Introduction
Målet med dette arbeidet er å tilveiebringe en protokoll for separering av bakterielle endospores fra vegetative bakterieceller i miljøprøver. Dannelsen av bakterielle endospores er en overlevelsesstrategi, vanligvis utløst av sult, som finnes i en rekke bakterielle grupper som hører til rekken firmicutes 1. Endosporer dannende bakterier er godt studert, hovedsakelig fordi en rekke stammer er patogener og dermed av medisinsk betydning (f.eks, Bacillus anthracis eller Clostridium difficile). Miljø stammer av endosporer dannende bakterier har blitt isolert fra nesten alle miljø (jord, vann, sediment, luft, is, menneskelige tarmen, dyr gut, og mer) 1-3. Derfor firmicutes er det nest vanligste phylum i kultursamlinger 4.
På grunn av sine hardføre ytre cortex og beskyttende kjerneproteiner, kan endospores overleve ekstreme miljøforhold som strekker seg from uttørking til høy stråling, ekstreme temperaturer og skadelige kjemikalier 5. Denne bemerkelsesverdige motstand gjør det til en utfordring å trekke ut DNA fra endospores 6-8. Dette forklarer trolig hvorfor de har blitt oversett i miljøsekvense studier 9,10. Andre metoder, slik som målretting av endosporer i miljøprøver ved fluorescerende antistoffer 11, kvantifisering av dipikolinsyre (DPA) i jord og sedimenter 13 12, strømningscytometri 14 eller pasteuriseringen og etterfølgende dyrking 15,16 har blitt brukt for å hente eller kvantifisere i endospores miljøprøver. I de siste årene har optimalisert DNA-ekstraksjon metoder samt spesifikke molekylære primere målrette endosporer spesifikke gensekvenser er utviklet 10,17-20. Dette har bidratt til å avsløre mer biologisk mangfold blant denne gruppen av bakterier 21 og har også ført til applikasjoner innen industri og medisin for påvisning av endosporesFor eksempel i melk pulver 19.
Protokollen som presenteres her er basert på forskjellen i motstand mot skadelige fysiske og kjemiske forhold (for eksempel varme og vaskemidler) av bakterielle endospores forhold til vegetative celler. For å ødelegge vegetative celler i en prøve, vi fortløpende anvende varme, lysozym og lave konsentrasjoner av vaskemidler. Tiden og styrken av disse behandlinger har blitt optimalisert for ikke å ødelegge sporer, men for å lysere alle vegetative celler. Noen celler i et miljø celle basseng er mer motstandsdyktig enn andre, slik at for å øke sannsynligheten for å ødelegge alle vegetative celler, kan vi bruke tre forskjellige behandlinger. Fordelen og nye ved denne fremgangsmåte er at endospores etter behandlingen er fortsatt intakt og kan brukes for videre nedstrøms analyser. Disse omfatter DNA-ekstraksjon, kvantitativ PCR (qPCR) og fragment eller metagenomic sekvensering (spesielt rettet mot gruppen av endosporer, og dermed redusere diversity, mens økende dekning). De endospores kan også brukes til nedstrøms dyrking eller kvantifisering av fluorescens mikroskopi, flowcytometri, eller deteksjon av DPA. Et viktig trekk ved denne metoden er at ved å sammenligne en ubehandlet prøve med en behandlet prøve, kan man utlede den mengde og mangfoldet av endosporer i en miljøprøve i tillegg til den komponent som svarer til vegetative celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av kjemikalier og utstyr
- Gjør 500 ml av en 1% natrium heksametafosfat (TTA) (Napo 3) n løsning og sterilisere i autoklav.
- Sterilisere nitrocellulose (NC) filtre (porestørrelse 0,22 mikrometer, diameter 47 mm) ved autoklave i lukket glass petriskåler.
- Sterilisere NC filtre (porestørrelse 0,22 mikrometer, diameter 25 mm) ved autoklave i lukket glass petriskåler.
- Vei og merk tomvekt sterile 50 ml rør (med cap på) (ett rør per prøve).
- Forbered Tris-EDTA-buffer (TE-buffer) 1x: Merke oppløsning av 10 mM Tris (tris (hydroksymetyl) aminometan), og 1 mM EDTA-buffer. Juster pH til 8 og sterilisere i autoklav.
