Introduction
Le but de ce travail est de fournir un protocole pour la séparation des endospores bactériennes partir de cellules bactériennes végétatives dans les échantillons environnementaux. La formation d'endospores bactériennes est une stratégie de survie, généralement déclenchée par la famine, trouvé dans un certain nombre de groupes de bactéries appartenant à l'embranchement des Firmicutes 1. Bactéries endospores sont bien étudiés, principalement en raison d'un certain nombre de souches sont pathogènes et donc d'une importance médicale (par exemple, Bacillus anthracis ou Clostridium difficile). Souches environnementales de bactéries endospores ont été isolés à partir de pratiquement chaque environnement (sol, eau, sédiments, l'air, la glace, intestin humain, les animaux intestin et plus) 1-3. Par conséquent, Firmicutes sont le deuxième embranchement le plus abondant dans les collections de cultures 4.
En raison de leurs protéines du cortex externe et fondamentales de protection robustes, endospores peuvent survivre dans des conditions environnementales extrêmes allant from dessiccation à rayonnement élevé, des températures extrêmes et des produits chimiques nocifs 5. Cette résistance remarquable en fait un défi pour extraire l'ADN des endospores 6-8. Cela explique probablement pourquoi ils ont été négligés dans les études de séquençage de l'environnement 9,10. D'autres méthodes, telles que le ciblage des endospores dans les échantillons environnementaux par des anticorps fluorescents 11, quantification de l'acide dipicolinique (DPA) dans le sol et les sédiments 13 12, la cytométrie de flux 14 ou la pasteurisation et la culture subséquente 15,16 ont été utilisés pour récupérer ou de quantifier dans endospores les échantillons environnementaux. Au cours des dernières années, les méthodes d'extraction d'ADN optimisée, ainsi que des amorces moléculaires spécifiques pour cibler des séquences de gènes spécifiques ont été développés endospores 10,17-20. Cela a contribué à révéler plus de biodiversité au sein de ce groupe de bactéries 21 et a également conduit à des applications dans l'industrie et la médecine pour la détection des endospores, Par exemple dans le lait en poudre 19.
Le protocole présenté ici est basé sur la différence de résistance à physico-chimiques nocifs (conditions telles que la chaleur et détergents) de endospores bactériennes par rapport à des cellules végétatives. Pour détruire les cellules végétatives dans un échantillon, nous appliquons consécutivement la chaleur, le lysozyme et de faibles concentrations de détergents. La durée et la force de ces traitements ont été optimisés afin de ne pas détruire les spores, mais pour lyser toutes les cellules végétatives. Certaines cellules dans une piscine de la cellule de l'environnement sont plus résistants que d'autres, afin d'augmenter la probabilité de détruire toutes les cellules végétatives, nous appliquons trois traitements différents. L'avantage de la nouveauté et cette méthode est que les endospores après le traitement sont encore intacts et peuvent être utilisés pour d'autres analyses en aval. Ceux-ci comprennent l'extraction de l'ADN, la PCR quantitative (qPCR) et amplicon ou le séquençage métagénomique (ciblant spécifiquement le groupe des endospores et donc de réduire dIVERSITÉ, tout en augmentant la couverture). Les endospores pourraient également être utilisés pour la culture ou la quantification en aval par microscopie par fluorescence, cytométrie de flux, ou la détection de DPA. Une caractéristique importante de ce procédé est que, en comparant un échantillon non traité avec un échantillon traité, on peut déduire la quantité et la diversité des endospores dans un échantillon environnemental, en plus de la composante correspondant à des cellules végétatives.
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Protocol
1. Préparation des produits chimiques et de l'équipement
- Ajouter 500 ml d'un hexamétaphosphate de sodium à 1% (SHMP) (NaPO 3) n solution et stériliser par autoclavage.
- Stériliser nitrocellulose (NC) filtres (taille de pores de 0,22 um, diamètre 47 mm) par autoclavage en verre fermé des boîtes de Pétri.
- Stériliser les filtres NC (taille de pores 0,22 pm, diamètre 25 mm) à l'autoclave fermé en verre boîtes de Pétri.
- Peser et noter le poids à vide des tubes de 50 ml stériles (avec Cap sur) (un tube par échantillon).
- Préparer Tris-EDTA-tampon (tampon TE) 1x: effectuer solution de Tris 10 mM (tris (hydroxyméthyl) aminométhane de) et le tampon EDTA 1 mM. Ajuster le pH à 8 et stériliser à l'autoclave.
