Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

المناهج التجريبية لدراسة الميتوكوندريا التعريب وظيفة من دورة الخلية النووية كيناز، Cdk1

doi: 10.3791/53417 Published: February 25, 2016

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

في الثدييات، تقدم دورة الخلية يعتمد على الأحداث أمر غاية التي تسيطر عليها الحلقيات وتحركات تعتمد على السيكلين (Cdks) 1. من خلال حشوية لها، والطاقة النووية، وتوطين centrosomal، CyclinB1 / Cdk1 قادر على مزامنة الأحداث المختلفة في الانقسام مثل انهيار الغلاف النووي والانفصال الجسيم المركزي 2. CyclinB1 / Cdk1 يحمي الخلايا الإنقسامية ضد الخلايا 3 ويعزز الانشطار الميتوكوندريا، خطوة حاسمة لتوزيع متساو للالميتوكوندريا في الخلايا الوليدة التي شكلت حديثا 4.

في تكاثر خلايا الثدييات، يتم إنشاء الميتوكوندريا ATP عن طريق الفسفرة التأكسدية (OXPHOS) الأجهزة (الإلكترون سلسلة النقل)، الذي يتكون من 5 مجمعات متعددة فرعية. أنا معقدة - V معقدة (CI-CV). ثنائي النوكليوتيد نيكوتيناميد الأدينين (NADH): مؤكسدة مختزلة يوبيكوينون أو معقدة الأول (CI) هو الأكبر والأقل يفهم من المجمعات الخمسة 5. ج معقدةonsists من 45 وحدات فرعية، منها 14 تشكل جوهر الحفاز. تجميعها مرة واحدة، يفترض مجمع هيكل على شكل حرف L مع ذراع واحدة بارزة في مصفوفة والذراع الأخرى جزءا لا يتجزأ من 6،7 الغشاء الداخلي. الطفرات في مفارز CI هي السبب في مجموعة متنوعة من اضطرابات الميتوكوندريا 8. مطلوب CI فعال وظيفيا في OXPHOS ليس فقط للتنفس الميتوكوندريا العام ولكن أيضا لخلية الناجحة دورة التقدم 10. يمكن التكشف الآليات الكامنة وراء عمل هذا المجمع انزيم بغشاء في الصحة والمرض تمكن من وضع إجراءات تشخيصية جديدة والاستراتيجيات العلاجية المتقدمة. في دراسة أجريت مؤخرا، وجدنا أن CyclinB1 / Cdk1 مجمع translocates في الميتوكوندريا في (الفجوة 2) G2 / (الانقسام) المرحلة M وphosphorylates مفارز CI إلى تعزيز إنتاج الطاقة في الميتوكوندريا، يحتمل أن تكون لتعويض زيادة احتياجاتها من الطاقة من الخلايا خلال خلية دورة 11. نحن هنا SHOwcase الإجراءات التجريبية والاستراتيجيات التي يمكن استخدامها لدراسة النبات الميتوكوندريا من تحركات خلاف النووية / هيولي، ركائز من الميتوكوندريا وكذلك العواقب الوظيفية للتوطين الميتوكوندريا الخاصة بهم باستخدام CyclinB1 / Cdk1 كمثال على ذلك.

ورأت أن CyclinB1 / Cdk1 مجمع translocates في الميتوكوندريا عند الحاجة دفعت دراسات overexpression-الميتوكوندريا محددة وضربة قاضية لهذا المجمع. لتحقيق التعبير عن الميتوكوندريا محدد من البروتينات، يمكن للمرء أن إضافة تسلسل الميتوكوندريا التي تستهدف (MTS) في N-محطة من البروتين من الفائدة. الميتوكوندريا التي تستهدف تسلسل تسمح للفرز بروتينات الميتوكوندريا في الميتوكوندريا التي يقيمون فيها عادة 12. لقد استخدمت 87 الميتوكوندريا قاعدة تستهدف تسلسل المستمدة من السلائف السيتوكروم البشري ج أوكسيديز فرعية 8A (COX8) والمستنسخة ذلك إلى البروتين الفلوري الأخضر (GFP) -tagged CyclinB1 أو الأحمر نيونبروتين (RFP) -tagged Cdk1 تحتوي على البلازميدات في الإطار. يسمح هذا الأسلوب لنا لاستهداف CyclinB1 وCdk1 في الميتوكوندريا، وتغيير وجه التحديد التعبير الميتوكوندريا من هذه البروتينات دون أن يؤثر ذلك تجمع النووي. عن طريق وضع علامات fluorescently هذه البروتينات، كنا قادرين على مراقبة التعريب في الوقت الحقيقي. وبالمثل، أدخلنا MTS إلى البلازميد التي تحتوي على الموسومة طلب تقديم العروض المهيمنة سلبية Cdk1، الذي سمح لنا أن يطرق على وجه التحديد أسفل التعبير وظائف الميتوكوندريا من Cdk1. لا بد من التمييز بين وظائف الميتوكوندريا والنووية للتحركات التي لديها تعريب المزدوجة مثل Cdk1. هندسة MTS إلى N-محطة من هذه تحركات الوظيفية المزدوجة يقدم استراتيجية كبيرة أن من السهل استخدامها وفعالة.

منذ Cdk1 هو كيناز دورة الخلية، وهو أساسي لتحديد تقدم دورة الخلية عندما يكون موضعيا Cdk1 إلى الميتوكوندريا. ولتحقيق ذلك، فإننا قد تستخدم لmetho جديدد لمراقبة محتوى الحمض النووي في الخلايا. وتشمل الأساليب التقليدية باستخدام BrdU (bromodeoxyuridine)، والثيميدين التماثلية الاصطناعية، والتي تضم في الحمض النووي مركبة جديدة خلال مرحلة من مراحل دورة الخلية إلى استبدال الثيميدين. ثم الخلايا التي يتم تكرار بنشاط عينات من الحمض النووي يمكن أن يتم الكشف باستخدام الأجسام المضادة ضد BrdU. ومن عيوب هذا الأسلوب هو أنه يتطلب تمسخ من الحمض النووي لتوفير وصول الأجسام المضادة BrdU بواسطة أساليب قاسية مثل العلاج حامض أو الحرارة، مما قد يؤدي إلى عدم تناسق بين النتائج 13،14. بدلا من ذلك، نحن تستخدم نهجا مماثلا لمراقبة تقسيم الخلايا بنشاط مع التناظرية ثيميدين مختلفة، EDU. لا يتطلب الكشف ايدو قاسية تمسخ الحمض النووي كما تمكن العلاج المنظفات معتدل الكاشف الكشف للوصول إلى ايدو في الحمض النووي توليفها حديثا. وقد ثبت أن طريقة ايدو لتكون أكثر موثوقية، بما يتفق ومع إمكانية تحليل الإنتاجية العالية (15).

وأخيرا، رس تحديد ركائز الميتوكوندريا من Cdk1، استخدمنا أداة البروتينات تسمى 2D-DIGE، وهو نسخة مطورة من الكلاسيكية الكهربائي للهلام ثنائي الأبعاد. اثنين الكهربائي الأبعاد يفصل البروتينات وفقا لنقطة تساوي الكهربائية في البعد الأول والوزن الجزيئي في الثانية. منذ مرحلة ما بعد التعديلات متعدية مثل الفسفرة تؤثر على نقطة تساوي الكهربائية والوزن الجزيئي للبروتينات، يمكن أن المواد الهلامية 2D كشف عن الاختلافات بين الحالات الفسفرة من البروتينات داخل عينات مختلفة. حجم (المساحة وكثافة) من البروتين البقع التغييرات مع مستوى التعبير من البروتينات، مما يتيح المقارنة الكمية بين عينات متعددة. باستخدام هذا الأسلوب، كنا قادرين على التفريق بين البروتينات فسفرته في النوع البري مقابل Cdk1 الخلايا معربا عن متحولة استهداف الميتوكوندريا. تم عزل البقع البروتين المحددة التي أظهرت في النوع البري ولكن في عداد المفقودين في متحولة إعداد Cdk1 استهداف الميتوكوندريا وحددت عن طريق قياس الطيف الكتلي.

في المواد الهلامية 2D التقليدية، وتستخدم الأصباغ ثلاثي فينيل ميثان لتصور البروتينات على هلام. يستخدم 2D-DIGE تسميات بروتين فلوري مع تأثير ضئيل على البروتين التنقل الكهربي. عينات البروتين مختلفة يمكن أن توصف مع الأصباغ الفلورية مختلفة، مختلطة مع بعضها البعض وتفصل بينها المواد الهلامية متطابقة، والسماح للزملاء الكهربائي من عينات متعددة على هلام واحد 16. هذا يقلل من الاختلافات جل إلى جيل، وهي مشكلة خطيرة في دراسات البروتينات القائم على هلام.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. عزل الميتوكوندريا من الخلايا المستزرعة

