Introduction
Målet med detta arbete är att ge ett protokoll för separation av bakterie endosporer från vegetativa bakterieceller i miljöprover. Bildningen av bakteriella endosporer är en överlevnadsstrategi, oftast utlöses av svält, finns i ett antal av bakteriegrupper som tillhör stammen Firmicutes 1. Endospor bildande bakterier är väl studerade, främst eftersom ett antal stammar är patogener och därmed av medicinsk betydelse (t.ex. Bacillus anthracis eller Clostridium difficile). Miljö stammar av endospor bildande bakterier har isolerats från praktiskt taget alla miljöer (jord, vatten, sediment, luft, is, människans tarm, djur gut, och mera) 1-3. Därför Firmicutes är den näst mest förekommande provins i kultursamlingar 4.
På grund av deras härdade yttre cortex och skyddande kärnproteiner, kan endosporer överleva extrema miljöförhållanden som sträcker sig frOm uttorkning till hög strålning, extrema temperaturer och skadliga kemikalier 5. Denna märkliga motstånd gör det till en utmaning att utvinna DNA från endosporer 6-8. Detta förklarar sannolikt varför de har förbisetts i miljösekvense studier 9,10. Andra metoder, såsom målsökning av endosporer i miljöprover genom fluorescerande antikroppar 11, kvantifiering av dipikolinsyra (DPA) i jord 12 och sediment 13, flödescytometri 14 eller pastörisering och efterföljande odling 15,16 har använts för att hämta eller kvantifiera endosporer i miljöprover. Under de senaste åren, till optimerad DNA extraktionsmetoder samt specifika molekylära primers rikta endospor specifika gensekvenser har utvecklats 10,17-20. Detta har bidragit till att avslöja mer biologisk mångfald bland denna grupp av bakterier 21 och har också lett till tillämpningar inom industri och medicin för upptäckten av endosporer, Exempelvis i mjölkpulver 19.
Protokollet presenteras här bygger på skillnaden i motståndet mot skadliga fysikalisk-kemiska förhållanden (såsom värme och rengöringsmedel) av bakteriella endosporer förhållande till vegetativa celler. Att förstöra vegetativa celler i ett prov, vi följd applicera värme, lysozym och låga koncentrationer av rengöringsmedel. Tiden och styrkan av dessa behandlingar har optimerats för att inte förstöra sporer, men att lysera alla vegetativa celler. Vissa celler i ett miljö cellpol är mer resistenta än andra, så för att öka sannolikheten för att förstöra alla vegetativa celler, tillämpar vi tre olika behandlingar. Fördelen och nyhet med denna metod är att endosporer efter behandlingen är fortfarande intakt och kan användas för ytterligare analyser nedströms. Dessa inkluderar DNA-extraktion, kvantitativ PCR (qPCR) och amplicon eller metagenomic sekvensering (inriktning särskilt gruppen av endosporer och därmed minska diversity, samtidigt som man ökar täckningen). De endosporer skulle också kunna användas för nedströms odling eller kvantifiering genom fluorescensmikroskopi, flödescytometri, eller detektering av DPA. En viktig egenskap hos detta förfarande är att genom att jämföra ett obehandlat prov med en behandlat prov, kan ett härleda mängden och mångfalden av endosporer i ett miljöprov förutom den komponent som motsvarar vegetativa celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Framställning av kemikalier och utrustning
- Gör 500 ml av en 1% natriumhexametafosfat (SHMP) (NaPO 3) n lösning och sterilisera i autoklav.
- Sterilisera nitrocellulosa (NC) filter (porstorlek 0,22 um, diameter 47 mm) genom autoklavering i sluten glaspetriskålar.
- Sterilisera NC filter (porstorlek 0,22 um, diameter 25 mm) genom autoklavering i slutna glaspetriskålar.
- Väg och notera den tomma vikten på sterila 50 ml rör (med locket på) (ett rör per prov).
- Förbered Tris-EDTA-buffert (TE-buffert) 1x: göra lösning av 10 mM Tris (tris (hydroximetyl) aminometan) och 1 mM EDTA-buffert. Justera pH till 8 och sterilisera i autoklav.