- Forbered lysozym oppløsning (20 mg / ml) ved å løse opp 0,02 g av lysozym i 1 ml TE-buffer. Ideelt lage fersk hver gang. Oppbevar ved 4 ° C i mer enn en uke.
- Forbered fysiologisk oppløsning ved å oppløse 8 g / l natriumklorid(NaCl) i destillert vann. Steriliser ved autoklave.
2. Separering av biomasse fra Sediment
- Tilsett 3 g av sedimentprøve til forhånds veide sterile 50 ml rør ved bruk av etanol-flammet metall kuler. Utføre dette på en ren, UV sterilisert biosikkerhet kabinett for å unngå forurensning.
- Tilsett 15 ml av en 1% steril (autoklavert) SHMP løsning til prøven ved hjelp av en steril gradert byrette. Den SHMP Løsningen kan også filtreres for å unngå forurensning.
- Homogen sedimentet og TTA løsning med en flytende disperser / homogenisator (f.eks Ultra-Turrax homogenisator). 70% etanol-sterilisere eller autoklaveres dispersjonen rotoren før bruk. Kjør homogenisering i 1 min ved 17 500 rpm. La prøven resten i 2 min og gjenta homogenisering i 1 min ved samme rotorhastighet.
- La prøven stå i 10 min. På dette trinnet, vil de tyngste partiklene (mineraler) avgjøre. Cellene og eventuelle organiske komponenter i prøven imidlertid will forblir i oppløsning. Etterpå overføre supematantløsningen (som inneholder celle biomasse) i en ren 50 ml tube, mens du tar vare ikke å forstyrre sedimentet pellet.
- Til sedimentet pellet legge igjen 15 ml av en 1% steril (autoklavert) SHMP løsning ved hjelp av en steril gradert byrette. Deretter gjentar du trinn 2.3 og 2.4. Denne gjentagelse sikrer adskillelsen av den maksimale mengden av celler og organiske partikler fra mineralkomponenten i sedimentet. Supernatanten fra denne andre separasjon kan bli slått sammen med supernatanten fra den første separering.
Merk: Følgende trinn er alt gjort på supernatanten (som inneholder celle biomasse). Mineralet komponent (sediment pellet) kan kastes. - Sentrifuger prøven ved 20 x g i 1 min. Dette trinnet øker g-kraft nok til å slå seg små mineralpartikler, mens den biologisk cellemateriale fremdeles er i oppløsning. Etter sentrifugering overføre den overliggende oppløsning (inneholdende celle biomasse) i enren 50 ml tube. Kast mineral pellet.
- Bestemme den endelige volumet av løsningen inneholdende biomasse ved å veie prøven. Vekten bestemmelse unngår å måtte overføre prøven til en målesylinder og reduserer risiko for forurensning.
3. Innsamling av biomasse på Filter Membrane
- Forbered filtreringsenhet (for 47 mm diameter membraner) og vakuumpumpe. Sterilfiltreringsenheten enten ved autoklavering eller (hvis Pyrex glass) ved å sprøyte den med 70% etanol og flammende den med en Bunsen-brenner. La den kjøle seg ned før du fortsetter med protokollen.
- Legg sterile NC membranen til filtreringsenheten ved hjelp av etanol flammet steriliserte tang.
- Tilsett halvparten av supernatanten prøven (fra trinn 2.6) på membranfiltreringsenheten og samle cellene på membranen ved hjelp av vakuumpumpen.
- Når væsken er fullstendig passert gjennom filteret, stoppe vakuumpumpen og fjern forsiktig membranen ved hjelp av ethanol-flammen sterilisert pinsett. Plassere membranen i en steril petriskål.
- Skjær membran i halvparten bruker etanol flammet steriliserte saks. Legge til hver halvdel av membranen til en separat 2 ml rør. Den ene halvdelen av membranen vil bli brukt for DNA-ekstraksjon og analyse av hele bakteriemiljøet. Den andre halvdelen av filteret vil bli lagret ved -80 ° C, og fungerer som en backup.
- Plassere nye NC membran på filtreringsenheten og samle biomasse fra andre halvdel av prøvevolum (fra trinn 2.6) ved hjelp av vakuumpumpe.
