Introduction
El objetivo de este trabajo es proporcionar un protocolo para la separación de las endosporas bacterianas a partir de células bacterianas vegetativas en muestras ambientales. La formación de endosporas bacterianas es una estrategia de supervivencia, por lo general desencadenada por la inanición, que se encuentra en una serie de grupos de bacterias pertenecientes a la phylum Firmicutes 1. Bacterias que forman endosporas están bien estudiados, principalmente debido a que un número de cepas son patógenos y, por tanto, de importancia médica (por ejemplo, Bacillus anthracis o Clostridium difficile). Cepas ambientales de bacterias formadoras de endosporas se han aislado de prácticamente cualquier entorno (suelo, agua, los sedimentos, el aire, hielo, intestino humano, animales intestino, y más) 1-3. Por lo tanto, Firmicutes son el segundo phylum más abundante en las colecciones de cultivos 4.
Debido a sus proteínas de la corteza externa y el núcleo de protección resistentes, endosporas pueden sobrevivir en condiciones ambientales extremas que van from desecación de alta radiación, temperaturas extremas y sustancias químicas nocivas 5. Este notable resistencia hace que sea un reto para extraer el ADN de las endosporas 6-8. Esto probablemente explica por qué se les ha pasado por alto en los estudios de secuenciación del medio ambiente 9,10. Otros métodos, tales como la orientación de endosporas en muestras ambientales por anticuerpos fluorescentes 11, la cuantificación de ácido dipicolínico (DPA) en el suelo 12 y el sedimento 13, citometría de flujo 14 o pasteurización y posterior cultivo de 15,16 se han utilizado para recuperar o cuantificar en endosporas muestras ambientales. En los últimos años, los métodos de extracción de ADN optimizada, así como cebadores moleculares específicos a secuencias diana de genes-endosporas específica se han desarrollado 10,17-20. Esto ha ayudado a revelar más biodiversidad en este grupo de bacterias 21 y también ha dado lugar a aplicaciones en la industria y la medicina para la detección de endosporas, Por ejemplo en la leche en polvo 19.
El protocolo que aquí se presenta se basa en la diferencia de resistencia a las condiciones físico-químicas nocivas (como el calor y detergentes) de endosporas bacterianas en relación con las células vegetativas. Para destruir las células vegetativas en una muestra, que consecutivamente aplicar calor, lisozima y bajas concentraciones de detergentes. El tiempo y la fuerza de estos tratamientos han sido optimizados a fin de no destruir las esporas, pero para lisar todas las células vegetativas. Algunas células en una piscina de células del medio ambiente son más resistentes que otros, por lo que con el fin de aumentar la probabilidad de destruir todas las células vegetativas, se aplican tres tratamientos diferentes. La ventaja y novedad de este método es que las endosporas después del tratamiento están todavía intactos y pueden ser utilizados para otros análisis aguas abajo. Estos incluyen la extracción de ADN, PCR cuantitativa (qPCR) y amplificación o secuenciación metagenómica (dirigido específicamente al grupo de endosporas y por lo tanto la reducción dIVERSIDAD, al tiempo que aumenta la cobertura). Las endosporas también podrían utilizarse para el cultivo de aguas abajo o cuantificación por microscopía de fluorescencia, citometría de flujo, o detección de DPA. Una característica importante de este método es que mediante la comparación de una muestra no tratada con una muestra tratada, se puede deducir la cantidad y diversidad de endosporas en una muestra ambiental, además de la componente correspondiente a las células vegetativas.
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Protocol
1. Preparación de los productos químicos y equipo
- Hacer 500 ml de una hexametafosfato de sodio 1% (SHMP) (NaPO3) n solución y esterilizar en autoclave.
- Esterilizar nitrocelulosa (NC) Filtros (tamaño de poro de 0,22 m, diámetro 47 mm) por autoclave en platos de cristal cerrado Petri.
- Esterilizar filtros NC (tamaño de poro de 0,22 m, 25 mm de diámetro) en autoclave en platos de vidrio cerrado de Petri.
- Pesar y anotar el peso en vacío de 50 ml tubos estériles (con tope a) (un tubo por muestra).
- Preparar Tris-EDTA-buffer (tampón TE) 1x: hacer una solución de Tris 10 mM (tris (hidroximetil) aminometano) y EDTA 1 mM tampón. Ajustar el pH a 8 y esterilizar en autoclave.
