Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

Eksperimentelle tilgange til at studere mitokondrie Lokalisering og funktion af en nuklear Cell Cycle kinase, Cdk1

doi: 10.3791/53417 Published: February 25, 2016

Introduction

I pattedyr cellecyklusprogression er afhængig af stærkt ordnede arrangementer kontrolleres af cycliner og cyclinafhængige kinaser (CDK'er) 1. Gennem sin cytoplasmatiske, nukleare, og centrosomal lokalisering, CyclinB1 / Cdk1 er i stand til at synkronisere forskellige begivenheder i mitosen såsom opdeling nukleare kuvert og centrosom adskillelse 2. CyclinB1 / Cdk1 beskytter mitotiske celler mod apoptose 3 og fremmer mitokondrie fission, et afgørende skridt for en ligelig fordeling af mitokondrier til de nydannede datterceller 4.

I prolifererende pattedyrceller, er mitokondrie ATP genereres via oxidativ phosphorylering (OXPHOS) udstyr (elektrontransportkæden), som er sammensat af 5 multi-subunit-komplekser; kompleks I - kompleks V (CI-CV). Nikotinamidadenindinucleotid (NADH): ubiquinone oxidoreduktase eller kompleks I (CI) er den største og mindste forstået af de fem komplekser 5. Komplekset consists af 45 underenheder, hvoraf 14 danner den katalytiske kerne. Når samlet, komplekset antager en L-formet struktur med den ene arm rager ind i matrixen og den anden arm indlejret i den indre membran 6,7. Mutationer i CI-underenheder er årsag til en række forskellige mitochondriale lidelser 8. Et funktionelt effektiv CI i OXPHOS er ikke kun brug for den overordnede mitokondriel respiration 9, men også for vellykket cellecyklusprogression 10. Opklaringen mekanismerne bag driften af ​​denne membranbundne enzym kompleks i sundhed og sygdom kunne muliggøre udviklingen af ​​nye diagnostiske procedurer og avancerede terapeutiske strategier. I en nylig undersøgelse, har vi fundet, at CyclinB1 / Cdk1 kompleks translokaliserer i mitokondrier i (Gap 2) G2 / (Mitose) M fase og phosphorylerer CI underenheder at øge mitokondrie energiproduktion, potentielt at opveje øgede energibehov af celler under celle cyklus 11. Her sho viwcase eksperimentelle procedurer og strategier, der kan anvendes til at studere mitokondrisk translokation af ellers nukleare / cytoplasmiske kinaser, deres mitokondrielle substrater samt funktionelle konsekvenser af deres mitokondrie lokalisering ved hjælp CyclinB1 / Cdk1 som eksempel.

Den fandt, at CyclinB1 / Cdk1 kompleks translokaliserer i mitokondrier når det er nødvendigt bedt studier af mitokondrier-specifikke overekspression og knockdown af dette kompleks. For at opnå mitokondrier ekspression af proteiner, kan man tilføje en mitokondrier targeting sekvens (MTS) i den N-terminale ende af proteinet af interesse. Mitokondrier rettet sekvenser tillader sortering af mitokondrielle proteiner i mitokondrierne, hvor de normalt bor 12. Vi har anvendt en 87 base-mitokondrier målrettet sekvens afledt fra forstadiet af human cytochrom c-oxidase subunit 8A (COX8) og klonet det i grønt fluorescerende protein (GFP) -mærket CyclinB1 eller rødt fluorescerendeProtein (RFP) -mærket Cdk1 indeholdende plasmider i ramme. Denne metode tillod os at målrette CyclinB1 og Cdk1 i mitokondrierne, specifikt ændrer den mitokondriske ekspression af disse proteiner uden at påvirke deres nukleare pool. Ved fluorescens tagging disse proteiner, var vi i stand til at overvåge deres lokalisering i realtid. Ligeledes har vi introduceret MTS i et plasmid indeholdende RFP-mærkede dominant negativ Cdk1, hvilket tillod os at specifikt vælte det mitokondrielle ekspression og funktion Cdk1. Det er vigtigt at skelne mellem mitokondrielle og de nukleare funktioner af kinaser, der har dobbelt lokaliseringer som Cdk1. Engineering MTS til N-terminalen af ​​disse dobbelte funktionelle kinaser tilbyder en stor strategi, der er let at være ansat og effektiv.

Da Cdk1 er en cellecyklus kinase, er det afgørende at bestemme cellecyklusprogression når Cdk1 er lokaliseret i mitokondrier. For at opnå dette, har vi udnyttet en ny method til at overvåge DNA-indholdet i celler. Traditionelle metoder omfatter anvendelse af BrdU (bromdeoxyuridin), en syntetisk thymidinanalog, som inkorporerer i det nyligt syntetiserede DNA under S-fasen af ​​cellecyklussen at erstatte thymidin. Derefter kan detekteres de celler, der aktivt replikerende deres DNA under anvendelse af anti-BrdU-antistoffer. En ulempe ved denne metode er, at den kræver denaturering af DNA for at give adgang for BrdU antistof ved barske metoder som syre eller varmebehandling, hvilket kan resultere i uoverensstemmelse mellem resultaterne 13,14. Alternativt vi udnyttet en lignende tilgang til at overvåge aktivt delende celler med en anden thymidin analog, Edu. Edu afsløring kræver ikke barske DNA denaturering som mildt rengøringsmiddel behandling gør det muligt for påvisningsreagenset at få adgang til Edu i nyligt syntetiseret DNA. Den edu-metoden har vist sig at være mere pålidelige, konsistente og med potentiale for high-throughput analyse 15.

Endelig to bestemme de mitokondrielle substrater af Cdk1 anvendte vi et proteomics værktøj kaldet 2D-DIGE, som er en avanceret udgave af klassisk todimensional gelelektroforese. Todimensional elektroforese adskiller proteiner på grundlag af deres isoelektriske punkt i den første dimension og molekylvægt i den anden. Da post-translationelle modifikationer, såsom phosphorylering påvirker det isoelektriske punkt og molekylvægten af ​​proteinerne, kan 2D-geler detektere forskellene mellem phosphoryle- status af proteiner i forskellige prøver. Størrelsen (areal og intensitet) protein blev ændringer med ekspressionsniveauet af proteiner, hvilket muliggør kvantitativ sammenligning mellem multiple prøver. Ved hjælp af denne metode, var vi i stand til at skelne de phosphorylerede proteiner i vildtype versus mutant mitokondrier målrettet CDK1 udtrykkende celler. De specifikke proteinpletter der viste i vild type, men manglede i mitokondrier målrettede mutant Cdk1 præparat blev isoleret ogidentificeret via massespektrometri.

I traditionelle 2D-geler, der triphenylmethanfarvestoffer farvestoffer anvendt til at visualisere proteinerne på gelen. 2D-DIGE bruger fluorescerende protein etiketter med minimal effekt på protein elektroforetisk mobilitet. Forskellige protein prøver kan mærkes med forskellige fluorescerende farvestoffer, blandet sammen og adskilt af identiske geler, tillader co-elektroforese af multiple prøver på en enkelt gel 16. Dette minimerer gel-til-gel variationer, hvilket er et kritisk problem i gel-baserede proteomics undersøgelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Isolering af mitokondrier fra dyrkede celler