- Når væsken er fullstendig passert gjennom filteret, stoppe vakuumpumpen og fjern forsiktig membranen ved hjelp av etanol-flammet steriliserte tang. Plasser hele membranen inn i en separat 2 ml rør. Denne prøven vil bli brukt for behandling for å separere endospores fra vegetative celler. Prøven kan oppbevares ved -20 ° C inntil bruk.
4. Lysis av vegetative celler
- Utførbehandling for å separere endospores fra vegetative celler på biomasse tidligere oppsamles på en NC-membran (trinn 3.6).
- Hvis membranen var frosset, la den ved RT i 10 min å tine. Deretter plasserer membranen i en steril petriskål og klippe det (ca. 4 ganger) i mindre biter ved hjelp av etanol flammet steriliserte saks. Deretter plasserer alle membranfilter stykker i en steril 2 ml tube.
- Legg 900 ul av 1x TE (Tris-EDTA) buffer (se 1.5) til røret inneholdende prøven membranen og blandes grundig ved vortex. Ved dette trinn blir biomassen fjernes fra membranen og inn i TE-bufferoppløsning.
- Plasser røret i en inkubator ved 65 ° C i 10 min og 80 rpm. Etterpå fjerne røret fra inkubator og la den avkjøles i 15 min.
- Tilsett 100 ul av nyfremstilt lysozym (se 1.5) for å nå en endelig konsentrasjon på 2 mg / ml. Ikke legg til lysozym før prøven er avkjølt til 37 ° C, da dette kan GraderRade enzymet.
- Inkuber prøven ved 37 ° C i 60 min og 80 rpm, de optimale betingelser for lysozym for å lysere vegetative celler.
- Etter at lysering er fullført, tilsettes 250 ul av 3 N natriumhydroksid (NaOH) og 250 ul av 6% natriumdodecylsulfat (SDS) -løsning til prøven. Ved å legge dette, når prøvevolum 1,5 ml, og det er en sluttkonsentrasjon på 0,5 N NaOH og endelig konsentrasjon på 1% SDS.
- Inkuber denne blandingen ved RT i 60 min og 80 rpm. Legge basen og vaskemidler vil hjelpe i finalen cellelysis. Konsentrasjonen av disse midlene som har blitt optimalisert for å ikke skade endosporer, mens lysere vegetative celler.
- Fremstille en steril filtreringsenhet som har 25 mm diameter membraner ved autoklavering, eller (hvis Pyrex glass) å spraye det med 70% etanol og flammende den med en Bunsen-brenner. La det avkjøles.
- Plasser en 0,2 um NC membran (25 mm diameter) på filtreringsenheten ved hjelp av etanol-flamme steriliserte tang. </ li>
- Tilsett prøven fra trinn 4.7 på membranen og filtrere væsken ved hjelp av vakuumpumpen. Når væsken har gått gjennom, slå av vakuumpumpe. Ved dette trinn blir den lyserte vegetative cellemateriale fjernes, da det ikke holdes tilbake på membranen. Bare endospores vil forbli på membranen.
- Tilsett 2 ml steril fysiologisk oppløsning for å vaske ut gjenværende vaskemidler og filtrere væsken ved hjelp av vakuumpumpen.
- Når væsken er fullt filtrert, slå av vakuumpumpen. La membranen på filtreringsenheten.
5. DNase behandling
Merk: Utfør DNase behandling direkte på filteret membran. Det er viktig at filtreringsenheten ikke lekker og vakuumpumpen er slått av.
- Legg 450 ul sterilt vann, 50 ul av DNase reaksjonsbuffer (1x), og 0,5 ul DNase enzym direkte på filtermembranen og la den stå i 15 min. Hvis det er mulig, gjør dette fordøyelsen i et rom som er litt krigmer enn gjennomsnittlig RT, siden enzymet virker bedre ved temperaturer på 25 ° C og over.
Merk: Holde bunsenbrenner side filtreringsenheten øker også temperaturen og har fordelen av å holde omgivelsene sterile, derfor redusert risiko for forurensning av prøvene. - Når DNase-behandling ved å vri på vakuumpumpen for å fjerne enzym fra prøven.
- Vask av gjenværende enzym ved å legge til og filtrering 1 ml fysiologisk oppløsning.