- Preparar la solución de lisozima (20 mg / ml) disolviendo 0,02 g de lisozima en 1 ml de tampón TE. Lo ideal es hacer fresco cada vez. Almacenar a 4 ° C durante no más de 1 semana.
- Preparar la solución fisiológica disolviendo / L de cloruro de sodio 8 g(NaCl) en agua destilada. Esterilizar en autoclave.
2. Separación de la biomasa a partir de sedimentos
- Añadir 3 g de muestra de sedimento de tarados estéril tubos de 50 ml utilizando cucharas de metal con etanol flameado. Realice esto en una, UV esterilizada gabinete de bioseguridad limpia para evitar la contaminación.
- Añadir 15 ml de una solución SHMP 1% estéril (autoclave) a la muestra usando una bureta graduada estéril. La solución SHMP también puede ser filtrada para evitar la contaminación.
- Homogeneizar el sedimento y la solución SHMP con un dispersor líquido / homogeneizador (por ejemplo, homogeneizador Ultra-Turrax). 70% de etanol-esterilizar en autoclave o el rotor de dispersión antes de su uso. Ejecutar la homogeneización durante 1 min a 17.500 rpm. Dejar reposar la muestra durante 2 min y repetir la homogeneización durante 1 minuto a la misma velocidad del rotor.
- Deje reposar la muestra durante 10 minutos. En este paso, las partículas más pesadas (minerales) se asentarán. Las células y los componentes orgánicos de la muestra sin embargo wenfermos permanecen en solución. Después, transferir la solución sobrenadante (que contiene la biomasa celular) en un tubo de 50 ml limpio, teniendo cuidado de no perturbar el pellet de sedimentos.
- Para el sedimento sedimentos añadir de nuevo 15 ml de una (autoclave) Solución de SHMP 1% estéril usando una bureta graduada estéril. Luego repita los pasos 2.3 y 2.4. Esta repetición asegura la separación de la cantidad máxima de células y partículas orgánicas a partir del componente mineral del sedimento. El sobrenadante de esta segunda separación se puede fusionó con el sobrenadante de la primera separación.
Nota: Los siguientes pasos se puede hacer todo en el sobrenadante (que contiene la biomasa celular). El componente mineral (pellet sedimentos) puede ser desechada. - Centrifugar la muestra a 20 xg durante 1 min. Este paso aumenta la fuerza g suficiente para resolver partículas minerales pequeñas mientras que el material de célula biológica aún permanece en solución. Después de la centrifugación, transferir la solución sobrenadante (que contiene la biomasa celular) en unalimpia tubo de 50 ml. Deseche el sedimento mineral.
- Determinar el volumen final de la solución que contiene la biomasa pesando la muestra. La determinación del peso evita tener que transferir la muestra a un cilindro graduado y reduce el riesgo de contaminación.
3. Recolección de Biomasa en filtro de membrana
- Preparar unidad de filtración (por 47 mm de diámetro membranas) y la bomba de vacío. Esterilizar la unidad de filtración, ya sea en autoclave o (si vidrio Pyrex) rociándolo con etanol al 70% y en llamas con un mechero Bunsen. Deje que se enfríe antes de continuar con el protocolo.
- Añadir membrana NC estéril para la unidad de filtración usando pinzas esterilizadas con etanol flameado.
- Añadir la mitad de la muestra de sobrenadante (de la etapa 2.6) en la unidad de filtración de membrana y recoger las células en la membrana utilizando la bomba de vacío.
- Cuando el líquido ha pasado totalmente a través del filtro, detenga la bomba de vacío y retire con cuidado la membrana utilizando ethanol-llama esterilizado fórceps. Colocar la membrana en una placa de Petri estéril.
- Cortar la membrana en un medio con unas tijeras esterilizadas con etanol flameado. Añadir cada medio de la membrana a un tubo de 2 ml separado. Una media de la membrana se utiliza para la extracción y el análisis de toda la comunidad bacteriana de ADN. El otro medio de filtro se almacenó a -80 ° C y sirve como una copia de seguridad.
- Coloque nueva membrana NC en la unidad de filtración y recoger biomasa a partir de la segunda mitad del volumen de la muestra (del paso 2.6) utilizando la bomba de vacío.