  1. إعداد عزل العازلة للخلايا (IBC) العازلة
    1. تحضير 0.1 M تريس / اجتماعات الأطراف (تريس (hydroxymethyl) aminomethane / 3- (N -morpholino) حمض propanesulfonic): ذوب 12.1 غرام من تريس في 800 مل من الماء المقطر، وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 باستخدام مسحوق اجتماعات الأطراف، إضافة الماء المقطر إلى ما مجموعه حجم 1 لتر وتخزينها في 4 درجة مئوية.
    2. تحضير 0.1 M EGTA (الايثيلين جلايكول مكرر (2-aminoethyl الأثير) حمض tetraacetic) / تريس: ذوب 38.1 غرام من EGTA في 800 مل من الماء المقطر، وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 باستخدام مسحوق تريس، إضافة الماء المقطر إلى إجمالي حجم 1 لتر وتخزينها في 4 درجة مئوية.
    3. إعداد 1 M السكروز: ذوب 34.23 غرام من السكروز في 100 مل من الماء المقطر، وجعل 20 مل قسامات، ومخزن في -20 درجة مئوية.
    4. إعداد العازلة ج IB: إعداد 100 مل من IB ج العازلة بإضافة 10 مل من 0.1 M تريس / اجتماعات الأطراف و1 مل من 0.1 M EGTA / تريس إلى 20 مل، من 1 M السكروز. إضافة الماء المقطر إلى إجمالي حجم 100 مل. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4.
  2. إعداد خلية الاحتياطي تحلل
    1. إعداد العازلة تحلل تحتوي على 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (7.5 درجة الحموضة)، 150 مم كلوريد الصوديوم، 1 ملم EDTA (الإثيلين diamino حمض tetraacetic)، 1 ملي EGTA، 1٪ تريتون-X-100، 2.5 ملم الصوديوم بيروفوسفات، 1 ملم β- سكرولي، 1 ملم الصوديوم orthovanadate. إضافة مثبطات بروتين 1 ميكروغرام / مل Leupeptin و1 ملم PMSF (phenylmethylsulfonyl الفلورايد) الحق قبل الاستخدام.
  3. عزل الميتوكوندريا
    1. حصاد 3 × 10 7 الخلايا مع الثلج الباردة برنامج تلفزيوني 1X (الفوسفات التخزين المؤقت المالحة)، ودرجة الحموضة 7.4 وأجهزة الطرد المركزي الخلايا في 600 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية. تجاهل طاف وإعادة تعليق بيليه في 5 مل العازلة IB ج الجليد الباردة.
    2. تجانس الخلايا باستخدام طاحونة الأنسجة الزجاجية / زجاج لمدة 10 دقيقة. نقل جناسة لأنبوب 15 مل وأجهزة الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 10 ميلن في 4 درجة مئوية. لالميتوكوندريا وظيفية، واستخدام اقتران الزجاج / تفلون كما أنه أقل ضررا على الميتوكوندريا من طاحونة الأنسجة الزجاجية / زجاج.
    3. جمع طاف في أنابيب 1.5 مل وأجهزة الطرد المركزي في 7000 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية. طاف لنقل أنبوب 1.5 مل، وباستثناء ما بروتين العصارة الخلوية.
    4. يغسل بيليه (الميتوكوندريا) مرتين مع 200 ميكرولتر الجليد الباردة عازلة IB ج وأجهزة الطرد المركزي في 7000 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية.
    5. تجاهل طاف وإعادة تعليق بيليه في المخزن المؤقت خلية تحلل واستخدامها على الفور أو تخزين في -80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل. إذا كانت هناك حاجة الميتوكوندريا وظيفية، وإعادة تعليق بيليه في المخزن المؤقت المتبقية بعد التخلص من طاف. تمييع جزء الميتوكوندريا الأخرى التي قد تؤدي إلى فقدان وظيفة الميتوكوندريا. تخزين على الجليد واستخدام إعداد في 1-3 ساعة حصول على أفضل النتائج.
    6. يصوتن بيليه معلق لمدة ثلاثين 3 انفجارات ثانية فيحمام الثلج، الطرد المركزي في 10000 x ج لمدة 5 دقائق، وحفظ طاف باعتبارها جزء الميتوكوندريا.

2. المشارك المناعية من Cdk1، CyclinB1 وCOXIV، وهو البروتين الميتوكوندريا المقيم

  1. تنمو 5 × 10 4 خلايا coverslips على في 24-جيدا لوحات O / N أو ما يصل إلى 70٪ التقاء. نضح المتوسطة وغسل الخلايا مرتين مع 500 ميكرولتر الجليد الباردة 1 × برنامج تلفزيوني، ودرجة الحموضة 7.4.
  2. إصلاح الخلايا مع 500 ميكرولتر الجليد الباردة بارافورمالدهيد 4٪ في RT لمدة 10 دقيقة. نضح الحل تحديد وغسل الخلايا مع 500 ميكرولتر 1 × PBS 3 مرات، مع كل طيف اهتزاز في RT مدة 5 دقائق.
  3. Permeabilize الخلايا مع 0.2٪ تريتون X-100 في 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق على RT. نضح الحل وغسل الخلايا 3 مرات، 5 دقائق لكل منهما مع 500 ميكرولتر برنامج تلفزيوني. إضافة عرقلة الحل (500 ميكرولتر، 1٪ BSA (الأبقار مصل الزلال) في برنامج تلفزيوني يحتوي على 1٪ توين 20) لمدة 30 دقيقة في RT.
  4. تمييع الأجسام المضادة الأولية 1: 250 (ت: ت) في 5001؛ لتر من عرقلة الحل واحتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الأولية المطلوبة التي أثيرت في الأنواع المختلفة لتجنب الإشارات عبر (CyclinB1 (الماوس) وCOXIV (أرنب) أو Cdk1 (الماوس) وCOXIV (الأرنب) في RT ل30 - 60 دقيقة أو O / N عند 4 درجة مئوية.
  5. غسل لل coverslips مع 500 ميكرولتر من 1 × PBS 3 مرات، 5 دقائق لكل منهما ثم احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية المخفف 1: 1000 في 500 ميكرولتر عرقلة الحل في RT لمدة 1 ساعة تليها الغسيل مع 500 ميكرولتر PBS 3 مرات، 5 دقائق لكل منهما.
  6. جبل لل coverslips مع 20 ميكرولتر من محلول تصاعد مكافحة تتلاشى وختم الشرائح مع طلاء الأظافر. صورة الشرائح باستخدام المجهر الفلورسنت على الفور أو تبقى في الظلام عند 4 درجة مئوية لمدة 1-2 أسابيع.

3. كربونات الصوديوم استخراج الميتوكوندريا سليمة

  1. ينمو حوالي 20 × 10 7 خلايا، والحصاد، ويغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني وعزل الميتوكوندريا كما هو موضح في القسم 1. تقسيم الميتوكوندريا يعزل إلى قسمين قدم المساواةنهاية الخبر قبل الطرد المركزي الماضي لبيليه الميتوكوندريا (قبل الخطوة 1.3.4)؛ انقاذ نصف لاستخدامها إجمالي الميتوكوندريا (الخطوة 3.2)، استخدم النصف الآخر لاستخراج كربونات الصوديوم (بعد خطوات 3،3-3،6) لفصل البروتينات القابلة للذوبان وغشاء ملزمة.
  2. ليز مجموع الميتوكوندريا بيليه مع 30 ميكرولتر من العازلة تحلل الخلايا وتخزين المحللة في -80 درجة مئوية حتى استخدامها في immunoblotting.
  3. إضافة 250 ميكرولتر من 0.1 M نا 2 CO 3 (كربونات الصوديوم)، ودرجة الحموضة 11.0، إلى النصف الآخر من بيليه الميتوكوندريا واحتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة.
  4. أجهزة الطرد المركزي في 100000 x ج لمدة 20 دقيقة. جمع طاف وانتقل إلى الخطوة 3.5. ليز بيليه باستخدام 30 ميكرولتر من العازلة خلية تحلل ويصوتن كما في الخطوة 1.3.6. تخزين في -80 درجة مئوية حتى استخدامها في immunoblotting.
  5. إضافة حجم مساو من 20٪ حمض الخليك ثلاثي الكلور تقدم طازجة (TCA) لطاف لترسيب البروتينات والحفاظ على الجليد لمدة 30 دقيقة.
  6. Centrifأويغه في 15000 x ج لمدة 10 دقيقة. تجاهل طاف، حل بيليه في 80 ميكرولتر من العازلة خلية تحلل ومخزن في -80 درجة مئوية حتى استخدامها في immunoblotting.

4. فصل الداخلية والخارجي الأغشية من الميتوكوندريا (عزل Mitoplasts)

  1. ينمو حوالي 20 × 10 7 خلايا، والحصاد، يغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني وعزل الميتوكوندريا كما هو موضح في القسم 1. فصل الكسور الميتوكوندريا إلى 10 أجزاء متساوية قبل الطرد المركزي الماضي لبيليه الميتوكوندريا (قبل الخطوة 1.3.4).
  2. حل كل بيليه في 30 ميكرولتر من تركيز المشار إليه من عازلة السكروز منخفض التوتر (1 ملم EDTA، 10 ملي اجتماعات الأطراف / KOH (هيدروكسيد البوتاسيوم)، ودرجة الحموضة 7.2، تركيز السكروز تتراوح 25-200 ملم) مع أو بدون 50 ميكروغرام / مل التربسين ( انظر الجدول 1)، واحتضان 30 دقيقة على الجليد.
  3. إضافة 3 ميكرولتر من 10 ملي PMSF (للوصول إلى تركيز النهائي من 1 ملم PMSF) إلى التربسين التي تحتوي على قوارير لوقف رانه التربسين الهضم واحتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة.
  4. أجهزة الطرد المركزي في 14000 x ج في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. نقل طاف في أنبوب جديد، ليز بيليه في 30 ميكرولتر من العازلة خلية تحلل، يصوتن كما في الخطوة 1.3.6، ومخزن في -80 درجة مئوية.