- Hvis væsken har vedtatt, slå av vakuumpumpe og fjern filtermembranen inneholder endospores bruker steril pinsett og legg den i en steril petriskål.
Merk: Utvalget av skilt endospores er nå klar for nedstrøms analyse. Oppbevar ved -20 ° C hvis det brukes for DNA-ekstraksjon eller alternativt ved 4 ° C hvis det brukes for spiring og dyrking.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultatene som presenteres her har vært publisert tidligere 10,21. Vennligst referer til disse artiklene for miljø tolkning og diskusjon av data.
Den generelle prosedyren er oppsummert i figur 1, og svarer til tre hovedtrinn: først, separasjon av biomassen fra sediment eller andre miljø matrise; andre, ødeleggelse av vegetative celler; og for det tredje nedstrøms analyse av de separerte endosporer. Nedstrøms analyse kunne bestå for eksempel av DNA-ekstraksjon og amplicon sekvensering for å bestemme mangfold. DNA-ekstraksjon må optimaliseres for å garantere lysis av endosporer. I sedimentprøver, har vi oppnådd dette ved hjelp av en kraftig sekvensiell DNA ekstraksjon prosedyre 10. Anvendelsen av fremgangsmåten i sedimentet viser en betydelig økning i den fraksjon av endosporer dannende firmicutes etter separasjon. I amplikon sekvensering av 16S rRNAgen, firmicutes i de ubehandlede prøver (hele samfunnet) tilsvarte bare til 8,0, og 19,0% av sekvensene (tabell 1). I motsetning til dette, etter behandlingen firmicutes representerte 90,6% og 83,9% av endosporer-anrikede prøven. De to store bestillinger av endosporer dannende firmicutes, Bacilliales og Clostridiales, ble beriket med metoden, i kontrast med fravær av ordrer som Lactobacilliales som er ikke endosporer dannende firmicutes. For å demonstrere at fremgangsmåten er spesielt egnet for anrikning av virkeendosporer, ble andre grupper som er i stand til å produsere sporelignende strukturer også analysert. Følgelig er frekvensen av aktinobakterier, cyanobakterier og Myxococcales redusert etter behandling for å lysere cellene.
Effektiviteten av behandlingen ble også demonstrert ved anvendelse av rene kulturer. En endosporer forberedelse (> 95% endospores) av Paenibacillus alvei, Bacillus subtilis og Bacillus megaterium Escherichia coli, ble behandlet som beskrevet i protokollen for lysis av vegetative celler. Alle kulturene ble deretter inkubert i næringsmedium ved 37 ° C, og veksten ble målt ved hjelp av optisk densitet ved 600 nm bølgelengde. Vekst ble observert i de kulturer endosporer, mens ingen vekst ble observert i det behandlede E. coli kultur, som beviser at vegetative cellene er irreversibelt skadet (figur 2).
Figur 1. Oversikt over den eksperimentelle prosedyre. Fremgangsmåte for å anrike endosporer dannende bakterier i miljøprøver. Trinnet med å separere celler og endospores fra miljø matrisen kan utelates, avhengig av typen av prøven (dvs. vannprøve). I figuren nedstrøms-metoder anvendes på spore-anrikede fraksjon tilsvarspond til DNA-ekstraksjon og høy gjennomstrømming sekvensering. Disse trinnene kan erstattes av dyrking. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Kontroll av behandlings på rene kulturer. Vekstkurver som bekrefter veksten av endosporer dannende bakterier fra en suspensjon av endosporer av Bacillus subtilis, Bacillus megaterium og Paenibacillus alvei og en cellekultur av Escherichia coli behandles med fremgangsmåten for den lysis av celler. Behandlet = ○. Ubehandlet = ●. Feilfelt fra tre uavhengige kulturer. Vekst av kontrollkulturer og gjenvekst av behandlede kulturer ble målt som optisk tetthet ved 600 nm bølgelengde. Dette tallet har blitt re-trykt from Wunderlin et al. 2 014 med tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Sediment 1 | Sediment 2 | |||
| Hele samfunnet | endosporer-beriket | Hele samfunnet | endosporer-beriket | |
| Firmicutes | 8,0 | 90,6 | 19.0 | 83.9 |
| Basiller | 0.5 | 10,0 | 5.7 | 15.1 |
| Clostridia | 7.4 | 76.9 | 12.5 | 63.2 |
| Aktinobakterier | 2.4 | 1.0 | 4.4 | 2.1 |
| Cyanobakterier | 1.1 | 0.1 | 0.7 | 0.1 |
| Myxococcales | 0.7 | 0.0 | 0.2 | 0.0 |