- Cuando el líquido ha pasado totalmente a través del filtro, detenga la bomba de vacío y retire con cuidado la membrana utilizando pinzas esterilizadas con etanol flameado. Coloque toda la membrana en un tubo de 2 ml separado. Esta muestra se utiliza para el tratamiento para separar las endosporas a partir de células vegetativas. La muestra puede ser almacenada a -20 ° C hasta su uso.
4. La lisis de las células vegetativas
- Realizar eltratamiento para separar las endosporas de células vegetativas en la biomasa recogida previamente sobre una membrana de NC (paso 3.6).
- Si la membrana se congela, dejarlo a temperatura ambiente durante 10 minutos para descongelar. A continuación, coloque la membrana en una placa de Petri estéril y cortarla (aproximadamente 4 veces) en trozos más pequeños con unas tijeras esterilizadas con etanol flameado. A continuación, coloque todas las piezas del filtro de membrana en un tubo de 2 ml estéril.
- Añadir 900 l de TE (Tris-EDTA) tampón 1x (véase 1.5) al tubo que contiene la membrana muestra y mezclar a fondo por vórtice. En este paso, la biomasa se elimina de la membrana en la solución de tampón TE.
- Colocar el tubo en una incubadora a 65 ° C durante 10 min y 80 rpm. Luego retire el tubo de la incubadora y deje que se enfríe durante 15 minutos.
- Añadir 100 l de lisozima recién preparada (ver 1.5) para llegar a una concentración final de 2 mg / ml. No agregue la lisozima antes de la muestra se ha enfriado a 37 ° C, ya que esto podría degRade la enzima.
- Incubar la muestra a 37 ° C durante 60 min y 80 rpm, las condiciones óptimas para la lisozima para lisar las células vegetativas.
- Después de la lisis es completa, añadir 250 l de 3 N de hidróxido de sodio (NaOH) y 250 l de dodecilsulfato de sodio (SDS) solución al 6% a la muestra. Mediante la adición de esto, el volumen de la muestra llega a 1,5 ml y hay una concentración final de 0,5 N NaOH y la concentración final de 1% de SDS.
- Incubar esta mezcla a TA durante 60 min y 80 rpm. Adición de la base y detergentes ayudará en la lisis celular final. La concentración de estos detergentes se ha optimizado para no dañar las endosporas, mientras que la lisis de las células vegetativas.
- Preparar una unidad de filtración estéril que contiene membranas de 25 mm de diámetro por tratamiento en autoclave, o (si Pyrex vidrio) rociándolo con etanol al 70% y en llamas con un quemador Bunsen. Deje que se enfríe.
- Coloque una membrana de 0,2 micras NC (25 mm de diámetro) en la unidad de filtración utilizando fórceps etanol llama esterilizados. </ li>
- Añadir la muestra a partir del paso 4.7 en la membrana y el filtrado del líquido utilizando la bomba de vacío. Cuando el líquido ha pasado a través, apague la bomba de vacío. En este paso, se retira el material de célula vegetativa lisadas, ya que no se retiene en la membrana. Sólo endosporas permanecerán en la membrana.
- Añadir 2 ml de solución fisiológica estéril para lavar detergentes residuales y filtrar el líquido usando la bomba de vacío.
- Cuando el líquido se filtra completamente, apague la bomba de vacío. Deja la membrana de la unidad de filtración.
5. El tratamiento DNasa
Nota: Realice el tratamiento DNasa directamente en la membrana de filtro. Es importante que la unidad de filtración no se escapa y la bomba de vacío está apagado.
- Añadir 450 l de agua estéril, 50 l de tampón de reacción de DNasa (1x) y 0,5 l enzima DNasa directamente sobre la membrana de filtro y se deja reposar durante 15 minutos. Si es posible, hacer esto digestión en una habitación que es ligeramente guerramer que el promedio RT, ya que la enzima funciona mejor a temperaturas de 25 ° C y por encima.
Nota: Mantener el quemador Bunsen a un lado la unidad de filtración también aumenta la temperatura y tiene la ventaja añadida de mantener estéril el entorno, por lo tanto menor riesgo de contaminación de las muestras. - Una vez finalizada la digestión DNasa, encienda la bomba de vacío para eliminar la enzima de la muestra.
