Introduction
Het doel van dit werk is om een protocol voor de scheiding van bacteriële endosporen van vegetatieve bacteriële cellen in het milieu monsters. De vorming van bacteriële endosporen een overlevingsstrategie, gewoonlijk veroorzaakt door verhongering gevonden in een aantal bacteriële groepen die tot phylum Firmicutes 1. Endospore-vormende bacteriën zijn goed bestudeerd, vooral omdat een aantal stammen zijn ziekteverwekkers en dus van medisch belang (bijvoorbeeld Bacillus anthracis of Clostridium difficile). Milieu stammen van endospore-vormende bacteriën zijn geïsoleerd uit vrijwel elke omgeving (bodem, water, sedimenten, lucht, ijs, menselijke darm, dieren gut, en meer) 1-3. Daarom Firmicutes zijn de tweede meest voorkomende stam in cultuur collecties 4.
Door hun sterke buitenste cortex en beschermende kern eiwitten, kan endospores extreme omstandigheden, variërend fr overlevenOM verdroging te hoge straling, extreme temperaturen en schadelijke chemische stoffen 5. Deze opmerkelijke weerstand maakt het een uitdaging om DNA uit endospores 6-8 halen. Dit verklaart waarschijnlijk waarom ze zijn over het hoofd gezien in het milieu sequencing studies 9,10. Andere methoden, zoals de concentratie van endospores milieumonsters door fluorescente antilichamen 11, kwantificatie van dipicolinezuur (DPA) in grond en sediment 13 12 flowcytometrie 14 of pasteurisatie en daaropvolgende kweek 15,16 zijn gebruikt om endosporen halen of kwantificeren milieu monsters. In de afgelopen jaren, geoptimaliseerde DNA-extractie werkwijzen en specifieke moleculaire primers te richten endospore-specifieke gensequenties ontwikkeld 10,17-20. Dit heeft bijgedragen aan meer biodiversiteit onder deze groep van bacteriën 21 onthullen en heeft ook geleid tot toepassingen in de industrie en de geneeskunde voor de detectie van endosporesBijvoorbeeld in melkpoeder 19.
De hier gepresenteerde protocol is gebaseerd op het verschil in weerstand tegen schadelijke fysisch-chemische omstandigheden (zoals warmte en detergenten) van bacteriële endosporen opzichte van vegetatieve cellen. Om vegetatieve cellen in een monster te vernietigen, we achtereenvolgens toepassen warmte, lysozym en lage concentraties van detergenten. De tijd en de sterkte van deze behandelingen zijn geoptimaliseerd om geen sporen te vernietigen, maar voor alle vegetatieve cellen lyseren. Sommige cellen in een milieu celpool meer resistent dan andere, dus om de kans op het vernietigen van alle vegetatieve cellen verhogen we drie behandelingen toegepast. Het voordelig nieuwheid van deze werkwijze is dat de endosporen na de behandeling nog steeds intact en kan worden gebruikt voor verdere stroomafwaartse analyses. Deze omvatten DNA-extractie, kwantitatieve PCR (qPCR) en amplicon of metagenomic sequencing (gericht op met name de groep van endospores en dus het verminderen van diversity, terwijl het verhogen van de dekking). De endosporen kan ook worden gebruikt voor stroomafwaartse cultuur- of kwantificatie met behulp van fluorescentie microscopie, flow cytometrie, of detectie van DPA. Een belangrijk kenmerk van deze methode is dat door een onbehandeld monster met een behandeld monster, kan men de hoeveelheid en de diversiteit van endosporen afleiden in een milieumonster naast de component die overeenkomt met vegetatieve cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van chemicaliën en apparatuur
- Voeg 500 ml van een 1% natriumhexametafosfaat (SHMP) (NaPO 3) n-oplossing en te steriliseren in de autoclaaf.