| Andre bakterier | 87.8 | 8.3 | 75.7 | 13.9 |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Motstanden i endosporer til eksterne fysiske og kjemiske aggressive faktorer (for eksempel temperatur eller vaskemidler) ble brukt til å utvikle en metode for å skille bakterielle endospores fra vegetative celler i miljøprøver. Dette er den første fremgangsmåte omfattende å isolere endospores fra miljøprøver i en ikke-destruktiv måte. Tidligere metoder for å kvantifisere, oppdage eller analysere endospores i prøvene var basert på måling av spesifikke fullmakter for endospores som dipikolinsyre eller spesifikke markørgener. I motsetning til dette, med den protokoll som presenteres her, eksempel enn endospores komponenter er fjernet og slik at endospores slutt forblir som de eneste og rensede rester av prøven. Selv om andre metoder som pasteurisering eller tetthetsgradient-sentrifugering har vært foreslått for å anrike for endospores 22, våre tester viste at tetthetsgradient-sentrifugering er ikke passende som en generell fremgangsmåte for miljøprøverPå grunn av fysiologiske forskjeller og forskjellige tettheter av forskjellige arter av endosporer-formers (data ikke vist). I motsetning til dette kan vår protokoll lett brukes på alle typer av miljøprøver, og er egnet til nedstrøms applikasjoner, inkludert genetiske metoder eller dyrkning.
Det er to viktige trinn i protokollen. Den første er separasjon av biomassen fra prøvemassen (dvs. partikler sediment). Det er vesentlig at antallet celler separert fra matriksen maksimeres, slik at det ikke overse del av mangfoldet. For sedimentprøver, som anvendt her, er en av de viktigste begrensninger av protokollen for det faktum at noen celler eller sporer ikke kan ha blitt frigjort fra sedimentmassen, og således ikke i nedstrøms analyse, som er en potensiell begrensning av metoden . Avhengig av prøvemassen (for eksempel hvis det er humussyrer), celler kan være tett bundet til det, og derfor vanskelig å løsne.Anvendelse av orto-fosfat-buffer, så vel som god homogenisering med en homogenisator eller blender er viktig på dette trinnet. For å øke utvinningen, er prosedyren for homogenisering, og fjerning av biomasse gjentatt to ganger som skrevet i protokollen. Protokollen er beskrevet her har blitt utviklet og optimalisert for prøver av ferskvann sediment. Noen parametre kan ikke være optimale for andre typer prøver. En måte å analysere fellesskap fraksjonen som potensielt ble oversett i prosessen vil være å utsette sedimentet matrisen til DNA-ekstraksjon og fragment sekvensering. Som mulige modifikasjoner av teknikken, kan trinnet for separasjon av biomassen fra prøvematrise utelates. Spesielt hvis miljøprøven ikke inneholder organisk material eller mineralpartikler som kan forstyrre den nedstrøms-protokollen (for eksempel, vann, andre væsker eller rensede kulturer), kan det forutgående separasjon ikke være nødvendig. For væskeprøver protokollen kan starte direkte på kapittel 3(Samling av biomasse på filter membran).
Den andre viktige trinn i protokollen er behandling med lysozym, varme, SDS og NaOH for å ødelegge vegetative celler. Temperatur, varighet og konsentrasjon av kjemikalier har alle blitt optimalisert for ikke å skade endosporer, mens ødelegge cellene. Disse parametrene må derfor strengt beholdes som de er. Bruken av et første trinn med oppvarming av prøven ved 65 ° C var meget effektiv for spesifikt å selektere for endosporer i forhold til andre typer av bakteriesporer eller sporelignende strukturer som forekommer blant bakterie phyla av aktinobakterier, Myxobacteria, cyanobakterier, som vanligvis ikke er Varmeresistent. Som det fremgår av tabell 1, ikke-sporedannende bakterier er fremdeles til stede etter behandlingen (8,3% til 14%). Noen forklaringer på dette er at sedimentprøver er svært komplisert, og kan også havn resistente ikke-spore celler. I tillegg kan restene organisk materiale tillate en viss ttached cellene å overleve behandlingen. For ytterligere å redusere prosentandelen av ikke-sporedannende celler i de behandlede prøvene, bør fremgangsmåten optimaliseres basert på individuell prøvetype.