- Lavar la enzima residual mediante la adición y filtrado 1 ml de solución fisiológica.
- Si el líquido ha pasado totalmente, apague la bomba de vacío y quitar la membrana de filtro que contiene endosporas usando pinzas estériles y colocarlo en una placa de Petri estéril.
Nota: La muestra de endosporas separadas está ahora listo para el análisis de aguas abajo. Almacenar a -20 ° C si se utiliza para la extracción de ADN o, alternativamente, a 4 ° C si se utiliza para la germinación y el cultivo.
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Representative Results
Los resultados presentados aquí han sido publicados anteriormente 10,21. Por favor, consulte los artículos para la interpretación ambiental y análisis de los datos.
El procedimiento global se resume en la figura 1 y corresponde a tres pasos principales: primero, la separación de la biomasa a partir de sedimentos o cualquier otra matriz ambiental; segundo, la destrucción de las células vegetativas; y tercero, el análisis de aguas abajo de las endosporas separadas. Análisis de aguas abajo podría consistir, por ejemplo, de la extracción de ADN y la secuencia del amplicón para determinar la diversidad. La extracción de ADN debe ser optimizado en cuanto a garantizar la lisis de las endosporas. En las muestras de sedimento, lo hemos logrado mediante el uso de un procedimiento de extracción de ADN secuencial contundente 10. La aplicación del método en el sedimento demuestra un aumento significativo en la fracción de Firmicutes que forman endosporas después de la separación. En la secuenciación del amplicón de 16S rRNAgen, Firmicutes en las muestras no tratadas (toda la comunidad) correspondió sólo a los 8,0 y 19,0% de las secuencias (Tabla 1). En contraste, después del tratamiento Firmicutes representaba 90,6% y 83,9% de la muestra endospora enriquecido. Los dos principales órdenes de endospora de formación de Firmicutes, Bacilliales y Clostridiales, se enriquecieron con el método, en contraste con la ausencia de órdenes como Lactobacilliales que no son formadoras de endosporas Firmicutes. Con el fin de demostrar que el método es particularmente adecuado para el enriquecimiento de los verdaderos endosporas, se analizaron también otros grupos capaces de producir estructuras de esporas similares. En consecuencia, la frecuencia de Actinobacteria, cianobacterias y Myxococcales disminuyó después del tratamiento para lisar las células.
La eficiencia del tratamiento también se demostró usando cultivos puros. Una preparación endospora (> 95%) endosporas de Paenibacillus alvei, Bacillus subtilis y Bacillus megaterium Escherichia coli, fueron tratados como se describe en el protocolo para la lisis de las células vegetativas. Todos los cultivos se incubaron a continuación en caldo nutriente a 37 ° C y el crecimiento se midió mediante densidad óptica a 600 nm de longitud de onda. El crecimiento se observó que para las culturas endospore mientras hay crecimiento se observó en el E. tratada cultura coli, lo que demuestra que las células vegetativas están irreversiblemente dañado (Figura 2).
Figura 1. Descripción general del procedimiento experimental. Procedimiento utilizado para enriquecer las bacterias formadoras de endosporas en muestras ambientales. La etapa de separar las células y las endosporas de la matriz ambiental se puede omitir dependiendo del tipo de muestra (es decir, muestra de agua). En la figura los métodos aguas abajo aplican sobre la espora enriquecido fracción correresponden a la extracción de ADN y secuenciación de alto rendimiento. Estos pasos pueden ser reemplazados por cultivo. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Verificación del tratamiento sobre cultivos puros. Las curvas de crecimiento que verifican el crecimiento de bacterias formadoras de endosporas de una suspensión de endosporas de Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, y Paenibacillus alvei y un cultivo de células de Escherichia coli tratado con el método para la lisis de las células. Tratada = ○. Sin tratamiento = ●. Las barras de error de tres culturas independientes. El crecimiento de los cultivos de control y re-crecimiento de los cultivos tratados se midió como densidad óptica a 600 nm de longitud de onda. Esta cifra ha sido re-impreso from Wunderlin et al. 2014, con permiso. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Sedimentos 1 | Sedimentos 2 | |||
| toda la comunidad | endospora enriquecido | toda la comunidad | endospora enriquecido | |
| Firmicutes | 8.0 | 90.6 | 19.0 | 83.9 |
| Bacilos | 0.5 | 10.0 | 5.7 | 15.1 |
| Clostridios | 7.4 | 76.9 | 12.5 | 63.2 |
| Actinobacteria | 2.4 | 1.0 | 4.4 | 2.1 |
| Las cianobacterias | 1.1 | 0.1 | 0.7 | 0.1 |
| Myxococcales | 0.7 | 0.0 | 0.2 | 0.0 |