- Steriliseren nitrocellulose (NC) filters (poriegrootte 0,22 pm, een diameter van 47 mm) in de autoclaaf in gesloten glazen petrischaaltjes.
- Steriliseren NC filters (poriegrootte 0,22 pm, diameter 25 mm) in de autoclaaf in gesloten glazen petrischaaltjes.
- Weeg en noteer het leeggewicht van de steriele 50 ml buizen (met pet op) (één tube per monster).
- Bereid Tris-EDTA-buffer (TE-buffer) 1x: maak oplossing van 10 mM Tris (tris (hydroxymethyl) aminomethaan) en 1 mM EDTA buffer. Stel de pH tot 8 en steriliseer in de autoclaaf.
- Bereid lysozym oplossing (20 mg / ml) door het oplossen van 0,02 g lysozym in 1 ml TE-buffer. Idealiter maken fris elke keer. Bewaren bij 4 ° C voor niet meer dan 1 week.
- Bereid fysiologische oplossing door het oplossen van 8 g / L natriumchloride(NaCl) in gedestilleerd water. Steriliseren in autoclaaf.
2. Scheiding van biomassa uit sediment
- Voeg 3 g sediment monster vooraf gewogen steriele 50 ml buizen met behulp van ethanol gevlamd metalen bolletjes. Voer deze in een schone, UV gesteriliseerde bioveiligheid kast om besmetting te voorkomen.
- Voeg 15 ml van een 1% steriele (autoclaaf) SHMP oplossing voor het monster met een steriele afgestudeerd buret. De SHMP oplossing kan ook worden gefilterd om besmetting te voorkomen.
- Homogeniseer het sediment en SHMP oplossing met een vloeibare verstrooier / homogenisator (bijvoorbeeld Ultra-Turrax homogenisator). 70% ethanol-of stoom steriliseren de dispersie rotor vóór gebruik. Voer het homogeniseren gedurende 1 min bij 17.500 rpm. Laat het monster 2 minuten rusten en herhaal het homogeniseren gedurende 1 minuut bij dezelfde rotorsnelheid.
- Laat het monster staan voor 10 min. Bij deze stap, zal de zwaarste deeltjes (mineralen) te beslechten. De cellen en de organische bestanddelen van het monster evenwel wziek in oplossing blijven. Daarna breng de bovenstaande oplossing (met cel biomassa) in een schone 50 ml tube, terwijl de zorg het sediment pellet niet te verstoren.
- Om het sediment pellet toe weer 15 ml van een 1% steriele (autoclaaf) SHMP oplossing met behulp van een steriele afgestudeerd buret. Dan stappen herhalen 2.3 en 2.4. Deze herhaling zorgt voor de scheiding van de maximale hoeveelheid cellen en organische deeltjes van de minerale component van het sediment. Het supernatant van deze tweede scheiding kan worden samengevoegd met de supernatant uit de eerste scheidingszone.
Opmerking: De volgende stappen worden allen uitgevoerd op het supernatant (cel bevattende biomassa). De minerale component (sediment pellet) worden weggegooid. - Centrifugeer het monster bij 20 xg gedurende 1 min. Deze stap verhoogt de g-kracht genoeg om kleine minerale deeltjes bezinken, terwijl de biologische cel materiaal blijft in oplossing. Na centrifugeren breng de bovenstaande oplossing (bevattende cel biomassa) in eenschoon 50 ml buis. Gooi het mineraal pellet.
- Bepaal het eindvolume van de oplossing bevattende biomassa door weging van het monster. Het gewicht bepaling wordt voorkomen dat het monster over te dragen aan een maatcilinder en vermindert het risico op besmetting.
3. Het verzamelen van biomassa op filtermembraan
- Bereid filtratie-eenheid (47 mm diameter membranen) en vacuümpomp. Steriliseer de filtratie-eenheid ofwel de autoclaaf of (indien Pyrex glas) door besproeien met 70% ethanol en vlammen met een bunsenbrander. Laat het afkoelen voordat u verder gaat met het protocol.