Metoden representerer en roman verktøy for målrettet studie av endosporer-formers i miljøprøver. Behandlingen for å ødelegge vegetative celler kan testes på rene kulturer av celler og endosporer, og er tilpasset for å passe individuelle motstand av celler. Ødeleggelse av cellene kan ses i kurvene i behandlede kulturer er vist på figur 2. Den forsinkede vekst av de behandlede kulturer kan være på grunn av den tid som endospores må re-spire og beveger seg inn i den eksponensielle vekstfase. Andre mulige forklaringer på denne forsinkelsen kan også være en svekkelse av endosporer kultur eller lavere celle tall etter behandling. Dersom de separerte endospores ikke benyttes for DNA-ekstraksjon, kan det siste trinnet av DNase-behandling utelates.
nt "> Fremtidige anvendelser av denne teknikken kan tenkes i bransjer der patogene endospores trenger å bli oppdaget. Et eksempel er i næringsmiddelindustrien og klinisk forskning, hvor påvisning og analyse (for identifikasjon) av endospores, og dens differensiering fra vegetative celler (for eksempel, fra mat produkter som melk eller melkebaserte produkter) er viktig. Dette kan være særlig aktuelt i betraktning at mange av standardprosedyrer vurdere direkte DNA-ekstraksjon fra en prøve ved anvendelse lytiske enzymer som ikke er tilpasset for å lysere endosporer, som vil dermed bli oversett. Med fremgangsmåten som presenteres her, celler kan bli fjernet, og etterfølgende analyse vil gi svar på tilstedeværelse eller fravær av endosporer i motsetning til celler. Andre anvendelser inkluderer analyse av endosporer fellesskap i forskjellige miljøprøver (for eksempel is eller sedimentkjerner ) som er historiske arkiver av miljøforhold. I mange miljøer med relativt stabile miljøvenntal betingelser (for eksempel vannet sedimentoverflaten) endosporer dannende firmicutes kan trives i form av vegetative celler. Når forholdene forverres (for eksempel ved næringsmangel under sediment begravelse eller en dreining mot anaerobe forhold) cellene flytte inn endosporer tilstand. Derfor kan de hentes endosporer samfunn fra sedimentkjerner reflektere de miljømessige forholdene på tidspunktet for begravelsen, og dermed brukes som en paleoecological indikator på forholdene før begravelse. Men vi er fortsatt å samle informasjon for å støtte denne påstanden.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne erkjenner den sveitsiske National Science Foundation for Grant No. 31003A-132358/1, 31003A_152972 og nr 151948, og Fundation Pierre Mercier pour la Science.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Whatman nitrocellulose membrane filters, 0.2 μm pore size, 47 mm diameter | Sigma-Aldrich | WHA7182004 Aldrich | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859 Sigma-Aldrich | CAS 77-86-1 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 Sigma-Aldrich | CAS 60-00-4 |
| Lysozyme from chicken egg white | Sigma-Aldrich | 62971 Fluka | powder, CAS 12650-88-3 |
| Ultra-Turrax homogenizer T18 basic | IKA | 3720000 | |
| Glass filter holders for 47 mm membranes, Pyrex glass | EMD Millipore | XX10 047 00 | |
| Chemical duty vacuum pump | Millipore | WP6122050 | 220 V/50 Hz |
| Manifold sampling filtration for 25 mm membranes | Millipore | 1225 Sampling Manifold | polypropylene |
| Dnase | New England Biolabs | M0303S | Rnase free |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 Sigma-Aldrich | CAS 1310-73-2 |
| Sodium dodecyl sulfphate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 Sigma | |
| Whatman nitrocellulose membrane filters, 0.2 μm pore size, 25 mm diameter | Sigma-Aldrich | WHA7182002 Aldrich |
References
- Nicholson, W. L. Roles of Bacillus endospores in the environment. Cell Mol Life Sci. 59 (3), 410-416 (2002).
- Lester, E. D., Satomi, M., Ponce, A. Microflora of extreme arid Atacama Desert soils. Soil Biol Biochem. 39 (2), 704-708 (2007).