| Otras bacterias | 87.8 | 8.3 | 75.7 | 13.9 |
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Discussion
La resistencia de endosporas a factores fisicoquímicos agresivas externas (por ejemplo, la temperatura o detergentes) se utilizó para diseñar un método para separar las endosporas bacterianas de células vegetativas en muestras ambientales. Esta es la primera método integral para aislar endosporas a partir de muestras ambientales de una manera no destructiva. Los métodos anteriores para cuantificar, detectar o analizar endosporas en las muestras se basan en la medición de los proxies específicos para las endosporas tales como ácido dipicolínico o genes marcadores específicos. En contraste, con el protocolo presentan aquí, se eliminan componentes de la muestra distintos de endosporas y así las endosporas finalmente permanecen como los restos únicos y purificadas de la muestra. Aunque se han propuesto otros métodos tales como la pasteurización o la centrifugación en gradiente de densidad para enriquecer endosporas 22, nuestras pruebas mostraron que la centrifugación en gradiente de densidad no es apropiado como un método general para muestras ambientales, Debido a las diferencias fisiológicas y diferentes densidades de varias especies de endosporas formadores (datos no mostrados). Por el contrario, nuestro protocolo se puede aplicar fácilmente a todos los tipos de muestras ambientales y es adecuado para aplicaciones posteriores, incluyendo los métodos moleculares o cultivo.
Hay dos pasos críticos en el protocolo. La primera es la separación de la biomasa a partir de matriz de la muestra (es decir, partículas de sedimento). Es esencial que el número de células separadas de la matriz de ser maximizada, para no pasar por alto parte de la diversidad. Para las muestras de sedimento, tal como se utiliza aquí, una de las principales limitaciones del protocolo es el hecho de que algunas células o esporas pueden no haber sido separado de la matriz de sedimentos y, por tanto, no incluido en el análisis de aguas abajo, lo cual es una limitación potencial del método . Dependiendo de la matriz de la muestra (por ejemplo, si hay ácidos húmicos), las células pueden estar estrechamente ligados a ella y por lo tanto difícil de liberar.El uso de tampón fosfato de orto-así como una buena homogeneización con un homogeneizador o mezclador son importantes en este paso. Para impulsar la recuperación, el procedimiento de homogeneización y extracción de la biomasa se repite dos veces como está escrito en el protocolo. El protocolo descrito aquí se ha desarrollado y optimizado para las muestras de sedimento del lago de agua dulce. Algunos parámetros pueden no ser óptimas para otros tipos de muestras. Una forma de analizar la fracción de la comunidad que fue potencialmente pasado por alto en el proceso sería someter la matriz de sedimentos para la extracción de ADN y la secuencia de amplificación. Como posibles modificaciones de la técnica, la etapa de separación de biomasa a partir de matriz de la muestra puede ser omitido. En particular, si la muestra ambiental no contiene materiales o minerales partículas orgánicas que podrían interferir con el protocolo de aguas abajo (por ejemplo, agua, otros líquidos o cultivos purificados), puede no ser necesario la separación previa. Para muestras líquidas el protocolo puede comenzar directamente en el capítulo 3(Colección de biomasa en la membrana de filtro).
El segundo paso importante del protocolo es el tratamiento con lisozima, calor, NaOH y SDS para destruir las células vegetativas. La temperatura, la duración, así como la concentración de productos químicos de todo se han optimizado no dañar endosporas, mientras que la destrucción de las células. Estos parámetros deben por lo tanto ser estrictamente mantienen como están. El uso de una primera etapa de calentar la muestra a 65 ° C fue muy eficaz para seleccionar específicamente para las endosporas en comparación con otros tipos de esporas bacterianas o estructuras de esporas como se producen entre los phyla bacteriana de Actinobacteria, Myxobacteria, cianobacterias, que generalmente no son resistente al calor. Como se ve en la Tabla 1, las bacterias que forman esporas no están todavía presentes después del tratamiento (8,3% a 14%). Algunas explicaciones para esto son que las muestras de sedimentos son muy complejos y también pueden albergar células no esporas resistentes. Además, la materia orgánica sobrante puede permitir cierta una células ttached para sobrevivir el tratamiento. Con el fin de reducir aún más el porcentaje de células no formadoras de esporas en las muestras tratadas, el método debe ser optimizado en función del tipo de muestra individual.
El método representa una nueva herramienta para el estudio selectivo de formadores de endosporas en muestras ambientales. El tratamiento para destruir las células vegetativas puede ser probado en cultivos puros de células y endosporas y adaptado a la resistencia individual de las células. La destrucción de las células se puede ver en las curvas de los cultivos tratados mostrados en la Figura 2. El retraso en el crecimiento de los cultivos tratados puede ser debido al tiempo que las endosporas necesitan volver a germinar y pasar a la fase de crecimiento exponencial. Otras posibles explicaciones para este retraso también podría ser un debilitamiento de la cultura endospora o el número de células más bajos después del tratamiento. Si las endosporas separadas no se utilizan para la extracción de ADN, el último paso del tratamiento con DNasa se puede omitir.
nt "> Las futuras aplicaciones de esta técnica podría preverse en las industrias donde endosporas patógenos necesitan ser detectado. Un ejemplo es en la industria alimentaria y la investigación clínica, donde la detección y análisis (para la identificación) de endosporas, y su diferenciación de las células vegetativas (por ejemplo, de productos alimenticios como la leche o los productos lácteos) es vital. Esto podría ser especialmente relevante teniendo en cuenta que muchos de los procedimientos estándar consideran la extracción directa del ADN de una muestra utilizando enzimas líticas que no están adaptadas para lisar endosporas, que de este modo pasarse por alto. Con el método presentado aquí, las células se pueden quitar y posterior análisis proporcionarán respuestas a la presencia o ausencia de endosporas en contraposición a las células. Otras aplicaciones incluyen el análisis de las comunidades endosporas en diferentes muestras ambientales (por núcleos ejemplo de hielo o de sedimentos ) que son archivos históricos de las condiciones ambientales. En muchos ambientes con ambien relativamente establecondiciones Tal (de superficie del sedimento ejemplo lago) endospora formadoras Firmicutes puede prosperar en la forma de las células vegetativas. Cuando las condiciones se deterioran (por ejemplo, por el agotamiento de nutrientes durante el entierro de sedimentos o la orientación hacia condiciones anaeróbicas) las células se mueven en endospora estado. Por lo tanto, las comunidades endospore recuperados de núcleos de sedimentos pueden reflejar las condiciones ambientales en el momento de la sepultura y por lo tanto ser utilizado como un indicador paleoecológicos de las condiciones previas para el entierro. Sin embargo, todavía estamos recopilando información para apoyar esta afirmación.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen a la Fundación Nacional de Ciencia de Suiza para la Subvención No. 31003A-132358/1, 31003A_152972 y No. 151 948, y la Fundación Pierre Mercier pour la Ciencia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Whatman nitrocellulose membrane filters, 0.2 μm pore size, 47 mm diameter | Sigma-Aldrich | WHA7182004 Aldrich | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859 Sigma-Aldrich | CAS 77-86-1 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 Sigma-Aldrich | CAS 60-00-4 |
| Lysozyme from chicken egg white | Sigma-Aldrich | 62971 Fluka | powder, CAS 12650-88-3 |
| Ultra-Turrax homogenizer T18 basic | IKA | 3720000 | |
| Glass filter holders for 47 mm membranes, Pyrex glass | EMD Millipore | XX10 047 00 | |
| Chemical duty vacuum pump | Millipore | WP6122050 | 220 V/50 Hz |
| Manifold sampling filtration for 25 mm membranes | Millipore | 1225 Sampling Manifold | polypropylene |
| Dnase | New England Biolabs | M0303S | Rnase free |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 Sigma-Aldrich | CAS 1310-73-2 |
| Sodium dodecyl sulfphate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 Sigma | |
| Whatman nitrocellulose membrane filters, 0.2 μm pore size, 25 mm diameter | Sigma-Aldrich | WHA7182002 Aldrich |
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