- Bered lysozymlösning (20 mg / ml) genom att lösa 0,02 g lysozym i en ml TE-buffert. Helst gör färska varje gång. Förvara vid 4 ° C under högst en vecka.
- Bered fysiologisk lösning genom upplösning av 8 g / I natriumklorid(NaCl) i destillerat vatten. Sterilisera genom autoklavering.
2. Separation av biomassa från sediment
- Tillsätt 3 g sedimentprov till pre-vägs sterila 50 ml rör med hjälp av etanol flammade metall skopor. Utför detta i en ren, UV steriliserad biosäkerhet skåp för att undvika kontaminering.
- Tillsätt 15 ml av en 1% steril (autoklaverad) SHMP lösning till provet med användning av en steril graderad byrett. Kan också filtreras SHMP lösning för att undvika kontaminering.
- Homogenisera sediment och SHMP lösning med en vätska dispergator / homogenisator (t.ex. Ultra-Turrax homogenisator). 70% etanol-sterilisera eller autoklaveras dispersionen rotorn före användning. Kör homogenisering under 1 minut vid 17.500 rpm. Låt provet vila i 2 minuter och upprepa homogenisering under 1 min vid samma rotorvarvtal.
- Låt provet stå i 10 minuter. I detta steg kommer de tyngsta partiklarna (mineraler) lösa. Cellerna och eventuella organiska komponenter i provet dock wsjuk förblir i lösning. Efteråt, överför supernatanten (innehållande cellbiomassa) till ett rent 50 ml rör, samtidigt noga med att inte störa sediment pellets.
- Till sedimentet pelleten Lägg till igen 15 ml av en 1% steril (autoklaverad) SHMP lösning med användning av en steril graderad byrett. Därefter upprepa steg 2,3 och 2,4. Denna upprepning säkerställer separationen av den maximala mängden celler och organiska partiklar från mineralkomponenten i sedimentet. Supernatanten från denna andra separation kan slås samman med supernatanten från den första separationen.
Obs: Följande steg är allt gjort på supernatanten (innehållande cellbiomassa). Den mineralkomponent (sediment pellet) kan kasseras. - Centrifugera provet vid 20 xg under 1 min. Detta steg ökar g-kraft nog att lösa små mineralpartiklar medan biologiska cellmaterialet återstår i lösning. Efter centrifugering, överför supernatanten (innehållande cellbiomassa) till enren 50 ml-rör. Kassera mineral pelleten.
- Bestäm den slutliga volymen av lösningen innehållande biomassan genom vägning av provet. Viktbestämn undviker att överföra provet till en graderad cylinder och minskar risken för förorening.
3. Insamling av biomassa på filtermembranet
- Förbered filtreringsenhet (för 47 mm membran diameter) och vakuumpump. Sterilisera filtreringsenheten, antingen genom autoklavering eller (om pyrexglas) genom besprutning med 70% etanol och flammande den med en bunsenbrännare. Låt den svalna innan du fortsätter med protokollet.
- Tillsätt steril NC membranet till filtreringsenheten med hjälp av etanol flammade steriliserade pincett.
- Tillsätt hälften av provsupernatanten (från steg 2,6) på membranfiltreringsenheten och samla upp celler på membranet med användning av vakuumpumpen.
- När vätskan har helt passerat genom filtret, stoppa vakuumpumpen och försiktigt bort membranet med hjälp av ethanol-flamma steriliserad pincett. Placera membranet i en steril petriskål.
- Skär membranet i hälften använder etanol flammade steriliserade sax. Lägg varje halv av membranet till en separat 2 ml rör. En halv av membranet kommer att användas för DNA-extraktion och analys av hela bakteriella gemenskap. Den andra hälften av filtret kommer att lagras vid -80 ° C och fungerar som en backup.
- Placera nya NC-membran på filtreringsenheten och samla biomassa från den andra halvan av provvolymen (från steg 2,6) med hjälp av vakuumpumpen.