5. بناء الميتوكوندريا استهداف GFP / الموسومة طلب تقديم العروض CyclinB1 / Cdk1 المتجهات وتأكيد تلك التعريب الميتوكوندريا

  1. استنساخ الميتوكوندريا التي تستهدف تسلسل (MTS، المستمدة من السلائف السيتوكروم البشري ج أوكسيديز فرعية 8A (COX8) بين النيوكليوتيدات 76-161) في إطار في N-محطة من GFP أو طلب تقديم العروض في مواقع NheI وBamHI من pEGFP-N1 أو pERFP ناقلات -N1 باستخدام تقنيات الاستنساخ الجزيئي القياسية.
  2. عند تصميم الاشعال PCR لجينات CyclinB1 وCdk1، إضافة مواقع BamHI انزيم التقييد الاعتراف (جريئة) ل5 'من الاشعال PCR.
    إلى الأمام Cdk1 BamH15 'CAG تي GG ATC C AA TGG مجموعة الاهلي ATT ATA التقييم القطري المشترك AAA T
    عكس Cdk1 BamH1 5 "CTG تي GG ATC C TG CAT CTT CTT AAT CTG ATT
    إلى الأمام CyclinB1 BamH1 5 "ATA TGG ATC الجهاز المركزي للمحاسبات TGG CGC TCC GAG TCA
    عكس CyclinB1 BamH1 5 "ATA TGG ATC CTG CAC CTT TGC CAC AGC C
  3. تضخيم الجينات Cdk1 وCyclinB1 استخدام هذه البادئات التالية الأساليب القياسية. هضم منتجات PCR مع 1 ميكرولتر من انزيم تقييد BamHI عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. تشغيل المنتجات الهضم على هلام الاغاروز 1٪. باستخدام شفرة حلاقة، وقطع الصحيحة شظايا الحمض النووي -sized بها وتنقية الحمض النووي من الجل باستخدام مجموعة استخراج الهلام.
  4. هضم 1 ميكروغرام من MTS-pEGFP-N1 والبلازميدات MTS-pERFP-N1 مع 1 ميكرولتر من انزيم BamHI عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. إضافة 1 ميكرولتر من العجل-INTEStinal الفوسفاتاز القلوية (CIP) لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. تشغيل المنتجات الهضم على هلام الاغاروز 1٪ وتنقية البلازميدات الخطية من هلام كما في الخطوة 5.3.
  5. إعداد رد فعل الربط عن طريق إضافة 1 ميكرولتر من البلازميد من الخطوة 5.4 و 5 ميكرولتر من Cdk1 أو CyclinB1 من الخطوة 5،3-3 ميكرولتر من العازلة يغاز، 0.5 ميكرولتر من T4 يغاز، و 20.5 ميكرولتر من درهم 2 O. احتضان O / N عند 4 درجات مئوية.
  6. تحويل كولاي DH5α الخلايا المختصة مع 10 ميكرولتر من خليط ربط التالية التقنيات القياسية وتنمو البكتيريا على 10 ملغ / مل الكانامايسين التي تحتوي على LB لوحات أجار O / N عند 37 درجة مئوية للحصول على المستعمرات.
  7. اقتطاف مستعمرة من O / N نمت لوحات باستخدام طرف ماصة معقمة، إدراج معلومات سرية إلى 5 مل من كانامايسين-LB التي تحتوي على أنبوب واحتضان O / N. عزل البلازميد باستخدام مجموعات miniprep وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة، وتسلسل البلازميد باستخدام التقنيات القياسية.
  8. Transfect MCF1 تنمو باطرادخلايا 0A (1.5 × 10 4 خلايا المصنفة على لوحات 96-جيدا) مع MTS-Cdk1-طلب تقديم العروض أو MTS-CyclinB1-GFP البلازميدات من الخطوة 5.7 من خلال إعداد البلازميد / ترنسفكأيشن نسبة كاشف 1: 2 (ث: ت، 100 نانوغرام : 0.2 ميكرولتر) في serum- 100 ميكرولتر والمتوسطة خالية من المضادات الحيوية.
  9. احتضان الخلايا في البلازميد مزيج / كاشف لمدة 48 ساعة على 37 درجة مئوية في حاضنة CO 2 مع مراقبة الرطوبة (5٪ CO الرطوبة النسبية 95٪).
  10. إعداد 1 ملم حل سهم الأصباغ الحمراء والخضراء الفلورسنت الميتوكوندريا عن طريق تذويب 50 ميكروغرام من مسحوق في 100 ميكرولتر من DMSO. تمييع الحلول الأوراق المالية 1: 400 في برنامج تلفزيوني 1X للحصول على 2.5 ميكرومتر حلول العمل. يمكن تخزين حلول السهم عند -20 درجة مئوية لمدة عام.
  11. خلط 2 ميكرولتر من 2.5 ميكرومتر من صبغة حمراء مع 98 ميكرولتر من مستنبت لإعداد تركيز النهائي 50 نانومتر.
  12. استبدال خلية ثقافة المتوسط ​​من CyclinB1-GFP تحمل خلايا MCF10A (ولدت في الخطوة 5.8) مع صبغة حمراء تحتوي متوسطة لمدة 2 دقيقة. تكرارنفس الإجراء مع صبغة خضراء لCdk1-طلب تقديم العروض خلايا تحمل MCF10A.
  13. يغسل مرتين مع 100 ميكرولتر 1 × برنامج تلفزيوني للتخلص من الحل تلطيخ الزائد، إضافة 100 ميكرولتر برنامج تلفزيوني 1X لوحة 96-جيدا.
  14. تصور الميتوكوندريا وCyclinB1-GFP (الإثارة من 488 نانومتر، والانبعاثات في 494-536 نانومتر) وCdk1-طلب تقديم العروض (الإثارة من 560 نانومتر، والانبعاثات في 565-620 نانومتر) على لوحات 96-جيدا تحت المجهر الفلورسنت في 40X التكبير.