- Voeg steriel NC membraan naar de filtratie-eenheid met behulp van ethanol gevlamd gesteriliseerde pincet.
- Voeg de helft van de supernatant monster (van stap 2,6) op de membraanfiltratie-eenheid en het verzamelen van cellen op het membraan met behulp van de vacuümpomp.
- Wanneer de vloeistof volledig is door het filter, stop de vacuümpomp en verwijder het membraan met behulp ethanol-vlam gesteriliseerd pincet. Plaats het membraan in een steriele petrischaal.
- Snijd het membraan in de helft gebruik van ethanol gevlamd gesteriliseerd schaar. Naar elke helft van het membraan om een aparte 2 ml buis. Eén helft van het membraan wordt gebruikt voor DNA-extractie en analyse van het volledige bacteriële gemeenschappen. De andere helft van de filter wordt opgeslagen bij -80 ° C en dient als backup.
- Plaats nieuwe NC membraan op de filtratie-eenheid en het verzamelen van biomassa uit de tweede helft van het monster volume (van stap 2.6) met behulp van de vacuümpomp.
- Wanneer de vloeistof volledig is door het filter, stop de vacuümpomp en verwijder het membraan met behulp van ethanol gevlamd gesteriliseerde pincet. Plaats het gehele membraan in een afzonderlijke 2 ml buis. Dit monster wordt gebruikt voor de behandeling endosporen scheiden van vegetatieve cellen. Het monster kan worden opgeslagen bij -20 ° C tot gebruik.
4. Lysis van vegetatieve cellen
- Voer debehandeling endospores van vegetatieve cellen te scheiden van de biomassa eerder verzamelde op een NC membraan (stap 3.6).
- Indien het membraan werd bevroren, laat het op kamertemperatuur 10 minuten te ontdooien. Plaats dan het membraan in een steriele petrischaal en snijd het (ongeveer 4 keer) in kleinere stukken met behulp van ethanol gevlamd gesteriliseerd schaar. Plaats dan alle membraanfilter stukken in een steriele 2 ml buis.
- Voeg 900 ul 1x TE (Tris-EDTA) buffer (zie 1.5) aan de buis met het monster membraan en meng goed door de vortex. Bij deze stap wordt de biomassa uit het membraan in de TE-bufferoplossing.
- Plaats de buis in een incubator bij 65 ° C gedurende 10 min en 80 rpm. Daarna verwijdert de buis uit de incubator en laat het afkoelen gedurende 15 minuten.
- Voeg 100 ul vers bereide lysozyme (zie 1.5) tot een eindconcentratie van 2 mg / ml te bereiken. Laat de lysozym niet toe te voegen voordat het monster is afgekoeld tot 37 ° C, omdat dit zou kunnen degrade het enzym.
- Incubeer het monster bij 37 ° C gedurende 60 min en 80 rpm, de optimale voorwaarden voor lysozym vegetatieve cellen lyseren.
- Na lysis is voltooid, voeg 250 gl 3 N natriumhydroxide (NaOH) en 250 pl 6% natriumdodecylsulfaat (SDS) oplossing van het monster. Door toevoeging van deze, het monstervolume bereikt 1,5 ml en er is een eindconcentratie van 0,5 N NaOH en het uiteindelijke concentratie van 1% SDS.
- Incubeer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 60 min en 80 rpm. Het toevoegen van de basis en wasmiddelen zal helpen bij het laatste cellysis. De concentratie van deze detergentia is geoptimaliseerd om geen endosporen schaden, terwijl lyseren vegetatieve cellen.
- Bereid een steriele filtratie-eenheid die 25 mm diameter membraan houdt de autoclaaf, of (indien Pyrex glas) besproeien met 70% ethanol en vlammen met een bunsenbrander. Laat het afkoelen.
- Plaats een 0,2 urn NC membraan (25 mm diameter) van de filtratie-eenheid met behulp van ethanol vlam gesteriliseerde pincet. </ li>
- Voeg het monster van stap 4.7 op het membraan en filtreren van de vloeistof met de vacuümpomp. Wanneer vloeistof door voorbij is, schakelt de vacuümpomp. Bij deze stap wordt de vegetatieve gelyseerd celmateriaal verwijderd, aangezien het niet op het membraan vastgehouden. Slechts endosporen wordt op het membraan achterblijven.
- Voeg 2 ml steriele fysiologische oplossing te wassen resterende detergenten en filteren de vloeistof met behulp van de vacuümpomp.
- Wanneer vloeistof volledig is gefilterd, schakelt de vacuümpomp. Laat het membraan op de filtratie-eenheid.
5. DNase behandeling
Opmerking: Voer de DNase behandeling direct op het filter membraan. Het is belangrijk dat het filtersysteem niet lekt en de vacuümpomp uitgeschakeld.
- Voeg 450 ul van steriel water, 50 pl DNase reactie buffer (1x) en 0,5 ul DNase enzym direct op het filter membraan en laat het staan voor 15 min. Als het mogelijk is, doe dit de spijsvertering in een kamer die een beetje oorlogmer dan gemiddeld RT, aangezien het enzym beter werkt bij een temperatuur van 25 ° C en hoger.
Opmerking: Houd de bunsenbrander vernietiging van het filtersysteem verhoogt ook de temperatuur en heeft het extra voordeel van het houden van de steriele omgeving, dus minder kans op contaminatie van de monsters. - Wanneer de DNase spijsvertering is voltooid, zet vacuümpomp om het enzym uit het monster te verwijderen.
- Afwassen resterende enzym door het toevoegen en het filteren van 1 ml fysiologische oplossing.
- Als er vloeistof volledig voorbij is, schakelt vacuümpomp en verwijder het filter membraan dat endospores met steriele pincet en leg het in een steriele petrischaal.
Opmerking: Het monster afgescheiden endospores is nu klaar voor downstream analyse. Bewaar bij -20 ° C indien gebruikt voor DNA-extractie of alternatief bij 4 ° C indien voor kweekdoeleinden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De hier gepresenteerde resultaten zijn eerder verschenen 10,21. Verwijzen wij u naar die artikelen voor de milieu-interpretatie en bespreking van de gegevens.
De algemene procedure wordt samengevat in figuur 1 en komt overeen met drie stappen: eerst de scheiding van biomassa uit sediment of andere milieu-matrix; tweede, de vernietiging van vegetatieve cellen; en ten derde de stroomafwaartse analyse van de afgescheiden endosporen. Downstream analyse kan bestaan, bijvoorbeeld, DNA-extractie en amplicon sequencing diversiteit bepalen. De DNA-extractie moet worden geoptimaliseerd om lysis van endosporen waarborgen. In sediment monsters, hebben we dit bereikt met behulp een krachtige DNA sequentiële extractieprocedure 10. De toepassing van de werkwijze sediment laat een significante toename van de fractie van endospore vormen Firmicutes na scheiding. In amplicon sequencen van het 16S rRNAgen Firmicutes in de onbehandelde monsters (gehele gemeenschap) overeen slechts 8,0 en 19,0% van de sequenties (tabel 1). Daarentegen na de behandeling Firmicutes vertegenwoordigde 90,6% en 83,9% van de endospore-verrijkte monster. De twee belangrijkste opdrachten van endospore vormen Firmicutes, Bacilliales en Clostridiales, werden verrijkt met de methode, die contrasteert met de afwezigheid van de orders als Lactobacilliales die niet-endospore vormen Firmicutes. Om aan te tonen dat de werkwijze bijzonder geschikt voor de verrijking van ware endospores werden andere groepen staat is spore-structuren geanalyseerd. Dienovereenkomstig, de frequentie van Actinobacteria, cyanobacteriën en Myxococcales af na de behandeling lyseren.
De doeltreffendheid van de behandeling werd eveneens aangetoond met behulp van zuivere kweken. Een Endospores preparaat (> 95% endosporen) van Paenibacillus alvei, Bacillus subtilis en Bacillus megaterium Escherichia coli, werden behandeld zoals beschreven in het protocol voor de lysis van vegetatieve cellen. Alle kweken werden vervolgens geïncubeerd in nutriënt bouillon bij 37 ° C en de groei werd gemeten door middel van optische dichtheid bij 600 nm golflengte. De groei werd waargenomen voor de endospore kweken terwijl er geen groei werd waargenomen in de behandelde E. coli cultuur, waaruit blijkt dat vegetatieve cellen onherstelbaar beschadigd is (figuur 2).
Figuur 1. Overzicht van de experimentele procedure. Procedure gebruikt voor endospore-vormende bacteriën te verrijken in het milieu monsters. De stap van het scheiden van cellen en endosporen het milieu matrix kan worden weggelaten afhankelijk van het type monster (bijv watermonster). In de figuur van de downstream-methoden toegepast op de spore verrijkte fractie Correspond om DNA-extractie en high throughput sequencing. Deze stappen kunnen worden vervangen door kweken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Verificatie van de behandeling op reinculturen. Groeicurven controleren van de groei van endospore bacteriën uit een suspensie van endosporen van Bacillus subtilis, Bacillus megaterium en Paenibacillus alvei en een celcultuur van Escherichia coli behandeld met de werkwijze voor de lysis cellen. Behandeld = ○. Onbehandelde = ●. Foutbalken drie onafhankelijke culturen. Groei controleculturen en de hergroei van behandelde kweken werd gemeten als optische dichtheid bij 600 nm golflengte. Dit cijfer is opnieuw gedrukt from Wunderlin et al. 2014 met toestemming. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Sediment 1 | Sediment 2 | |||
| hele gemeenschap | -endospore verrijkte | hele gemeenschap | -endospore verrijkte | |
| Firmicutes | 8.0 | 90.6 | 19.0 | 83.9 |
| Bacillen | 0.5 | 10.0 | 5.7 | 15.1 |
| Clostridia | 7.4 | 76.9 | 12.5 | 63.2 |
| Actinobacteria | 2.4 | 1.0 | 4.4 | 2.1 |
| Cyanobacteriën | 1.1 | 0.1 | 0.7 | 0.1 |
| Myxococcales | 0.7 | 0.0 | 0.2 | 0.0 |
| Andere bacteriën | 87.8 | 8.3 | 75.7 | 13.9 |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De weerstand van endosporen externe agressieve fysisch-chemische factoren (bijvoorbeeld temperatuur of detergenten) werd gebruikt om een methode om bacteriële endosporen scheiden van vegetatieve cellen milieumonsters bedenken. Dit is de eerste uitgebreide methode endosporen van milieumonsters te isoleren op een niet-destructieve wijze. Vorige methoden te kwantificeren, sporen of endospores in monsters te analyseren gebaseerd op de meting van specifieke proxies voor endosporen zoals dipicolinezuur of specifieke markergenen. In tegenstelling met de hier gepresenteerde protocol, behalve endospores monstercomponenten verwijderd en zo de endosporen uiteindelijk als enige en gezuiverde restanten van het monster blijft. Hoewel andere werkwijzen zoals pasteurisatie of dichtheidsgradiënt centrifugatie werden voorgesteld verrijken endosporen 22, onze tests bleek dat dichtheidsgradiënt centrifugeren niet geschikt als een algemene werkwijze voor milieumonstersVanwege fysiologische verschillen en de verschillende dichtheden van verschillende soorten endospore-vormers (data niet getoond). Daarentegen kan ons protocol eenvoudig worden toegepast op alle soorten milieumonsters en is geschikt voor verdere toepassingen zoals moleculaire methoden of kweken.
Er zijn twee belangrijke stappen in het protocol. De eerste is de scheiding van biomassa uit monstermatrix (dwz sedimentpartikels). Het is essentieel dat het aantal cellen gescheiden van de matrix worden gemaximaliseerd, zodat geen deel van de diversiteit kijken. Voor sediment monsters, zoals hier gebruikt, een van de belangrijkste beperkingen van het protocol is het feit dat sommige cellen of sporen niet zijn losgemaakt van het sediment matrix en dus niet in de stroomafwaartse analyse, die een potentiële beperking van de werkwijze . Afhankelijk van het monster matrix (bijvoorbeeld als er humuszuren) cellen worden stevig aan gebonden en daarom gemakkelijk gaat.Het gebruik van ortho-fosfaat buffer en goed homogeniseren met een homogeniseerinrichting of blender belang in deze stap. Om herstel te stimuleren, is de werkwijze van homogeniseren en verwijderen van biomassa tweemaal herhaald zoals beschreven in het protocol. Is ontwikkeld het hier beschreven protocol en geoptimaliseerd voor monsters van zoetwatermeer sediment. Sommige parameters niet optimaal op andere soorten monsters. Een manier om de gemeenschap fractie die mogelijk werd vergeten in het te analyseren zou zijn om het sediment matrix DNA-extractie en amplicon sequentiebepaling onderworpen. Als mogelijke modificaties van de techniek, kan de stap van de scheiding van biomassa uit monstermatrix worden weggelaten. Vooral als het milieu monster geen organisch materiaal of minerale deeltjes die kunnen interfereren met de stroomafwaartse protocol (bijvoorbeeld water, andere vloeistoffen of reinculturen) bevatten, worden eerst de scheiding niet nodig. Voor vloeibare monsters het protocol direct bij hoofdstuk 3 kan beginnen(Verzamelen van biomassa op filter membraan).
De tweede belangrijke stap van het protocol is de behandeling met lysozym, warmte, NaOH en SDS te vernietigen vegetatieve cellen. Temperatuur, tijdsduur en concentratie van chemicaliën zijn allemaal geoptimaliseerd geen endosporen schade, terwijl het vernietigen van de cellen. Deze parameters moeten daarom strikt worden gehouden als ze zijn. Het gebruik van een eerste stap van het verwarmen van het monster bij 65 ° C was zeer effectief specifiek kiezen voor endosporen vergelijking met andere soorten van bacteriële sporen of spore-structuren optreedt tussen de bacteriële phyla van Actinobacteria, myxobacteriën, cyanobacteriën, die in het algemeen niet hitte bestendig. Zoals blijkt uit tabel 1, niet-sporenvormende bacteriën nog aanwezig na de behandeling (8,3% tot 14%). Sommige verklaringen hiervoor zijn dat sediment monsters zijn zeer complex en kan ook de haven resistente non-spore cellen. Daarbij mag overgebleven organisch materiaal een bepaalde toestaan ttached cellen voor de behandeling overleven. Voor het verder verminderen van het percentage niet-sporenvormende cellen in de behandelde monsters, moet de werkwijze worden geoptimaliseerd op basis van individuele monstertype.
De methode is een nieuw instrument voor de gerichte studie van endospore-vormers in milieu monsters. De behandeling om de vegetatieve cellen te vernietigen kunnen worden getest op zuivere celkweken en endosporen en aangepast aan de individuele weerstand van cellen aan te passen. De vernietiging van cellen te zien in de curven van behandelde kweken in figuur 2. De vertraagde groei van de behandelde kweken kan worden vanwege de tijd die endosporen opnieuw moet ontkiemen en te verplaatsen naar de exponentiële groeifase. Andere mogelijke verklaringen voor deze vertraging kan ook een verzwakking van de endospore cultuur of lager aantal cellen na behandeling. Wanneer de afgescheiden endosporen niet worden gebruikt voor DNA-extractie, kan de laatste stap van DNase behandeling worden weggelaten.
nt "> Toekomstige toepassingen van deze techniek kan in industrieën waar pathogene endosporen moeten worden gedetecteerd worden overwogen. Een voorbeeld is in de voedingsmiddelenindustrie en klinisch onderzoek, waarbij de detectie en analyse (identificatie) van endosporen en de differentiatie van vegetatieve cellen (bijvoorbeeld van voedingsmiddelen zoals melk en melkproducten) essentieel. Dit kan bijzonder relevant aangezien vele standaard procedures interessant rechtstreekse DNA-extractie van een monster met behulp van lytische enzymen die niet aangepast zijn aan endosporen lyseren, die aldus hoofd worden gezien. Met de hier voorgestelde werkwijze cellen kan worden verwijderd en daaropvolgende analyse antwoorden op de aanwezigheid of afwezigheid van endosporen tegenover cellen. Andere toepassingen omvatten de analyse van endospore gemeenschappen in verschillende milieumonsters (zoals ijs of sediment kernen ), die zijn historische archieven van milieu-omstandigheden. In veel omgevingen met een relatief stabiele environmenTal omstandigheden (bijvoorbeeld meer sediment oppervlak)-endospore vormen Firmicutes kan gedijen in de vorm van een vegetatieve cellen. Wanneer de omstandigheden verslechteren (bijvoorbeeld door een tekort aan nutriënten tijdens sediment begrafenis of een verschuiving naar anaerobe omstandigheden) de cellen verhuizen naar endospore staat. Daarom kan de opgehaalde endospore gemeenschappen uit sedimentkernen de milieu-omstandigheden op het moment van de begrafenis weerspiegelen en dus worden gebruikt als een paleoecologische indicator van de voorwaarden voorafgaand aan de begrafenis. Toch zijn we nog steeds het verzamelen van informatie om deze bewering te ondersteunen.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs erkennen de Swiss National Science Foundation voor Grant No. 31003A-132358/1, 31003A_152972 en nr 151.948 en Fundation Pierre Mercier pour la Science.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Whatman nitrocellulose membrane filters, 0.2 μm pore size, 47 mm diameter | Sigma-Aldrich | WHA7182004 Aldrich | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859 Sigma-Aldrich | CAS 77-86-1 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 Sigma-Aldrich | CAS 60-00-4 |
| Lysozyme from chicken egg white | Sigma-Aldrich | 62971 Fluka | powder, CAS 12650-88-3 |
| Ultra-Turrax homogenizer T18 basic | IKA | 3720000 | |
| Glass filter holders for 47 mm membranes, Pyrex glass | EMD Millipore | XX10 047 00 | |
| Chemical duty vacuum pump | Millipore | WP6122050 | 220 V/50 Hz |
| Manifold sampling filtration for 25 mm membranes | Millipore | 1225 Sampling Manifold | polypropylene |
| Dnase | New England Biolabs | M0303S | Rnase free |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 Sigma-Aldrich | CAS 1310-73-2 |
| Sodium dodecyl sulfphate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 Sigma | |
| Whatman nitrocellulose membrane filters, 0.2 μm pore size, 25 mm diameter | Sigma-Aldrich | WHA7182002 Aldrich |
References
- Nicholson, W. L. Roles of Bacillus endospores in the environment. Cell Mol Life Sci. 59 (3), 410-416 (2002).
- Lester, E. D., Satomi, M., Ponce, A. Microflora of extreme arid Atacama Desert soils. Soil Biol Biochem. 39 (2), 704-708 (2007).
- Wilson, M. S., Siering, P. L., White, C. L., Hauser, M. E., Bartles, A. N. Novel archaea and bacteria dominate stable microbial communities in North America's Largest Hot Spring. Microb Ecol. 56 (2), 292-305 (2008).
- Hugenholtz, P. Exploring prokaryotic diversity in the genomic era. Genome Biol. 3 (2), (2002).
- Onyenwoke, R. U., Brill, J. A., Farahi, K., Wiegel, J. Sporulation genes in members of the low G+C Gram-type-positive phylogenetic branch (Firmicutes). Arch Microbiol. 182 (2-3), 182-192 (2004).
- Delmont, T. O., et al. Accessing the soil metagenome for studies of microbial diversity. Appl Environ Microbiol. 77 (4), 1315-1324 (2011).
- Ricca, E., Henriques, A. O., Cutting, S. M. Bacterial spore formers: probiotics and emerging applications. , Horizon Bioscience. (2004).
- Kuske, C. R., et al. Small-Scale DNA Sample Preparation Method for Field PCR Detection of Microbial Cells and Spores in Soil. Appl Environ Microbiol. 64 (7), 2463-2472 (1998).
- von Mering, C., et al. Quantitative phylogenetic assessment of microbial communities in diverse environments. Science. 315 (8515), 1126-1130 (2007).
- Wunderlin, T., Junier, T., Roussel-Delif, L., Jeanneret, N., Junier, P. Stage 0 sporulation gene A as a molecular marker to study diversity of endospore-forming Firmicutes. Environ Microbiol Rep. 5 (6), 911-924 (2013).
- Siala, A., Hill, I. R., Gray, T. R. G. Populations of spore-forming bacteria in an acid forest soil, with special reference to Bacillus subtilis. J General Microbiol. 81 (1), 183-190 (1974).
- Brandes Ammann, A., Kolle, L., Brandl, H. Detection of bacterial endospores in soil by terbium fluorescence. Int J Microbiol. , 435281 (2011).
- Fichtel, J., Koster, J., Rullkotter, J., Saas, H. High variations in endospore numbers within tidal flat sediments revealed by quantification of dipicolinic acid. Geomicrobiol J. 25 (7-8), (2008).
- Cronin, U. P., Wilkinson, M. G. The potential of flow cytometry in the study of Bacillus cereus. J Appl Microbiol. 108 (1), 1-16 (2010).
- de Rezende, J. R., et al. Dispersal of thermophilic Desulfotomaculum endospores into Baltic Sea sediments over thousands of years. ISME J. 7 (1), 72-84 (2013).
- Hubert, C., et al. Thermophilic anaerobes in Arctic marine sediments induced to mineralize complex organic matter at high temperature. Environ Microbiol. 12 (4), 1089-1104 (2010).
- Garbeva, P., van Veen, J. A., van Elsas, J. D. Predominant Bacillus spp. in agricultural soil under different management regimes detected via PCR-DGGE. Microb Ecol. 45 (3), 302-316 (2003).
- Brill, J. A., Wiegel, J. Differentiation between spore-forming and asporogenic bacteria using a PCR and southern hybridization based method. J Microbiol Methods. 31 (1-2), 29-36 (1997).
- Rueckert, A., Ronimus, R. S., Morgan, H. W. Development of a real-time PCR assay targeting the sporulation gene, spo0A., for the enumeration of thermophilic bacilli in milk powder. Food Microbiol. 23 (3), 220-230 (2006).
- Bueche, M., et al. Quantification of endospore-forming firmicutes by quantitative PCR with the functional gene spo0A. Appl Environ Microbiol. 79 (17), 5302-5312 (2013).
- Wunderlin, T., Junier, T., Roussel-Delif, L., Jeanneret, N., Junier, P. Endospore-enriched sequencing approach reveals unprecedented diversity of Firmicutes in sediments. Environ Microbiol Rep. 6 (6), 631-639 (2014).
- Nicholson, W. L., Law, J. F. Method for purification of bacterial endospores from soils: UV resistance of natural Sonoran desert soil populations of Bacillus spp. with reference to B. subtilis strain 168. J Microbiol Methods. 35 (1), 13-21 (1999).