- Wilson, M. S., Siering, P. L., White, C. L., Hauser, M. E., Bartles, A. N. Novel archaea and bacteria dominate stable microbial communities in North America's Largest Hot Spring. Microb Ecol. 56 (2), 292-305 (2008).
- Hugenholtz, P. Exploring prokaryotic diversity in the genomic era. Genome Biol. 3 (2), (2002).
- Onyenwoke, R. U., Brill, J. A., Farahi, K., Wiegel, J. Sporulation genes in members of the low G+C Gram-type-positive phylogenetic branch (Firmicutes). Arch Microbiol. 182 (2-3), 182-192 (2004).
- Delmont, T. O., et al. Accessing the soil metagenome for studies of microbial diversity. Appl Environ Microbiol. 77 (4), 1315-1324 (2011).
- Ricca, E., Henriques, A. O., Cutting, S. M. Bacterial spore formers: probiotics and emerging applications. , Horizon Bioscience. (2004).
- Kuske, C. R., et al. Small-Scale DNA Sample Preparation Method for Field PCR Detection of Microbial Cells and Spores in Soil. Appl Environ Microbiol. 64 (7), 2463-2472 (1998).
- von Mering, C., et al. Quantitative phylogenetic assessment of microbial communities in diverse environments. Science. 315 (8515), 1126-1130 (2007).
- Wunderlin, T., Junier, T., Roussel-Delif, L., Jeanneret, N., Junier, P. Stage 0 sporulation gene A as a molecular marker to study diversity of endospore-forming Firmicutes. Environ Microbiol Rep. 5 (6), 911-924 (2013).
- Siala, A., Hill, I. R., Gray, T. R. G. Populations of spore-forming bacteria in an acid forest soil, with special reference to Bacillus subtilis. J General Microbiol. 81 (1), 183-190 (1974).
- Brandes Ammann, A., Kolle, L., Brandl, H. Detection of bacterial endospores in soil by terbium fluorescence. Int J Microbiol. , 435281 (2011).
- Fichtel, J., Koster, J., Rullkotter, J., Saas, H. High variations in endospore numbers within tidal flat sediments revealed by quantification of dipicolinic acid. Geomicrobiol J. 25 (7-8), (2008).
- Cronin, U. P., Wilkinson, M. G. The potential of flow cytometry in the study of Bacillus cereus. J Appl Microbiol. 108 (1), 1-16 (2010).
- de Rezende, J. R., et al. Dispersal of thermophilic Desulfotomaculum endospores into Baltic Sea sediments over thousands of years. ISME J. 7 (1), 72-84 (2013).
- Hubert, C., et al. Thermophilic anaerobes in Arctic marine sediments induced to mineralize complex organic matter at high temperature. Environ Microbiol. 12 (4), 1089-1104 (2010).
- Garbeva, P., van Veen, J. A., van Elsas, J. D. Predominant Bacillus spp. in agricultural soil under different management regimes detected via PCR-DGGE. Microb Ecol. 45 (3), 302-316 (2003).
- Brill, J. A., Wiegel, J. Differentiation between spore-forming and asporogenic bacteria using a PCR and southern hybridization based method. J Microbiol Methods. 31 (1-2), 29-36 (1997).
- Rueckert, A., Ronimus, R. S., Morgan, H. W. Development of a real-time PCR assay targeting the sporulation gene, spo0A., for the enumeration of thermophilic bacilli in milk powder. Food Microbiol. 23 (3), 220-230 (2006).
- Bueche, M., et al. Quantification of endospore-forming firmicutes by quantitative PCR with the functional gene spo0A. Appl Environ Microbiol. 79 (17), 5302-5312 (2013).
- Wunderlin, T., Junier, T., Roussel-Delif, L., Jeanneret, N., Junier, P. Endospore-enriched sequencing approach reveals unprecedented diversity of Firmicutes in sediments. Environ Microbiol Rep. 6 (6), 631-639 (2014).
- Nicholson, W. L., Law, J. F. Method for purification of bacterial endospores from soils: UV resistance of natural Sonoran desert soil populations of Bacillus spp. with reference to B. subtilis strain 168. J Microbiol Methods. 35 (1), 13-21 (1999).
