Introduction
Målet med dette arbejde er at give en protokol til adskillelse af bakterielle endosporer fra vegetative bakterieceller i miljøprøver. Dannelsen af bakterielle endosporer er en overlevelsesstrategi, som regel udløst af sult, findes i en række af bakterielle grupper, der tilhører phylum Firmicutes 1. Endospore-dannende bakterier er godt undersøgt, hovedsagelig fordi en række stammer er patogener og dermed medicinsk betydning (f.eks Bacillus anthracis eller Clostridium difficile). Miljømæssige stammer af endospore-dannende bakterier er blevet isoleret fra stort set alle miljø (jord, vand, sediment, luft, is, menneskelige tarm, dyr tarmen, og mere) 1-3. Derfor Firmicutes er den anden mest forekommende phylum i kultursamlinger 4.
På grund af deres hårdføre ydre cortex og beskyttende kerneproteiner, kan endosporer overleve ekstreme miljøforhold spænder frabout udtørring til høj stråling, ekstreme temperaturer og skadelige kemikalier 5. Dette fremragende bestandighed gør det til en udfordring at ekstrahere DNA fra endosporer 6-8. Dette sandsynligvis forklarer, hvorfor de er blevet overset i miljømæssig sekventering studier 9,10. Andre metoder, såsom målretning af endosporer i miljøprøver af fluorescerende antistoffer 11, kvantificering af dipicolinsyre (DPA) i jord 12 og sediment 13, flowcytometri 14 eller pasteurisering og efterfølgende dyrkning 15,16 er blevet anvendt til at hente eller kvantificere endosporer i miljøprøver. I de seneste år har optimeret DNA ekstraktionsmetoder samt specifikke molekylære primere målrette endospore-specifikke gensekvenser er blevet udviklet 10,17-20. Dette har været med til at afsløre mere biodiversitet blandt denne gruppe af bakterier 21, og har også ført til applikationer i erhvervsliv og medicin til påvisning af endosporerFor eksempel i mælkepulver 19.
Protokollen præsenteres her er baseret på forskellen i modstand mod skadelige fysisk-kemiske forhold (såsom varme og detergenter) af bakterielle endosporer forhold til vegetative celler. At ødelægge vegetative celler i en prøve, vi fortløbende anvende varme, lysozym og lave koncentrationer af detergenter. Den tid og styrken af disse behandlinger er blevet optimeret for ikke at ødelægge sporer, men at lysere alle vegetative celler. Nogle celler i en miljømæssig celle pool er mere modstandsdygtige end andre, så med henblik på at øge sandsynligheden for at destruere alle vegetative celler, anvender vi tre forskellige behandlinger. Fordelen og nyhedsværdi ved denne metode er, at de endosporer efter behandlingen er stadig intakt og kan anvendes til yderligere efterfølgende analyser. Disse omfatter dna-ekstraktion, kvantitativ PCR (qPCR) og amplikon eller metagenomisk sekventering (rettet specifikt gruppen af endosporer og dermed reducere dANGE, og samtidig øge dækningen). De endosporer kan også anvendes til nedstrøms dyrkning eller kvantificering ved fluorescensmikroskopi, flow-cytometri eller påvisning af DPA. Et vigtigt træk ved denne fremgangsmåde er, ved at sammenligne en ubehandlet prøve med en behandlede prøve, kan man udlede mængden og mangfoldigheden af endosporer i en miljøprøve foruden komponenten svarende til vegetative celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af kemikalier og udstyr
- Lav 500 ml af en 1% natriumhexametaphosphat (SHMP) (NaPO 3) n-opløsning og steriliseres ved autoklavering.
- Sterilisere nitrocellulose (NC) filtre (porestørrelse 0,22 um, diameter 47 mm) ved autoklavering i lukkede glas petriskåle.
- Sterilisere NC-filtre (porestørrelse 0,22 pm, diameter 25 mm) ved autoklavering i lukket glaspetriskåle.
- Vejes, og bemærk den tomme vægt af sterile 50 ml rør (med hætten på) (et rør per prøve).
- Forbered Tris-EDTA-puffer (TE-buffer) 1x: gør opløsning af 10 mM Tris (tris (hydroxymethyl) aminomethan) og 1 mM EDTA-buffer. Juster pH til 8 og der steriliseres ved autoklavering.
- Forbered lysozymopløsning (20 mg / ml) ved at opløse 0,02 g af lysozym i 1 ml TE-buffer. Ideelt set lave frisk hver gang. Opbevar ved 4 ° C i ikke mere end 1 uge.
- Forbered fysiologisk opløsning ved at opløse 8 g / l natriumchlorid(NaCl) i destilleret vand. Der steriliseres i autoklave.
2. Adskillelse af biomasse fra Sediment
- Tilføj 3 g sediment prøve at pre-vejet steril 50 ml rør ved hjælp af ethanol-flammet metal scoops. Udfør denne i en ren, UV steriliseret biosikkerhed kabinet for at undgå forurening.
- Der tilsættes 15 ml af en 1% sterilt (autoklaveret) SHMP løsning på prøven under anvendelse af en steril burette. Den SHMP løsningen kan også filtreres for at undgå forurening.
- Homogeniseres sedimentet og SHMP opløsning med en flydende dispergeringsapparat / homogenisator (fx Ultra-Turrax homogenisator). 70% ethanol-sterilisere eller autoklavere dispersionen rotor før brug. Kør homogenisering i 1 minut ved 17.500 rpm. Lad prøven hvile i 2 minutter og gentag homogenisering i 1 minut ved samme rotorhastighed.
- Lad prøven henstå i 10 minutter. På dette trin, vil de tungeste partikler (mineraler) nøjes. Cellerne og eventuelle organiske bestanddele af prøven dog wsyge forbliver i opløsning. Bagefter overføre supernatantopløsning (indeholdende celle biomasse) i et rent 50 ml rør, samtidig sørge for ikke at forstyrre sedimentet pillen.
- Til sedimentet pellet tilsættes igen 15 ml af en 1% sterilt (autoklaveret) SHMP opløsning under anvendelse af en steril burette. Derefter skal du gentage trin 2.3 og 2.4. Denne gentagelse sikrer adskillelsen af den maksimale mængde af celler og organiske partikler fra den mineralske del af sedimentet. Supernatanten af denne anden adskillelse kan sammenlægges med supernatanten fra den første adskillelse.
Bemærk: Følgende trin er alle udført på supernatanten (indeholdende celle biomasse). Mineralet komponent (sediment pellet) kan kasseres. - Centrifuger prøven ved 20 x g i 1 min. Dette trin øger g-force nok til at løse små mineralpartikler, mens den biologiske cellemateriale forbliver i opløsning. Efter centrifugering overføres supernatanten (indeholdende cellebiomasse) i enren 50 ml rør. Kassér mineral pellet.
- Bestemme den endelige volumen af opløsningen indeholdende biomasse ved vejning af prøven. Vægtbestemmelsen undgår at skulle overføre prøven til et måleglas og reducerer risikoen for forurening.
3. Indsamling af biomasse på filtermembranen
- Forbered filtreringsenhed (for 47 mm membraner diameter) og vakuumpumpe. Steriliser filtreringsenheden enten ved autoklavering eller (Pyrex glas) ved at sprøjte den med 70% ethanol og flammende det med en bunsenbrænder. Lad den køle af, inden du fortsætter med protokollen.
- Tilføj sterilt NC membranen til filtreringsenheden under anvendelse af ethanol-brændt steriliserede pincetter.
- Tilsæt halvdelen af supernatanten prøve (fra trin 2.6) på membranfiltreringsenheden og indsamle cellerne på membranen ved hjælp af vakuumpumpen.
- Når væsken er helt passeret gennem filteret, stoppe vakuumpumpen og fjern forsigtigt membranen ved hjælp af ethanol-flamme steriliseret pincet. Anbring membranen i en steril petriskål.
- Skær membranen i halve ved hjælp ethanol-flammet steriliserede saks. Tilføj hver halvdel af membranen til en separat 2 ml rør. Den ene halvdel af membranen vil blive anvendt til DNA-ekstraktion og analyse af hele bakterielle samfund. Den anden halvdel af filteret opbevares ved -80 ° C og tjener som backup.
- Placer nye NC-membran på filtreringsenheden og indsamle biomasse fra anden halvdel af prøvevolumen (fra trin 2.6) ved hjælp af vakuumpumpen.
- Når væsken er helt passeret gennem filteret, stoppe vakuumpumpen og fjern forsigtigt membranen ved hjælp af ethanol-flammet steriliserede pincet. Placere hele membranen i en separat 2 ml rør. Denne prøve vil blive anvendt til behandling for at adskille endosporer fra vegetative celler. Prøven kan opbevares ved -20 ° C indtil anvendelse.
4. Lyse af vegetative celler
- Udførbehandling for at adskille endosporer fra vegetative celler på biomassen tidligere indsamlet på en NC-membran (trin 3.6).
- Hvis membranen var frosset, lade det blive ved stuetemperatur i 10 minutter at tø. Derefter placere membranen i en steril petriskål og klippe det (ca. 4 gange) i mindre stykker ved hjælp af ethanol-flammet steriliserede saks. Derefter placere alle membran filter brikker i en steril 2 ml rør.
- Tilføj 900 pi 1x TE (Tris-EDTA) buffer (se 1.5) til røret indeholdende prøven membranen og blandes omhyggeligt ved vortex. På dette trin, er biomassen fjernes fra membranen ind i TE-bufferopløsning.
- Glasset anbringes i en inkubator ved 65 ° C i 10 minutter og 80 rpm. Bagefter fjerne røret fra inkubatoren, og lad den køle af i 15 minutter.
- Tilføj 100 ul frisklavet lysozym (se 1.5) for at nå frem til en endelig koncentration på 2 mg / ml. Du må ikke tilføje lysozym før prøven er kølet ned til 37 ° C, da dette kunne degrade enzymet.
- Prøven inkuberes ved 37 ° C i 60 minutter og 80 rpm, de optimale betingelser for lysozym for at lysere vegetative celler.
- Efter lysis er færdig, tilsættes 250 pi 3 N natriumhydroxid (NaOH) og 250 pi 6% natriumdodecylsulfat (SDS) opløsning til prøven. Ved at tilføje denne, prøvevolumenet når 1,5 ml, og der er en slutkoncentration på 0,5 N NaOH og endelig koncentration på 1% SDS.
- Inkuber denne blanding ved stuetemperatur i 60 minutter og 80 rpm. Tilføjelse af base og rengøringsmidler vil hjælpe i den endelige cellelyse. Koncentrationen af disse midler er blevet optimeret for ikke skade endosporer, mens lysere vegetative celler.
- Forbered en steril filtrering enhed, der holder membraner diameter 25 mm ved autoklavering eller (hvis Pyrex glas) sprøjtning det med 70% ethanol og flammende det med en bunsenbrænder. Lad det køle af.
- Placer en 0,2 um NC-membran (diameter 25 mm) på filtrering enhed ved hjælp af ethanol-flamme steriliserede pincet. </ li>
- Tilføj prøven fra trin 4.7 på membranen og filtrere væsken ved hjælp af vakuumpumpen. Når væsken har passeret, skal du slukke vakuumpumpe. På dette trin, er den lyserede vegetativt cellemateriale fjernes, da det ikke er fastholdt på membranen. Kun endosporer vil forblive på membranen.
- Tilsæt 2 ml steril fysiologisk opløsning til at vaske resterende detergenter og filtreres væsken ved hjælp af vakuumpumpen.
- Når væsken har fuldt filtreret, slukke for vakuumpumpen. Lad membran på filtreringsenheden.
5. DNase-behandling
Bemærk: Udfør DNase-behandling direkte på filtermembranen. Det er vigtigt, at filtreringsenheden ikke lække og vakuumpumpen slukkes.
- Tilsættes 450 pi sterilt vand, 50 pi DNase reaktionsbuffer (1x) og 0,5 pi DNase enzym direkte på filtermembranen og lad det stå i 15 minutter. Hvis det er muligt, gør dette fordøjelse i et rum, der er lidt krigmer end gennemsnittet RT, idet enzymet virker bedre ved temperaturer på 25 ° C og derover.
Bemærk: Hold bunsenbrænder til side filtreringsenheden øger også temperaturen og har den ekstra fordel af at holde omgivelserne sterilt, derfor reduceret risiko for forurening af prøverne. - Når DNase fordøjelsen er færdig, tænde vakuumpumpen for at fjerne enzymet fra prøven.
- Vask resterende enzym ved at tilføje og filtrere 1 ml fysiologisk opløsning.
- Hvis fuldt har bestået væske, skal du slukke vakuumpumpe og fjern filtermembranen indeholder endosporer hjælp steril pincet og læg det i en steril petriskål.
Bemærk: Prøven af adskilte endosporer er nu klar til nedstrøms analyse. Opbevares ved -20 ° C, hvis de anvendes til DNA-ekstraktion eller alternativt ved 4 ° C, hvis de anvendes til spiring og dyrkning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultaterne præsenteres her er blevet offentliggjort tidligere 10,21. Der henvises til disse artikler for miljømæssig fortolkning og diskussion af data.
Den samlede procedure er opsummeret i figur 1 og svarer til tre hovedtrin: første, adskillelse af biomasse fra sediment eller andre miljøvenlige matrix; andet, ødelæggelse af vegetative celler; og for det tredje nedstrøms analyse af de separerede endosporer. Downstream analyse kunne bestå, for eksempel på DNA-ekstraktion og amplikon sekventering til at bestemme mangfoldighed. DNA-ekstraktion skal optimeres for at sikre lysis af endosporer. I sedimentprøver, har vi opnået dette ved hjælp af en kraftig sekventiel DNA-ekstraktion procedure 10. Anvendelsen af fremgangsmåden i sediment viser en signifikant stigning i den del af endospore-dannende Firmicutes efter separation. I amplicon sekventering af 16S rRNA igen, Firmicutes i de ubehandlede prøver (hele samfundet) svarede kun til 8,0 og 19,0% af sekvenserne (tabel 1). I modsætning hertil efter behandlingen Firmicutes udgjorde 90,6% og 83,9% af endospore-beriget prøve. De to store ordrer endospore-dannende Firmicutes, Bacilliales og Clostridiales, blev beriget med den metode, i modsætning til fraværet af ordrer som Lactobacilliales der er ikke endospore-dannende Firmicutes. For at demonstrere, at fremgangsmåden er særligt egnet til berigelse af sande endosporer, blev andre grupper, der kan producere spore-lignende strukturer også analyseret. Følgelig hyppigheden af aktinobakterier, cyanobakterier og Myxococcales faldt efter behandlingen for at lysere cellerne.
Effektiviteten af behandlingen blev også demonstreret under anvendelse af rene kulturer. En endospore præparat (> 95%) endosporer af Paenibacillus alvei, Bacillus subtilis og Bacillus megaterium Escherichia coli, blev behandlet som beskrevet i protokollen til lyse af vegetative celler. Alle kulturer blev derefter inkuberet i næringsmedium ved 37 ° C og væksten blev målt ved anvendelse af optisk densitet ved 600 nm bølgelængde. Vækst blev observeret for de endospore kulturer, mens ingen vækst blev observeret i den behandlede E. coli-kultur, der beviser, at vegetative celler irreversibelt beskadiget (figur 2).
Figur 1. Oversigt over den eksperimentelle procedure. Procedure brugt til at berige endospore-dannende bakterier i miljøprøver. Trinnet til separering af celler og endosporer fra et miljømæssigt matrix kan udelades afhængig af typen af prøve (dvs. prøve). I figuren anvendes de efterfølgende metoder på sporen fraktion korrespond til DNA-ekstraktion og high throughput sekventering. Disse trin kan erstattes af dyrkning. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Kontrol af behandling på rene kulturer. Vækstkurver verificerer væksten af endospore-dannende bakterier fra en suspension af endosporer af Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, og Paenibacillus alvei og en cellekultur af Escherichia coli behandlet med metoden for lysis af celler. Behandlet = ○. Ubehandlet = ●. Fejlsøjler fra tre uafhængige kulturer. Vækst af kontrolkulturer og genvækst af behandlede kulturer blev målt som optisk densitet ved 600 nm bølgelængde. Dette tal er blevet re-trykt from Wunderlin et al. 2014 med tilladelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Sediment 1 | Sediment 2 | |||
| hele samfundet | endospore-beriget | hele samfundet | endospore-beriget | |
| Firmicutes | 8,0 | 90,6 | 19,0 | 83,9 |
| Baciller | 0,5 | 10,0 | 5.7 | 15.1 |
| Clostridia | 7.4 | 76,9 | 12.5 | 63.2 |
| Aktinobakterier | 2.4 | 1,0 | 4.4 | 2.1 |
| Cyanobakterier | 1.1 | 0.1 | 0,7 | 0.1 |
| Myxococcales | 0,7 | 0,0 | 0,2 | 0,0 |
| Andre bakterier | 87.8 | 8.3 | 75,7 | 13.9 |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Modstanden i endosporer til eksterne aggressive fysisk-kemiske faktorer (f.eks, temperatur eller detergenter) blev anvendt til at udvikle en metode til at adskille bakterielle endosporer fra vegetative celler i miljøprøver. Dette er den første omfattende metode til at isolere endosporer fra miljøprøver i en ikke-destruktiv måde. Tidligere metoder til at kvantificere, opdage eller analyserer endosporer i prøverne var baseret på målingen af specifikke fuldmagter til endosporer såsom dipicolinsyre eller specifikke markørgener. I modsætning hertil med protokollen præsenteres her, bortset endosporer prøvekomponenterne fjernes og så endosporer sidst forblive som de eneste og oprensede rester af prøven. Selv om der er foreslået andre metoder såsom pasteurisering eller densitetsgradientcentrifugering til berigelse for endosporer 22, vores tests viste, at densitetsgradientcentrifugering er ikke hensigtsmæssigt, da en generel metode til miljøprøverPå grund af fysiologiske forskelle og forskellige densiteter af forskellige arter af endospore-dannere (data ikke vist). Derimod kan vores protokol nemt anvendes på alle typer af miljøprøver og er velegnet til downstream-applikationer, herunder molekylære metoder eller dyrkning.
Der er to vigtige trin i protokollen. Den første er adskillelsen af biomasse fra prøve-matrix (dvs. partikler sediment). Det er vigtigt, at antallet af celler adskilt fra matrixen maksimeres, for ikke at overse en del af mangfoldighed. For sedimentprøver, som anvendt her, en af de vigtigste begrænsninger i protokollen er, at nogle celler eller sporer muligvis ikke er blevet løsrevet fra sedimentet matrix og derfor ikke medtaget i den nedstrøms analyse, som er en potentiel begrænsning af fremgangsmåden . Afhængigt af prøven matrix (for eksempel hvis der er humussyrer), celler kan tæt bundet til den, og derfor vanskeligt at frigøre.Anvendelsen af ortho-phosphatpuffer samt god homogenisering med en homogenisator eller blender er vigtige på dette trin. For at sætte skub i inddrivelsen, er proceduren for homogenisering og fjernelse af biomasse gentaget to gange som skrevet i protokollen. Den her beskrevne protokol er blevet udviklet og optimeret til prøver af ferskvandssø sediment. Nogle parametre kan ikke være optimalt for andre typer prøver. En måde at analysere samfundet fraktion, der blev potentielt overset i processen ville være at underkaste sedimentet matrix til DNA-ekstraktion og amplikon sekventering. Som mulige modifikationer af teknikken, kan trinnet med separering af biomasse fra prøve-matrix udelades. Især hvis den miljømæssige prøven ikke indeholder organisk materiale eller mineralske partikler, der kan forstyrre den nedstrøms protokol (f.eks vand, andre væsker eller renkulturer), kan forudgående separation ikke være nødvendig. For flydende prøver protokollen kan starte direkte på kapitel 3(Indsamling af biomasse på filter membran).
Det andet vigtige skridt i protokollen er behandling med lysozym, varme, NaOH og SDS til at ødelægge vegetative celler. Temperatur, varighed samt koncentrationen af kemikalier er alle blevet optimeret for ikke at skade endosporer, samtidig med at ødelægge cellerne. Disse parametre bør derfor strengt holdes som de er. Anvendelsen af et første trin med opvarmning af prøven ved 65 ° C var meget effektiv til at specifikt selektere for endosporer i forhold til andre typer af bakterielle sporer eller spore-lignende strukturer, der forekommer blandt de bakterielle phyla af aktinobakterier, myxobakterier, cyanobakterier, der almindeligvis ikke varmebestandigt. Som det ses i tabel 1, ikke-sporedannende bakterier stadig er til stede efter behandlingen (8,3% til 14%). Nogle forklaringer på dette er, at sedimentprøver er meget komplekse, og kan også havnen resistente ikke-Spore celler. Derudover kan rester organisk materiale tillader sikker på en ttached celler at overleve behandlingen. For yderligere at reducere andelen af ikke-sporedannende celler i de behandlede prøver, bør fremgangsmåden optimeres baseret på individuel prøvetype.
Fremgangsmåden repræsenterer en ny redskab til målrettet undersøgelse af endospore-dannere i miljøprøver. Behandlingen for at ødelægge vegetative celler kan afprøves i rene kulturer af celler og endosporer og tilpasses individuelle modstand i cellerne. Ødelæggelsen af celler kan ses i kurverne i behandlede kulturer vist i figur 2. Den forsinkede væksten af behandlede kulturer kan skyldes den tid, endosporer brug for at re-spire og flytte ind den eksponentielle vækstfase. Andre mulige forklaringer på denne forsinkelse kunne også være en svækkelse af endospore kultur eller lavere celletal efter behandlingen. Hvis de adskilte endosporer ikke anvendes til DNA-ekstraktion, kan det sidste trin af DNase behandling udelades.
nt "> Fremtidige anvendelser af denne teknik kunne overvejes i industrier, hvor patogene endosporer har behov for at blive opdaget. Et eksempel er i fødevareindustrien og klinisk forskning, hvor påvisning og analyse (til identifikation) af endosporer og dens differentiering fra vegetative celler (for eksempel fra fødevarer produkter såsom mælk eller mælkebaserede produkter) er afgørende. Dette kan være særligt relevant i betragtning af at mange standardprocedurer overveje direkte DNA-ekstraktion fra en prøve ved hjælp af lytiske enzymer, der ikke er tilpasset til at lysere endosporer, hvilket vil således blive overset. Med den metode, der præsenteres her, celler kan fjernes og efterfølgende analyse vil give svar på tilstedeværelsen eller fraværet af endosporer i modsætning til celler. Andre anvendelsesområder omfatter analyse af endospore samfund i forskellige miljøprøver (f.eks is eller sedimentkerner ), der er historiske arkiver for miljøforhold. I mange miljøer med relativt stabile millæggende betingelser (f.eks søbunden overflade) endospore-dannende Firmicutes kan trives i form af vegetative celler. Når forholdene forværres (for eksempel ved næringsstof udtynding under sediment begravelse eller omstilling til anaerobe forhold) cellerne flytte ind endospore tilstand. Derfor kan de hentede endospore samfund fra sedimentkerner afspejle de miljømæssige forhold på tidspunktet for begravelse og således anvendes som en paleoecological indikator for de betingelser, før begravelse. Men vi stadig at indsamle oplysninger til støtte for denne påstand.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender den schweiziske National Science Foundation for Grant nr 31003A-132358/1, 31003A_152972 og nr 151948, og Fundation Pierre Mercier pour la Science.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Whatman nitrocellulose membrane filters, 0.2 μm pore size, 47 mm diameter | Sigma-Aldrich | WHA7182004 Aldrich | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859 Sigma-Aldrich | CAS 77-86-1 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 Sigma-Aldrich | CAS 60-00-4 |
| Lysozyme from chicken egg white | Sigma-Aldrich | 62971 Fluka | powder, CAS 12650-88-3 |
| Ultra-Turrax homogenizer T18 basic | IKA | 3720000 | |
| Glass filter holders for 47 mm membranes, Pyrex glass | EMD Millipore | XX10 047 00 | |
| Chemical duty vacuum pump | Millipore | WP6122050 | 220 V/50 Hz |
| Manifold sampling filtration for 25 mm membranes | Millipore | 1225 Sampling Manifold | polypropylene |
| Dnase | New England Biolabs | M0303S | Rnase free |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 Sigma-Aldrich | CAS 1310-73-2 |
| Sodium dodecyl sulfphate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 Sigma | |
| Whatman nitrocellulose membrane filters, 0.2 μm pore size, 25 mm diameter | Sigma-Aldrich | WHA7182002 Aldrich |
References
- Nicholson, W. L. Roles of Bacillus endospores in the environment. Cell Mol Life Sci. 59 (3), 410-416 (2002).
- Lester, E. D., Satomi, M., Ponce, A. Microflora of extreme arid Atacama Desert soils. Soil Biol Biochem. 39 (2), 704-708 (2007).
- Wilson, M. S., Siering, P. L., White, C. L., Hauser, M. E., Bartles, A. N. Novel archaea and bacteria dominate stable microbial communities in North America's Largest Hot Spring. Microb Ecol. 56 (2), 292-305 (2008).
- Hugenholtz, P. Exploring prokaryotic diversity in the genomic era. Genome Biol. 3 (2), (2002).
- Onyenwoke, R. U., Brill, J. A., Farahi, K., Wiegel, J. Sporulation genes in members of the low G+C Gram-type-positive phylogenetic branch (Firmicutes). Arch Microbiol. 182 (2-3), 182-192 (2004).
- Delmont, T. O., et al. Accessing the soil metagenome for studies of microbial diversity. Appl Environ Microbiol. 77 (4), 1315-1324 (2011).
- Ricca, E., Henriques, A. O., Cutting, S. M. Bacterial spore formers: probiotics and emerging applications. , Horizon Bioscience. (2004).
- Kuske, C. R., et al. Small-Scale DNA Sample Preparation Method for Field PCR Detection of Microbial Cells and Spores in Soil. Appl Environ Microbiol. 64 (7), 2463-2472 (1998).
- von Mering, C., et al. Quantitative phylogenetic assessment of microbial communities in diverse environments. Science. 315 (8515), 1126-1130 (2007).
- Wunderlin, T., Junier, T., Roussel-Delif, L., Jeanneret, N., Junier, P. Stage 0 sporulation gene A as a molecular marker to study diversity of endospore-forming Firmicutes. Environ Microbiol Rep. 5 (6), 911-924 (2013).
- Siala, A., Hill, I. R., Gray, T. R. G. Populations of spore-forming bacteria in an acid forest soil, with special reference to Bacillus subtilis. J General Microbiol. 81 (1), 183-190 (1974).
- Brandes Ammann, A., Kolle, L., Brandl, H. Detection of bacterial endospores in soil by terbium fluorescence. Int J Microbiol. , 435281 (2011).
- Fichtel, J., Koster, J., Rullkotter, J., Saas, H. High variations in endospore numbers within tidal flat sediments revealed by quantification of dipicolinic acid. Geomicrobiol J. 25 (7-8), (2008).
- Cronin, U. P., Wilkinson, M. G. The potential of flow cytometry in the study of Bacillus cereus. J Appl Microbiol. 108 (1), 1-16 (2010).
- de Rezende, J. R., et al. Dispersal of thermophilic Desulfotomaculum endospores into Baltic Sea sediments over thousands of years. ISME J. 7 (1), 72-84 (2013).
- Hubert, C., et al. Thermophilic anaerobes in Arctic marine sediments induced to mineralize complex organic matter at high temperature. Environ Microbiol. 12 (4), 1089-1104 (2010).
- Garbeva, P., van Veen, J. A., van Elsas, J. D. Predominant Bacillus spp. in agricultural soil under different management regimes detected via PCR-DGGE. Microb Ecol. 45 (3), 302-316 (2003).
- Brill, J. A., Wiegel, J. Differentiation between spore-forming and asporogenic bacteria using a PCR and southern hybridization based method. J Microbiol Methods. 31 (1-2), 29-36 (1997).
- Rueckert, A., Ronimus, R. S., Morgan, H. W. Development of a real-time PCR assay targeting the sporulation gene, spo0A., for the enumeration of thermophilic bacilli in milk powder. Food Microbiol. 23 (3), 220-230 (2006).
- Bueche, M., et al. Quantification of endospore-forming firmicutes by quantitative PCR with the functional gene spo0A. Appl Environ Microbiol. 79 (17), 5302-5312 (2013).
- Wunderlin, T., Junier, T., Roussel-Delif, L., Jeanneret, N., Junier, P. Endospore-enriched sequencing approach reveals unprecedented diversity of Firmicutes in sediments. Environ Microbiol Rep. 6 (6), 631-639 (2014).
- Nicholson, W. L., Law, J. F. Method for purification of bacterial endospores from soils: UV resistance of natural Sonoran desert soil populations of Bacillus spp. with reference to B. subtilis strain 168. J Microbiol Methods. 35 (1), 13-21 (1999).