  1. Udarbejdelse af Isolation Buffer for Cells (IBC) Buffer
    1. Forbered 0,1 M Tris / MOPS (tris (hydroxymethyl) aminomethan / 3- (N -morpholino) propansulfonsyre): Opløs 12,1 g Tris i 800 ml destilleret vand, justering af pH til 7,4 ved anvendelse MOPS pulver, tilsættes destilleret vand til en samlet volumen på 1 liter og opbevares ved 4 ° C.
    2. Forbered 0,1 M EGTA (ethylenglycol-bis- (2-aminoethylether) tetraeddikesyre) / Tris: Opløs 38,1 g EGTA i 800 ml destilleret vand, justering af pH til 7,4 under anvendelse af Tris pulver, tilsættes destilleret vand til et samlet volumen på 1 liter og opbevares ved 4 ° C.
    3. Forbered en M Saccharose: Opløs 34,23 g saccharose i 100 ml destilleret vand, lave 20 ml portioner og opbevares ved -20 ° C.
    4. Forbered IB c buffer: Forbered 100 ml IB c Buffer ved tilsætning af 10 ml 0,1 M Tris / MOPS og 1 ml 0,1 M EGTA / Tris til 20 ml; 1 M saccharose. Tilsæt destilleret vand til et samlet volumen på 100 ml. Indstil pH til 7,4.
  2. Fremstilling af Cell Lysis Buffer
    1. Forbered lysepuffer indeholdende 20 mM Tris-HCI (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA (Ethylen diamino tetraeddikesyre), 1 mM EGTA, 1% Triton-X-100, 2,5 mM natriumpyrophosphat, 1 mM β- glycerophosphat, 1 mM natriumorthovanadat. Tilføj proteinaseinhibitorer 1 ug / ml leupeptin og 1 mM PMSF (phenylmethylsulfonylfluorid) lige før brug.
  3. Isolering af mitokondrier
    1. Harvest 3 x 10 7 celler med iskold 1x PBS (phosphatbufret saltvand), pH 7,4 og centrifugeres celler ved 600 xg i 10 min ved 4 ° C. Supernatanten fjernes, og re-suspendere pellet i 5 ml iskold IB c buffer.
    2. Homogenisere cellerne under anvendelse af en glas / glas vævsformaler i ca. 10 minutter. Overfør homogenatet til en 15 ml rør og centrifugeres ved 600 xg i 10 min ved 4 ° C. For funktionel mitokondrier, bruge glas / Teflon kobling, da det er mindre skadelig for mitokondrier end glas / glasvæv kværn.
    3. Opsaml supernatanten i 1,5 ml rør og centrifugeres ved 7.000 xg i 10 minutter ved 4 ° C. Supernatanten overføres til et 1,5 ml rør og gemme som cytosol protein.
    4. Vask pelleten (mitochondrier) to gange med 200 pi iskold IB c puffer og centrifugeres ved 7.000 xg i 10 minutter ved 4 ° C.
    5. Supernatanten fjernes, og resuspender pelleten i cellen lysisbuffer og bruge det straks eller opbevares ved -80 ° C til senere brug. Hvis der er behov funktionelle mitokondrier, re-suspendere pillen i den resterende buffer efter kassere supernatanten. Fortynding mitochondriefraktionen yderligere kan resultere i tab af funktion af mitokondrier. Opbevar på is og bruge præparatet i 1 - 3 ud t for de bedste resultater.
    6. Sonikeres den resuspenderede pellet i tredive 3-sec bursts i enisbad, centrifugeres ved 10.000 xg i 5 min, og gem supernatanten som mitochondriefraktionen.

2. Co-immunfarvning af Cdk1, CyclinB1 og COXIV, et mitokondrie Resident Protein

  1. Grow 5 x 10 4 celler på dækglas i 24-brønds plader O / N eller op til 70% konfluens. Aspirer mediet og vaskes cellerne to gange med 500 pi iskold 1 x PBS, pH 7,4.
  2. Fix celler med 500 pi iskold 4% paraformaldehyd ved stuetemperatur i 10 min. Aspirer fikseringsopløsningen og vask af cellerne med 500 pi 1 x PBS 3 gange, 5 minutter hver med forsigtig rystning ved stuetemperatur.
  3. Permeabilisere cellerne med 0,2% Triton X-100 i 500 pi PBS i 5 minutter ved stuetemperatur. Aspirer opløsningen og vask cellerne 3 gange, 5 minutter hver med 500 pi PBS. Tilsæt blokerende opløsning (500 pi, 1% BSA (bovint serumalbumin) i PBS indeholdende 1% Tween 20) i 30 minutter ved stuetemperatur.
  4. Fortynd de primære antistoffer 1: 250 (vol: vol) i 5001 l blokeringsopløsning og inkuber cellerne med ønskede primære antistoffer i forskellige arter for at undgå cross signalering (CyclinB1 (mus) og COXIV (kanin) eller Cdk1 (mus) og COXIV (kanin) ved stuetemperatur i 30 - 60 min eller O / N ved 4 ° C.
  5. Vask dækglassene med 500 pi 1 x PBS 3 gange, 5 minutter hver og derefter inkuberes med sekundært antistof fortyndet 1: 1.000 i 500 pi blokerende opløsning ved stuetemperatur i 1 time efterfulgt af vask med 500 pi PBS 3 gange, 5 minutter hver.
  6. Monter dækglas med 20 pi anti-fade monteringsløsning og forsegle dias med neglelak. Billede dias ved hjælp af et fluorescerende mikroskop med det samme eller holde i mørke ved 4 ° C i 1 - 2 uger.

3. Sodium Carbonate Ekstraktion af intakte Mitokondrier

  1. Grow ca. 20 x 10 7 celler, høst, vask gang med PBS og isolere mitokondrier som beskrevet i afsnit 1. Divide mitokondrie-isolater i to parts før den sidste centrifugering til pelletering mitokondrier (før trin 1.3.4); medmindre halvdelen skal anvendes som det samlede mitochondrier (trin 3.2), bruge den anden halvdel for natriumcarbonat ekstraktion (efter trin 3,3-3,6) for at adskille opløselige og membranbundne proteiner.
  2. Lyse de samlede mitokondrier pelletere med 30 pi celle lysis buffer og opbevares lysatet ved -80 ° C indtil anvendelse i immunblotting.
  3. Tilsættes 250 pi 0,1 M Na 2 CO 3 (natriumcarbonat), pH 11,0, til den anden halvdel af det mitokondrielle pellet og inkuber på is i 30 minutter.
  4. Centrifuger ved 100.000 xg i 20 min. Saml supernatanten og fortsæt til trin 3.5. Lyse pellet ved hjælp af 30 pi cellelysebuffer og soniker som i trin 1.3.6. Opbevar ved -80 ° C indtil anvendt i immunblotting.
  5. Tilføj et tilsvarende volumen 20% frisk gjort trichloreddikesyre (TCA) til supernatanten for at udfælde proteinerne og holde på is i 30 minutter.
  6. centrifugaluge ved 15.000 xg i 10 min. Supernatanten fjernes, pellet opløses i 80 pi celle lysis buffer og opbevares ved -80 ° C indtil anvendelse i immunblotting.

4. Adskillelse af Indre og ydre membraner af mitokondrier (Isolering af Mitoplasts)

  1. Grow ca. 20 x 10 7 celler, høst, vask gang med PBS og isolere mitokondrier som beskrevet i afsnit 1. Adskil mitokondrie fraktioner i 10 lige store portioner, før den sidste centrifugering til pelletering mitokondrier (før trin 1.3.4).
  2. Opløs hver pellet i 30 pi af den angivne koncentration af hypotonisk saccharose puffer (1 mM EDTA, 10 mM MOPS / KOH (kaliumhydroxid), pH 7,2; saccharose koncentration i området fra 25 - 200 mM) med eller uden 50 ug / ml trypsin ( se tabel 1) og inkuber 30 minutter på is.
  3. Tilsæt 3 pi 10 mM PMSF (for at nå en slutkoncentration på 1 mM PMSF) til trypsin indeholdende hætteglas at stoppe than trypsinspaltning og inkuber på is i 10 min.
  4. Der centrifugeres ved 14.000 xg ved 4 ° C i 10 min. Overfør supernatanten til et nyt rør, lysere pellet i 30 pi cellelysebuffer, soniker som i trin 1.3.6, og opbevares ved -80 ° C.

