Introduction
L'obiettivo di questo lavoro è quello di fornire un protocollo per la separazione di endospore batteriche da cellule batteriche vegetative in campioni ambientali. La formazione di endospore batteriche è una strategia di sopravvivenza, di solito innescato da inedia, trovato in un certo numero di gruppi di batteri appartenenti al phylum Firmicutes 1. Batteri che formano endospore sono ben studiati, soprattutto a causa di un numero di ceppi sono patogeni e quindi di importanza medica (per esempio, il Bacillus anthracis o Clostridium difficile). Ceppi ambientali di batteri che formano endospora sono stati isolati da praticamente ogni ambiente (suolo, acqua, sedimenti, aria, ghiaccio, intestino umano, gli animali intestino, e altro) 1-3. Pertanto, Firmicutes sono la seconda phylum più abbondante nel collezioni di colture 4.
A causa delle loro proteine resistenti corteccia esterna e nucleo protettivo, endospore possono sopravvivere a condizioni ambientali estreme che vanno from essiccazione a radiazioni elevate, temperature estreme e sostanze chimiche nocive 5. Questo notevole resistenza lo rende una sfida per estrarre il DNA da endospore 6-8. Questo probabilmente spiega perché sono stati trascurati negli studi di sequenziamento ambientale 9,10. Altri metodi, come ad esempio il targeting di endospore in campioni ambientali da anticorpi fluorescenti 11, la quantificazione di acido dipicolinico (DPA) nel suolo e nei sedimenti 13 12, citofluorimetria 14 o la pastorizzazione e la successiva coltivazione 15,16 sono stati utilizzati per recuperare o quantificare endospores in campioni ambientali. Negli ultimi anni, metodi di estrazione del DNA ottimizzato così come primers molecolari specifici per indirizzare sequenze geniche specifiche endospora sono stati sviluppati 10,17-20. Ciò ha contribuito a rivelare di più la biodiversità tra questo gruppo di batteri 21 e ha portato anche ad applicazioni nell'industria e in medicina per il rilevamento di endospore, Per esempio in latte in polvere 19.
Il protocollo qui presentata si basa sulla differenza di resistenza alle condizioni fisico-chimiche nocive (quali calore e detergenti) di endospore batteriche relativi alle cellule vegetative. Per distruggere le cellule vegetative in un campione, noi applichiamo consecutivamente calore, lisozima e basse concentrazioni di detergenti. Il tempo e la forza di questi trattamenti sono stati ottimizzati in modo da non distruggere le spore, ma per lisare tutte le cellule vegetative. Alcune cellule in un pool di cellule ambientale sono più resistenti di altre, per cui al fine di aumentare la probabilità di distruggere tutte le cellule vegetative, si applicano tre diversi trattamenti. Il vantaggio e la novità di questo metodo è che i endospore dopo il trattamento sono ancora intatte e possono essere utilizzati per ulteriori analisi a valle. Questi includono l'estrazione del DNA, PCR quantitativa (qPCR) e amplicone o sequenziamento metagenomica (di mira in particolare il gruppo di endospore e riducendo diversity, aumentando la copertura). Le endospore potrebbero essere utilizzati anche per la coltivazione a valle o la quantificazione mediante microscopia a fluorescenza, citometria a flusso, o il rilevamento di DPA. Una caratteristica importante di questo metodo è che confrontando un campione non trattato con un campione trattato, si può dedurre la quantità e la diversità di endospore in un campione ambientale, oltre alla componente corrispondente al vegetative cellule.
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Protocol
1. Preparazione di prodotti chimici e attrezzature
- Fare 500 ml di una esametafosfato di sodio all'1% (SHMP) (NaPO 3) n soluzione e sterilizzare in autoclave.
- Sterilizzare nitrocellulosa (NC) filtri (diametro dei pori 0,22 micron, 47 mm di diametro) in autoclave in vetro chiuso Petri.
- Sterilizzare filtri NC (dimensione dei pori di 0,22 micron, 25 mm di diametro) in autoclave in vetro chiuso piastre di Petri.
- Pesare e prendere nota del peso a vuoto di sterili provette da 50 ml (con tappo) (un tubo per campione).
- Preparare Tris-EDTA-buffer (TE-buffer) 1x: rendere la soluzione di 10 mM Tris (tris (idrossimetil) aminometano) e 1 tampone mM EDTA. Regolare il pH a 8 e sterilizzare in autoclave.