- När vätskan har helt passerat genom filtret, stoppa vakuumpumpen och försiktigt bort membranet med hjälp av etanol flammade steriliserade pincett. Placera hela membranet i en separat 2 ml rör. Detta prov kommer att användas för behandling för att separera endosporer från vegetativa celler. Provet kan lagras vid -20 ° C tills användning.
4. Lys av vegetativa celler
- Utförbehandling för att separera endosporer från vegetativa celler på biomassan tidigare insamlade på en NC-membran (steg 3,6).
- Om membranet frystes, lämna det vid RT i 10 minuter för att tina. Placera sedan membranet i en steril petriskål och skär den (ungefär 4 gånger) i mindre bitar med hjälp av etanol flammade steriliserade sax. Placera sedan alla membranfilter bitar i ett sterilt 2 ml rör.
- Lägg 900 il 1x TE (Tris-EDTA) buffert (se 1.5) till röret innehållande provet membranet och blanda väl genom virvel. Vid detta steg är biomassan avlägsnas från membranet in i TE-buffertlösning.
- Placera röret i en inkubator vid 65 ° C under 10 min och 80 varv per minut. Efteråt ta bort röret från inkubatorn och låt den svalna i 15 minuter.
- Tillsätt 100 ni nyberedd lysozym (se 1,5) för att nå en slutlig koncentration av 2 mg / ml. Lägg inte till lysozym innan provet har svalnat till 37 ° C, eftersom detta skulle kunna digRADE enzymet.
- Inkubera provet vid 37 ° C under 60 min och 80 varv per minut, de optimala betingelserna för lysozymet att lysera vegetativa celler.
- Efter lys är fullständig, tillsätt 250 | il av 3 N natriumhydroxid (NaOH) och 250 pl 6% natriumdodecylsulfat (SDS) -lösning till provet. Genom att lägga till detta, når provvolymen 1,5 ml och det finns en slutlig koncentration av 0,5 N NaOH och slutkoncentration av 1% SDS.
- Inkubera denna blandning vid rumstemperatur under 60 minuter och 80 rpm. Lägga basen och rengöringsmedel kommer att bidra till slut cellys. Koncentrationen av dessa tvättmedel har optimerats för att inte skada endosporer, medan lyse vegetativa celler.
- Förbered en steril filtreringsenhet som håller membranen 25 mm diameter genom autoklavering, eller (om Pyrex glas) besprutning med 70% etanol och flammande den med en bunsenbrännare. Låt den svalna.
- Placera ett 0,2 pm NC membran (25 mm diameter) på filtreringsenheten med användning av etanol-flamma steriliserade pincett. </ li>
- Lägg provet från steg 4,7 på membranet och filtrera vätskan med hjälp av vakuumpumpen. När vätskan har passerat genom, stänga av vakuumpumpen. I detta steg, är den lyserade vegetativa cellmaterialet bort, eftersom det inte är kvar på membranet. Endast endosporer blir kvar på membranet.
- Tillsätt 2 ml av steril fysiologisk lösning för att tvätta bort rest detergenter och filtrera vätskan med hjälp av vakuumpumpen.
- När vätskan har helt filtreras stänga av vakuumpumpen. Lämna membranet på filtreringsenheten.
5. DNas Behandling
Notera: Utför DNas-behandling direkt på filtermembranet. Det är viktigt att läcka filtreringsenheten inte och vakuumpumpen stängs av.
- Tillsätt 450 | il sterilt vatten, 50 pl DNas-reaktionsbuffert (1 x) och 0,5 | il DNas enzym direkt på filtermembranet och låt den stå i 15 minuter. Om möjligt, gör detta uppslutning i ett rum som är något krigmeren än genomsnittet RT, eftersom enzymet fungerar bättre vid temperaturer av 25 ° C och däröver.
Notera: Att hålla Bunsenbrännare undan filtreringsenheten ökar också temperaturen och har den extra fördelen av att hålla omgivningen steril, därför minskad risk för kontaminering av proverna. - När DNas matsmältningen är klar, slå på vakuumpump för att avlägsna enzymet från provet.
- Tvätta resterande enzym genom att lägga till och filtrering 1 ml fysiologisk lösning.