5. Konstruktion af mitokondrier målrettet GFP / RFP-mærkede CyclinB1 / Cdk1 Vektorer og Bekræftelse af deres mitokondrie Lokalisering

  1. Klone mitokondrier målrettet sekvens (MTS; afledt fra forstadiet af human cytochrom c-oxidase subunit 8A (COX8) mellem nukleotider 76 - 161) i ramme til N-terminalen af ​​GFP eller RFP på Nhel- og BamHI-stederne i pEGFP-N1 eller pERFP -N1 vektorer under anvendelse af standard molekylære kloningsteknikker.
  2. Ved konstruktionen PCR primere for CyclinB1 og CDK1 gener, tilføje BamHI restriktionsenzymgenkendelsessteder (fed) til 5'af PCR-primerne.
    Forward Cdk1 BamH15 'CAG T GG ATC C AA TGG AAG ATT ATA CCA AAA T
    Reverse Cdk1 BamH1 5 'CTG T GG ATC C TG CAT CTT CTT AAT CTG ATT
    Forward CyclinB1 BamH1 5'ATA TGG ATC CAA TGG CGC TCC GAG TCA
    Reverse CyclinB1 BamH1 5'ATA TGG ATC CTG CAC CTT TGC CAC AGC C
  3. Forstærke CDK1 og CyclinB1 gener ved hjælp af disse primere efter standard teknikker. Fordøje PCR produkter med 1 pi BamHI-restriktionsenzym ved 37 ° C i 2 timer. Kør fordøjelsesprodukter på en 1% agarosegel. Brug af et barberblad, skåret de korrekte -størrelse DNA-fragmenter ud og oprense DNA'et fra gelen under anvendelse af et Gel Extraction kit.
  4. Fordøje 1 ug MTS-pEGFP-N1 og MTS-pERFP-N1 plasmider med 1 pi BamHI-enzym ved 37 ° C i 2 timer. Tilsæt 1 pi Calf-INTEStinal alkalisk phosphatase (CIP) i 30 minutter ved 37 ° C. Kør fordøjelsesprodukter på en 1% agarosegel og oprense lineære plasmider fra gel som i trin 5.3.
  5. Oprette en ligeringsreaktion ved at tilsætte 1 pi af plasmid fra trin 5,4 og 5 pi Cdk1 eller CyclinB1 fra trin 5.3 til 3 ul ligasepuffer, 0,5 ul T4 ligase og 20,5 pi dH 2 O. Inkuber O / N ved 4 ° C.
  6. Transform Escherichia coli DH5a kompetente celler med 10 pi ligeringsblanding efter standardteknikker og vokse bakterier på 10 mg / ml kanamycin-indeholdende LB-agarplader O / N ved 37 ° C til opnåelse af kolonier.
  7. Udvælge en koloni fra O / N voksne plader ved hjælp af en steril pipette spids, indsætte spidsen i en 5 ml kanamycin-LB-holdige rør og inkuberes O / N. Isoler plasmidet under anvendelse miniprep kit ifølge fabrikantens protokol, og sekventere plasmidet anvendelse af standardteknikker.
  8. Transficere eksponentielt voksende MCF10A celler (1,5 x 10 4 celler podet på plader med 96 brønde) med MTS-Cdk1-RFP eller MTS-CyclinB1-GFP-plasmider fra trin 5.7 ved fremstilling af en plasmid / transfektionsreagens forhold på 1: 2 (w: v, 100 ng : 0,2 pi) i 100 pi serum- og antibiotikum-frit medium.
  9. Inkubér cellerne i plasmid / reagensblanding i 48 timer ved 37 ° C i en CO2-inkubator fugtstyring (5% CO2, 95% relativ fugtighed).
  10. Forberede 1 mM stamopløsning af mitochondriske rød og grøn fluorescerende farvestoffer ved at opløse 50 ug pulver i 100 pi DMSO. Fortynd stamopløsning 1: 400 i 1x PBS for at opnå 2,5 uM arbejder løsninger. Stamopløsningerne kan opbevares ved -20 ° C i et år.
  11. Bland 2 pi 2,5 uM rødt farvestof med 98 pi dyrkningsmedium til at forberede en 50 nM endelig koncentration.
  12. Erstat celledyrkningsmediet af CyclinB1-GFP bærende MCF10A celler (frembragt i trin 5.8) med rød farve holdigt medium i 2 min. Gentagsamme procedure med grønt farvestof for Cdk1-RFP bærende MCF10A celler.
  13. Vask to gange med 100 pi 1 x PBS at slippe af med den overskydende farvningsopløsning, tilsættes 100 pi 1x PBS til 96-brønds plade.
  14. Visualisere mitokondrierne og CyclinB1-GFP (excitation ved 488 nm og emission til 494 - 536 nm) og Cdk1-RFP (excitation ved 560 nm og emission ved 565 - 620 nm) på plader med 96 brønde under fluorescerende mikroskop ved 40X forstørrelse.

6. Identifikation af differentielt Phosphorylerede proteiner via 2D-DIGE

  1. Prøvefremstilling
    1. Isoler mitokondrier og lyserer mitokondriske fraktioner som i Trin 1.3. Tilføj et tilsvarende volumen 20% TCA (trichloreddikesyre i vand) til hver prøve og vortex i 15 sekunder. Inkuber prøver på is i 30 minutter, da proteinerne udfældes af opløsningen.
    2. Centrifuger prøverne ved 9.300 xg ved 4 ° C i 5 minutter, fjern supernatant, og der tilsættes 60 ul kold acetone (100%), efterfulgt afcentrifugering ved 9.300 xg ved 4 ° C i 5 min.
    3. Gentag acetone vasketrinnet (trin 6.1.2) en gang mere, fjern supernatanten og genopslæmmes prøverne i 50 pi DIGE mærkning buffer (7 M urinstof, 2 M thiourinstof, 4% CHAPS, 30 mM Tris, pH 8,5).
  2. Forbered fluorescerende farvestoffer
    1. Forbered stamopløsning: Opløs farvestoffer (5 nmol) i 5 pi frisk dimethylformamid (DMF) til en slutkoncentration på 1 nmol / pl. Bestanden farveopløsning ved -20 ° C indtil brug for et par måneder Opbevar.
    2. Forbered arbejdsopløsning: Tillad farvestoffer at sætte ved stuetemperatur i 5 min. Fortynd 1 pi farvestof med 4 pi DMF til en slutkoncentration på 200 pmol / pl. Hold på is under brug. Bemærk: Arbejdsgruppen løsning kan opbevares ved -20 ° C i 3 uger.
  3. Label Proteiner
    1. Bland 1 pi arbejde farveopløsning pr 12,5 ug protein. Skalere op efter behov. For poolede standarder, tilsættes 61 l af Cy2 arbejdsopløsning til 300 ug poolede protein.
    2. Vortex for 30 sec og centrifugeres ved 4 ° C i 30 sekunder ved 12.000 x g. Inkuber på is i mørke i 30 min. Stop mærkningen ved at tilføje 1 pi 10 mM lysin pr 1 pi arbejdsopløsning brugt. Bland godt og inkuber på is i mørke i 10 min.
    3. Pool individuelt mærkede prøver og blandes med rehydrering buffer (7 M urinstof, 2 M thiourinstof, 4% CHAPS, 1,2% destreak, 1% pharmalytes, bromphenolblåt). Samlet volumen vil være 125 pi.
    4. Vortex prøver til 30 sek og tillader prøver at indstille ved stuetemperatur i 30 min. Belastning 125 pi prøver onto 7 cm pH 4 - 9 isoelektriske fokusering (IEF) strips.
  4. First Dimension Elektroforese
    1. Placer strimler holdere (kister) på elektroden plade, og sørg for striben indehavere er helt ren og tør. Pipette 125 pi prøver i en kiste, spreder jævnt over hele kiste.
    2. Brug tweezers, afhente IEF striben, forsigtigt fjerne plast beskyttende dække, og placere den (gel nedad) ind i kiste / rehydrering buffer. Undgå fældefangst luftbobler. Langsomt fylde kiste (1 - 1,5 ml) med mineralolie og placere kisten dækker på kisterne.
    3. Begynd isoelektrisk fokusering efter protokollen i tabel 2:
      Bemærk: Når kørslen er færdig, kan strimlerne opbevares i plastrør ved -80 ° C eller direkte flyttede til ækvilibrering og den anden dimension.
  5. Anden dimension - natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE)
    1. ligevægtsindstilling
      1. Tø SDS ækvilibreringsbuffer (8 ml pr bånd, 6 M urinstof, 30% glycerol, 2% SDS). Afvej dithiothreitol (DTT, 10 mg DTT pr 1 ml SDS ækvilibreringsbuffer). Opløs DTT i 4 ml SDS ækvilibreringsbuffer.
      2. Afvejes IAA (iodacetamid, 25 mg IAA pr 1 ml SDS ækvilibreringsbuffer).Opløs IAA i 4 ml SDS ækvilibreringsbuffer.
      3. Smelt 1 ml tætningsprodukter agaroseopløsning i et vandbad til senere brug.
      4. Hvis strimlerne blev frosset, lad dem tø fuldstændigt. Place strimler gel opad i reswelling bakken. Tilsæt 4 ml SDS ækvilibreringsbuffer med DTT til hver strimmel og inkuberes i 15 minutter under forsigtig omrystning.
      5. Hæld al SDS ækvilibreringsbuffer med DTT. Tilsæt 4 ml SDS ækvilibreringsbuffer med IAA til hver strimmel og inkuberes i yderligere 15 minutter under forsigtig omrystning. Efter ækvilibrering med IAA puffer, hæld af SDS ækvilibreringsbuffer.
    2. SDS-PAGE
      1. Pak mini geler, fjerne kam og skyl gelen og brøndene med Hedeselskabet 2 O. Fjern den hvide tape i bunden af ​​gelen før kører. Vend strimlen på gelen korrekt, gel orientering er afgørende for spot skæring.
      2. Placer gelen fladt på tæller med den lille plade op og gel top vender experimenter. Læg strimlen på høj nummerplade med anodiske ende (++ ende med stregkoden) vender mod venstre side af gelen. Ved hjælp af en lineal, langsomt skubbe stribe ned på gel overflade. Undgå fældefangst luftbobler mellem båndet og gelen. Stå gelen op i et glas plade stativ.
      3. Der tilsættes 1 ml varm forsegling agaroseopløsning til åbningen af ​​kassetten. Sørg presses alle luftbobler ud ved hjælp af en flad lineal. Apparatet samles og køre gelen ved en konstant 125 V i 90 min.
      4. Når gelen er færdig kører, placere gel på en biomolekylært imager med 2 ml Hedeselskabet 2 O og scanne gelen i fluorescens erhvervelse mode med 635 nm excitation laser og 665 nm emission filter.
    3. phosphoprotein Farvning
      1. Fastgør gelen med 50% methanol og 10% eddikesyre-blanding (10 ml) i 30 minutter to gange. Vask med 10 ml vand i 10 minutter tre gange og pletten med 10 ml phosphoprotein pletten i 60 - 90 min, efterfulgt afaffarvning med 10 ml affarves opløsningen i 30 minutter tre gange.
      2. Vask med 10 ml vand 5 min to gange og billede gelen med en laser gel scanner ved 532 nm / 560 nm Excitation / Emission.
    4. Protein Digestion og identifikation
      1. Excise alle af differentielt udtrykte protein pletter fra gelen til mikropladebrønde ved anvendelse af en robot spot-picker ifølge producentens specifikationer, og der tilsættes 100 mM ammoniumbicarbonat (2 ml) i 1 time ved stuetemperatur til affarvning gelstykkerne. Dehydrere med 2 ml 100% acetonitril der vaskes to gange og tørres i et vakuum koncentrator i 30 min.
      2. Rehydrere gelstykkerne med 100 pi 13 ng / pl modificeret porcin trypsin i 50 mM ammoniumbicarbonat i 16 timer ved 37 ° C. Indsamle supernatanterne og længere ekstrahere proteinerne med 100 pi 5% trifluoreddikesyre i 50% acetonitril i 30 min.
      3. Koncentrer peptiderne ned til 5 pi ved vakuum centrifuge concentdøråbneren og analysere med maldi - Time of Flight - tandem massespektrometri analyse (MALDI TOF-MS / MS) 17.