6. تحديد تفاضلي فسفرته البروتينات عبر 2D-DIGE

  1. إعداد عينة
    1. عزل الميتوكوندريا وليز الكسور الميتوكوندريا كما في الخطوة 1.3. إضافة حجم مساو من 20٪ TCA (حمض التريكلوروسيتيك في الماء) لكل عينة ودوامة لمدة 15 ثانية. احتضان عينات على الجليد لمدة 30 دقيقة كما تترسب البروتينات من الحل.
    2. عينات الطرد المركزي في 9300 x ج في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، وإزالة طاف، وإضافة 60 ميكرولتر الأسيتون البارد (100٪)، يليهالطرد المركزي في 9300 x ج في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    3. كرر الخطوة غسل الأسيتون (الخطوة 6.1.2) واحد مزيد من الوقت، إزالة طاف واعادة تعليق العينات في 50 ميكرولتر DIGE وضع العلامات عازلة (7 M اليوريا و 2 M ثيوريا، 4٪ CHAPS، 30 ملي تريس، ودرجة الحموضة 8.5).
  2. إعداد الأصباغ الفلورية
    1. إعداد محلول المخزون: ذوب الأصباغ (5 نانومول) في 5 ميكرولتر من الفورماميد ثنائي ميثيل جديدة (DMF) إلى تركيز النهائي من 1 نانومول / ميكرولتر. تخزين محلول المخزون صبغ في -20 درجة مئوية حتى استخدامها لبضعة أشهر.
    2. يعد حل العمل: السماح الأصباغ لتعيين في RT لمدة 5 دقائق. تمييع 1 ميكرولتر من صبغ مع 4 ميكرولتر من DMF إلى التركيز النهائي من 200 بمول / ميكرولتر. الحفاظ على الجليد أثناء الاستخدام. ملاحظة: الحل العمل يمكن أن تبقى عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة 3 أسابيع.
  3. البروتينات التسمية
    1. مزيج 1 ميكرولتر من محلول الصبغة العمل في 12.5 ميكروغرام من البروتين. تصعيد حسب الحاجة. لمعايير المجمعة، إضافة 61؛ لتر من Cy2 حل العاملة إلى 300 ميكروغرام تجميع البروتين.
    2. دوامة لمدة 30 ثانية وأجهزة الطرد المركزي عند 4 درجة مئوية لمدة 30 ثانية في 12000 ز س. احتضان على الجليد في الظلام لمدة 30 دقيقة. وقف الوسم بإضافة 1 ميكرولتر من 10 ملي يسين في 1 ميكرولتر من محلول العمل المستخدمة. تخلط جيدا واحتضان على الجليد في الظلام لمدة 10 دقيقة.
    3. تجمع صفت بشكل فردي عينات وتخلط مع العازلة الإماهة (7 M اليوريا و 2 M ثيوريا، 4٪ CHAPS، 1.2٪ destreak، 1٪ pharmalytes، برموفينول الأزرق). وسيبلغ اجمالي حجم يكون 125 ميكرولتر.
    4. عينات دوامة لمدة 30 ثانية، وتسمح عينات لتعيين في RT لمدة 30 دقيقة. تحميل 125 ميكرولتر من العينات على 7 سم درجة الحموضة 4-9، ISOELECTRIC التركيز (منتدى الطاقة الدولي) شرائط.
  4. أولا البعد الكهربائي
    1. وضع أصحاب الشريط (توابيت) على لوحة إلكترود، والتأكد من أصحاب قطاع نظيفة تماما وجاف. ماصة 125 عينات ميكرولتر في تابوت، ونشر بالتساوي على نعش بأكمله.
    2. استخدام ينتفالتمرير، والتقاط قطاع منتدى الطاقة الدولي، بعناية إزالة الغطاء الواقي البلاستيك، ووضعه (الجانب جل أسفل) في المخزن نعش / الإماهة. تجنب احتباس فقاعات الهواء. ببطء ملء نعش (1-1،5 مل) مع الزيوت المعدنية ووضع التابوت يغطي على التوابيت.
    3. تبدأ ISOELECTRIC التركيز بعد بروتوكول في الجدول 2:
      ملاحظة: بمجرد تشغيل كاملة، قد يتم تخزين الشرائط في أنابيب بلاستيكية في -80 درجة مئوية أو انتقل مباشرة إلى موازنة والبعد الثاني.
  5. البعد الثاني - الصوديوم دوديسيل كبريتات-إس دي إس بايج (SDS-PAGE)
    1. موازنة
      1. ذوبان الجليد SDS عازلة موازنة (8 مل لكل قطاع، 6 M اليوريا، و 30٪ الجلسرين، 2٪ SDS). تزن خارج dithiothreitol (DTT و 10 ملغ DTT لكل 1 مل من العازلة موازنة SDS). حل DTT إلى 4 مل SDS عازلة موازنة.
      2. تزن خارج IAA (iodoacetamide، 25 ملغ IAA لكل 1 مل من العازلة موازنة SDS).حل IAA إلى 4 مل SDS عازلة موازنة.
      3. تذوب 1 مل ختم الحل الاغاروز في حمام مائي لاستخدامها لاحقا.
      4. إذا تم تجميد شرائح، تسمح لهم ذوبان الجليد تماما. مكان شرائط الجانب جل ما يصل إلى علبة reswelling. إضافة 4 مل من العازلة موازنة SDS مع DTT إلى كل قطاع واحتضان لمدة 15 دقيقة مع اهتزاز لطيف.
      5. تخلصي من كل المخزن المؤقت موازنة SDS مع التلفزيون الرقمي الأرضي. إضافة 4 مل من العازلة موازنة SDS مع IAA إلى كل قطاع واحتضان لمدة 15 دقيقة أخرى مع اهتزاز لطيف. بعد موازنة مع العازلة IAA، صب المخزن المؤقت موازنة SDS.
    2. SDS-PAGE
      1. بسط الهلام صغيرة، وإزالة المشط وشطف جل والآبار مع DDH 2 O. إزالة الشريط الأبيض في الجزء السفلي من هلام قبل تشغيل. توجيه قطاع على هلام بشكل صحيح، والتوجه هلام هو أمر حاسم لقطع الفور.
      2. ضع شقة الجل على مواجهة مع لوحة صغيرة صعودا وهلام أعلى تواجه هxperimenter. وضع الشريط على لوحة طويل القامة مع نهاية انوديك (++ تنتهي مع الباركود) التي تواجه الجانب الأيسر من هلام. وباستخدام مسطرة، ودفع ببطء الشريط أسفل على سطح هلام. تجنب احتباس فقاعات الهواء بين القطاع وهلام. الوقوف على جل ما يصل في موقف لوحة من الزجاج.
      3. إضافة 1 مل من الملفات الساخنة حل ختم الاغاروز افتتاح الكاسيت. تأكد من الضغط على جميع فقاعات الهواء خارج باستخدام مسطرة شقة. تجميع الجهاز وتشغيل هلام في ثابت 125 فولت لمدة 90 دقيقة.
      4. عند انتهاء هلام التشغيل، وضع الجل على جهاز تصوير الجزيئية البيولوجية مع 2 مل ده 2 O ومسح هلام في وضع الاستحواذ مضان مع 635 نانومتر ليزر الإثارة و 665 مرشح الانبعاثات نانومتر.
    3. بروتين فسفوري؛ فسوبروتين تلطيخ
      1. إصلاح هلام مع 50٪ الميثانول و 10٪ خليط حامض الخليك (10 مل) لمدة 30 دقيقة مرتين. يغسل مع 10 مل من الماء لمدة 10 دقيقة ثلاث مرات وصمة عار مع 10 مل بروتين فسفوري؛ فسوبروتين وصمة عار ل60-90 دقيقة، تليهاdestaining مع 10 مل يزيل اللون الحل لمدة 30 دقيقة ثلاث مرات.
      2. يغسل مع 10 مل من الماء 5 دقائق مرتين وصورة هلام مع ماسح ضوئي هلام الليزر في 532 نانومتر / 560 نانومتر الإثارة / الانبعاث.
    4. البروتين الهضم وتحديد
      1. المكوس جميع تفاضلي أعرب البقع البروتين من هلام في الآبار صفيحة باستخدام الروبوت بقعة منقار وفقا لمواصفات الشركة الصانعة، وإضافة 100 ملي بيكربونات الأمونيوم (2 مل) لمدة 1 ساعة على RT ليزيل اللون القطع هلام. يذوى مع 2 مل 100٪ الأسيتونتريل يغسل مرتين والجافة في المكثف فراغ لمدة 30 دقيقة.
      2. ترطيب القطع هلام مع 100 ميكرولتر من 13 نانوغرام / التربسين الخنازير المعدلة ميكرولتر في بيكربونات الأمونيوم 50 ملم لمدة 16 ساعة على 37 درجة مئوية. جمع supernatants وزيادة استخراج البروتينات مع 100 ميكرولتر من حمض trifluoroacetic 5٪ في 50٪ الأسيتونتريل لمدة 30 دقيقة.
      3. التركيز على الببتيدات وصولا الى 5 ميكرولتر من فراغ الطرد المركزي تناسقRATOR وتحليل مع مصفوفة بمساعدة الليزر الامتزاز التأين - وقت الطيران - جنبا إلى جنب تحليل الطيف الكتلي (MALDI TOF-MS / MS) 17.

7. في المختبر كيناز الفحص

  1. إعداد ركائز
    1. استنساخ الفرعي مجمع الأول (CI) مفارز (NDUFV1، NDUFV3، NDUFS2، NDUFB6، وNDUFA12)، التي يتم تحديدها كأهداف Cdk1 فسفرته تفاضلي، إلى pGEX-5X-1 ناقلات لتوليد الجلوتاثيون-S-ترانسفيراز (GST) -tagged التعبير البكتيرية البلازميدات 11. تنقية مفارز CI باستخدام أعمدة الجلوتاثيون عالية تقارب بعد بروتوكول أدناه.
      1. ثقافة GST-الموسومة CI فرعية تحتوي على كولاي سلالة BL-21 في مرق مع 50 ميكروغرام / مل من الأمبيسلين في شاكر عند 37 درجة مئوية لوريا، Bertani (LB) حتى الكثافة البصرية (OD) من تم التوصل 0.6. إضافة الآيزوبروبيل BD-ثيو-galactopyranoside (IPTG) إلى عبادةلدى عودتهم إلى تركيز النهائي من 0.1 ملم، واحتضان ل3 ساعة إضافية.
      2. أجهزة الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 10 دقيقة لجمع البكتيريا وإعادة تعليق في 5 مل من 1 العازلة في برنامج تلفزيوني س تحتوي على 5 ملم من DTT، 1 × بروتين مثبط كوكتيل، و 0.1٪ الليزوزيم. ليز الخلايا عن طريق صوتنة لمدة عشرين 5 ثوان رشقات نارية، وإزالة الحطام الخلية بواسطة الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 10 دقيقة.
      3. جمع طاف واحتضان مع حبات 4B-الجلوتاثيون الاغاروز في نسبة حجم 4: 1 (طاف: حبة) لمدة 1 ساعة على RT.
      4. أزل البروتينات GST الانصهار من الخرز مع 3 مل من العازلة الجلوتاثيون شطف (10 ملي الجلوتاثيون المختزل في 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0) وإخضاع البروتينات مزال لغسيل الكلى في الجزيئي أنابيب غشاء مسامي (الوزن الجزيئي الحد الفاصل لل12 -14 kiloDaltons) مع 1 × PBS / 1 ملم EDTA. تخزين تنقية البروتينات في - 80 درجة مئوية.
  2. Cdk1 كيناز الفحص
    1. قبل البدء في الحمار كينازعبد المنعم يوسف، تعيين كتل التدفئة إلى 30 درجة مئوية و 100 درجة مئوية. ذوبان التجاري CyclinB1 / Cdk1 مجمع انزيم وركائز على الجليد.
    2. تحضير مزيج رد فعل على الجليد. منذ تشارك 32 ف ATP النظير، وإعداد جميع مخاليط رد فعل في 1.5 مل أنابيب العينات مع قبعات المسمار تحتوي على حلقة O لمنع انتشار النشاط الإشعاعي.
      تحذير: اتبع قواعد حماية المواد المشعة. استخدام 8 مم زجاجي سميك يحمي والعمل على الأقل تجارية بحتة. مسح أسفل أي المنطقة الملوثة بالماء.
    3. إعداد عازلة رد فعل 30 ميكرولتر تحتوي على 1 × عازلة Cdk1 (50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، 10 ملي MgCl2، 2 ملي DTT، 1 ملي EGTA، 0.01٪ بريج 35، ودرجة الحموضة 7.5)، 0.6 ملي اعبي التنس المحترفين البارد، 0.1 μCi 32 ف ATP، 2 وحدة من CyclinB1 / Cdk1 و 6 ميكروغرام من البروتين الركيزة. ضبط مستوى الصوت إلى 30 ميكرولتر مع ده 2 O. رد فعل إيجابي السيطرة، استبدال الركيزة مع 0.01 ملي هيستون H1، وهي معروفة جيدا CyclinB1 / Cdk1 الركيزة.
      1. لكنترول السلبيةردود الفعل ل، (1) محل الركيزة مع بروتين ضريبة السلع والخدمات فقط و (2) استبدال الركيزة مع 0.01 ملي هيستون H1 + 0.5 ميكرومتر RO-3306، وهو Cdk1 مثبط انتقائي.
    4. تخلط جيدا مع ماصة وأجهزة الطرد المركزي لجلب كل السائل إلى أسفل الأنبوب، والتقليل من مخاطر التلوث. احتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
    5. إضافة 6 ميكرولتر من عينة العازلة 5X SDS لوقف التفاعل وتفسد على 100 ​​درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. تشغيل العينات على 10٪ هلام SDS-PAGE 160 V لمدة 2 ساعة، أو حتى أمام الصبغة قد وصل إلى نهاية هلام. نقل الجل على ورقة اللوني والتفاف مع غلاف بلاستيكي.
      تحذير: جميع السائل في اتصال مع النظائر المشعة يجب أن تعامل على أنها النفايات المشعة والتخلص منها في الدامجانة زجاجة بولي 5 غالون التي تقدمها خدمات الصحة والسلامة البيئية وفقا لتوجيهات المؤسسية.
    6. فضح هلام إلى فيلم الأشعة السينية لمدة 1 يوم أو ما يصل إلى 1 في الاسبوع في -20 درجة مئوية تبعا لنشاط محدد من النظائر المشعة المستخدمةوالانزيم.