- Préparer la solution de lysozyme (20 mg / ml) en dissolvant 0,02 g de lysozyme dans 1 ml de tampon TE. Idéalement, faire des frais à chaque fois. Conserver à 4 ° C pendant pas plus de 1 semaine.
- Préparer la solution physiologique en dissolvant 8 g / L de chlorure de sodium(NaCl) dans l'eau distillée. Stériliser à l'autoclave.
2. La séparation de la biomasse à partir des sédiments
- Ajouter 3 g d'échantillon de sédiments pré-pesée stérile tubes de 50 ml à l'aide de boules métalliques éthanol flambé. Effectuez cette dans un endroit propre, stérilisée par UV enceinte de biosécurité pour éviter la contamination.
- Ajouter 15 ml d'une solution stérile (autoclave) solution de SHMP de 1% à l'aide d'un échantillon stérile gradué burette. La solution SHMP peut également être filtré pour éviter la contamination.
- Homogénéiser le sédiment et la solution SHMP avec une dispersion liquide / homogénéisation (par exemple, homogénéisateur Ultra-Turrax). 70% d'éthanol-stériliser à l'autoclave ou le rotor de dispersion avant l'utilisation. Exécutez l'homogénéisation pendant 1 min à 17 500 rpm. Laisser l'échantillon reposer pendant 2 min et répéter l'homogénéisation pendant 1 min à la même vitesse du rotor.
- Laissez l'échantillon reposer pendant 10 min. À cette étape, les particules les plus lourdes (minéraux) se déposent. Les cellules et les composants organiques de l'échantillon cependant wmalades restent en solution. Ensuite, transférer la solution de surnageant (contenant de la biomasse cellulaire) dans un tube de 50 ml propre, tout en prenant soin de ne pas perturber le culot de sédiments.
- Pour le culot de sédiments ajouter encore 15 ml d'une solution stérile (autoclave) solution de SHMP 1% en utilisant une burette graduée stérile. Puis répétez les étapes 2.3 et 2.4. Cette répétition assure la séparation de la quantité maximale des cellules et des particules organiques dans le composant minéral du sédiment. Le surnageant de cette deuxième séparation peut être fusionné avec le surnageant provenant de la première séparation.
Remarque: Les étapes suivantes sont toutes effectuées sur le surnageant (contenant la biomasse cellulaire). Le composant minéral (pastille sédiment) peut être mis au rebut. - Centrifuger l'échantillon à 20 x g pendant 1 min. Cette étape augmente la suffisant pour régler les petites particules minérales force g tandis que le matériau de cellule biologique reste encore en solution. Après centrifugation, transférer la solution de surnageant (contenant de la biomasse cellulaire) dans unpropre tube de 50 ml. Jeter le culot minérale.
- Déterminer le volume final de la solution contenant la biomasse en pesant l'échantillon. La détermination du poids évite d'avoir à transférer l'échantillon dans un cylindre gradué et réduit les risques de contamination.
3. Collection de la biomasse sur le filtre à membrane
- Préparer unité de filtration (membranes de 47 mm de diamètre) et la pompe à vide. Stériliser l'unité de filtration soit par autoclavage ou (si le verre Pyrex) par pulvérisation avec 70% d'éthanol et enflammé par un bec Bunsen. Laissez-le refroidir avant de continuer avec le protocole.
- Ajouter membrane NC stérile à l'unité de filtration à l'aide de pinces stériles éthanol flambé.
- Ajouter la moitié de l'échantillon de surnageant (de l'étape 2.6) sur l'unité de filtration à membrane et recueillir les cellules sur la membrane en utilisant la pompe à vide.
- Lorsque le liquide est complètement passé à travers le filtre, arrêter la pompe à vide et retirer délicatement la membrane en utilisant Ethanol-flamme pince stérilisée. Placez la membrane dans une boîte de Pétri stérile.
- Couper la membrane de moitié l'aide de ciseaux stérilisés éthanol flambé. Ajouter chaque moitié de la membrane dans un tube de 2 ml distinct. La moitié de la membrane sera utilisé pour l'extraction et l'analyse de l'ensemble de la communauté bactérienne ADN. L'autre moitié du filtre est stockée à -80 ° C et sert comme une sauvegarde.
- Placez nouvelle membrane NC sur l'unité de filtration et de collecter la biomasse à partir de la seconde moitié du volume de l'échantillon (de l'étape 2.6) en utilisant la pompe à vide.
- Lorsque le liquide est complètement passé à travers le filtre, arrêter la pompe à vide et retirer délicatement la membrane en utilisant des pinces stérilisées éthanol flambé. Placer l'ensemble de membrane dans un tube de 2 ml distinct. Cet exemple sera utilisé pour le traitement de séparer les endospores de cellules végétatives. L'échantillon peut être stocké à -20 ° C jusqu'à utilisation.
4. La lyse des cellules végétatives
- Effectuer latraitement pour séparer les endospores de cellules végétatives sur la biomasse déjà recueillis sur une membrane NC (étape 3.6).
- Si la membrane a été gelé, le laisser à température ambiante pendant 10 min à décongeler. Ensuite, placez la membrane dans une boîte de Pétri stérile et couper (environ 4 fois) en petits morceaux avec des ciseaux stérilisés éthanol flambé. Ensuite, placer tous les éléments de filtre à membrane dans un tube stérile de 2 ml.
- Ajouter 900 pi de 1x TE (Tris-EDTA) tampon (voir 1.5) dans le tube contenant la membrane de l'échantillon et bien mélanger au vortex. A ce stade, la biomasse est enlevée de la membrane dans la solution tampon TE.
- Placer le tube dans un incubateur à 65 ° C pendant 10 min et 80 tours par minute. Ensuite retirer le tube de l'incubateur et le laisser refroidir pendant 15 min.
- Ajouter 100 ul de lysozyme fraîchement préparé (voir 1.5) pour atteindre une concentration finale de 2 mg / ml. Ne pas ajouter le lysozyme avant que l'échantillon est refroidi à 37 ° C, car cela pourrait degRade l'enzyme.
- Incuber l'échantillon à 37 ° C pendant 60 min et 80 tours par minute, les conditions optimales pour le lysozyme pour lyser des cellules végétatives.
- Après la lyse est complète, ajouter 250 ul de 3 N d'hydroxyde de sodium (NaOH) et 250 pi de dodécylsulfate de sodium (SDS) solution à 6% de l'échantillon. En ajoutant cela, le volume d'échantillon de 1,5 ml et atteint il y a une concentration finale de 0,5 N de NaOH et la concentration finale de 1% de SDS.
- Incuber ce mélange à température ambiante pendant 60 min et 80 tours par minute. Ajout de la base et des détergents aidera en finale de la lyse cellulaire. La concentration de ces détergents a été optimisée pour ne pas endommager les endospores, tandis que la lyse des cellules végétatives.
- Préparer une unité de filtration stérile qui contient 25 membranes mm de diamètre à l'autoclave, ou (si le verre Pyrex) pulvérisation d'éthanol à 70% et enflammé par un bec Bunsen. Laissez refroidir.
- Placer une membrane NC 0,2 um (diamètre 25 mm) sur l'unité de filtration en utilisant une pince-éthanol flamme stérilisés. </ li>
- Ajouter l'échantillon provenant de l'étape 4.7 sur la membrane et le liquide au moyen d'un filtrage de la pompe à vide. Lorsque le liquide est passé à travers, éteignez la pompe à vide. A cette étape, le matériau cellulaire lysé végétatif est éliminé, car il ne sont pas retenus sur la membrane. Seulement des endospores resteront sur la membrane.
- Ajouter 2 ml de solution physiologique stérile pour laver détergents résiduels et filtrer le liquide en utilisant la pompe à vide.
- Lorsque le liquide est entièrement filtrée, éteignez la pompe à vide. Laisser la membrane de l'unité de filtration.
5. Traitement DNase
Remarque: effectuer le traitement à la DNase directement sur la membrane filtrante. Il est important que l'unité de filtration ne fuit pas et la pompe à vide est éteint.
- Ajouter 450 ul d'eau stérile, 50 ul de tampon de réaction de DNase (1 x) et 0,5 ul de DNase X enzyme directement sur la membrane filtrante et laisser reposer pendant 15 min. Si possible, faire la digestion dans une chambre qui est légèrement guerreRT mer que la moyenne, étant donné que l'enzyme fonctionne mieux à des températures de 25 ° C et au-dessus.
Remarque: En gardant le bec Bunsen de côté de l'unité de filtration augmente également la température et a l'avantage supplémentaire de conserver stérile l'environnement, donc réduit le risque de contamination des échantillons. - Lorsque la digestion de DNase est terminée, tourner sur la pompe à vide pour éliminer l'enzyme de l'échantillon.
- Laver enzyme résiduelle et à filtrer en ajoutant 1 ml de solution physiologique.
- Si du liquide a pleinement réussi, éteignez la pompe à vide et retirer la membrane de filtration contenant des endospores l'aide de pinces stériles et le placer dans une boîte de Pétri stérile.
Remarque: L'échantillon d'endospores séparés est maintenant prêt pour l'analyse en aval. Conserver à -20 ° C si utilisé pour l'extraction de l'ADN ou bien à 4 ° C si elle est utilisée pour la germination et la culture.
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Representative Results
Les résultats présentés ici ont été publiés plus tôt 10,21. S'il vous plaît se référer à ces articles pour l'interprétation de l'environnement et la discussion des données.
La procédure générale est résumée sur la figure 1 et correspond à trois étapes principales: d'abord, la séparation de la biomasse à partir de sédiments ou de toute autre matrice de l'environnement; d'autre part, la destruction de cellules végétatives; et la troisième, l'analyse en aval des endospores séparés. En aval analyse pourrait consister, par exemple, de l'extraction d'ADN et le séquençage de l'amplicon pour déterminer la diversité. L'extraction de l'ADN doit être optimisée pour garantir la lyse des endospores. Dans les échantillons de sédiments, nous avons atteint cet objectif en utilisant un ADN séquentielle procédure force d'extraction 10. L'application de la méthode dans les sédiments démontre une augmentation significative de la fraction de Firmicutes __gVirt_NP_NN_NNPS<__ formant des endospores après la séparation. Dans le séquençage de l'amplicon de l'ARNr 16Sgène, Firmicutes dans les échantillons non traités (communauté tout) correspond seulement à 8,0 et 19,0% des séquences (Tableau 1). En revanche, après le traitement Firmicutes représenté 90,6% et 83,9% de l'échantillon d'endospores enrichi. Les deux principaux ordres de endospores Firmicutes, Bacilliales et Clostridiales, ont été enrichies avec la méthode, contrastant avec l'absence d'ordres comme Lactobacilliales qui sont non endospores Firmicutes. Afin de démontrer que le procédé est particulièrement approprié pour l'enrichissement de véritables endospores, d'autres groupes capables de produire des structures en forme de spores ont également été analysés. En conséquence, la fréquence de Actinobacteria, les cyanobactéries et Myxococcales diminué après le traitement pour lyser les cellules.
L'efficacité du traitement a été également démontrée en utilisant des cultures pures. Une préparation d'endospores (> 95%) des endospores de Paenibacillus alvei, Bacillus subtilis et Bacillus megaterium Escherichia coli, ont été traités de la manière décrite dans le protocole pour la lyse des cellules végétatives. Toutes les cultures ont ensuite été incubées dans un bouillon nutritif à 37 ° C et la croissance a été mesurée en utilisant la densité optique à 600 nm de longueur d'onde. La croissance a été observée pour les cultures de endospores tandis que l'absence de croissance a été observée dans le traitement E. culture coli, ce qui prouve que les cellules végétatives sont irréversiblement endommagée (Figure 2).
Figure 1. Vue d'ensemble de la procédure expérimentale. Procédure utilisée pour enrichir les bactéries endospores dans des échantillons environnementaux. L'étape de séparation des cellules et des endospores de la matrice de l'environnement peut être omis en fonction de la nature de l'échantillon (par exemple, l'échantillon d'eau). Dans la figure, les méthodes appliquées en aval sur la fraction Corre de spores enrichipondre à l'extraction d'ADN et le séquençage à haut débit. Ces étapes peuvent être remplacées par la culture. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. La vérification du traitement sur des cultures pures. Les courbes de croissance vérifiant la croissance des bactéries formant des endospores à partir d'une suspension d'endospores de Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, et Paenibacillus alvei et une culture de cellules de Escherichia coli traité par la méthode de la lyse des cellules. ○ = traité. Non traitée = ●. Les barres d'erreur de trois cultures indépendantes. La croissance des cultures témoins et re-croissance de cultures traitées a été mesurée en tant que densité optique à 600 nm de longueur d'onde. Ce chiffre a été ré-imprimés from Wunderlin et al. 2014, avec la permission. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Sédiments 1 | Sédiments 2 | |||
| ensemble de la communauté | endospores enrichie | ensemble de la communauté | endospores enrichie | |
| Firmicutes | 8.0 | 90,6 | 19,0 | 83,9 |
| Bacilles | 0,5 | 10,0 | 5.7 | 15.1 |
| Clostridia | 7.4 | 76,9 | 12,5 | 63,2 |
| Actinobacteria | 2.4 | 10 | 4.4 | 2.1 |
| Cyanobactéries | 1.1 | 0,1 | 0,7 | 0,1 |
| Myxococcales | 0,7 | 0.0 | 0,2 | 0.0 |
| Autres bactéries | 87,8 | 8.3 | 75,7 | 13,9 |
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Discussion
La résistance des endospores à des facteurs physico-chimiques agressifs externes (par exemple, la température ou détergents) a été utilisé pour mettre au point une méthode pour séparer les endospores bactériennes à partir de cellules végétales dans des échantillons environnementaux. Ceci est la première méthode complète pour isoler à partir d'échantillons environnementaux endospores d'une manière non-destructive. Les procédés antérieurs pour quantifier, détecter ou analyser endospores dans les échantillons ont été basées sur la mesure de procurations spécifiques pour endospores tels que l'acide dipicolinique ou des gènes marqueurs spécifiques. En revanche, avec le protocole présenté ici, les composants de l'échantillon autres que les endospores sont supprimés et ainsi les endospores restent finalement que les restes de sole et purifiées de l'échantillon. Bien que d'autres méthodes telles que la pasteurisation ou la centrifugation en gradient de densité ont été proposées pour enrichir en 22 endospores, nos tests ont montré que gradient de densité centrifugation ne convient pas en tant que procédé général pour les échantillons environnementaux, En raison de différences physiologiques et différentes densités de diverses espèces d'endospores faiseurs (données non présentées). Par contraste, notre protocole peut facilement être appliquée à tous les types d'échantillons de l'environnement et est adapté pour les applications en aval, y compris les méthodes et la culture moléculaire.
Il ya deux étapes critiques dans le protocole. La première est la séparation de la biomasse à partir de la matrice échantillon (à savoir, les particules de sédiments). Il est essentiel que le nombre de cellules séparées de la matrice être maximisée, afin de ne pas négliger la partie de la diversité. Pour les échantillons de sédiments, telle qu'elle est utilisée ici, l'une des principales limitations du protocole est le fait que certaines cellules ou les spores peuvent ne pas avoir été détaché de la matrice de sédiments et donc pas inclus dans l'analyse en aval, ce qui est une limitation potentielle de la méthode . En fonction de la matrice de l'échantillon (par exemple si il y a les acides humiques), les cellules peuvent être étroitement liées à elle et donc difficiles à libérer.L'utilisation de tampon ortho-phosphate ainsi que la bonne homogénéisation avec un homogénéiseur ou un mélangeur sont importants à cette étape. Pour stimuler la reprise, la procédure d'homogénéisation et l'enlèvement de la biomasse est répété deux fois comme écrit dans le protocole. Le protocole décrit ici a été développé et optimisé pour des échantillons de sédiments lac d'eau douce. Certains paramètres peuvent ne pas être optimal pour d'autres types d'échantillons. Une façon d'analyser la fraction de la communauté qui a été potentiellement négligée dans le processus serait de soumettre la matrice de sédiments à l'extraction de l'ADN et le séquençage de l'amplicon. Comme modifications possibles de la technique, l'étape de séparation de la biomasse à partir de matrice de l'échantillon peut être omise. Surtout si l'échantillon de l'environnement ne contient pas de matières organiques ou minérales particules qui pourraient interférer avec le protocole aval (par exemple, l'eau, d'autres liquides ou les cultures purifiées), la séparation préalable peut ne pas être nécessaire. Pour les échantillons liquides le protocole peut commencer directement à Chapitre 3(Collection de la biomasse sur membrane filtrante).
La deuxième étape importante du protocole est le traitement avec le lysozyme, la chaleur, NaOH et SDS pour détruire les cellules végétatives. Température, durée ainsi que la concentration de produits chimiques ont tous été optimisés pour ne pas nuire endospores, tout en détruisant les cellules. Ces paramètres doivent donc être strictement comme elles sont. L'utilisation d'une première étape de chauffage de l'échantillon à 65 ° C a été très efficace pour sélectionner spécifiquement pour les endospores rapport à d'autres types de spores bactériennes ou les structures de spores comme se produisant entre les phylums bactérienne de Actinobacteria, myxobactéries, cyanobactéries, qui ne sont généralement pas résistant à la chaleur. Comme on le voit dans le tableau 1, non-bactéries sporulées sont encore présentes après le traitement (8,3% à 14%). Quelques explications pour cela sont que des échantillons de sédiments sont très complexes et peuvent également héberger des cellules non-spores résistantes. En outre, les restes de matière organique peut permettre une certaine ttached cellules de survivre au traitement. Afin de réduire davantage le pourcentage de cellules non sporulées dans les échantillons traités, le procédé doit être optimisée en fonction de individu type d'échantillon.
La méthode représente un nouvel outil pour l'étude ciblée de endospores faiseurs dans les échantillons environnementaux. Le traitement pour détruire les cellules végétatives peuvent être testés sur des cultures pures de cellules et des endospores et adaptée à la résistance des cellules individuelles. La destruction des cellules peut être vu dans les courbes des cultures traitées à la figure 2. Le retard de croissance des cultures traitées peut être dû au temps que endospores besoin de re-germination et passer à la phase de croissance exponentielle. D'autres explications possibles de ce retard pourrait aussi être un affaiblissement de la culture de endospore ou numéros de cellulaires plus faibles après le traitement. Si les endospores séparés ne sont pas utilisés pour l'extraction d'ADN, la dernière étape de traitement à la DNase peut être omis.
nt "> Les futures applications de cette technique pourrait être envisagée dans les industries où les endospores pathogènes doivent être détecté. Un exemple est dans l'industrie alimentaire et de la recherche clinique, où la détection et l'analyse (pour l'identification) des endospores, et sa différenciation de cellules végétatives (par exemple, à partir de produits d'aliments tels que les produits laitiers ou à base de lait) est essentiel. Cela pourrait être particulièrement pertinente étant donné que de nombreuses procédures standard considèrent l'extraction directe de l'ADN à partir d'un échantillon à l'aide d'enzymes lytiques qui ne sont pas adaptées à la lyse endospores, qui sera ainsi être négligée. Avec la méthode présentée ici, les cellules peuvent être enlevés et analyse subséquente fourniront des réponses à la présence ou l'absence d'endospores par opposition aux cellules. Les autres applications comprennent l'analyse des communautés de endospores dans différents échantillons de l'environnement (par exemple la glace ou des carottes de sédiments ) qui sont des archives historiques de conditions environnementales. Dans de nombreux environnements avec envi relativement stableconditions Tal (pour surface des sédiments du lac par exemple) endospores Firmicutes peut prospérer sous la forme de cellules végétatives. Lorsque les conditions se détériorent (par exemple, par l'épuisement des nutriments durant l'enfouissement des sédiments ou l'orientation vers des conditions anaérobies), les cellules se déplacent dans endospore Etat. Par conséquent, les communautés de endospores Récupérée de carottes de sédiments peuvent refléter les conditions environnementales au moment de l'inhumation et donc être utilisé comme un indicateur paléoécologique des conditions préalables à l'enfouissement. Cependant, nous sommes encore recueillons des données pour étayer cette allégation.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs ont rien à révéler.
Acknowledgments
Les auteurs reconnaissent la National Science Foundation suisse pour Grant No. 31003A-132358/1, 31003A_152972 et n ° 151 948, et Fondation Pierre Mercier Pour la Science.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Whatman nitrocellulose membrane filters, 0.2 μm pore size, 47 mm diameter | Sigma-Aldrich | WHA7182004 Aldrich | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859 Sigma-Aldrich | CAS 77-86-1 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 Sigma-Aldrich | CAS 60-00-4 |
| Lysozyme from chicken egg white | Sigma-Aldrich | 62971 Fluka | powder, CAS 12650-88-3 |
| Ultra-Turrax homogenizer T18 basic | IKA | 3720000 | |
| Glass filter holders for 47 mm membranes, Pyrex glass | EMD Millipore | XX10 047 00 | |
| Chemical duty vacuum pump | Millipore | WP6122050 | 220 V/50 Hz |
| Manifold sampling filtration for 25 mm membranes | Millipore | 1225 Sampling Manifold | polypropylene |
| Dnase | New England Biolabs | M0303S | Rnase free |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 Sigma-Aldrich | CAS 1310-73-2 |
| Sodium dodecyl sulfphate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 Sigma | |
| Whatman nitrocellulose membrane filters, 0.2 μm pore size, 25 mm diameter | Sigma-Aldrich | WHA7182002 Aldrich |
References
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