- Om vätska har helt gått, stäng av vakuumpumpen och ta bort filtermembranet innehållande endosporer med hjälp av steril pincett och placera den i en steril petriskål.
Obs: Urvalet av separerade endosporer är nu klar för efterföljande analys. Förvara vid -20 ° C om den används för DNA-extraktion eller alternativt vid 4 ° C om de används för groning och odling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De resultat som presenteras här har tidigare 10,21 publicerats. Se dessa artiklar för tolkning och diskussion av miljödata.
Den totala proceduren sammanfattas i figur 1 och motsvarar tre huvudsteg: först, separation av biomassa från sediment eller någon annan miljömatris; andra, förstörelse av vegetativa celler; och för det tredje den nedströms analys av de separerade endosporer. Nedströms analys kan bestå till exempel av DNA-extraktion och amplikon sekvensering för att bestämma mångfalden. Den DNA-extraktion måste optimeras för att garantera lys av endosporer. I sedimentprover, har vi uppnått detta genom att använda en kraftfull sekventiell DNA-extraktion förfarandet 10. Tillämpningen av metoden i sediment visar en signifikant ökning av andelen endospor bildande Firmicutes efter separation. I amplikon sekvensering av 16S rRNAgen, Firmicutes i de obehandlade proverna (hela samhället) motsvarade endast 8,0 och 19,0% av sekvenserna (tabell 1). I motsats, efter behandlingen Firmicutes representerade 90,6% och 83,9% av endospor berikade prov. De två större order av endospor bildande Firmicutes, Bacilliales och Clostridiales, berikades med metoden, som kontrasterar mot avsaknaden av order som Lactobacilliales som är icke endospor bildande Firmicutes. För att demonstrera att metoden är speciellt lämplig för anrikningen av sanna endosporer, var andra grupper med förmåga att producera sporbildande liknande strukturer också analyseras. Följaktligen minskade frekvensen av Aktinobakterier, Cyanobakterier och Myxococcales efter behandlingen för att lysera cellerna.
Effektiviteten av behandlingen demonstrerades också med användning av rena kulturer. En endospores preparat (> 95% endosporer) av Paenibacillus alvei, Bacillus subtilis och Bacillus megaterium Escherichia coli, behandlades såsom beskrivits i protokollet för lys av vegetativa celler. Alla kulturer inkuberades sedan i näringsbuljong vid 37 ° C och tillväxt mättes med användning av optisk densitet vid 600 nm våglängd. Tillväxten observerades för endospor kulturer medan ingen tillväxt observerades i den behandlade E. coli kultur, bevisar att vegetativa celler irreversibelt skadad (Figur 2).
Figur 1. Översikt över den experimentella proceduren. Förfarande som används för att berika endospor bildande bakterier i miljöprover. Steget att separera celler och endosporer från miljömatris kan utelämnas beroende på den typ av prov (dvs prov vatten). I figuren tillämpat nedströms metoder på spor fraktionen motsvastämmer till DNA-extraktion och hög kapacitet sekvensering. Dessa steg kan ersättas med odling. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Verifiering av behandlingen på rena kulturer. Tillväxtkurvor som kontrollerar tillväxten av endospor-bildande bakterier från en suspension av endosporer av Bacillus subtilis, Bacillus megaterium och Paenibacillus alvei och en cellodling av Escherichia coli som behandlats med metoden för lys av celler. Behandlad = ○. Obehandlad = ●. Felstaplar från tre oberoende kulturer. Tillväxt av kontrollkulturer och återväxt av behandlade kulturer mättes som optisk densitet vid 600 nm våglängd. Denna siffra har fått en ny tryckt from et al. Wunderlin 2014 med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Sediment 1 | Sediment 2 | |||
| hela samhället | endospor berikad | hela samhället | endospor berikad | |
| Firmicutes | 8,0 | 90,6 | 19,0 | 83,9 |
| Baciller | 0,5 | 10,0 | 5,7 | 15,1 |
| Clostridia | 7,4 | 76,9 | 12,5 | 63,2 |
| Aktinobakterier | 2,4 | 1,0 | 4,4 | 2,1 |
| Cyanobakterier | 1,1 | 0,1 | 0,7 | 0,1 |
| Myxococcales | 0,7 | 0,0 | 0,2 | 0,0 |
| Andra bakterier | 87,8 | 8,3 | 75,7 | 13,9 |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Motståndet av endosporer till externa aggressiva fysikalisk-kemiska faktorer (t.ex. temperatur eller rengöringsmedel) användes för att ta fram en metod för att skilja bakteriella endosporer från vegetativa celler i miljöprover. Detta är den första heltäckande metod för att isolera endosporer från miljöprover på ett icke-förstörande sätt. Tidigare metoder för att kvantifiera, upptäcka eller analysera endosporer i prover baserades på mätning av specifika ombud för endosporer såsom dipikolinsyra eller särskilda markörgener. I motsats, med protokollet presenteras här, provkomponenter än endosporer tas bort och så endosporer förbli så småningom som de enda och renade resterna av provet. Även om andra metoder såsom pastörisering eller densitetsgradientcentrifugering har föreslagits för anrikning av endosporer 22, våra tester visade att densitetsgradientcentrifugering inte är lämpligt som ett allmänt förfarande för miljöproverPå grund av fysiologiska skillnader och olika densiteter av olika arter av endospor-formare (data ej visade). Däremot kan våra protokoll lätt tillämpas på alla typer av miljöprover och är lämplig för tillämpningar efter bland annat molekylära metoder eller odling.
Det finns två viktiga steg i protokollet. Den första är separationen av biomassan från provmatrisen (dvs sedimentpartiklar). Det är väsentligt att antalet celler separerade från matrisen maximeras, så att inte förbise en del av mångfalden. För sedimentprover, som används här, är en av de viktigaste begränsningarna av protokollet att vissa celler eller sporer inte kan ha lossnat från sedimentmatrisen och därför inte ingår i nedströms analysen, som är en potentiell begränsning av metoden . Beroende på provmatrisen (t ex om det finns humussyror), celler kan vara tätt bunden till sig och därför svåra att frigöra.Användningen av orto-fosfatbuffert samt god homogenisering med en homogenisator eller bländare är viktiga i detta steg. För att öka återvinning, är förfarandet i homogenisering och uttag av biomassa upprepades två gånger som det står skrivet i protokollet. Protokollet som beskrivs här har utvecklats och optimerats för prover av insjö sediment. Vissa parametrar kanske inte är optimal för andra typer av prover. Ett sätt att analysera samhället fraktion som potentiellt förbisågs i processen skulle vara att utsätta sedimentmatrisen till DNA-extraktion och amplicon sekvensering. Som möjliga modifieringar av tekniken, kan steget för separation av biomassa från provmatrisen utelämnas. Särskilt om miljö provet inte innehåller organiskt material eller mineralpartiklar som kan störa den efterföljande protokoll (t.ex. vatten, andra vätskor eller renkulturer), får tidigare separation inte behövas. För vätskeprover protokollet kan starta direkt i kapitel 3(Insamling av biomassa på filtermembranet).
Det andra viktiga steget i protokollet är behandling med lysozym, värme, NaOH och SDS för att förstöra vegetativa celler. Temperatur, har varaktighet samt koncentration av kemikalier alla optimerats för att inte skada endosporer, medan förstöra cellerna. Dessa parametrar bör därför vara strängt bevaras som de är. Användningen av ett första steg med upphettning av provet vid 65 ° C var mycket effektiv för att specifikt selektera för endosporer jämfört med andra typer av bakteriella sporer eller sporbildande liknande strukturer som förekommer bland den bakteriella fyla av Aktinobakterier, myxobakterier, cyanobakterier, som i allmänhet inte värmebeständigt. Såsom framgår av tabell 1, icke-sporbildande bakterier är fortfarande närvarande efter behandlingen (8,3% till 14%). Några förklaringar till detta är att sedimentprover är mycket komplexa och kan även hysa resistenta icke-spor-celler. Dessutom kan överblivna organiskt material tillåter vissa a ttached celler att överleva behandlingen. För att ytterligare minska andelen icke-sporbildande celler i de behandlade proverna bör metoden optimeras baserat på individuell provtyp.
Metoden representerar ett nytt verktyg för riktade studier av endospor-bildare i miljöprover. Behandlingen för att förstöra vegetativa celler kan testas på rena cellkulturer och endosporer och anpassas till individuella motstånd av celler. Förstörelsen av celler kan ses i kurvorna för behandlade kulturerna som visas i figur 2. Den fördröjda tillväxt hos de behandlade kulturer kan bero på den tid som endosporer på nytt behöver gro och flytta in den exponentiella tillväxtfasen. Andra möjliga förklaringar till denna försening kan också vara en försvagning av endospores kultur eller lägre cellantal efter behandling. Om de separerade endosporer inte används för DNA-extraktion, kan det sista steget i DNas-behandling utelämnas.
nt "> Framtida tillämpningar av denna teknik kan övervägas i branscher där patogena endosporer måste upptäckas. Ett exempel är inom livsmedelsindustrin och klinisk forskning, där detektering och analys (för identifiering) av endosporer och dess differentiering från vegetativa celler (till exempel, från livsmedel produkter såsom mjölk eller mjölkbaserade produkter) är av avgörande betydelse. Detta kan vara särskilt relevant med tanke på att många standardprocedurer anser direkt DNA-extraktion från ett prov med hjälp av lytiska enzymer som inte är anpassade till lysera endosporer, som därmed kommer att förbises. Med den metod som presenteras här, celler kan tas bort och efterföljande analys kommer att ge svar på närvaron eller frånvaron av endosporer i motsats till celler. Andra användningsområden inkluderar en analys av endospor samhällen i olika miljöprover (t ex is eller sedimentkärnor ) som är historiska arkiv miljöförhållanden. I många miljöer med relativt stabil environmental villkor (till exempel sjösediment yta) endospor bildande Firmicutes kan frodas i form av vegetativa celler. När förhållandena försämras (till exempel genom närings utarmning under sediment begravning eller omställning till anaeroba förhållanden) cellerna flytta in endospores staten. Därför kan de hämtade endospor samhällen från sedimentkärnor återspeglar miljöförhållandena vid tidpunkten för nedgrävning och således användas som en paleoecological indikator på de villkor som före begravning. Men vi fortfarande att samla in information för att stödja detta påstående.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna erkänner Swiss National Science Foundation för Grant No. 31003A-132358/1, 31003A_152972 och nr 151948, och Fundation Pierre Mercier pour la Science.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Whatman nitrocellulose membrane filters, 0.2 μm pore size, 47 mm diameter | Sigma-Aldrich | WHA7182004 Aldrich | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859 Sigma-Aldrich | CAS 77-86-1 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 Sigma-Aldrich | CAS 60-00-4 |
| Lysozyme from chicken egg white | Sigma-Aldrich | 62971 Fluka | powder, CAS 12650-88-3 |
| Ultra-Turrax homogenizer T18 basic | IKA | 3720000 | |
| Glass filter holders for 47 mm membranes, Pyrex glass | EMD Millipore | XX10 047 00 | |
| Chemical duty vacuum pump | Millipore | WP6122050 | 220 V/50 Hz |
| Manifold sampling filtration for 25 mm membranes | Millipore | 1225 Sampling Manifold | polypropylene |
| Dnase | New England Biolabs | M0303S | Rnase free |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 Sigma-Aldrich | CAS 1310-73-2 |
| Sodium dodecyl sulfphate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 Sigma | |
| Whatman nitrocellulose membrane filters, 0.2 μm pore size, 25 mm diameter | Sigma-Aldrich | WHA7182002 Aldrich |
References
- Nicholson, W. L. Roles of Bacillus endospores in the environment. Cell Mol Life Sci. 59 (3), 410-416 (2002).
- Lester, E. D., Satomi, M., Ponce, A. Microflora of extreme arid Atacama Desert soils. Soil Biol Biochem. 39 (2), 704-708 (2007).
- Wilson, M. S., Siering, P. L., White, C. L., Hauser, M. E., Bartles, A. N. Novel archaea and bacteria dominate stable microbial communities in North America's Largest Hot Spring. Microb Ecol. 56 (2), 292-305 (2008).
- Hugenholtz, P. Exploring prokaryotic diversity in the genomic era. Genome Biol. 3 (2), (2002).
- Onyenwoke, R. U., Brill, J. A., Farahi, K., Wiegel, J. Sporulation genes in members of the low G+C Gram-type-positive phylogenetic branch (Firmicutes). Arch Microbiol. 182 (2-3), 182-192 (2004).
- Delmont, T. O., et al. Accessing the soil metagenome for studies of microbial diversity. Appl Environ Microbiol. 77 (4), 1315-1324 (2011).
- Ricca, E., Henriques, A. O., Cutting, S. M. Bacterial spore formers: probiotics and emerging applications. , Horizon Bioscience. (2004).
- Kuske, C. R., et al. Small-Scale DNA Sample Preparation Method for Field PCR Detection of Microbial Cells and Spores in Soil. Appl Environ Microbiol. 64 (7), 2463-2472 (1998).
- von Mering, C., et al. Quantitative phylogenetic assessment of microbial communities in diverse environments. Science. 315 (8515), 1126-1130 (2007).
- Wunderlin, T., Junier, T., Roussel-Delif, L., Jeanneret, N., Junier, P. Stage 0 sporulation gene A as a molecular marker to study diversity of endospore-forming Firmicutes. Environ Microbiol Rep. 5 (6), 911-924 (2013).
- Siala, A., Hill, I. R., Gray, T. R. G. Populations of spore-forming bacteria in an acid forest soil, with special reference to Bacillus subtilis. J General Microbiol. 81 (1), 183-190 (1974).
- Brandes Ammann, A., Kolle, L., Brandl, H. Detection of bacterial endospores in soil by terbium fluorescence. Int J Microbiol. , 435281 (2011).
- Fichtel, J., Koster, J., Rullkotter, J., Saas, H. High variations in endospore numbers within tidal flat sediments revealed by quantification of dipicolinic acid. Geomicrobiol J. 25 (7-8), (2008).
- Cronin, U. P., Wilkinson, M. G. The potential of flow cytometry in the study of Bacillus cereus. J Appl Microbiol. 108 (1), 1-16 (2010).
- de Rezende, J. R., et al. Dispersal of thermophilic Desulfotomaculum endospores into Baltic Sea sediments over thousands of years. ISME J. 7 (1), 72-84 (2013).
- Hubert, C., et al. Thermophilic anaerobes in Arctic marine sediments induced to mineralize complex organic matter at high temperature. Environ Microbiol. 12 (4), 1089-1104 (2010).
- Garbeva, P., van Veen, J. A., van Elsas, J. D. Predominant Bacillus spp. in agricultural soil under different management regimes detected via PCR-DGGE. Microb Ecol. 45 (3), 302-316 (2003).
- Brill, J. A., Wiegel, J. Differentiation between spore-forming and asporogenic bacteria using a PCR and southern hybridization based method. J Microbiol Methods. 31 (1-2), 29-36 (1997).
- Rueckert, A., Ronimus, R. S., Morgan, H. W. Development of a real-time PCR assay targeting the sporulation gene, spo0A., for the enumeration of thermophilic bacilli in milk powder. Food Microbiol. 23 (3), 220-230 (2006).
- Bueche, M., et al. Quantification of endospore-forming firmicutes by quantitative PCR with the functional gene spo0A. Appl Environ Microbiol. 79 (17), 5302-5312 (2013).
- Wunderlin, T., Junier, T., Roussel-Delif, L., Jeanneret, N., Junier, P. Endospore-enriched sequencing approach reveals unprecedented diversity of Firmicutes in sediments. Environ Microbiol Rep. 6 (6), 631-639 (2014).
- Nicholson, W. L., Law, J. F. Method for purification of bacterial endospores from soils: UV resistance of natural Sonoran desert soil populations of Bacillus spp. with reference to B. subtilis strain 168. J Microbiol Methods. 35 (1), 13-21 (1999).