- Preparare la soluzione di lisozima (20 mg / ml) sciogliendo 0,02 g di lisozima in 1 ml di TE-buffer. Idealmente, fare fresco ogni volta. Conservare a 4 ° C per non più di 1 settimana.
- Preparare la soluzione fisiologica sciogliendo 8 g / l di cloruro di sodio(NaCl) in acqua distillata. Sterilizzare in autoclave.
2. Separazione di biomassa da sedimenti
- Aggiungere 3 g di campione di sedimento di pre-pesare sterili provette da 50 ml con palline di metallo etanolo fiammato. Eseguire questo in una, UV sterilizzata armadio biosicurezza pulito per evitare la contaminazione.
- Aggiungere 15 ml di una sterile (autoclave) Soluzione SHMP 1% al campione utilizzando una sterile buretta. La soluzione può SHMP inoltre il filtraggio per evitare la contaminazione.
- Omogeneizzare il sedimento e la soluzione SHMP con un dispersore liquido / omogeneizzatore (ad esempio, Ultra-Turrax omogeneizzatore). 70% di etanolo o sterilizzare in autoclave il rotore di dispersione prima dell'uso. Eseguire l'omogeneizzazione per 1 min a 17.500 rpm. Lasciare riposare campione per 2 minuti e ripetere l'omogeneizzazione per 1 min alla stessa velocità del rotore.
- Lasciate riposare il campione per 10 min. A questo punto, le particelle più pesanti (minerali) si sistemerà. Le cellule ei componenti organici del campione tuttavia wmalato rimangono in soluzione. Successivamente, trasferire la soluzione surnatante (contenente biomassa cellulare) in una provetta pulita da 50 ml, facendo attenzione a non disturbare il pellet sedimento.
- Per il pellet sedimento aggiungere nuovamente 15 ml di una sterile (autoclave) Soluzione SHMP 1% con una sterile buretta. Poi ripetere i punti 2.3 e 2.4. Questa ripetizione assicura la separazione della quantità massima di cellule e particelle organiche dalla componente minerale del sedimento. Il supernatante di questa seconda separazione può essere fusa con il supernatante dal prima separazione.
Nota: Le seguenti operazioni sono tutti fatti sul surnatante (contenente biomassa cellulare). La componente minerale (sedimenti pellet) può essere scartato. - Centrifugare il campione a 20 xg per 1 min. Questo passaggio aumenta la forza g sufficiente per risolvere piccole particelle minerali mentre il materiale cellula biologica rimane in soluzione. Dopo centrifugazione, trasferire la soluzione surnatante (contenente biomassa cellulare) in unpulito tubo da 50 ml. Eliminare il pellet minerale.
- Determinare il volume finale della soluzione contenente biomassa pesando il campione. La determinazione del peso evita di dover trasferire il campione ad un cilindro graduato e riduce il rischio di contaminazione.
3. Raccolta di biomassa su membrana filtrante
- Preparare unità di filtrazione (per 47 mm di membrane di diametro) e pompa del vuoto. Sterilizzare l'unità di filtrazione sia in autoclave o (se Pyrex vetro) spruzzando con il 70% di etanolo e fiamme con un becco Bunsen. Lasciate raffreddare prima di continuare con il protocollo.
- Aggiungere sterili membrana NC all'unità di filtrazione con pinze sterilizzate etanolo fiammato.
- Aggiungere metà del campione surnatante (dal punto 2.6) sul gruppo di filtrazione a membrana e raccogliere le cellule sulla membrana utilizzando la pompa a vuoto.
- Quando il liquido è completamente passata attraverso il filtro, arrestare la pompa per vuoto e rimuovere con cautela la membrana utilizzando ethanol-fiamma pinza sterilizzata. Posizionare la membrana in una piastra di Petri sterile.
- Tagliare la membrana a metà con le forbici sterilizzate etanolo fiammato. Aggiungere ogni metà della membrana su un tubo separato 2 ml. Una metà della membrana sarà utilizzata per l'estrazione del DNA e l'analisi dell'intera comunità batterica. L'altra metà del filtro sarà conservato a -80 ° C e serve come backup.
- Posizionare nuova membrana NC sul gruppo di filtrazione e raccogliere biomassa dalla seconda metà del volume del campione (dal punto 2.6) con la pompa a vuoto.
- Quando il liquido è completamente passata attraverso il filtro, arrestare la pompa per vuoto e rimuovere con cautela la membrana con pinze sterili etanolo fiammato. Posizionare tutta la membrana in un tubo separato 2 ml. Questo campione verrà utilizzato per il trattamento di separare endospore da cellule vegetative. Il campione può essere conservato a -20 ° C fino al momento dell'uso.
4. Lisi di cellule vegetative
- Eseguire latrattamento per separare endospore dalle cellule vegetative sulla biomassa precedentemente raccolto su una membrana NC (passo 3.6).
- Se la membrana è stato congelato, lasciarlo a temperatura ambiente per 10 minuti per scongelare. Poi posto la membrana in una piastra di Petri sterile e tagliarlo (circa 4 volte) in pezzi più piccoli con le forbici sterilizzate etanolo fiammato. Poi posto tutti i pezzi del filtro a membrana in una provetta sterile da 2 ml.
- Aggiungere 900 ml di 1x TE (Tris-EDTA) Buffer (vedi 1.5) per il tubo contenente la membrana campione e mescolare accuratamente vortice. A questo punto, la biomassa viene rimosso dalla membrana nella soluzione TE-buffer.
- Porre il tubo in un incubatore a 65 ° C per 10 min e 80 rpm. Successivamente rimuovere il tubo dal termostato e lasciarlo raffreddare per 15 minuti.
- Aggiungere 100 ml di lisozima preparata di fresco (vedi 1.5) per ottenere una concentrazione finale di 2 mg / ml. Non aggiungere il lisozima prima che il campione è raffreddato a 37 ° C, in quanto questo potrebbe degRade l'enzima.
- Incubare il campione a 37 ° C per 60 min e 80 rpm, le condizioni ottimali per il lisozima di lisare cellule vegetative.
- Dopo lisi è completa, aggiungere 250 ml di idrossido di 3 N di sodio (NaOH) e 250 ml di soluzione al 6% sodio dodecilsolfato (SDS) al campione. Aggiungendo questo, il volume del campione raggiunge 1,5 ml e vi è una concentrazione finale di 0,5 N NaOH e concentrazione finale di 1% SDS.
- Incubare la miscela a temperatura ambiente per 60 min e 80 rpm. Aggiunta la base e detergenti aiuterà nella lisi cellulare finale. La concentrazione di questi detergenti è stato ottimizzato per non danneggiare le endospore, mentre lisi cellule vegetative.
- Preparare un'unità di filtrazione sterile che contiene 25 mm di diametro membrane in autoclave, o (se Pyrex vetro) spruzzandolo con 70% etanolo e fiamme con un becco Bunsen. Lasciate raffreddare.
- Posizionare un NC membrana 0,2 micron (diametro 25 mm) in unità di filtrazione con pinze etanolo fiamma sterilizzati. </ li>
- Aggiungere il campione dal punto 4.7 sulla membrana e filtrare il liquido con la pompa a vuoto. Quando il liquido è passato attraverso, spegnere pompa a vuoto. A questo punto, il materiale cellula vegetativa lisato viene rimosso, in quanto non è trattenuto sulla membrana. Solo endospore rimarranno sulla membrana.
- Aggiungere 2 ml di soluzione fisiologica sterile per lavare detergenti residue e filtrare il liquido con la pompa a vuoto.
- Quando il liquido è completamente filtrato, spegnere la pompa del vuoto. Lasciare la membrana sul gruppo di filtrazione.
5. Il trattamento DNasi
Nota: eseguire il trattamento DNasi direttamente sulla membrana del filtro. È importante che l'unità di filtrazione non perde e la pompa a vuoto è spento.
- Aggiungere 450 ml di acqua sterile, 50 ml di tampone di reazione DNasi (1x) e 0,5 microlitri DNasi enzima direttamente sulla membrana del filtro e lasciar riposare per 15 minuti. Se possibile, fare questo digestione in una stanza che è un po 'di guerramer della media RT, poiché l'enzima funziona meglio a temperature di 25 ° C e oltre.
Nota: Mantenere il becco Bunsen parte l'unità di filtrazione aumenta anche la temperatura e ha il vantaggio di mantenere le frazioni sterile, quindi ridotto rischio di contaminazione dei campioni. - Quando la digestione DNasi è terminato, accenda la pompa del vuoto per rimuovere l'enzima dal campione.
- Lavare enzimatica residua aggiungendo e filtrando 1 ml di soluzione fisiologica.
- Se del liquido è completamente superato, spegnere pompa del vuoto e rimuovere la membrana filtro contenente endospore con pinza sterile e posizionarlo in una piastra di Petri sterile.
Nota: Il campione di endospore separati è ora pronto per l'analisi a valle. Conservare a -20 ° C se utilizzato per l'estrazione del DNA oppure a 4 ° C se utilizzato per la germinazione e la coltivazione.
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Representative Results
I risultati presentati qui sono stati pubblicati in precedenza 10,21. Si prega di fare riferimento a tali articoli per l'interpretazione ambientale e discussione dei dati.
La procedura generale è riassunto in Figura 1 e corrisponde a tre fasi principali: in primo luogo, la separazione della biomassa da sedimenti o qualsiasi altra matrice ambientale; secondo, la distruzione di cellule vegetative; e terzo, l'analisi a valle delle endospore separati. Analisi valle potrebbe consistere, ad esempio, di estrazione del DNA e amplicon sequencing per determinare diversità. L'estrazione di DNA deve essere ottimizzato per garantire lisi di endospore. In campioni di sedimento, abbiamo raggiunto questo utilizzando un forte DNA sequenziale procedura di estrazione 10. L'applicazione del metodo in sedimenti dimostra un significativo aumento della frazione di-endospora formare Firmicutes dopo la separazione. In ampliconi sequenziamento del 16S rRNAgene, Firmicutes nei campioni non trattati (un'intera comunità) corrispondeva solo 8,0 e 19,0% delle sequenze (Tabella 1). Al contrario, dopo il trattamento Firmicutes rappresentato 90,6% e 83,9% del campione endospore arricchito. I due principali ordini di-endospora formare Firmicutes, Bacilliales e Clostridiales, sono stati arricchiti con il metodo, in contrasto con l'assenza di ordini come Lactobacilliales che sono non-endospora formando Firmicutes. Per dimostrare che il metodo è particolarmente adatto per l'arricchimento dei veri endospore, sono stati analizzati anche altri gruppi capaci di produrre strutture spore-like. Pertanto, la frequenza di Actinobacteria, cianobatteri e Myxococcales diminuito dopo il trattamento per lisare le cellule.
L'efficacia del trattamento è stata anche dimostrata usando colture pure. Una preparazione endospore (> 95%) di endospore Paenibacillus alvei, Bacillus subtilis e Bacillus megaterium Escherichia coli, sono stati trattati come descritto nel protocollo per la lisi delle cellule vegetative. Tutte le colture sono state poi incubate in brodo nutriente a 37 ° C e la crescita è stata misurata utilizzando densità ottica a 600 nm di lunghezza d'onda. La crescita è stata osservata per le culture endospora mentre nessuna crescita è stata osservata nel E. trattata cultura coli, dimostrando che le cellule vegetative sono irreversibilmente danneggiato (Figura 2).
Figura 1. Panoramica della procedura sperimentale. Procedura utilizzata per arricchire i batteri endospora formando in campioni ambientali. La fase di separare cellule e endospore dalla matrice ambientale può essere omessa a seconda del tipo di campione (cioè, campione d'acqua). Nella figura i metodi applicati a valle sulla frazione corre spore arricchitaspondere a estrazione del DNA e sequenziamento ad alta produttività. Questi passaggi possono essere sostituite da colture. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Verifica del trattamento su colture pure. Le curve di crescita verifica la crescita di batteri endospora formando da una sospensione di endospore di Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, e Paenibacillus alvei e una coltura cellulare di Escherichia coli trattati con il metodo per la lisi di cellule. Trattata = ○. Non trattata = ●. Le barre di errore di tre culture indipendenti. La crescita di colture di controllo e ricrescita delle colture trattate è stata misurata come densità ottica a 600 nm di lunghezza d'onda. Questo dato è stato ristampato from Wunderlin et al. 2014, con il permesso. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| Sedimenti 1 | Sedimenti 2 | |||
| tutta la comunità | endospora arricchita | tutta la comunità | endospora arricchita | |
| Firmicutes | 8.0 | 90.6 | 19.0 | 83.9 |
| Bacilli | 0.5 | 10.0 | 5.7 | 15.1 |
| Clostridi | 7.4 | 76.9 | 12.5 | 63.2 |
| Actinobacteria | 2.4 | 1.0 | 4.4 | 2.1 |
| I cianobatteri | 1.1 | 0.1 | 0.7 | 0.1 |
| Myxococcales | 0.7 | 0.0 | 0.2 | 0.0 |
| Altri batteri | 87.8 | 8.3 | 75.7 | 13.9 |
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Discussion
La resistenza di endospore a fattori fisico-chimici aggressivi esterni (ad esempio, temperatura o detergenti) è stato usato per elaborare un metodo per separare endospore batteriche da cellule vegetative in campioni ambientali. Questo è il primo metodo completo per isolare endospore da campioni ambientali in modo non distruttivo. I metodi precedenti per quantificare, rilevare o analizzare endospore in campioni erano basati sulla misurazione delle deleghe specifiche per endospore come l'acido dipicolinico o geni marcatori specifici. Al contrario, con il protocollo qui presentati, i componenti del campione diversi endospore vengono rimossi e quindi le endospore eventualmente rimangono come unico e purificati resti del campione. Sebbene altri metodi come la pastorizzazione o centrifugazione in gradiente di densità sono state proposte per arricchire per endospore 22 I test hanno mostrato che in gradiente di densità centrifugazione non è appropriato come un metodo generale per campioni ambientali, A causa delle differenze fisiologiche e differenti densità di varie specie di endospora-formatori (dati non riportati). Al contrario, il nostro protocollo può essere facilmente applicato a tutti i tipi di campioni ambientali ed è adatto per applicazioni a valle compresi metodi molecolari o coltura.
Ci sono due passi fondamentali nel protocollo. La prima è la separazione della biomassa dalla matrice del campione (cioè particelle di sedimento). È essenziale che il numero di cellule separate dalla matrice essere massimizzata, in modo da non trascurare parte della diversità. Per campioni di sedimento, come qui utilizzato, una delle principali limitazioni del protocollo è il fatto che alcune cellule o spore potrebbero non essere state staccate dalla matrice sedimenti e quindi non inclusi nell'analisi a valle, che è una potenziale limitazione del metodo . A seconda della matrice del campione (ad esempio se vi sono acidi umici), le cellule possono essere strettamente legati ad esso e quindi difficili da rilasciare.L'uso di tampone ortofosfato, nonché una buona omogeneizzazione con un omogeneizzatore o frullatore sono importanti in questa fase. Per stimolare la ripresa, la procedura di omogeneizzazione e la rimozione della biomassa è ripetuta due volte come scritto nel protocollo. Il protocollo qui descritto è stato sviluppato e ottimizzato per i campioni di sedimenti lago d'acqua dolce. Alcuni parametri possono non essere ottimale per altri tipi di campioni. Un modo per analizzare la frazione comunità che è stata potenzialmente trascurato nel processo sarebbe quello di sottoporre la matrice sedimento di estrazione del DNA e amplicon sequenziamento. Come possibili modifiche alla tecnica, la fase di separazione della biomassa dalla matrice del campione può essere omessa. In particolare, se il campione ambientale non contiene materiali o minerali particelle organiche che potrebbero interferire con il protocollo a valle (ad esempio, acqua, altri liquidi o culture purificate), può non essere necessaria la separazione prima. Per i campioni di liquido il protocollo può iniziare direttamente a capitolo 3(Collezione di biomassa su membrana filtrante).
Il secondo passo importante del protocollo è il trattamento con lisozima, il calore, NaOH e SDS per distruggere le cellule vegetative. Temperatura, durata e concentrazione di sostanze chimiche sono stati ottimizzati per non danneggiare endospore, mentre distrugge le cellule. Questi parametri devono essere pertanto strettamente mantenute come sono. L'uso di una prima fase di riscaldamento del campione a 65 ° C è molto efficace per selezionare specificamente per endospore rispetto ad altri tipi di spore batteriche o strutture spore simili si verificano tra i phyla batterica Actinobacteria, Myxobacteria, cianobatteri, che non sono generalmente resistente al calore. Come si vede nella Tabella 1, non formano spore batteri sono ancora presenti dopo il trattamento (8,3% al 14%). Alcune spiegazioni per questo sono che i campioni di sedimenti sono molto complessi e possono anche porto cellule non-spore resistenti. Inoltre, il materiale organico residuo può consentire una certa cellule ttached di sopravvivere al trattamento. Al fine di ridurre ulteriormente la percentuale di cellule non sporigeni nei campioni trattati, il metodo deve essere ottimizzato il tipo di campione individuale.