8. الموقع الموجه الطفرات لتوليد Cdk1 سلبي المهيمن (D146N)

  1. الاشعال تصميم الطفرات. اثنين الاشعال، مكملة لبعضها البعض، يحتوي على موقع متحولة (سيتم استبدال G التي كتبها A النوكليوتيدات إلى رمز ل N بدلا من مد الأحماض الأمينية) يحيط بها 20 قاعدة على كل جانب (11).
  2. إعداد 50 ميكرولتر تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) مزيج يحتوي على رد فعل العازلة 1X، 2.5 ملي dNTPs، 10 ميكرومتر الاشعال (على حد سواء إلى الأمام والخلف)، 40 نانوغرام من القالب، وده 2 O. إضافة 2.5 U من البلمرة الحمض النووي في رد الفعل.
  3. تشغيل البرنامج PCR التالية: 95 درجة مئوية 3 دقائق و 95 درجة مئوية و 30 ثانية و 55 درجة مئوية مدة 30 دقيقة، 68 ° C 6 دقائق. 16 دورات (ملاحظة: يتم تحديد 68 ° C فترة حضانة حسب حجم الحمض النووي مطلوب 1 دقيقة / كيلو بايت الحمض النووي ≤ 10 كيلوبايت لالحمض النووي أكبر، 2 دقيقة / كيلو بايت بالإضافة إلى 10 ثانية لكل دورة.). متابعة من قبل 68 ° C 7 دقيقة وعقد في 4 درجات مئوية لتصبح جاهزة للاستخدام.
  4. إضافة2 ميكرولتر من DPN أنا انزيم التقييد (10 U / ميكرولتر) و 5.7 ميكرولتر DPN أنا العازلة، تخلط جيدا مع الصنبور لطيف مع إصبع واحتضان رد الفعل عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  5. نقل 10 ميكرولتر DPN I-معاملة المنتجات PCR إلى 50 ميكرولتر من الخلايا المختصة DH5α للتحول. احتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة، تليها 45 ثانية الحرارة صدمة في 42 درجة مئوية و 5 دقائق على الجليد. إضافة 500 ميكرولتر من LB ويهز عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة قبل الطلاء على لوحات LB-أجار. احتضان O / N عند 37 درجة مئوية.
  6. اختيار مستعمرة من O / N نمت لوحات أجار باستخدام معقم الأصفر طرف ماصة، وانخفاض طرف في أنبوب يحتوي على 5 مل من LB، وتنمو O / N في 37 درجة مئوية شاكر. عزل البلازميد باستخدام طقم miniprep وتسلسل البلازميد لتأكيد طفرة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.

9. تحديد دورة الخلية المرحلة أطوال مع ايدو التأسيس الفحص

  1. الفرز الخلية
    1. آرansfect 2 × 10 5 الخلايا مع ناقلات المشار إليها (MTS-GFP / RFP، MTS-CyclinB1-GFP / Cdk1-WT-طلب تقديم العروض أو MTS-Cdk1-DN-RFP) في لوحة 6 جيدا باستخدام 1: 2 (ث: • 2.5 ميكروغرام: 5 ميكرولتر) نسبة الحمض النووي: ترنسفكأيشن الكاشف خليط أعد في 2.5 مل serum- والمضادات الحيوية وسائل الاعلام ثقافة خالية لمدة 48 ساعة. خلايا النوع الحية يعبرون عن مستقر البروتينات CyclinB1 GFP الموسومة Cdk1 والموسومة طلب تقديم العروض عن طريق قياس التدفق الخلوي.
      1. غسل الخلايا مع 1 × برنامج تلفزيوني، إضافة 100 ميكرولتر من التربسين في صحن واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. إضافة 2 مل من وسائل الإعلام الثقافة لجمع الخلايا وتمريرها من خلال 70 ميكرون فلتر لتوليد تعليق خلية واحدة. غسل تعليق خلية واحدة مع 500 ميكرولتر من 1٪ الجنين العجل المصل في برنامج تلفزيوني (FCS / PBS) قبل تحميلها على قياس التدفق الخلوي.
      2. إعداد معلمات فرز التالية البروتوكولات المعمول 18 النابضة للخلايا إيجابية مزدوجة ملطخة كلا GFP وطلب تقديم العروض. جمع الخلايا مرتبة الخروج من الكريات إلى contai أنبوبنينغ زراعة الخلايا المتوسطة واستخدام هذه الخلايا لتحليل تقدم دورة الخلية مع وضع العلامات ايدو نبض مطاردة كما هو الحال في بروتوكول 9.2.
  2. قياس طول دورة الخلية باستخدام الفحص ايدو وصفها التدفق الخلوي
    1. البذور فرز الخلايا في 6 لوحات بشكل جيد في مناطق ذات كثافة من 2.5 × 10 5 خلايا لكل بئر والثقافة O / N عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO 2. إضافة EDU إلى مستنبت بتركيز نهائي من 25 ميكرومتر. احتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO 2 لمدة 1 ساعة.
    2. غسل الخلايا مع 1٪ BSA في 500 ميكرولتر برنامج تلفزيوني وجمعها في أنبوب 1.5 مل على فترات ساعة 2 ليصبح المجموع من 10 - 12 ساعة.
    3. خلايا الطرد المركزي في 350 x ج لمدة 5 دقائق، تجاهل طاف. طرد بيليه وذلك بإضافة 100 ميكرولتر من محلول التثبيت (المقدمة من قبل الشركة المصنعة داخل EDU الوسم عدة) لمدة 15 دقيقة في RT وتخلط جيدا.
    4. غسل الخلايا مع 1 مل من 1٪ BSA في برنامج تلفزيوني ثلاث مرات. إصلاحالخلايا مرة أخرى مع 0.5 مل من الايثانول 70٪ O / N عند 4 درجة مئوية.
      ملاحظة: تحديد الإيثانول أمر بالغ الأهمية لإرواء مضان GFP / RFP الداخلي نظرا لتعبير البروتين المؤتلف الموسومة.
    5. الطرد المركزي الخلايا مرة أخرى في 350 x ج لمدة 5 دقائق ويغسل بيليه مع 1 مل من 1٪ BSA في برنامج تلفزيوني مرة واحدة. إعادة تعليق الخلايا في 1 مل من العازلة permeabilization (0.1٪ تريتون-X-100، 1٪ BSA، 0.2 ملغ / مل ريبونوكلياز ألف في برنامج تلفزيوني) لمدة 20 دقيقة في RT.
    6. غسل الخلايا مع 1 مل من 1٪ BSA في برنامج تلفزيوني مرة واحدة. إضافة 0.5 مل من الكوكتيل رد فعل في كل أنبوب وتخلط جيدا. احتضان خليط التفاعل على RT لمدة 30 دقيقة في الظلام.
    7. تغسل مع 1 مل من 1٪ BSA في برنامج تلفزيوني مرة واحدة والحمض النووي وصمة عار مع 50 ميكروغرام / مل يوديد propidium (PI) في 1 مل من 1٪ BSA في برنامج تلفزيوني.
    8. تحليل الخلايا عن طريق التدفق الخلوي لمتابعة السكان EDU إيجابية. الحالية مبعثر مؤامرة نقطة من الخلايا المسمى EDU الملطخة عن محتوى الحمض النووي (تلطيخ PI، المحور السيني) وايدو (اليكسا 647 تلطيخ، العمودي).
      1. استخدام قناة APC لأليكسa647-EDU استخدام عصابة تمرير الترشيح 670/30 مع جميع الحاضرين خفيفة أقل من 685 نانومتر ضرب هذا المرشح. وفيكوإيريترين قناة (PE) لPI مع عصابة تمرير الترشيح 581/15 أمامه مع جميع الحاضرين خفيفة أقل من 600 نانومتر ضرب هذا المرشح.
      2. إدراج أول أنبوب يحتوي على الخلايا في التدفق الخلوي واستخدام استراتيجية النابضة القياسية لاقتناء: قطعة FSC المساحة X SSC-منطقة لالتشكل تليها PI (قناة PE) X Alexa647-EDU (قناة APC) عن تلطيخ الخلايا. تسجيل البيانات لجميع الأنابيب واحدا تلو الآخر الحصول على 10،000 الأحداث في العينة.
      3. تحديد توزيع مرحلة دورة الخلية من الخلايا وأطوال المرحلة باستخدام التدفق الخلوي برامج تحليل البيانات التالية البروتوكولات المعمول 11،30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

التعريب شبه الميتوكوندريا من CyclinB1 وCdk1

يستخدم استخراج كربونات الصوديوم لتحديد ما إذا كان يقع على البروتين داخل الميتوكوندريا أو على السطح الخارجي، وهي الغشاء الخارجي. مرة واحدة يظهر بروتين في توطين داخل الميتوكوندريا، وزيادة عزم التعريب شبه الميتوكوندريا يمكن إجراء عبر mitoplasting جنبا إلى جنب مع عملية الهضم البروتيني. لتحديد التعريب شبه الميتوكوندريا من CyclinB1 أو Cdk1، تم عزل mitoplasts عن طريق تمييع الميتوكوندريا في مخازن ناقص التوتر مع تناقص تركيز السكروز الاسموزي من 200 ملم إلى 25 ملم. يبدأ الغشاء الخارجي للتمزق في 150 ملي من السكروز، في حين لا يزال الغشاء الداخلي قائما حتى التركيز النهائي في 25 ملي من السكروز (الشكل 1A). في تركيبة مع mitoplasting، البروتيني حماية الفحص يمكن تنفيذها باستخدام trypsفي لهضم البروتينات المعرضين عقب تمزق الغشاء الخارجي. وهذا يؤدي إلى هضم البروتينات الفضاء intermembrane. إذا محمي البروتين من الفائدة من عملية الهضم التربسين، وهذا يدل على توطين مصفوفة الميتوكوندريا من البروتين. في هذا الشكل التمثيلي، استخدمت الميتوكوندريا البروتين مصفوفة Hsp60، والبروتين الفضاء intermembrane Timm13 كعلامات التعريب شبه الميتوكوندريا. تتشابه مع Hsp60 ولكن على عكس Timm13، CyclinB1 وCdk1 كانت محمية من الهضم التربسين، مما يدل على مصفوفة توطين الميتوكوندريا (الشكل 1B).

التعبير الميتوكوندريا من MTS- وCyclinB1 الموسومة GFP وCdk1 البروتينات

يتم استنساخ النظام التجاري المتعدد الأطراف في إطار في N-محطة الجينات CyclinB1 أو Cdk1، التي لديها GFP أو طلب تقديم العروض علامات في اجتماعهم محطة سي. البروتين المؤتلف ينتج عن ذلك استهداف الميتوكوندريا GFP- أو الموسومة طلب تقديم العروض قبرصيclinB1 أو Cdk1. يتم عرض قائمة من بنيات المولدة والمستخدمة في هذه الدراسة في الشكل. باستخدام هذه التركيبات، overexpression من CyclinB1 و / أو Cdk1 في الميتوكوندريا تم تحقيقه، كما هو موضح هنا من قبل النشاف الغربي من الكسور الميتوكوندريا المعزولة (الشكل 2).

أهداف الميتوكوندريا المحتملة للCyclinB1 / Cdk1 يحددها 2D-DIGE

Cdk1 ينتمي إلى سيرين / ثريونين (S / T) عائلة كيناز تحفيز نقل الفوسفات من ATP إلى برولين (P) المنحى S أو T المخلفات. طفرة نقطة الذي يحل محل بقايا اسبارتاتي (D) مع الهليونين (N) في موقف 146 من Cdk1 (D146N) يولد سلبية المهيمنة (DN) Cdk1 متحولة 19. لدراسة وظيفة الميتوكوندريا Cdk1، فقد تولدت البروتين Cdk1-DN-المستهدفة الميتوكوندريا عن طريق بناء البلازميد (pERFP-N1-MTS-Cdk1-DN) تحتوي على 29 الأحماض الأمينية خط الطولز الميتوكوندريا التي تستهدف تسلسل (MTS) المشتقة من الوحيدات الثامن من أوكسيديز السيتوكروم C البشري المرتبط طلب تقديم العروض الموسومة DN-Cdk1. وقد استخدم pERFP-N1-MTS إنتاج المستهدفة الميتوكوندريا البروتين ERFP باعتبارها مكافحة ناقلات الفارغة. / تم محة بروتين فوسفاتي الميتوكوندريا في الخلايا G2 M transfected مع كل من يبني من خلال تحليل هلام 2D مع الرقم الهيدروجيني 4-10 شرائط هلام. مقارنة مع transfectants ناقلات فارغة (الشكل 3، اللوحة العليا)، وكانت مجموعة من بروتين فوسفاتي الميتوكوندريا غائبة على ما يبدو أو انخفضت في Cdk1-DN transfectants (الشكل 3، اللوحة السفلى). تحليل الطيف الكتلي من البقع الكشف عن تحديد هوية من البروتينات فسفرته بواسطة Cdk1 في الميتوكوندريا.

تقدم دورة الخلية وتحديد المرحلة أطوال مع الفحص EDU نبض مطاردة

للتحقيق في تطور دورة الخلية عرجن CyclinB1 الميتوكوندريا / وزادت مستويات Cdk1، نبض مطاردة العلامات التجربة باستخدام التناظرية ثيميدين، تم إجراء إيثينيل deoxyuridine (EDU) لتسمية السكان من الخلايا التي تمر توليف الحمض النووي 20. هذا الأسلوب يسمح التصور من دورة الخلية القبض على نافذة 22 ساعة من خلال تتبع السكان EDU إيجابية عندما تتقدم الخلايا من خلال S و G2 / M مراحل وتتراكم في المرحلة G1. وأظهرت النتائج أن وصفت الخلايا مرحلة S تقدما من خلال G2 / المرحلة M وظهرت في المرحلة G1 بأسرع 4 ساعات في الخلايا معربا عن النوع البري CyclinB1 الميتوكوندريا / Cdk1، بالمقارنة إلى 6 ساعات في الخلايا transfected مع مكافحة ناقلات الأمراض أو CyclinB1 متحولة / Cdk1 الشكل (4A)، مشيرا إلى أن تعزيز CyclinB1 الميتوكوندريا / Cdk1 تسارع تقدم دورة الخلية.

الشكل 1
الشكل 1. الميتوكوندريا CyclinB1 / Cdk1 يموضع في مصفوفة (AB) توطين الميتوكوندريا الفرعية من CyclinB1 وCdk1 الكشف عنها بواسطة mitoplasting وفحص حماية الأنزيم البروتيني، تم تعديل الرقم من وانغ وآخرون، 2014 (11). تعرضوا مجموع (T)، بيليه (P)، وطاف (S) الكسور إلى تحليل النشاف الغربية مع الأجسام المضادة المشار إليها. TIMM13 (بروتين أمور الفضاء)، وHSP60 (بروتين المصفوفة). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. التعبير من الميتوكوندريا Cdk1 التركيبات. النشاف الغربي من الكسور الميتوكوندريا المعزولة من خلايا transfected مع CyclinB1 استهداف الميتوكوندريا و / أو نوع البرية أو متحولة السلبي السائد Cdk1 (يشار البلازميدات على القاع 11. كانت pEGFP-N1-MTS وناقلات pERFP-N1-MTS للنواقل فارغة للMTS-CyclinB1 وMTS-Cdk1 على التوالي). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. المحتملة الميتوكوندريا ركائز من Cdk1. بروتينات الميتوكوندريا المستخرجة من G2 / خلايا بلغت ذروتها M-transfected مع استهداف الميتوكوندريا ناقلات فارغة (pERFP-N1-MTS، لوحة العليا) أو متحولة Cdk1 (pERFP-N1-MTS-Cdk1-DN، وصفت اللوحة السفلى) مع Cy5 (الأخضر)، مفصولة هلام 2-D وكانت ملطخة بروتينات فسفرته مع صبغ بروتين فسفوري؛ فسوبروتين (الحمراء). تم تعديل هذا الرقم من وانغ وآخرون. 2014 11."> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4. الميتوكوندريا Cdk1 يعزز G2 / M الانتقالية وعموما دورة التقدم.
تحليل دورة الخلية مع وضع العلامات ايدو نبض مطاردة. ووضعت رسوم بيانية مبعثر مؤامرة من الخلايا المسمى ايدو لمحتوى الحمض النووي (المحور السيني) وايدو (العمودي). وتظهر الأرقام أقل في كل لوحة كثافة مضان يعني من ايدو وصفت نوى. وأشار إلى نقطة زمنية في ساعة بعد نبض ايدو (11). لجميع النقاط الزمنية، ووضعت بوابات عرض السكان التالية: G0 / G1، S، و G2 / M. للحصول على نقاط الساعة 6 و 8 و 10 ساعة، وصفت EDU- G1 *، S / G2 *، و G2 / تظهر M * السكان. تم تعديل هذا الرقم من وانغ وآخرون، 2014 (11). يرجى النقرهنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تركيزات السكروز مستعمل
لا التربسين 25 ملي 50 ملي 100 ملي 150 مم 200 ملي
+ التربسين 25 ملي 50 ملي 100 ملي 150 مم 200 ملي

الجدول 1. منخفض التوتر السكروز المخازن المستخدمة لالخطوة 4.2

الخطوة 1 30 V 12 ساعة خطوة وعقد
الخطوة 2 300 V 0.5 ساعة خطوة وعقد
خطوة 3 1000 V 0.5 ساعة ميل
5000 V 1.33 ساعة ميل
خطوة 5 5000 V 20000 V ساعة خطوة وعقد

الجدول 2. بروتوكول ISOELECTRIC المستخدمة لالخطوة 6.4.5

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

مثل البروتينات الموجهة للعضيات التحت خلوية أخرى، فإن البروتينات الميتوكوندريا المستهدفة تمتلك إشارات تستهدف ضمن الهيكل الأساسي أو الثانوي في أن توجيهها إلى عضية بمساعدة translocating بروتين معقد وآلات للطي 21،22. الميتوكوندريا التي تستهدف تسلسل (MTS) تم الحصول عليها من البروتينات المقيمين الميتوكوندريا حصرا مثل COX8 يمكن أن تضاف إلى N-محطة من أي تسلسل الجيني لاستهداف بروتينات معينة في الميتوكوندريا 11،23،24. هنا، تم استنساخ CyclinB1 وCdk1 الجينات إلى MTS COX8 تحتوي على النواقل وعلى التعبير، ومترجمة CyclinB1 المؤتلف وCdk1 في الميتوكوندريا. وميزة هذا النهج هو أنه يمكن تعديل التعبير الجيني في حجرة شبه الخلوية معينة، في هذه الحالة الميتوكوندريا، دون تغيير التعبير الجيني الكلي. مع هذه الاستراتيجية، تم على فك Cdk1 الميتوكوندريا محددة ظائف كيناز النوويةtermined. وبالمثل، وذلك بإضافة MTS إلى Cdk1 سلبية المهيمنة، هدم للوظائف الميتوكوندريا معين من Cdk1 تم تحقيقه، والذي يسمح بالتعرف الميتوكوندريا أهداف محددة من Cdk1، وتمكين تحليل عواقب وظيفية من غياب الميتوكوندريا وظيفة Cdk1. overexpression من Cdk1 دون علامة MTS النتائج في تعزيز تعبير عن Cdk1 في كل من الميتوكوندريا والنواة، وبالتالي تعقيد التحقيقات مزيد من النتائج المترتبة على إجراءات الميتوكوندريا معين من Cdk1.

ومع ذلك، فإن هذا النهج قد لا تكون مناسبة لجميع منتجات الجين كما شهدنا عدة محاولات فاشلة في نقل بعض تحركات في الميتوكوندريا عن طريق إضافة بطاقة MTS. قد تكون بعض خطوط الخلايا مقاومة جدا لترنسفكأيشن، والعثور على بروتوكول الأمثل قد يكون مضيعة للوقت. حتى عندما كانت الخلايا السليمة وترنسفكأيشن ناجحا، والعمل مع البروتينات الفلورية الموسومة يسلك بعض المشاكل يمثح كما التجميع، الترجمة غير صحيح، اندماج غير وظيفية، والإشارات الضعيفة.

وتشمل القيود الرئيسية للعزل الميتوكوندريا وmitoplasts انخفاض المحصول وتلوث محتمل من المقصورات الخلوية أو دون الميتوكوندريا أخرى. ويشار إلى أن الخلايا الملتصقة لا تمزق بكفاءة عن طريق الطرق الكيميائية أو الميكانيكية التقليدية، لذلك، مما يجعل من الصعب الحصول على كميات عالية من الميتوكوندريا من الخلايا الملتصقة مثقف. هنا، نحن تستخدم الثقافات ملتصقة الخلايا MCF10A. لانتاج حوالي 30 - 50 ميكروغرام من البروتين الميتوكوندريا، وهو مبلغ يبدأ من 3-5 س استخدمت 10 7 خلايا. الخطوة التجانس هي النقطة الحرجة آخر للالعائد النهائي من التحضيرات الميتوكوندريا. اعتمادا على خطوط الخلايا المستخدمة، وعدد من السكتات الدماغية و / أو وقت التجانس قد تختلف. لخلايا MCF10A، لاحظنا أن 10 دقيقة من التجانس من قبل الخالط الزجاج / الزجاج هو مطلوب، في حين الماوس fibrobla الجنينيةالقديسان (MEF) المطلوب فقط 3-5 دقائق من التجانس. منذ التجانس المفرط يمكن أن يسبب ضرر لغشاء الميتوكوندريا وتؤدي إلى الإفراج مكونات الميتوكوندريا، والظروف المعيارية لكل خط الخلية وينبغي أن تحدد من خلال الخبرة. استخدام الخالط الزجاج من الزجاج يزيد من العائد من التحضيرات الميتوكوندريا مقارنة المجانسة الزجاج / تفلون. كمية بدءا من الخلايا وكذلك تجميد / ذوبان الخلايا قد يغير من عدد من السكتات الدماغية اللازمة لكسر فتح الخلايا. وأخيرا، قد تحدث تمسخ البروتين وتجميع بسبب التدفئة المترجمة من العينة خلال التجانس. ولذلك، من الضروري قبل البرد طاحونة الأنسجة والحفاظ على عينات على الجليد خلال هذا الإجراء.

طريقة أخرى في هذه المقالة هو استخدام EDU وضع العلامات لمراقبة دورة الخلية في الوقت الحقيقي. ايدو هو التماثلية ثيميدين المعدلة التي fluorescently المسمى مع مشرق، صامد صبغ فلور اليكسا. ايدو هو ايفيأدرجت بشكل كاف في الحمض النووي توليفها حديثا. هذا الأسلوب هو أفضل بديل لاستخدام العلامات التقليدية من الخلايا المتكاثرة مع التناظرية نيكليوزيد، bromodeoxyuridine (BrdU). أدرج BrdU الى الحمض النووي خلال توليف الحمض النووي النشط. الكمي من الحمض النووي المسمى BrdU يتطلب تمسخ الحمض النووي عن طريق أساليب قاسية نسبيا مثل ارتفاع الحرارة أو الحموضة عالية للكشف عن جزيئات BrdU لBrdU الأجسام المضادة ملزمة. المعاملة القاسية للتمسخ الحمض النووي قد تؤثر على نوعية العينة وهو مضيعة للوقت. مع ايدو والمنظفات permeabilization يكفي عموما للكشف كاشف EDU للوصول إلى الحمض النووي. دون الحاجة إلى استخدام المواد الكيميائية القاسية أو الحرارة للوصول إلى الحمض النووي، وطريقة ايدو هو أسهل استخداما وأكثر دقيقة ومتسقة. وبصرف النظر عن مزايا تقدم ايدو، كان هناك بعض المخاوف بشأن استخدام ايدو لدراسة انتشار الأسلحة النووية. أظهرت EDU نشاط مكافحة التكاثري طفيف في علاج أكثر من 72 ساعة، والتي يمكن أن تخفض إلى neglمستويات igible عندما كان يحتفظ نبض ايدو في 1 ساعة 25.

واحد تعديل يعملون مع EDU الوسم هو الوقت المناسب تحديد والأسلوب. اقترحت عدة لتثبيت 15 دقيقة مع الحل تحديد المقدمة. ومع ذلك، واستخدمت لتثبيت إضافي مع 70٪ من الإيثانول في هذه التجربة. هناك سببان لاستخدام الايثانول: 1) لمتابعة تقدم دورة الخلية مع مرور الوقت، تم إجراء تجربة الوقت نقطة، حيث تم جمع الخلايا كل ساعة 2. وأبقى الخلايا في الايثانول 70٪ في 4 درجة مئوية حتى تم الانتهاء من جميع نقاط الوقت التجريبية. في الواقع، والخلايا يمكن أن تظل في 70٪ من الإيثانول لأطول (عدة أسابيع أو شهور) إذا لزم الأمر. 2) الخلايا المستخدمة في التجربة تم ستابلي مع GFP الموسومة Cdk1 و / أو CyclinB1-طلب تقديم العروض الكلمات الدلالية. لفصل ايدو وPI إشارات من GFP / RFP مضان، واستخدمت الإيثانول تثبيت لتفسد GFP وطلب تقديم العروض البروتينات، وبالتالي إرواء مضان من قبل تنفيذ ايدو لد PI تلطيخ. التشويه والتحريف البروتينات GFP / RFP هي أساسا تماما غير الفلورسنت، ربما لأن حامل اللون لم يعد محميا من التبريد 26،27.

لتحديد أهداف الميتوكوندريا من Cdk1، وكان يستخدم 2D-DIGE طريقة، وهي متفوقة على المواد الهلامية 2D التقليدية في نواح كثيرة. في 2D-DIGE، الأصباغ الفلورية متميزة، على سبيل المثال، قبرصي 3 و 5 و 2، وتستخدم لعينات التسمية، والذي يسمح تشغيل ما يصل إلى 3 عينات في هلام واحد، والحد من تغير دون الحاجة إلى تشغيل مكررات كما هو الحال في جل 2D القياسية. الأصباغ الفلورية المستخدمة في 2D-DIGE لديها حساسية عالية جدا من 0.2 نانوغرام / بقعة مقارنة بما كان عليه من الأصباغ ثلاثي فينيل ميثان في 100 نانوغرام / بقعة، وبالتالي، الأمر الذي يتطلب كمية أقل من البروتينات تعمل على المواد الهلامية 2D-DIGE لقرار بقعة عالية و نشر مسح هلام الجودة. يتم استخدام برامج الحاسوب الآلي لكشف وقياس وتحديد البروتينات وأعرب تفاضلي. بسبب قرار بقعة عالية، التفاضلية التعبير البروتين في عينات كاليفورنيان أن تقارن بدقة باستخدام بمساعدة برنامج بقعة الكمي. فرق منخفضة تصل إلى 10٪ ويمكن الكشف عن طريق 2D-DIGE، مما يمكن التصور من التعديلات بعد متعدية بسهولة. استخدام البرمجيات بمساعدة في جل التحليل يمكن أيضا اكتساب البيانات بشكل أسرع. ومع ذلك، منذ المعدات، مثل الماسحات الضوئية الفلورسنت، ومطلوبة من أجل الحصول على الصور، واستخدام هذه الطريقة تنطوي على تكاليف إضافية. وتشمل القيود الأخرى من 2D-DIGE ضعف تمثيل البروتينات مسعور وكذلك البروتينات مع نقطة تساوي الكهربائية القصوى والأوزان الجزيئية الكبيرة 28،29. مطلوب مزيد من التحقق من النتائج التي تم الحصول عليها مع 2D-DIGE باستخدام تقنيات بديلة، مثل مناعية أو لطخة غربية لتأكيد نتائج جديدة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
32P ATP  PerkinElmer BLU002001MC 
Anti-mouse secondary antibody Invitrogen  A-11003 Alexa-546 conjugated
Anti-rabbit secondary antibody Invitrogen  A11029 Alexa-488 conjugated
ATP Research Organics 1166A For in vitro kinase assay
Cdk1 antibody Cell Signaling Technology 9112
Cdk1 kinase buffer New England Biolabs P6020S
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit Life Technologies C10337 For cell cycle analysis with EdU labeling
COX IV antibody Cell Signaling Technology 4844S For mitochondrial immunostaining
Cyclin B1 antibody Santa Cruz Biotech sc-752
CyclinB1/Cdk1 enzyme complex New England Biolabs P6020S Avoid freeze/thaw
CyDye DIGE Fluor Labeling Kit GE Healthcare Life Sciences 25-8009-83
DIGE Gel and DIGE Buffer Kit GE Healthcare Life Sciences 28-9480-26 AA
Dimethylformamide  Sigma Aldrich 319937 DMF
Dithiothreitol Bio-Rad 161-0611 DTT
dNTP EMD Millipore 71004 For site-directed mutagenesis
Dpn I enzyme Stratagene 200519-53 For site-directed mutagenesis
Dry Strip cover fluid GE Healthcare Life Sciences 17-1335-01 Used as mineral oil
EDTA J.T. Baker 4040-03
EGTA Acros Organics 409910250
Eppendorf Vacufuge Concentrator Fisher Scientific 07-748-13 Used as vacuum centrifuge concentrator
Fluoromount G Southern Biotech 0100-01 Anti-fade mounting solution
Fortessa Flow Cytometer BD Biosciences 649908 For cell cycle analysis with EdU labeling
Histone H1 Calbiochem 382150 For in vitro kinase assay
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704 For purifying DNA fragments from agarose gels
Immobiline DryStrip Gels GE Healthcare Life Sciences 18-1016-61 IEF (isoelectric focusing) strips
Immobilized Glutathione Thermo Scientific 15160 Glutathione-agarose beads
Iodoacetamide Sigma Aldrich I1149 IAA
IPGphor 3 Isoelectric Focusing Unit GE Healthcare Life Sciences 11-0033-64 IPGphor strip holders
Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside  RPI Corp 156000-5.0 IPTG
Leupeptin Sigma Aldrich L9783 For cell lysis buffer
Lipofectamine 2000 Life Technologies 11668027 Transfection reagent
Lysine Sigma Aldrich L5501 For CyDye labeling
Lysozyme EMD Chemicals 5960
Mitoctracker Red/Green Invitrogen  M7512/M7514 Mitochondrial fluorescent dyes
MOPS EMD Chemicals 6310
pEGFP-N1 Clonetech 6085-1 GFP-expressing vector
Pfu Stratagene 600-255-52
pGEX-5X-1  GE Healthcare Life Sciences 28-9545-53 GST-expressing vector
Phenylmethylsulfonyl fluoride Shelton Scientific IB01090 PMSF
Phosphate buffered saline Life Technologies 14040 PBS
Spectra/Por 4 dialysis tubing Spectrum Labs 132700 as porous membrane tubing for dialysis
Pro-Q Diamond Phosphoprotein Gel Stain Life Technologies P-33300 For staining phosphoproteins on 2D gels
Proteinase inhibitor cocktail Calbiochem 539134 For cell lysis buffer
QuikChange site-directed mutagenesis kit Stratagene 200519-5
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27104 MiniPrep Plasmid Isolation Kit
RO-3306 Alexis Biochemicals 270-463-M001 Cdk1 inhibitor
Rotenone MP Biomedicals 150154 Complex I inhibitor
Sodium carbonate Fisher Scientific S93359
Sodium chloride EMD Chemicals SX0420-5 For cell lysis buffer
Sodium orthovanadate MP Biomedicals 159664 For cell lysis buffer
Sodium pyrophosphate decahydrate Alfa Aesar 33385 For cell lysis buffer
Sodium β-glycerophosphate Alfa Aesar L03425 For cell lysis buffer
SpectraMax M2e  Molecular Devices M2E Microplate reader
Sucrose Fisher Scientific 57-50-1
Tissue Grinder pestle Kimble Chase 885301-0007 For mitochondria isolation
Tissue Grinder tube Kimble Chase 885303-0007 For mitochondria isolation
Trichloroacetic acid solution Sigma Aldrich T0699 TCA
Tris MP Biomedicals 103133
Triton-x-100 Teknova T1105
Trypsin Calbiochem 650211
Typhoon Imager GE Healthcare Life Sciences 28-9558-09 Laser gel scanner fro 2D-DIGE
Ubiquinone Sigma Aldrich C7956

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Weinert, T., Hartwell, L. Control of G2 delay by the rad9 gene of Saccharomyces cerevisiae. J Cell Sci Suppl. 12, 145-148 (1989).
  2. Takizawa, C. G., Morgan, D. O. Control of mitosis by changes in the subcellular location of cyclin-B1-Cdk1 and Cdc25C. Curr Opin Cell Biol. 12, (6), 658-665 (2000).
  3. Allan, L. A., Clarke, P. R. Phosphorylation of caspase-9 by CDK1/cyclin B1 protects mitotic cells against apoptosis. Mol Cell. 26, (2), 301-310 (2007).
  4. Cerveny, K. L., Tamura, Y., Zhang, Z., Jensen, R. E., Sesaki, H. Regulation of mitochondrial fusion and division. Trends Cell Biol. 17, (11), 563-569 (2007).
  5. Brandt, U. Energy converting NADH:quinone oxidoreductase (complex I). Annu Rev Biochem. 75, 69-92 (2006).
  6. Hofhaus, G., Weiss, H., Leonard, K. Electron microscopic analysis of the peripheral and membrane parts of mitochondrial NADH dehydrogenase (complex I). J Mol Biol. 221, (3), 1027-1043 (1991).
  7. Weiss, H., Friedrich, T., Hofhaus, G., Preis, D. The respiratory-chain NADH dehydrogenase (complex I) of mitochondria. Eur J Biochem. 197, (3), 563-576 (1991).
  8. Janssen, R. J., Nijtmans, L. G., van den Heuvel, L. P., Smeitink, J. A. Mitochondrial complex I: structure, function and pathology. J Inherit Metab Dis. 29, (4), 499-515 (2006).
  9. Roessler, M. M., et al. Direct assignment of EPR spectra to structurally defined iron-sulfur clusters in complex I by double electron-electron resonance. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (5), 1930-1935 (2010).
  10. Owusu-Ansah, E., Yavari, A., Mandal, S., Banerjee, U. Distinct mitochondrial retrograde signals control the G1-S cell cycle checkpoint. Nat Genet. 40, (3), 356-361 (2008).
  11. Wang, Z., et al. Cyclin B1/Cdk1 coordinates mitochondrial respiration for cell-cycle G2/M progression. Dev Cell. 29, (2), 217-232 (2014).
  12. Omura, T. Mitochondria-targeting sequence, a multi-role sorting sequence recognized at all steps of protein import into mitochondria. J Biochem. 123, (6), 1010-1016 (1998).
  13. Konishi, T., Takeyasu, A., Natsume, T., Furusawa, Y., Hieda, K. Visualization of heavy ion tracks by labeling 3'-OH termini of induced DNA strand breaks. J Radiat Res. 52, (4), 433-440 (2011).
  14. Leif, R. C., Stein, J. H., Zucker, R. M. A short history of the initial application of anti-5-BrdU to the detection and measurement of S phase. Cytometry A. 58, (1), 45-52 (2004).
  15. Li, K., Lee, L. A., Lu, X., Wang, Q. Fluorogenic 'click' reaction for labeling and detection of DNA in proliferating cells. Biotechniques. 49, (1), 525-527 (2010).
  16. Kondo, T., et al. Application of sensitive fluorescent dyes in linkage of laser microdissection and two-dimensional gel electrophoresis as a cancer proteomic study tool. Proteomics. 3, (9), 1758-1766 (2003).
  17. Gundry, R. L., et al. Chapter 10, Preparation of proteins and peptides for mass spectrometry analysis in a bottom-up proteomics workflow. Curr Protoc Mol Biol. Unit 10.25 (2009).
  18. Davies, D. Chapter 11, Cell Sorting by Flow Cytometry. Flow Cytometry. Macey, M. G. Humana Press. 257-276 (2007).
  19. van den Heuvel, S., Harlow, E. Distinct roles for cyclin-dependent kinases in cell cycle control. Science. 262, (5142), 2050-2054 (1993).
  20. Terry, N. H. A., White, R. A. Flow cytometry after bromodeoxyuridine labeling to measure S and G2+M phase durations plus doubling times in vitro and in vivo. Nat. Protcols. 1, (2), 859-869 (2006).
  21. Becker, L., et al. Preprotein translocase of the outer mitochondrial membrane: reconstituted Tom40 forms a characteristic TOM pore. J Mol Biol. 353, (5), 1011-1020 (2005).
  22. Karniely, S., Pines, O. Single translation--dual destination: mechanisms of dual protein targeting in eukaryotes. EMBO Rep. 6, (5), 420-425 (2005).
  23. Candas, D., et al. CyclinB1/Cdk1 phosphorylates mitochondrial antioxidant MnSOD in cell adaptive response to radiation stress. J Mol Cell Biol. 5, (3), 166-175 (2013).
  24. Nantajit, D., et al. Cyclin B1/Cdk1 phosphorylation of mitochondrial p53 induces anti-apoptotic response. PLoS One. 5, (8), e12341 (2010).
  25. Cappella, P., Gasparri, F., Pulici, M., Moll, J. A novel method based on click chemistry, which overcomes limitations of cell cycle analysis by classical determination of BrdU incorporation, allowing multiplex antibody staining. Cytometry A. 73, (7), 626-636 (2008).
  26. Niwa, H., et al. Chemical nature of the light emitter of the Aequorea green fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, (24), 13617-13622 (1996).
  27. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
  28. Marouga, R., David, S., Hawkins, E. The development of the DIGE system: 2D fluorescence difference gel analysis technology. Anal Bioanal Chem. 382, (3), 669-678 (2005).
  29. Timms, J. F., Cramer, R. Difference gel electrophoresis. Proteomics. 8, (23-24), 4886-4897 (2008).
  30. Crane, J., Mittar, D., Soni, D., McIntyre, C. Cell Cycle Analysis Using the BD BrdU FITC Assay on the BD FACSVerse System. BD Biosciences Appl Notes. (2011).
المناهج التجريبية لدراسة الميتوكوندريا التعريب وظيفة من دورة الخلية النووية كيناز، Cdk1
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Candas, D., Qin, L., Fan, M., Li, J. J. Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1. J. Vis. Exp. (108), e53417, doi:10.3791/53417 (2016).More

Candas, D., Qin, L., Fan, M., Li, J. J. Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1. J. Vis. Exp. (108), e53417, doi:10.3791/53417 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter