营养细胞环境样品中分离的细菌芽孢。这是第一个全面的方法来隔离环境样品的内生孢子在非破坏性的方式。以前的方法来定量，检测或分析样品中内生孢子是根据特定的代理内生孢子诸如吡啶二羧酸或特定的标记基因的测定。与此相反，与协议这里介绍，比生孢子其他样品组分被去除，所以内生孢子最终仍作为样品的唯一和纯化的残余。尽管其它方法，如巴氏灭菌法或密度梯度离心已经提出以富集生孢子22，我们的试验表明，密度梯度离心是不适合作为用于环境样品的一般方法，由于生理差异和不同种类的内生孢子形成剂的密度不同的（数据未显示）。相比之下，我们的协议可以很容易地应用于所有类型的环境样品的，适合于下游应用，包括分子的方法或培养。
有在协议中的两个关键步骤。第一种是生物质从样品基质（即，沉积物的颗粒）的分离。至关重要的是，细胞从基质中分离的数目被最大化，以便不忽略的多样性的一部分。对沉积物样品，如这里使用的，的协议的主要限制之一是，某些细胞或孢子可能没有被撕下沉积物矩阵，因此不包括在下游分析，这是该方法的一个潜在的局限性。取决于样品基质（例如，如果有腐殖酸），细胞可以紧密结合，并因此难以释放。使用邻 - 磷酸盐缓冲液，以及良好的均化用均化器或混合器是在此步骤中很重要的。为了提高回收率，均质化和除去生物量的过程重复两次作为写入协议。此处所描述的协议已被开发并用于淡水湖沉积物样品进行了优化。一些参数可能不是最佳的其他类型的样品。分析这是潜在的过程中忽略了社区级分的一种方法是将受到沉积物矩阵的DNA提取和扩增子测序。尽可能修改的技术中，生物量的分离从样品基质中的步骤可被省略。特别是如果环境样品不含有机材料或矿物颗粒可能干扰下游协议 （例如，水，其它液体或纯化的培养物），现有的分离可以不需要。液体样品的协议可以在第3章直接启动（生物质对滤膜收集）。
该协议的第二个重要步骤是用溶菌酶，热，氢氧化钠和SDS以破坏营养细胞的治疗。温度，持续时间，以及化学品的浓度都得到了优化作为不伤害内生孢子，而破坏细胞。这些参数，因此应严格保持原样。使用加热样品在65℃的第一步骤是非常有效的，以供生孢子专门选择相对于其他类型放线菌，粘细菌，蓝藻的细菌门之间存在的细菌孢子或孢状结构中，即通常是不耐热性。 正如表1中，非孢子形成细菌仍是治疗（8.3％至14％）后存在。有人解释这是沉积物样品非常复杂，还能够携带性非孢子细胞。此外，剩余的有机材料可以允许某些一 ttached细胞生存的治疗。为了进一步减少非孢子形成细胞的处理的样品中的百分比，该方法应该根据个人的样品类型进行优化。
该方法代表了一种新的工具，的内生孢子膜剂环境样品中目标的研究。以破坏营养细胞的治疗可以在细胞和内生孢子的纯培养测试和调整，以适应细胞的个体的阻力。细胞的破坏可以看出，在图 2中所示处理的培养的曲线。处理过的培养物的生长延迟可能是由于该内生孢子需要重新发芽并移动到指数生长期的时间。其他可能的解释此延迟也可能是处理后的生孢子培养或更低的细胞数的削弱。如果不用于DNA提取所分离的内生孢子，DNA酶处理的最后步骤可以省略。
核苷酸“>该技术的未来的应用可以在工业，其中致病生孢子需要检测可以设想，其中一个例子是在食品工业和临床研究，其中的检测和内生孢子的分析（识别），和从营养细胞的分化（例如，从食物，如牛奶或基于乳的产品）是至关重要的，这可能是特别相关的考虑，许多标准程序考虑从样品直接DNA提取使用不适合于裂解生孢子裂解酶，其将因此被忽视。随着这里介绍的方法，细胞可以被去除和随后的分析将提供答案，而不是细胞内生孢子的存在或不存在。其他应用包括不同环境样品中内生孢子群体的分析（例如冰或沉积物岩芯），这些环境条件下的历史档案。在许多环境中相对稳定的环境下TAL条件（例如湖泊沉积物表面）形成内生孢子厚壁菌可以在植物细胞的形式蓬勃发展。当（在泥沙掩埋或对厌氧条件下的转变，例如通过养分耗竭）条件恶化的细胞进入孢子状态。因此，从沉积物岩芯检索孢子社区可以反映在埋葬时的环境条件，因此可以作为之前埋葬的条件的古生态指标。但是，我们仍然收集信息来支持这种说法。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
作者承认瑞士国家科学基金会的批准号：31003A-一分之一十三万二千三百五十八，31003A_152972和No. 151948，和基金会皮埃尔·名士倒拉科学。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Whatman nitrocellulose membrane filters, 0.2 μm pore size, 47 mm diameter | Sigma-Aldrich | WHA7182004 Aldrich | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859 Sigma-Aldrich | CAS 77-86-1 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 Sigma-Aldrich | CAS 60-00-4 |
| Lysozyme from chicken egg white | Sigma-Aldrich | 62971 Fluka | powder, CAS 12650-88-3 |
| Ultra-Turrax homogenizer T18 basic | IKA | 3720000 | |
| Glass filter holders for 47 mm membranes, Pyrex glass | EMD Millipore | XX10 047 00 | |
| Chemical duty vacuum pump | Millipore | WP6122050 | 220 V/50 Hz |
| Manifold sampling filtration for 25 mm membranes | Millipore | 1225 Sampling Manifold | polypropylene |
| Dnase | New England Biolabs | M0303S | Rnase free |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 Sigma-Aldrich | CAS 1310-73-2 |
| Sodium dodecyl sulfphate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 Sigma | |
| Whatman nitrocellulose membrane filters, 0.2 μm pore size, 25 mm diameter | Sigma-Aldrich | WHA7182002 Aldrich |
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