Il metodo rappresenta uno strumento innovativo per lo studio mirato di endospora-formatori in campioni ambientali. Il trattamento per distruggere le cellule vegetative può essere testata su colture pure di cellule e endospore ed adattabile ad resistenza individuale di cellule. La distruzione di cellule può essere visto nelle curve di colture trattate mostrati in Figura 2. Il ritardo della crescita delle colture trattate può essere dovuto al tempo che endospore bisogno di ri-germinare e passare alla fase di crescita esponenziale. Altre spiegazioni possibili per questo ritardo potrebbe anche essere un indebolimento della cultura endospore oi numeri cellulari inferiori dopo il trattamento. Se le endospore separati non sono utilizzati per l'estrazione del DNA, l'ultima fase di trattamento DNasi può essere omesso.
nt "> potrebbe prevedere future applicazioni di questa tecnica in settori in cui è necessario rilevare endospore patogeni. Un esempio è nell'industria alimentare e ricerca clinica, dove la rilevazione e l'analisi (per l'identificazione) di endospore, e la sua differenziazione da cellule vegetative (ad esempio, da prodotti di alimenti come il latte o a base di latte) è fondamentale. Questo potrebbe essere particolarmente rilevante se si considera che molte procedure standard considerano estrazione del DNA direttamente da un campione utilizzando enzimi litici che non sono adatte per la lisi endospore, che sarà quindi essere trascurato. Con il metodo qui presentato, le cellule possono essere rimossi e successiva analisi forniranno risposte alla presenza o assenza di endospore in contrapposizione alle cellule. Altre applicazioni includono l'analisi delle comunità endospora diversi campioni ambientali (ad esempio ghiaccio o di sedimenti ) che sono archivi storici delle condizioni ambientali. In molti ambienti con environmen relativamente stabilecondizioni Tal (ad esempio lago superficiale di sedimenti)-endospora formando Firmicutes può prosperare in forma di cellule vegetative. Quando le condizioni si deteriorano (ad esempio esaurimento degli elementi nutritivi durante sedimenti sepoltura o l'orientamento verso condizioni anaerobiche) le cellule si muovono in endospora stato. Pertanto, le comunità endospora recuperati da campioni di sedimenti in grado di riflettere le condizioni ambientali al momento della sepoltura e quindi essere utilizzata come indicatore paleoecologica delle condizioni preliminari per la sepoltura. Tuttavia, stiamo ancora raccogliendo informazioni a sostegno di questa affermazione.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori riconoscono la National Science Foundation svizzero per Grant No. 31003A-132358/1, 31003A_152972 e n 151.948, e Fondazione Pierre Mercier pour la Science.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Whatman nitrocellulose membrane filters, 0.2 μm pore size, 47 mm diameter | Sigma-Aldrich | WHA7182004 Aldrich | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859 Sigma-Aldrich | CAS 77-86-1 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 Sigma-Aldrich | CAS 60-00-4 |
| Lysozyme from chicken egg white | Sigma-Aldrich | 62971 Fluka | powder, CAS 12650-88-3 |
| Ultra-Turrax homogenizer T18 basic | IKA | 3720000 | |
| Glass filter holders for 47 mm membranes, Pyrex glass | EMD Millipore | XX10 047 00 | |
| Chemical duty vacuum pump | Millipore | WP6122050 | 220 V/50 Hz |
| Manifold sampling filtration for 25 mm membranes | Millipore | 1225 Sampling Manifold | polypropylene |
| Dnase | New England Biolabs | M0303S | Rnase free |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 Sigma-Aldrich | CAS 1310-73-2 |
| Sodium dodecyl sulfphate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 Sigma | |
| Whatman nitrocellulose membrane filters, 0.2 μm pore size, 25 mm diameter | Sigma-Aldrich | WHA7182002 Aldrich |
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