7. In vitro kinase assay

  1. Fremstilling af substrater
    1. Sub-klon Complex I (CI) subunits (NDUFV1, NDUFV3, NDUFS2, NDUFB6, og NDUFA12), der er identificeret som forskelligt fosforylerede CDK1 mål, i pGEX-5X-1 vektor til at generere Glutathion-S-transferase (GST) tagged bakteriel ekspressionsplasmider 11. Oprense CI-underenheder ved hjælp af glutathion kolonnerne høj affinitet følge nedenstående protokol.
      1. Kultur GST-mærket CI-indeholdende Escherichia coli-stamme BL-21 i Luria-Bertani (LB) bouillon med 50 ug / ml ampicillin i et rysteapparat ved 37 ° C, indtil en optisk densitet (OD) på 0,6 blev nået. Tilføj isopropyl-BD-thio-galactopyranosid (IPTG) til kulture i en slutkoncentration på 0,1 mM, og der inkuberes i yderligere 3 timer.
      2. Centrifuger ved 600 xg i 10 min for at opsamle bakterierne og resuspender i 5 ml 1 x PBS-buffer indeholdende 5 mM DTT, 1 x proteinase inhibitor cocktail, og 0,1% lysozym. Lysere cellerne ved sonikering i tyve 5 s bursts, og fjern cellerester ved centrifugering ved 600 xg i 10 min.
      3. Opsaml supernatanten og inkuberes med glutathion-agarose 4B-perler i et volumenforhold på 4: 1 (supernatant: bead) i 1 time ved stuetemperatur.
      4. Eluere GST-fusionsproteiner fra perlerne med 3 ml glutathion elueringspuffer (10 mM reduceret glutathion i 50 mM Tris-HCI, pH 8,0) og underkaste de eluerede proteiner til dialyse i molekylær porøs membran slange (molekylvægt cut-off 12 -14 kilodalton) med 1 x PBS / 1 mM EDTA. Opbevar de oprensede proteiner ved - 80 ° C.
  2. CDK1 kinaseanalyse
    1. Før igangsættelse af kinase røvay, indstille varmeblokke til 30 ° C og 100 ° C. Tø kommerciel CyclinB1 / Cdk1 enzymkompleks og substrater på is.
    2. Forbered reaktionsblandingen på is. Siden 32P ATP isotop er involveret, forberede alle reaktionsblandinger i 1,5 ml prøveglas med skruelåg, der indeholder en O ring for at forhindre spredning af radioaktivitet.
      Forsigtig: Følg de radioaktive regler materiale beskyttelse. Brug en 8 mm tykke plexiglas afskærmning og arbejder i det mindste på en arms længde. Tør nogen forurenede område med vand.
    3. Forbered en 30 pi reaktionsbuffer indeholdende 1 x Cdk1 puffer (50 mM Tris-HCI, 10 mM MgCI2, 2 mM DTT, 1 mM EGTA, 0,01% Brij 35, pH 7,5), 0,6 mM kold ATP, 0,1 pCi 32P ATP, 2 enheder CyclinB1 / Cdk1 og 6 ug substrat protein. Juster lydstyrken til 30 pi med Hedeselskabet 2 O. For positiv kontrolreaktion, udskifte substratet med 0,01 mM histon H1, en velkendt CyclinB1 / Cdk1 substrat.
      1. For negative control reaktioner, (1) erstatte substratet med GST-protein alene og (2) udskifte substratet med 0,01 mM histon H1 + 0,5 uM RO-3306, en selektiv Cdk1 inhibitor.
    4. Bland godt med pipette og centrifugeres for at bringe al væsken til bunden af ​​røret, hvilket minimerer risikoen for kontaminering. Inkuber ved 30 ° C i 60 minutter.
    5. Tilsæt 6 pi 5x SDS-prøvebuffer for at standse reaktionen og denaturere ved 100 ° C i 10 min. Køre prøver på 10% SDS-PAGE-gel ved 160 V i 2 timer, eller indtil farvefronten har nået enden af ​​gelen. Overfør gel på en kromatografi papir og wrap med plastfolie.
      Forsigtig: Alt væske i kontakt med radioisotoper bør behandles som radioaktivt affald og bortskaffes i en 5-gallon poly ballon, som de miljø- sikkerheds- og sundhedsmæssige tjenester som pr institutionelle retningslinier.
    6. Eksponere gelen til røntgenfilm i 1 dag eller op til 1 uge ved -20 ° C, afhængigt af den specifikke aktivitet af radioisotop anvendesog enzymet.

8. steddirigeret mutagenese til at generere dominant negative Cdk1 (D146N)

  1. Design mutagenese primere; to primere, som er komplementære til hinanden, indeholdende det mutante stedet (G vil blive erstattet af en nukleotid til at kode for N i stedet for D aminosyre) flankeret af 20 baser på hver side 11.
  2. Forbered en 50 pi Polymerase Chain Reaction (PCR) blanding indeholdende 1x reaktion buffer, 2,5 mM dNTP'er, 10 uM af primere (både frem og bak), 40 ng af skabelonen, og Hedeselskabet 2 O. Tilføj 2,5 U DNA-polymerase i reaktionen.
  3. Kør følgende PCR program: 95 ° C 3 min, 95 ° C 30 sek, 55 ° C 30 min, 68 ° C 6 minutter; 16 cyklusser (Bemærk: 68 ° C inkubationstid bestemmes af størrelsen af ​​DNA'et 1 min / kb er påkrævet for DNA ≤ 10 kb For større DNA, 2 min / kb plus 10 sekunder pr..). Følg med 68 ° C 7 min og hold ved 4 ° C, indtil klar til brug.
  4. Tilføje2 pi Dpnl restriktionsenzym (10 U / pl) og 5,7 pi Dpnl buffer, bland godt med forsigtig tap med fingeren og inkuber reaktionen ved 37 ° C i 1 time.
  5. Transfer 10 pi Dpnl-behandlede PCR-produkter i 50 pi DH5a kompetente celler til transformation. Der inkuberes på is i 30 minutter, efterfulgt af 45 sek varmechok ved 42 ° C og 5 minutter på is. Der tilsættes 500 pi LB og rystes ved 37 ° C i 1 time før udpladning på LB-agarplader. Inkuber O / N ved 37 ° C.
  6. Vælg en koloni fra O / N dyrket agarplader under anvendelse af en steril gul pipettespids, drop spidsen ind i et rør indeholdende 5 ml LB, og vokse O / N i et 37 ° C rysteapparat. Isoler plasmid under anvendelse af et miniprep kit og sekventere plasmid for at bekræfte mutationen ifølge producentens protokol.

9. Bestemmelse af Cell Cycle Fase Længder med Edu Indbygning Assay

  1. Cell Sortering
    1. transfect 2 x 10 5 celler med angivne vektorer (MTS-GFP / RFP, MTS-CyclinB1-GFP / Cdk1-wt-RFP eller MTS-Cdk1-dn-RFP) i en 6-brønds plade under anvendelse af 1: 2 (w: v , 2,5 ug: 5 pi) forholdet mellem DNA: transfektionsreagens blanding fremstillet i 2,5 ml serum- og antibiotika frie kulturmedier i 48 timer. Levende sortere celler, der stabilt udtrykker GFP-mærket Cdk1 og RFP-mærkede CyclinB1 proteiner via flowcytometer.
      1. Vask cellerne med 1 x PBS, tilsættes 100 pi trypsin i fadet og inkuberes ved 37 ° C i 5 min. Tilsæt 2 ml dyrkningsmedier at opsamle cellerne og passerer gennem en 70 um filter til at generere en enkelt cellesuspension. Vask enkelt celle suspension med 500 pi 1% føtalt kalveserum i PBS (FCS / PBS), før du lægger dem på flowcytometer.
      2. Opsætning af sortering parametre følgende fastsatte protokoller 18 gating for dobbelt positive celler farvet med både GFP og RFP. Opsaml sorterede celler kommer ud af cytometeret til et rør beholdere underning cellekulturmedium og bruge disse celler til analyse af cellecyklusprogression med Edu puls-chase mærkning i protokol 9.2.
  2. Måling af Cell Cycle Length Brug af Edu Mærkning flowcytometriassayet
    1. Seed sorteret celler i 6-brønds plader ved en densitet på 2,5 x 10 5 celler per brønd og kultur O / N ved 37 ° C i en CO2-inkubator. Tilføj edu til dyrkningsmediet i en slutkoncentration på 25 uM. Der inkuberes ved 37 ° C i en CO2-inkubator i 1 time.
    2. Vask cellerne med 1% BSA i 500 pi PBS og samle dem i et 1,5 ml rør ved 2 timers intervaller i i alt på 10 - 12 timer.
    3. Centrifugér celler ved 350 xg i 5 min, supernatanten. Løsne pillen ved tilsætning af 100 ul fastsættelse opløsning (leveret af producenten i edu mærkning kit) i 15 minutter ved stuetemperatur og bland godt.
    4. Vask cellerne med 1 ml af 1% BSA i PBS tre gange. Fastgørceller igen med 0,5 ml 70% ethanol O / N ved 4 ° C.
      Bemærk: Ethanol fiksering er afgørende for at standse indre GFP / RFP fluorescens som følge af det rekombinante-mærkede protein ekspression.
    5. Centrifugeres cellerne igen ved 350 xg i 5 min og vask pellet med 1 ml 1% BSA i PBS én gang. Resuspender cellerne i 1 ml permeabilisering buffer (0,1% Triton-X-100, 1% BSA, 0,2 mg / ml RNase A i PBS) i 20 minutter ved stuetemperatur.
    6. Vask cellerne med 1 ml af 1% BSA i PBS én gang. Tilsæt 0,5 ml af reaktionsblandingen cocktail i hvert rør og bland godt. Inkuber reaktionsblandingen ved stuetemperatur i 30 minutter i mørke.
    7. Vask med 1 ml 1% BSA i PBS én gang og plette DNA med 50 pg / ml propidiumiodid (PI) i 1 ml 1% BSA i PBS.
    8. Analyser cellerne ved flowcytometri til at følge edu-positive population. Foreliggende scatter punktdiagram over edu-mærkede celler farvet for DNA-indhold (PI farvning X-aksen) og edu (Alexa 647 farvning Y-akse).
      1. Brug APC kanal for Alexa647-edu udnytte en 670/30 båndpasfilter med alt lys til stede under 685 nm, rammer det filter; og phycoerythrin (PE) kanal for PI med en 581/15 båndpasfilter foran det med alt lys til stede mindre end 600 nm rammer dette filter.
      2. Indsæt de første rør indeholdende celler i flowcytometri og bruge en standard gating-strategi for erhvervelse: Plot FSC-området X SSC-område for morfologi efterfulgt af PI (PE-kanal) X Alexa647-Edu (APC kanal) for celle farvning. Optag data for alle rør én efter én at erhverve 10.000 hændelser pr prøve.
      3. Bestem cellecyklussen fasefordeling af cellerne og længder fase under anvendelse af en flow-cytometri dataanalyse software ifølge etablerede protokoller 11,30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Sub-mitokondrie lokalisering af CyclinB1 og Cdk1

Natriumcarbonat ekstraktion anvendes til at bestemme, om et protein er placeret inde i mitokondrierne eller på den udvendige overflade, nemlig ydre membran. Når et protein er vist at lokalisere inde i mitokondrierne, kan yderligere bestemmelse af sub-mitokondrie lokalisering foretages via mitoplasting kombineret med protease-fordøjelse. For at angive sub-mitokondrie lokalisering af CyclinB1 eller Cdk1 blev mitoplasts isoleret ved at fortynde mitokondrier i hypotonisk buffere med faldende koncentrationer af det osmotiske saccharose fra 200 mM til 25 mM. Den ydre membran begynder at briste ved 150 mM saccharose, mens den indre membran forbliver intakt, indtil den endelige koncentration på 25 mM saccharose (figur 1A). I kombination med mitoplasting, kan protease beskyttelse assay udføres under anvendelse trypsi at fordøje udsatte proteiner efter ydre membran brud. Dette vil resultere i fordøjelse af intermembrane rum proteiner. Hvis proteinet af interesse er beskyttet mod trypsin fordøjelse, indikerer dette mitochondriematricen lokalisering af proteinet. I denne repræsentativt tal blev mitokondrie matrix protein Hsp60, og intermembrane plads protein Timm13 brugt som sub-mitokondrie lokalisering markører. Lignende med Hsp60 men i modsætning Timm13, CyclinB1 og Cdk1 blev beskyttet mod trypsin fordøjelse, hvilket indikerer deres mitokondrie matrix lokalisering (figur 1B).

Mitokondrie Ekspression af MTS- og GFP-mærkede CyclinB1 og CDK1 Proteiner

MTS klones i ramme ved N-terminalen af ​​CyclinB1 eller CDK1 gener, som har GFP eller RFP tags ved deres C-terminus. Den resulterende rekombinante protein er mitokondrier målrettet GFP- eller RFP-mærket CyclinB1 eller Cdk1. Listen af ​​konstruktionerne frembragt og anvendt i denne undersøgelse er vist i figuren. Ved hjælp af disse konstruktioner, overekspression af CyclinB1 og / eller Cdk1 i mitokondrier blev opnået, er vist her ved Western blotting af de isolerede mitokondriske fraktioner (figur 2).

Potentielle Mitochondriale Mål af CyclinB1 / Cdk1 Bestemt af 2D-DIGE

CDK1 hører til serin / threonin (S / T) kinasefamilien katalyserer overførslen af ​​en phosphatgruppe fra ATP til prolin (P) -orienterede S eller T-rester. Et punkt mutation, der erstatter en aspartat (D) rest med asparagin (N) ved position 146 i Cdk1 (D146N) genererer en dominerende negativ (dn) Cdk1 mutant 19. For at undersøge funktionen af ​​mitokondrie Cdk1 blev en mitokondrier målrettet Cdk1-dn protein genereres ved at konstruere et plasmid (pERFP-N1-MTS-Cdk1-dn), der indeholder en 29 aminosyre-long mitokondrie-targeting sekvens (MTS) afledt af subunit VIII af den humane cytochrom C oxidase knyttet til RFP-mærket dn-Cdk1. pERFP-N1-MTS producerende mitokondrier-målrettede ERFP protein blev anvendt som en tom vektorkontrol. Mitokondrielle phosphoproteiner i G2 / M-celler transficeret med begge konstruktioner blev profileret ved 2D-gel-analyse med pH 4-10 gelstrimler. Sammenlignet med tom vektor transfektanter (figur 3, øverste felt), en gruppe af mitokondrielle phosphoproteiner var tilsyneladende manglende eller nedsat i Cdk1-dn transfektanter (figur 3, nederste panel). Massespektrometrianalyse af de detekterede pletter bestemmes identiteten af ​​proteinerne phosphoryleret med Cdk1 i mitokondrierne.

Cellecyklusprogression og Bestemmelse af fase længder med Edu Pulse-chase-analyse

For at undersøge udviklingen af ​​cellecyklus when mitokondrie CyclinB1 / CDK1-niveauer øges, en puls-chase mærkning eksperiment under anvendelse af en thymidin-analog, ethynyl deoxyuridin (edu) blev udført til at mærke populationen af celler undergår DNA-syntese 20. Denne metode gør det muligt at visualisering af cellecyklus fanget over en 22 timers vindue ved at spore Edu-positive population, når celler fremskridt gennem S og G2 / M-faser og ophobes i G1 fasen. Resultaterne viser, at mærkede S-fase celler skred gennem G2 / M-fase og optrådte i G1-fasen så hurtigt som 4 timer i celler, der udtrykker vildtype mitokondrie CyclinB1 / Cdk1, sammenlignet med 6 timer i celler transficeret med en vektor kontrol eller mutant CyclinB1 / CDK1 (figur 4A), hvilket viser, at forøgelse af mitokondrisk CyclinB1 / CDK1 accelererer cellecyklusprogression.

Figur 1
Figur 1. mitokondrie CyclinB1 / CDK1 lokaliserer i Matrix. (AB) Sub-mitokondrie lokalisering af CyclinB1 og Cdk1 opdaget af mitoplasting og protease beskyttelse assay, figur er blevet ændret fra Wang et al., 2014 11. Den samlede (T), pellet (P), og supernatanten (S) fraktioner blev underkastet western blotting-analyse med viste antistoffer. TIMM13 (en inter-rum protein), og HSP60 (en matrix protein). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Ekspression af Mitochondriale CDK1 konstruktioner. Western blotting af mitokondriske fraktioner isoleret fra celler transficeret med mitokondrier målrettet CyclinB1 og / eller vildtype eller dominant negativ mutant Cdk1 (plasmider er angivet på bunden 11. pEGFP-N1-MTS og pERFP-N1-MTS vektorer var tomme vektor kontrol for MTS-CyclinB1 og MTS-Cdk1 henholdsvis). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Potentielle Mitochondrial Substrater af Cdk1. Mitokondrielle proteiner udvundet fra G2 / M-toppede celler transficeret med mitokondrier målrettet tom vektor (pERFP-N1-MTS, øverste panel) eller mutant Cdk1 (pERFP-N1-MTS-Cdk1-dn, nedre panel) blev mærket med Cy5 (grøn), adskilt af 2-D gel og phosphorylerede proteiner blev farvet med phosphoprotein farvestof (rød). Dette tal er blevet ændret fra Wang et al. 2014 11."> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. Mitokondriel Cdk1 Forbedrer G2 / M Overgang og Samlet Cycle Progression.
Cell cyklus analyse med Edu puls-chase mærkning. Scatter plot histogrammer for edu-mærkede celler blev trukket for DNA-indhold (x-aksen) og edu (Y-aksen). De lavere tal i hvert panel viser gennemsnitlige fluorescensintensitet af edu mærkede kerner. De tidspunkter blev angivet i timer efter at edu puls 11. For alle tidspunkter, blev portene viser følgende befolkninger trukket: G0 / G1, S og G2 / M. Til 6, 8, og 10-timers tidspunkter, uddan- mærket G1 *, S / G2 *, og G2 / M * populationer er vist. Dette tal er blevet ændret fra Wang et al., 2014 11. Klikher for at se en større version af dette tal.

Saccharose anvendte koncentrationer
ingen trypsin 25 mM 50 mM 100 mM 150 mM 200 mM
+ trypsin 25 mM 50 mM 100 mM 150 mM 200 mM

Tabel 1. Hypotoniske Saccharose Buffere Anvendes til Trin 4.2

Trin 1 30 V 12 hr Trin og Hold
trin 2 300 V 0,5 timer Trin og Hold
trin 3 1.000 V 0,5 timer Gradient
5000 V 1,33 t Gradient
trin 5 5000 V 20.000 V t Trin og Hold

Tabel 2. Isoelektrisk protokol Bruges til trin 6.4.5

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ligesom proteinerne bestemt til andre subcellulære organeller, mitokondrier målrettede proteiner besidder målrettet signaler på deres primære eller sekundære struktur, som dirigerer dem til organel med bistand fra omfattende protein translokaliserende og falsning 21,22. Mitokondrier targetingsekvenser (MTS), der udelukkende er mitokondrielle residente proteiner såsom COX8 kan sættes til N-terminalen af enhver gensekvens at målrette specifikke proteiner i mitokondrierne 11,23,24. Her blev CyclinB1 og CDK1 gener klonet i COX8 MTS indeholdende vektorer og efter ekspression, blev det rekombinante CyclinB1 og Cdk1 lokaliseret i mitokondrierne. Fordelen ved denne fremgangsmåde er, at den muliggør modifikation af genekspression i en undergruppe cellulært rum, i dette tilfælde mitokondrier, uden at ændre den samlede genekspression. Med denne strategi, mitokondrier-specifikke funktioner af en nuklear kinase blev Cdk1 DEtermined. Ligeledes ved at tilføje MTS til en dominerende negativ Cdk1, banke ned af mitokondrier-specifikke funktioner Cdk1 blev opnået, som tillod identifikation af mitokondrier specifikke mål Cdk1, og gjorde det muligt for analyse af funktionelle konsekvenser af mitokondrie fravær af Cdk1 funktion. Overekspression af Cdk1 uden MTS tag resulterer i forøget ekspression af Cdk1 i både mitokondrier og kerne, og derfor komplicerer de yderligere undersøgelser af konsekvenserne af mitokondrier-specifikke handlinger Cdk1.

Dog kan denne fremgangsmåde ikke være egnet til alle genprodukter, som vi har oplevet et par mislykkede forsøg på at flytte nogle kinaser ind i mitokondrierne via tilsætning af MTS tag. Nogle cellelinier kan være ret resistent over for transfektion, og finde den optimale protokol kan være tidskrævende. Selv når cellerne er sunde og transfektionen er vellykket, arbejder med fluorescerende mærkede proteiner udviser nogle problemer such som sammenlægning, forkert lokalisering, ikke-funktionelle fusioner, og svage signaler.

Større begrænsninger isolering af mitokondrier og mitoplasts omfatter det lave udbytte og mulig forurening fra andre cellulære eller sub-mitokondrie rum. Det foreslås, at adhærerende celler ikke brydes effektivt ved konventionelle kemiske eller mekaniske metoder, således gør det vanskeligt at opnå høje mængder af mitokondrier fra dyrkede adhærente celler. Her har vi udnyttet adhærente kulturer af MCF10A celler. For at give omkring 30 - 50 ug af mitokondrie protein, et grundbeløb af 3 - 5 x blev udnyttet 10 7 celler. Den homogeniseringstrin er et andet kritisk punkt ved den endelige udbytte på mitokondriske præparater. Afhængigt af de anvendte cellelinier, kan antallet af slag og / eller tidspunkt for homogenisering variere. For MCF10A celler, vi observeret, at 10 minutter af homogenisering af glas / glas homogenisator er påkrævet, mens mus embryonale fibroblam (MEF), der kræves kun 3 - 5 minutter af homogenisering. Da overdreven homogenisering kan forårsage skade på mitokondriemembranen og udløse frigivelse af mitokondrie komponenter, bør de almindelige betingelser for hver cellelinje bestemmes ved erfaring. Anvendelsen af ​​en glas-glas-homogenisator forøger udbyttet af mitokondrielle præparater sammenlignet med glas / teflon homogenisatorer. Grundbeløbet for celler samt fryse / optøning af celler kan ændre antallet af slag, der er nødvendige for at bryde åbne cellerne. Endelig kan proteindenaturering og aggregering forekomme på grund af lokal opvarmning af prøven under homogenisering. Det er derfor vigtigt at pre-chill vævet slibemaskinen og opbevare prøver på is under denne procedure.

En anden fremgangsmåde præsenteres i denne artikel er brugen af ​​edu mærkning til at overvåge cellecyklus i realtid. Edu er en modificeret thymidin-analog, der er fluorescerende mærket med en lys, fotostabilt Alexa Fluor farvestof. Edu er Effikeligt inkorporeret i nyligt syntetiseret DNA. Denne metode er et bedre alternativ til anvendelsen af ​​traditionelle mærkning af prolifererende celler med nukleosidanalogen, bromdeoxyuridin (BrdU). BrdU inkorporeret i DNA under aktiv DNA-syntese. Kvantificeringen af ​​BrdU-mærkede DNA kræver DNA denaturering ved relativt barske metoder såsom høj varme eller høj surhedsgrad for at blotlægge BrdU molekyler til BrdU-antistof binding. Den barske behandling for DNA denaturering kan påvirke kvaliteten prøven og er tidskrævende. Med edu, detergent permeabilisering er normalt tilstrækkeligt til edu påvisningsreagenset at få adgang til DNA'et. Uden behov for at bruge skrappe kemikalier eller varme til DNA adgang, EDU metode er lettere at bruge, mere præcis og konsekvent. Bortset fra de fordele edu indeholder, har der været nogle bekymringer vedrørende anvendelse af edu at studere spredning. Edu viste en lille antiproliferativ aktivitet ved behandlinger over 72 timer, hvilket kan reduceres til ubetydigible niveauer, når Edu puls blev holdt på 1 time 25.

En modifikation ansat i Edu mærkning fastsættelse tid og metode. Sættet foreslog en 15 min fiksering med den medfølgende fastsættelse løsning. Blev imidlertid en yderligere fiksering med 70% ethanol anvendt i dette eksperiment. Der er to grunde til anvendelse af ethanol: 1) at følge cellecyklusprogression over tid, en tid-point forsøg blev udført, hvor celler blev opsamlet hver 2. time. Cellerne blev holdt i 70% ethanol ved 4 ° C, indtil alle de eksperimentelle tidspunkter er afsluttet. Faktisk kan celler opbevares i 70% ethanol i længere (flere uger til måneder), hvis nødvendigt. 2) De anvendte celler til eksperimentet blev stabilt transficeret med GFP-mærkede Cdk1 og / eller RFP-mærket CyclinB1. For at adskille Edu og PI signaler fra GFP / RFP fluorescens blev ethanol fiksering udnyttet til at denaturere GFP og RFP proteiner, og dermed slukke deres fluorescens før du udfører Edu end PI-farvning. Denaturerede GFP / RFP-proteiner er i det væsentlige fuldstændig ikke-fluorescerende, formentlig fordi kromoforen ikke længere er beskyttet mod bratkøling 26,27.

At identificere mitokondriske mål for Cdk1 blev 2D-DIGE metoden, som er overlegen i forhold til traditionelle 2D-geler på mange måder anvendes. I 2D-DIGE, distinkte fluorescerende farvestoffer, f.eks Cy 3, 5 og 2, til at mærke prøver, som gør det muligt kører op til 3 prøver i en gel, hvilket reducerer variabiliteten uden behov for at køre replikater ligesom i standard 2D gel. De fluorescerende farvestoffer, der anvendes i 2D-DIGE har en meget høj følsomhed på 0,2 ng / plet sammenlignet med den af ​​triphenylmethanfarvestoffer farvestoffer ved 100 ng / plet, således som kræver mindre mængde proteiner kørt på de 2D-Dige geler med høj stedet opløsning og offentliggørelse kvalitet gel scanninger. En automatiseret software anvendes til at påvise, kvantificere og definere differentielt udtrykte proteiner. På grund af høj stedet opløsning, differential proteinekspression i prøver can sammenlignes præcist bruge softwaren-aided spot kvantificering; en forskel så lav som 10% kan detekteres via 2D-DIGE, muliggør visualisering af post-translationelle modifikationer nemt. Brugen af ​​software-aided i-gel-analyse muliggør også hurtigere erhvervelse af data. Men da udstyr, såsom fluorescerende scannere, der kræves for billedoptagelsen, anvendelse af denne fremgangsmåde medføre yderligere omkostninger. Andre begrænsninger af 2D-DIGE omfatte dårlig repræsentation af hydrofobe proteiner samt proteiner med ekstreme isoelektriske punkter og store molekylvægte 28,29. Yderligere validering af resultater opnået med 2D-DIGE anvendelse af alternative teknikker, såsom immunocytokemi eller western blot er forpligtet til at bekræfte nye fund.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
32P ATP  PerkinElmer BLU002001MC 
Anti-mouse secondary antibody Invitrogen  A-11003 Alexa-546 conjugated
Anti-rabbit secondary antibody Invitrogen  A11029 Alexa-488 conjugated
ATP Research Organics 1166A For in vitro kinase assay
Cdk1 antibody Cell Signaling Technology 9112
Cdk1 kinase buffer New England Biolabs P6020S
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit Life Technologies C10337 For cell cycle analysis with EdU labeling
COX IV antibody Cell Signaling Technology 4844S For mitochondrial immunostaining
Cyclin B1 antibody Santa Cruz Biotech sc-752
CyclinB1/Cdk1 enzyme complex New England Biolabs P6020S Avoid freeze/thaw
CyDye DIGE Fluor Labeling Kit GE Healthcare Life Sciences 25-8009-83
DIGE Gel and DIGE Buffer Kit GE Healthcare Life Sciences 28-9480-26 AA
Dimethylformamide  Sigma Aldrich 319937 DMF
Dithiothreitol Bio-Rad 161-0611 DTT
dNTP EMD Millipore 71004 For site-directed mutagenesis
Dpn I enzyme Stratagene 200519-53 For site-directed mutagenesis
Dry Strip cover fluid GE Healthcare Life Sciences 17-1335-01 Used as mineral oil
EDTA J.T. Baker 4040-03
EGTA Acros Organics 409910250
Eppendorf Vacufuge Concentrator Fisher Scientific 07-748-13 Used as vacuum centrifuge concentrator
Fluoromount G Southern Biotech 0100-01 Anti-fade mounting solution
Fortessa Flow Cytometer BD Biosciences 649908 For cell cycle analysis with EdU labeling
Histone H1 Calbiochem 382150 For in vitro kinase assay
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704 For purifying DNA fragments from agarose gels
Immobiline DryStrip Gels GE Healthcare Life Sciences 18-1016-61 IEF (isoelectric focusing) strips
Immobilized Glutathione Thermo Scientific 15160 Glutathione-agarose beads
Iodoacetamide Sigma Aldrich I1149 IAA
IPGphor 3 Isoelectric Focusing Unit GE Healthcare Life Sciences 11-0033-64 IPGphor strip holders
Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside  RPI Corp 156000-5.0 IPTG
Leupeptin Sigma Aldrich L9783 For cell lysis buffer
Lipofectamine 2000 Life Technologies 11668027 Transfection reagent
Lysine Sigma Aldrich L5501 For CyDye labeling
Lysozyme EMD Chemicals 5960
Mitoctracker Red/Green Invitrogen  M7512/M7514 Mitochondrial fluorescent dyes
MOPS EMD Chemicals 6310
pEGFP-N1 Clonetech 6085-1 GFP-expressing vector
Pfu Stratagene 600-255-52
pGEX-5X-1  GE Healthcare Life Sciences 28-9545-53 GST-expressing vector
Phenylmethylsulfonyl fluoride Shelton Scientific IB01090 PMSF
Phosphate buffered saline Life Technologies 14040 PBS
Spectra/Por 4 dialysis tubing Spectrum Labs 132700 as porous membrane tubing for dialysis
Pro-Q Diamond Phosphoprotein Gel Stain Life Technologies P-33300 For staining phosphoproteins on 2D gels
Proteinase inhibitor cocktail Calbiochem 539134 For cell lysis buffer
QuikChange site-directed mutagenesis kit Stratagene 200519-5
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27104 MiniPrep Plasmid Isolation Kit
RO-3306 Alexis Biochemicals 270-463-M001 Cdk1 inhibitor
Rotenone MP Biomedicals 150154 Complex I inhibitor
Sodium carbonate Fisher Scientific S93359
Sodium chloride EMD Chemicals SX0420-5 For cell lysis buffer
Sodium orthovanadate MP Biomedicals 159664 For cell lysis buffer
Sodium pyrophosphate decahydrate Alfa Aesar 33385 For cell lysis buffer
Sodium β-glycerophosphate Alfa Aesar L03425 For cell lysis buffer
SpectraMax M2e  Molecular Devices M2E Microplate reader
Sucrose Fisher Scientific 57-50-1
Tissue Grinder pestle Kimble Chase 885301-0007 For mitochondria isolation
Tissue Grinder tube Kimble Chase 885303-0007 For mitochondria isolation
Trichloroacetic acid solution Sigma Aldrich T0699 TCA
Tris MP Biomedicals 103133
Triton-x-100 Teknova T1105
Trypsin Calbiochem 650211
Typhoon Imager GE Healthcare Life Sciences 28-9558-09 Laser gel scanner fro 2D-DIGE
Ubiquinone Sigma Aldrich C7956

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Weinert, T., Hartwell, L. Control of G2 delay by the rad9 gene of Saccharomyces cerevisiae. J Cell Sci Suppl. 12, 145-148 (1989).
  2. Takizawa, C. G., Morgan, D. O. Control of mitosis by changes in the subcellular location of cyclin-B1-Cdk1 and Cdc25C. Curr Opin Cell Biol. 12, (6), 658-665 (2000).
  3. Allan, L. A., Clarke, P. R. Phosphorylation of caspase-9 by CDK1/cyclin B1 protects mitotic cells against apoptosis. Mol Cell. 26, (2), 301-310 (2007).
  4. Cerveny, K. L., Tamura, Y., Zhang, Z., Jensen, R. E., Sesaki, H. Regulation of mitochondrial fusion and division. Trends Cell Biol. 17, (11), 563-569 (2007).
  5. Brandt, U. Energy converting NADH:quinone oxidoreductase (complex I). Annu Rev Biochem. 75, 69-92 (2006).
  6. Hofhaus, G., Weiss, H., Leonard, K. Electron microscopic analysis of the peripheral and membrane parts of mitochondrial NADH dehydrogenase (complex I). J Mol Biol. 221, (3), 1027-1043 (1991).
  7. Weiss, H., Friedrich, T., Hofhaus, G., Preis, D. The respiratory-chain NADH dehydrogenase (complex I) of mitochondria. Eur J Biochem. 197, (3), 563-576 (1991).
  8. Janssen, R. J., Nijtmans, L. G., van den Heuvel, L. P., Smeitink, J. A. Mitochondrial complex I: structure, function and pathology. J Inherit Metab Dis. 29, (4), 499-515 (2006).
  9. Roessler, M. M., et al. Direct assignment of EPR spectra to structurally defined iron-sulfur clusters in complex I by double electron-electron resonance. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (5), 1930-1935 (2010).
  10. Owusu-Ansah, E., Yavari, A., Mandal, S., Banerjee, U. Distinct mitochondrial retrograde signals control the G1-S cell cycle checkpoint. Nat Genet. 40, (3), 356-361 (2008).
  11. Wang, Z., et al. Cyclin B1/Cdk1 coordinates mitochondrial respiration for cell-cycle G2/M progression. Dev Cell. 29, (2), 217-232 (2014).
  12. Omura, T. Mitochondria-targeting sequence, a multi-role sorting sequence recognized at all steps of protein import into mitochondria. J Biochem. 123, (6), 1010-1016 (1998).
  13. Konishi, T., Takeyasu, A., Natsume, T., Furusawa, Y., Hieda, K. Visualization of heavy ion tracks by labeling 3'-OH termini of induced DNA strand breaks. J Radiat Res. 52, (4), 433-440 (2011).
  14. Leif, R. C., Stein, J. H., Zucker, R. M. A short history of the initial application of anti-5-BrdU to the detection and measurement of S phase. Cytometry A. 58, (1), 45-52 (2004).
  15. Li, K., Lee, L. A., Lu, X., Wang, Q. Fluorogenic 'click' reaction for labeling and detection of DNA in proliferating cells. Biotechniques. 49, (1), 525-527 (2010).
  16. Kondo, T., et al. Application of sensitive fluorescent dyes in linkage of laser microdissection and two-dimensional gel electrophoresis as a cancer proteomic study tool. Proteomics. 3, (9), 1758-1766 (2003).
  17. Gundry, R. L., et al. Chapter 10, Preparation of proteins and peptides for mass spectrometry analysis in a bottom-up proteomics workflow. Curr Protoc Mol Biol. Unit 10.25 (2009).
  18. Davies, D. Chapter 11, Cell Sorting by Flow Cytometry. Flow Cytometry. Macey, M. G. Humana Press. 257-276 (2007).
  19. van den Heuvel, S., Harlow, E. Distinct roles for cyclin-dependent kinases in cell cycle control. Science. 262, (5142), 2050-2054 (1993).
  20. Terry, N. H. A., White, R. A. Flow cytometry after bromodeoxyuridine labeling to measure S and G2+M phase durations plus doubling times in vitro and in vivo. Nat. Protcols. 1, (2), 859-869 (2006).
  21. Becker, L., et al. Preprotein translocase of the outer mitochondrial membrane: reconstituted Tom40 forms a characteristic TOM pore. J Mol Biol. 353, (5), 1011-1020 (2005).
  22. Karniely, S., Pines, O. Single translation--dual destination: mechanisms of dual protein targeting in eukaryotes. EMBO Rep. 6, (5), 420-425 (2005).
  23. Candas, D., et al. CyclinB1/Cdk1 phosphorylates mitochondrial antioxidant MnSOD in cell adaptive response to radiation stress. J Mol Cell Biol. 5, (3), 166-175 (2013).
  24. Nantajit, D., et al. Cyclin B1/Cdk1 phosphorylation of mitochondrial p53 induces anti-apoptotic response. PLoS One. 5, (8), e12341 (2010).
  25. Cappella, P., Gasparri, F., Pulici, M., Moll, J. A novel method based on click chemistry, which overcomes limitations of cell cycle analysis by classical determination of BrdU incorporation, allowing multiplex antibody staining. Cytometry A. 73, (7), 626-636 (2008).
  26. Niwa, H., et al. Chemical nature of the light emitter of the Aequorea green fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, (24), 13617-13622 (1996).
  27. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
  28. Marouga, R., David, S., Hawkins, E. The development of the DIGE system: 2D fluorescence difference gel analysis technology. Anal Bioanal Chem. 382, (3), 669-678 (2005).
  29. Timms, J. F., Cramer, R. Difference gel electrophoresis. Proteomics. 8, (23-24), 4886-4897 (2008).
  30. Crane, J., Mittar, D., Soni, D., McIntyre, C. Cell Cycle Analysis Using the BD BrdU FITC Assay on the BD FACSVerse System. BD Biosciences Appl Notes. (2011).
Eksperimentelle tilgange til at studere mitokondrie Lokalisering og funktion af en nuklear Cell Cycle kinase, Cdk1
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Candas, D., Qin, L., Fan, M., Li, J. J. Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1. J. Vis. Exp. (108), e53417, doi:10.3791/53417 (2016).More

Candas, D., Qin, L., Fan, M., Li, J. J. Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1. J. Vis. Exp. (108), e53417, doi:10.3791/53417 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter