Introduction
O objetivo deste trabalho é fornecer um protocolo para a separação de esporos bacterianos, a partir de células bacterianas vegetativas em amostras ambientais. A formação de esporos bacterianos é uma estratégia de sobrevivência, geralmente desencadeado pela inanição, encontrado num número de grupos de bactérias pertencentes ao filo Firmicutes 1. Bactérias formadoras de Endospore são bem estudadas, principalmente porque um número de cepas são agentes patogênicos e, portanto, de importância médica (por exemplo, Bacillus anthracis ou Clostridium difficile). Estirpes ambientais de bactérias formadoras de endospore foram isolados a partir de praticamente qualquer ambiente (solo, água, sedimentos, o ar, gelo, intestino humano, animais intestino, e mais) 1-3. Portanto, Firmicutes são a segunda filo mais abundante em coleções de cultura 4.
Por causa de suas proteínas córtex externo e do núcleo de protecção resistentes, endospores podem sobreviver a condições ambientais extremas que vão from dessecação à alta radiação, temperaturas extremas e produtos químicos prejudiciais 5. Este notável resistência torna-se um desafio para extrair DNA de endósporos 6-8. Isso provavelmente explica por que eles têm sido negligenciados nos estudos de sequenciamento ambiental 9,10. Outros métodos, tais como a concentração de endósporos em amostras ambientais por anticorpos fluorescentes 11, a quantificação de ácido dipicolínico (DPA) no solo e nos sedimentos 13 12, por citometria de fluxo 14 ou a pasteurização e cultivo subsequente 15,16 têm sido usados para obter ou quantificar em endosporos amostras ambientais. Em anos recentes, os métodos de extracção de ADN optimizada, bem como iniciadores moleculares específicos para sequências alvo específicas do gene endospore foram desenvolvidos 10,17-20. Isto tem ajudado a revelar mais biodiversidade entre este grupo de bactérias e 21 também levou a aplicações na indústria e medicina para a detecção de endospores, Por exemplo, em leite em pó 19.
O protocolo aqui apresentado é baseado na diferença em resistência às condições físico-químicas prejudiciais (tais como o calor e detergentes) de endosporos bacterianos relativos a células vegetativas. Para destruir as células vegetativas em uma amostra, consecutivamente aplicar calor, lisozima e baixas concentrações de detergentes. O tempo e a força destes tratamentos foram optimizadas de forma a não destruir os esporos, mas de lisar todas as células vegetativas. Algumas células em uma piscina de células ambiental são mais resistentes do que outros, por isso, a fim de aumentar a probabilidade de destruir todas as células vegetativas, aplicamos três tratamentos diferentes. A novidade e vantagens deste método é que os endosporos após o tratamento ainda estão intactas e podem ser utilizados para outras análises a jusante. Estes incluem a extração de DNA, PCR quantitativo (qPCR) e amplicon ou seqüenciamento metagenomic (visando especificamente o grupo de endospores e, assim, reduzindo diversity, enquanto o aumento da cobertura). Os endosporos também poderia ser utilizada para o cultivo ou a jusante quantificação por microscopia de fluorescência, citometria de fluxo, ou a detecção de DPA. Uma característica importante deste método é que, ao comparar uma amostra não tratada com uma amostra tratada, pode-se deduzir a quantidade e diversidade de endósporos em uma amostra ambiental, além do componente que corresponde a células vegetativas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparação de produtos químicos e equipamentos
- Adicione 500 ml de um 1% de hexametafosfato de sódio (SHMP) (NaPO3) n solução e esterilizar em autoclave.
- Esterilizar de nitrocelulose (NC) (filtros de tamanho de poro de 0,22 um, 47 mm diâmetro) em autoclave de vidro em placas de Petri fechada.
- Esterilizar filtros NC (dimensão do poro de 0,22 um, 25 mm de diâmetro) em autoclave de vidro em placas de Petri fechada.
- Pesar e anotar o peso vazio da estéreis tubos de 50 ml (com tampa em) (um tubo por amostra).
- Prepare de Tris-EDTA-tampão (tampão TE) 1x: preparar uma solução de Tris 10 mM (tris (hidroximetil) aminometano) e tampão de EDTA 1 mM. Ajustar o pH para 8 e esterilizar em autoclave.
- Preparar solução de lisozima (20 mg / ml) por dissolução de 0,02 g de lisozima em 1 ml de tampão TE. Idealmente, fazer fresco o tempo todo. Armazenar a 4 ° C durante não mais de uma semana.
- Preparar solução fisiológica por dissolução de cloreto de sódio 8 g / L(NaCl) em água destilada. Esterilizar em autoclave.
2. Separação de Biomassa de Sedimentos
- Adicionar 3 g de amostra de sedimento para pré-pesado estéril tubos de 50 ml usando colheres de metal inflamado a etanol. Execute isso em um, UV esterilizado gabinete de biossegurança limpo para evitar a contaminação.
- Adicionar 15 ml de uma solução estéril (autoclavada) solução SHMP 1% para a amostra usando uma bureta graduada estéril. O SHMP solução também pode ser filtrada para evitar a contaminação.
- Homogeneizar o sedimento e SHMP solução com um dispersor líquido / homogeneizador (por exemplo, homogeneizador Ultra-Turrax). 70% de etanol em autoclave ou esterilizar o rotor dispersão antes da utilização. Executar a homogeneização durante 1 minuto a 17.500 rpm. Deixe o resto da amostra durante 2 minutos e repetir a homogeneização durante 1 min à mesma velocidade do rotor.
- Deixe a amostra repousar durante 10 min. Neste passo, as partículas mais pesadas (minerais) vai assentar. As células e os componentes orgânicos da amostra no entanto Wdoentes permanecem em solução. Em seguida, transferir a solução sobrenadante (contendo biomassa celular) para um tubo limpo 50 ml, enquanto tomando cuidado para não perturbar o pellet sedimento.
- Para o sedimento sedimentos adicionar novamente 15 ml de uma (autoclavada) solução SHMP 1% estéril usando um estéril bureta graduada. Em seguida, repita os passos 2.3 e 2.4. Esta repetição assegura a separação da quantidade máxima de células e partículas orgânicas do componente mineral do sedimento. O sobrenadante desta segunda separação pode ser mesclado com o sobrenadante da primeira separação.
Nota: Todos os passos seguintes são feitas no sobrenadante (contendo biomassa celular). O componente mineral (sedimento sedimento) pode ser descartado. - Centrifugar a amostra a 20 xg durante 1 min. Esta etapa aumenta o g-força suficiente para resolver partículas minerais pequenas enquanto o material biológico celular ainda permanece em solução. Após centrifugação, transferir a solução sobrenadante (contendo biomassa celular) numlimpo tubo de 50 ml. Descartar o sedimento mineral.
- Determinar o volume final da solução contendo biomassa por pesagem da amostra. A determinação do peso evita a necessidade de transferir a amostra para um cilindro graduado e reduz o risco de contaminação.
3. Cobrança de Biomassa no filtro de membrana
- Prepare unidade de filtração (por 47 mm de diâmetro membranas) e bomba de vácuo. Esterilizar a unidade de filtração quer por autoclavagem ou (se vidro Pyrex) por aspersão com etanol a 70% e em chamas com um bico de Bunsen. Deixe-o esfriar antes de continuar com o protocolo.
- Adicionar membrana NC estéril para a unidade de filtração usando uma pinça esterilizados inflamado a etanol.
- Adicionar metade da amostra de sobrenadante (a partir do passo 2.6) para a unidade de filtração por membrana e recolher as células sobre a membrana usando a bomba de vácuo.
- Quando o líquido tiver totalmente passado através do filtro, parar a bomba de vácuo e cuidadosamente remover a membrana utilizando etanol-chama fórceps esterilizado. Colocar a membrana em uma placa de Petri esterilizada.
- Corte a membrana ao meio com uma tesoura esterilizada inflamado a etanol. Adicionar cada metade da membrana para um tubo separado de 2 ml. Uma metade da membrana vai ser utilizado para a extracção do ADN e análise de toda a comunidade bacteriana. A outra metade do filtro vai ser armazenado a -80 ° C e serve como uma cópia de segurança.
- Coloque nova membrana de NC para a unidade de filtração e recolha de biomassa a partir da segunda metade do volume da amostra (a partir do passo 2.6), utilizando a bomba de vácuo.
- Quando o líquido está totalmente passou através do filtro, parar a bomba de vácuo e retire cuidadosamente a membrana com a pinça esterilizados inflamado a etanol. Coloque toda a membrana, para um tubo separado de 2 ml. Este exemplo vai ser utilizada para o tratamento de separar os esporos a partir de células vegetativas. A amostra pode ser armazenada a -20 ° C até à sua utilização.
4. Lise de células vegetativas
- Execute otratamento para separar endosporos de células vegetativas da biomassa previamente recolhidas numa membrana de NC (passo 3.6).
- Se a membrana foi congelado, deixá-lo à TA durante 10 min para descongelar. Em seguida, coloque a membrana em uma placa de Petri estéril e cortá-la (aproximadamente 4 vezes) em pequenos pedaços com uma tesoura esterilizada inflamado a etanol. Em seguida, coloque todas as peças filtro de membrana em um tubo estéril 2 ml.
- Adicionar 900 ul de 1x TE (Tris-EDTA) tampão (ver 1.5) para o tubo contendo a amostra de membrana e homogeneiza-se por vortex. Neste passo, a biomassa é removida a partir da membrana para a solução de tampão TE.
- Colocar o tubo em uma incubadora a 65 ° C durante 10 min e 80 rpm. Depois retire o tubo da incubadora e deixe-o esfriar por 15 min.
- Adiciona-se 100 ul de lisozima preparada de fresco (ver 1.5) para atingir uma concentração final de 2 mg / ml. Não adicione a lisozima antes de a amostra ter arrefecido até 37 ° C, pois isso poderia degRade a enzima.
- Incubar a amostra a 37 ° C durante 60 min e 80 rpm, as condições óptimas para a lisozima para lisar as células vegetativas.
- Após a lise estar completa, adicionar 250 ul de 3 N de hidróxido de sódio (NaOH) e 250 uL de solução a 6% de sulfato de dodecilo de sódio (SDS) para a amostra. Ao adicionar este, o volume da amostra atinge 1,5 ml e há uma concentração final de NaOH 0,5 N e a concentração final de 1% de SDS.
- Incubar esta mistura à TA durante 60 min e 80 rpm. Adicionando a base e detergentes vai ajudar na lise celular final. A concentração destes detergentes foi otimizado para não prejudicar os endospores, enquanto lisar células vegetativas.
- Prepara-se uma unidade de filtração estéril, que contém as membranas 25 mm de diâmetro por autoclavagem, ou (se vidro Pyrex) pulverizando-o com etanol a 70% e em chamas com um bico de Bunsen. Deixe-o esfriar.
- Coloque uma membrana NC 0,2 m (25 mm de diâmetro) na unidade de filtração usando uma pinça etanol chama-esterilizados. </ li>
- Adicionar a amostra a partir do passo 4.7 sobre a membrana e filtrar o líquido através da bomba de vácuo. Quando o líquido passou por, desligar a bomba de vácuo. Neste passo, o material de célula vegetativa lisadas é removido, uma vez que não é retida na membrana. Apenas endospores permanecerá na membrana.
- Adicionar 2 ml de solução fisiológica estéril para lavar detergentes residuais e filtrar o líquido através da bomba de vácuo.
- Quando o líquido foi totalmente filtrado, desligar a bomba de vácuo. Deixar a membrana da unidade de filtração.
5. O tratamento DNase
Nota: realizar o tratamento com DNase directamente na membrana de filtro. É importante que a unidade de filtração não se escapa e a bomba de vácuo é desligada.
- Adicionar 450 uL de água estéril, 50 ul de tampão de reacção de ADNase (1x) e 0,5 ul de enzima ADNase directamente sobre a membrana de filtro e deixar repousar durante 15 min. Se possível, fazer isso digestão em uma sala que é ligeiramente guerramer que a média RT, uma vez que a enzima funciona melhor a temperaturas de 25 ° C e acima.
Nota: Mantendo o bico de Bunsen de lado da unidade de filtração também aumenta a temperatura e tem o benefício adicional de manter o ambiente estéril, por conseguinte, um risco reduzido de contaminação das amostras. - Quando a digestão de DNase é acabado, em vez da bomba de vácuo para remover o enzima a partir da amostra.
- Lavar enzimática residual por filtragem e adicionando 1 ml de solução fisiológica.
- Se algum líquido tiver passado completamente, desligar a bomba de vácuo e remover a membrana de filtro endosporulante usando uma pinça estéril e colocá-lo em uma placa de Petri estéril.
Nota: A amostra de endospores separados está agora pronto para análise a jusante. Armazenar a -20 ° C quando é usado para a extracção de ADN ou, alternativamente, a 4 ° C quando é usado para a germinação e cultivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Os resultados aqui apresentados foram publicados anteriormente 10,21. Por favor, consulte os artigos para a interpretação ambiental e discussão dos dados.
O processo global está resumida na Figura 1 e corresponde a três passos principais: em primeiro lugar, a separação da biomassa a partir de sedimentos ou qualquer outra matriz ambiental; Em segundo lugar, a destruição de células vegetativas; e em terceiro lugar, a análise a jusante dos endosporos separadas. Análise a jusante poderia consistir, por exemplo, de extracção de ADN e amplicão de sequenciação para determinar a diversidade. A extracção de ADN tem de ser optimizado a garantir lise de endósporos. Em amostras de sedimentos, temos conseguido isso usando um procedimento de extração de DNA sequencial vigorosa 10. A aplicação do método descrito no sedimento demonstra um aumento significativo na fracção de formadores de endósporos Firmicutes após a separação. Em amplicon seqüenciamento do 16S rRNAdo gene, Firmicutes nas amostras não tratadas (toda a comunidade) correspondia apenas aos 8,0 e 19,0% das sequências (Tabela 1). Em contraste, após o tratamento Firmicutes representado 90,6% e 83,9% da amostra enriquecida com endósporos. As duas grandes ordens de formadores de endósporos Firmicutes, Bacilliales e Clostridiales, foram enriquecidos com o método, em contraste com a ausência de ordens, como Lactobacilliales que não são formadoras de endósporos Firmicutes. A fim de demonstrar que o método é particularmente adequado para o enriquecimento dos verdadeiros endosporos, também foram analisados outros grupos capazes de produzir estruturas semelhantes a esporos. Consequentemente, a frequência de Actinobacteria, cianobactérias e Myxococcales diminuíram após o tratamento para lisar as células.
A eficiência do tratamento também foi demonstrada utilizando culturas puras. Uma preparação de esporo (> 95%) de endósporos Paenibacillus alvei, Bacillus subtilis e Bacillus megaterium Escherichia coli, foram tratadas como descrito no protocolo para a lise das células vegetativas. Todas as culturas foram então incubadas em caldo nutriente a 37 ° C e o crescimento foi medida usando a densidade óptica a 600 nm de comprimento de onda. O crescimento foi observado para as culturas endospore enquanto nenhum crescimento foi observado em E. tratada cultura coli, provando que as células vegetativas são irreversivelmente danificadas (Figura 2).
Figura 1. Visão geral do procedimento experimental. Procedimento utilizado para enriquecer bactérias formadoras de endospore em amostras ambientais. O passo de separar as células e os esporos a partir da matriz do meio ambiente pode ser omitido dependendo do tipo de amostra (isto é, amostra de água). Na figura os métodos a jusante aplicada na fracção enriquecida Corre-espororespondem à extração de DNA e seqüenciamento de alta taxa de transferência. Estes passos podem ser substituídos por cultura. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. A verificação do tratamento em culturas puras. As curvas de crescimento verificar o crescimento de bactérias formadoras de endósporos partir de uma suspensão de endósporos de Bacillus subtilis, Bacillus megaterium e Paenibacillus alvei, e uma cultura de células de Escherichia coli tratados com o método para a lise de células. ○ = tratado. Se não for tratada = ●. As barras de erro a partir de três culturas independentes. O crescimento de culturas de controlo e re-crescimento de culturas tratadas foi medida como densidade óptica a 600 nm de comprimento de onda. Este número foi re-impressa from Wunderlin et al. 2014, com permissão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Sedimentos 1 | Sedimentos 2 | |||
| Toda comunidade | enriquecida com endósporos | Toda comunidade | enriquecida com endósporos | |
| Firmicutes | 8 | 90,6 | 19,0 | 83,9 |
| Bacilos | 0,5 | 10,0 | 5,7 | 15.1 |
| Clostridia | 7,4 | 76,9 | 12,5 | 63,2 |
| Actinobacteria | 2.4 | 1.0 | 4.4 | 2.1 |
| As cianobactérias | 1.1 | 0,1 | 0,7 | 0,1 |
| Myxococcales | 0,7 | 0.0 | 0,2 | 0.0 |
| Outras bactérias | 87,8 | 8.3 | 75,7 | 13,9 |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
A resistência de endósporos a factores físico-químicos agressivos externos (por exemplo, temperatura ou detergentes) foi utilizado para conceber um método para separar os esporos bacterianos a partir de células vegetativas em amostras ambientais. Este é o primeiro método global para isolar os esporos a partir de amostras ambientais de uma maneira não destrutiva. Os métodos anteriores para quantificar, detectar e analisar os esporos foram em amostras com base na medição de proxies específicos para endosporos, tais como ácido dipicolínico ou genes marcadores específicos. Em contraste, com o protocolo aqui apresentado, outros do que os endosporos componentes da amostra são removidos e, eventualmente, de modo que os endosporos permanecem como os restos únicos e purificado da amostra. Embora outros métodos, tais como a pasteurização ou centrifugação em gradiente de densidade têm sido propostos para enriquecer para endosporos 22, os nossos ensaios mostraram que a centrifugação com gradiente de densidade não é apropriado como um método geral para amostras ambientais, Devido a diferenças fisiológicas e densidades diferentes de várias espécies de endósporos formadores (dados não mostrados). Em contraste, o nosso protocolo pode ser facilmente aplicado a todos os tipos de amostras ambientais e é adequado para aplicações a jusante, incluindo métodos moleculares ou de cultura.
Existem dois passos críticos no protocolo. A primeira é a separação da biomassa da matriz da amostra (isto é, partículas de sedimento). É essencial que o número de células separadas a partir da matriz ser maximizada, de modo a não negligenciar parte da diversidade. Para amostras de sedimentos, tal como se utiliza aqui, uma das principais limitações do protocolo é o facto de algumas células ou esporos não podem ter sido separado da matriz de sedimentos e, por conseguinte, não incluídos na análise a jusante, o que é uma limitação potencial do método . Dependendo da matriz da amostra (por exemplo, se existem ácidos húmicos), as células podem ser firmemente ligado a ele e, por conseguinte, difíceis de libertar.A utilização de tampão de orto-fosfato, bem como uma boa homogeneização com um homogeneizador ou um misturador são importantes neste passo. Para impulsionar a recuperação, o processo de homogeneização e remoção de biomassa é repetido duas vezes como está escrito no protocolo. O protocolo aqui descrito, foi desenvolvido e optimizado para as amostras de sedimento lago de água doce. Alguns parâmetros podem não ser óptimos para outros tipos de amostras. Uma forma de analisar a fração comunidade que foi potencialmente esquecido no processo seria sujeitar a matriz de sedimentos para a extração do DNA e amplicon seqüenciamento. Como possíveis modificações para a técnica, o passo de separação de biomassa a partir da matriz da amostra pode ser omitido. Particularmente, se a amostra ambiental não contêm materiais orgânicos ou minerais partículas que poderiam interferir com o protocolo a jusante (por exemplo, água, outros líquidos ou culturas puras), pode não ser necessário antes da separação. Para amostras líquidas do protocolo pode iniciar diretamente no capítulo 3(Coleção de biomassa na membrana de filtro).
O segundo passo importante do protocolo é o tratamento com lisozima, calor, NaOH e SDS para destruir células vegetativas. Temperatura, duração, bem como concentração de produtos químicos todos foram otimizados para não prejudicar endospores, enquanto vai destruindo as células. Estes parâmetros devem ser estritamente mantidos como eles estão. O uso de um primeiro passo de aquecimento da amostra a 65 ° C foi muito eficaz para seleccionar especificamente para endosporos em comparação com outros tipos de esporos bacterianos ou estruturas de esporos como ocorrendo entre os filos bacteriana de Actinobacteria, Myxobacteria, cianobactérias, que geralmente não são resistente ao calor. Como pode ser visto na Tabela 1, as bactérias formadoras de esporos não estão ainda presentes após o tratamento (8,3% a 14%). Algumas explicações para isso são que as amostras de sedimentos são altamente complexos e também pode abrigar células não esporos resistentes. Além disso, o material orgânico residual pode permitir que um determinado células ttached para sobreviver ao tratamento. A fim de reduzir ainda mais a percentagem de células não-formadoras de esporos nas amostras tratadas, o método deve ser optimizada com base no tipo de amostra individual.
O método representa uma nova ferramenta para o estudo de alvo endospore formadores em amostras ambientais. O tratamento para destruir as células vegetativas podem ser testados em culturas puras de células e endosporos e adaptado para se adequar a resistência individual de células. A destruição das células pode ser observado nas curvas de culturas tratadas mostrados na Figura 2. O atraso no crescimento das culturas tratadas pode ser devido ao tempo que endosporos precisa de voltar a germinar e passar para a fase de crescimento exponencial. Outras explicações possíveis para este atraso pode ser também um enfraquecimento da cultura o número de células ou esporos inferiores após o tratamento. Se os endosporos separados não são usados para a extracção do ADN, o último passo de tratamento de DNase pode ser omitido.
nt "> As aplicações futuras desta técnica poderia ser considerado em indústrias onde endospores patogênicos precisam ser detectado. Um exemplo é na indústria de alimentos e investigação clínica, onde a detecção e análise (para identificação) de endospores, e sua diferenciação de células vegetativas (por exemplo, a partir de produtos de alimentos, tais como leite ou produtos à base de leite) é vital. Isto pode ser particularmente relevante considerando que muitos procedimentos padrão considerar a extracção directa de ADN a partir de uma amostra utilizando enzimas líticas, que não se encontram adaptados para lisar endosporos, a qual será assim ser negligenciado. Com o método aqui apresentado, as células podem ser removidas e análise subsequente irá fornecer respostas para a presença ou ausência de endosporos, em oposição às células. Outras aplicações incluem a análise de comunidades endospore em diferentes amostras ambientais (por exemplo de gelo ou de sedimentos núcleos ), que são arquivos históricos das condições ambientais. Em muitos ambientes com environmen relativamente estávelTal (condições de superfície do sedimento exemplo lago) Firmicutes pode prosperar sob a forma de células vegetativas de formação de esporos. Quando as condições se deterioram (por exemplo, esgotamento de nutrientes durante o soterramento de sedimentos ou a orientação para condições anaeróbicas) as células se movem em endospore estado. Portanto, as comunidades endospore recuperados a partir de núcleos de sedimentos pode refletir as condições ambientais no momento do enterro e, assim, ser utilizada como um indicador paleoecological das condições prévias para o enterro. No entanto, ainda estamos a reunir informação para apoiar esta reivindicação.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores agradecem o Swiss National Science Foundation para Grant No. 31003A-132358/1, 31003A_152972 e nº 151948, e Fundação Pierre Mercier pour la Science.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Whatman nitrocellulose membrane filters, 0.2 μm pore size, 47 mm diameter | Sigma-Aldrich | WHA7182004 Aldrich | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859 Sigma-Aldrich | CAS 77-86-1 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 Sigma-Aldrich | CAS 60-00-4 |
| Lysozyme from chicken egg white | Sigma-Aldrich | 62971 Fluka | powder, CAS 12650-88-3 |
| Ultra-Turrax homogenizer T18 basic | IKA | 3720000 | |
| Glass filter holders for 47 mm membranes, Pyrex glass | EMD Millipore | XX10 047 00 | |
| Chemical duty vacuum pump | Millipore | WP6122050 | 220 V/50 Hz |
| Manifold sampling filtration for 25 mm membranes | Millipore | 1225 Sampling Manifold | polypropylene |
| Dnase | New England Biolabs | M0303S | Rnase free |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 Sigma-Aldrich | CAS 1310-73-2 |
| Sodium dodecyl sulfphate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 Sigma | |
| Whatman nitrocellulose membrane filters, 0.2 μm pore size, 25 mm diameter | Sigma-Aldrich | WHA7182002 Aldrich |
References
- Nicholson, W. L. Roles of Bacillus endospores in the environment. Cell Mol Life Sci. 59 (3), 410-416 (2002).
- Lester, E. D., Satomi, M., Ponce, A. Microflora of extreme arid Atacama Desert soils. Soil Biol Biochem. 39 (2), 704-708 (2007).
- Wilson, M. S., Siering, P. L., White, C. L., Hauser, M. E., Bartles, A. N. Novel archaea and bacteria dominate stable microbial communities in North America's Largest Hot Spring. Microb Ecol. 56 (2), 292-305 (2008).
- Hugenholtz, P. Exploring prokaryotic diversity in the genomic era. Genome Biol. 3 (2), (2002).
- Onyenwoke, R. U., Brill, J. A., Farahi, K., Wiegel, J. Sporulation genes in members of the low G+C Gram-type-positive phylogenetic branch (Firmicutes). Arch Microbiol. 182 (2-3), 182-192 (2004).
- Delmont, T. O., et al. Accessing the soil metagenome for studies of microbial diversity. Appl Environ Microbiol. 77 (4), 1315-1324 (2011).
- Ricca, E., Henriques, A. O., Cutting, S. M. Bacterial spore formers: probiotics and emerging applications. , Horizon Bioscience. (2004).
- Kuske, C. R., et al. Small-Scale DNA Sample Preparation Method for Field PCR Detection of Microbial Cells and Spores in Soil. Appl Environ Microbiol. 64 (7), 2463-2472 (1998).
- von Mering, C., et al. Quantitative phylogenetic assessment of microbial communities in diverse environments. Science. 315 (8515), 1126-1130 (2007).
- Wunderlin, T., Junier, T., Roussel-Delif, L., Jeanneret, N., Junier, P. Stage 0 sporulation gene A as a molecular marker to study diversity of endospore-forming Firmicutes. Environ Microbiol Rep. 5 (6), 911-924 (2013).
- Siala, A., Hill, I. R., Gray, T. R. G. Populations of spore-forming bacteria in an acid forest soil, with special reference to Bacillus subtilis. J General Microbiol. 81 (1), 183-190 (1974).
- Brandes Ammann, A., Kolle, L., Brandl, H. Detection of bacterial endospores in soil by terbium fluorescence. Int J Microbiol. , 435281 (2011).
- Fichtel, J., Koster, J., Rullkotter, J., Saas, H. High variations in endospore numbers within tidal flat sediments revealed by quantification of dipicolinic acid. Geomicrobiol J. 25 (7-8), (2008).
- Cronin, U. P., Wilkinson, M. G. The potential of flow cytometry in the study of Bacillus cereus. J Appl Microbiol. 108 (1), 1-16 (2010).
- de Rezende, J. R., et al. Dispersal of thermophilic Desulfotomaculum endospores into Baltic Sea sediments over thousands of years. ISME J. 7 (1), 72-84 (2013).
- Hubert, C., et al. Thermophilic anaerobes in Arctic marine sediments induced to mineralize complex organic matter at high temperature. Environ Microbiol. 12 (4), 1089-1104 (2010).
- Garbeva, P., van Veen, J. A., van Elsas, J. D. Predominant Bacillus spp. in agricultural soil under different management regimes detected via PCR-DGGE. Microb Ecol. 45 (3), 302-316 (2003).
- Brill, J. A., Wiegel, J. Differentiation between spore-forming and asporogenic bacteria using a PCR and southern hybridization based method. J Microbiol Methods. 31 (1-2), 29-36 (1997).
- Rueckert, A., Ronimus, R. S., Morgan, H. W. Development of a real-time PCR assay targeting the sporulation gene, spo0A., for the enumeration of thermophilic bacilli in milk powder. Food Microbiol. 23 (3), 220-230 (2006).
- Bueche, M., et al. Quantification of endospore-forming firmicutes by quantitative PCR with the functional gene spo0A. Appl Environ Microbiol. 79 (17), 5302-5312 (2013).
- Wunderlin, T., Junier, T., Roussel-Delif, L., Jeanneret, N., Junier, P. Endospore-enriched sequencing approach reveals unprecedented diversity of Firmicutes in sediments. Environ Microbiol Rep. 6 (6), 631-639 (2014).
- Nicholson, W. L., Law, J. F. Method for purification of bacterial endospores from soils: UV resistance of natural Sonoran desert soil populations of Bacillus spp. with reference to B. subtilis strain 168. J Microbiol Methods. 35 (1), 13-21 (1999).
