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Biology

ミトコンドリア局在と原子力細胞周期キナーゼ、Cdk1のの機能を研究するための実験的アプローチ

doi: 10.3791/53417 Published: February 25, 2016

Introduction

哺乳類では、細胞周期の進行は、サイクリンおよびサイクリン依存性キナーゼ(CDK)1によって制御される、高度に秩序イベントに依存しています。その細胞質、核、および中心体の局在化を通じ、サイクリン/ Cdk1のは、核エンベロープの破壊や中心体の分離2などの有糸分裂におけるさまざまなイベントを同期することができます。サイクリン/ Cdk1のは、アポトーシス3に対して有糸分裂細胞を保護し、ミトコンドリアの分裂、新たに形成された娘細胞4にミトコンドリアの平等な分配のための重要なステップを促進します。

哺乳動物細胞の増殖には、ミトコンドリアのATP、5マルチサブユニット複合体で構成されている酸化的リン酸化(OXPHOS)機械(電子伝達系)を介して生成されます。複合体I - 複雑なV(CI-CV)。ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH):ユビキノン酸化還元酵素または複合体I(CI)は、5つの複合体5の理解最大と最小です。複雑なC45サブユニットの14のonsistsは、触媒コアを形成します。一旦組み立てられる、複合体は、1マトリックス内に突出するアームと内膜6,7に埋め込 ​​まれ、他方のアームとL字型構造を前提としています。 CIサブユニットの変異は、ミトコンドリア病8の様々な原因です。 OXPHOSで機能的、効率的なCIが、全体的なミトコンドリア呼吸9のためだけでなく、成功した細胞周期進行10のためだけでなく、必要とされます。健康と病気で、この膜結合酵素複合体の機能のメカニズムをUnravellingする新規な診断手順と高度な治療戦略の開発を可能にすることができます。最近の研究では、サイクリン/ Cdk1の複合体が細胞中の細胞の増加したエネルギー需要を相殺する(ギャップ2)G2 /(有糸分裂)M期におけるミトコンドリアに移行し、潜在的に、ミトコンドリアのエネルギー産生を高めるために、CIサブユニットをリン酸化することを見出しましたサイクル11。ここでは、SHO実験手順および他の方法で核/細胞質キナーゼのミトコンドリア転移を研究するために使用することができます戦略、そのミトコンドリアの基質と同様の例として、サイ​​クリン/ Cdk1のを使用して、ミトコンドリア局在の機能的結果をwcase。

必要なときにサイクリン/ Cdk1の複合体はミトコンドリアに移行していることを発見は、この複合体のミトコンドリア固有の過剰発現およびノックダウンの研究を促しました。蛋白質のミトコンドリア特異的発現を達成するためには、目的のタンパク質のN末端にミトコンドリアターゲティング配列(MTS)を追加することができます。配列を標的とするミトコンドリアは、彼らは通常、12を常駐ミトコンドリアへミトコンドリアタンパク質の選別を可能にします。我々は、サイクリンまたは赤色蛍光をタグ付きヒトシトクロムcオキシダーゼサブユニット8A(COX8)の前駆体から誘導された87塩基ミトコンドリアターゲティング配列を使用し、緑色蛍光タンパク質(GFP)にそれをクローン化してきましたタンパク質(RFP)がCdk1のがフレーム内にプラスミドを含むタグ付き。この方法は、具体的には、それらの核のプールに影響を与えることなく、これらのタンパク質のミトコンドリアの表現を変え、私たちはミトコンドリアにサイクリンとCdk1のをターゲットにすることができました。蛍光これらのタンパク質をタグ付けすることによって、我々はリアルタイムでそれらの局在をモニターすることができました。同様に、私たちは私たちは、特にCdk1のミトコンドリアの発現と機能をノックダウンすることができRFPタグ付きドミナントネガティブCdk1のを含むプラスミドにMTSを導入しています。 Cdk1のような二重のローカライズ版を持っているキナーゼのミトコンドリアと核の機能を区別することが不可欠です。これらの二重機能性キナーゼのN末端へのエンジニアリングMTSを採用することが容易かつ効果的である偉大な戦略を提供しています。

Cdk1のは、細胞周期キナーゼであるので、Cdk1のは、ミトコンドリアに局在している場合、細胞周期の進行を決定するために基本的です。これを達成するために、我々は、新しいメトを利用していますdは細胞におけるDNA含有量を監視します。従来の方法は、チミジンを置換するために、細胞周期のS期の間に新たに合成されたDNAに組み込まれたBrdU(ブロモデオキシウリジン)、合成チミジン類似体を用いることを含みます。そして積極的にそれらのDNAを複製している細胞を、抗BrdU抗体を用いて検出することができます。この方法の一つの欠点は、結果13,14の間で矛盾を生じ得る酸または熱処理などの過酷な方法によってBrdU抗体のためのアクセスを提供するために、DNAの変性を必要とすることです。代わりに、我々は異なるチミジンアナログ、EDUで活発に分裂する細胞を監視するために、同様のアプローチを利用しました。中性洗剤処理は新たに合成されたDNAにEDUにアクセスするための検出試薬を可能としてEDU検出は、過酷なDNA変性を必要としません。 EDUの方法は、より信頼性の高い一貫性および高スループット分析15のための潜在的であることが証明されています。

最後に、トンO Cdk1のミトコンドリアの基質を決定、我々は古典的な2次元ゲル電気泳動の高度なバージョンである2D-DIGEと呼ばれるプロテオミクスツールを使用していました。二次元電気泳動は、第二の最初の次元と分子量のそれらの等電点に応じてタンパク質を分離します。例えば、リン酸化などの翻訳後修飾は、タンパク質の等電点および分子量に影響を与えるので、2Dゲルは、異なる試料内のタンパク質のリン酸化状態の違いを検出することができます。タンパク質スポットの大きさ(面積および強度)は、複数のサンプル間の定量的な比較を可能にするタンパク質の発現レベルの変化します。この方法を使用して、我々は、変異ミトコンドリア標的Cdk1の発現細胞に対する野生型ではリン酸化タンパク質を区別することができました。野生型で示したが、ミトコンドリアを標的とした突然変異体Cdk1の準備に欠落していた特定のタンパク質スポットを単離し、質量分析により同定。

従来の2Dゲル中で、トリフェニルメタン染料、ゲル上のタンパク質を可視化するために使用されます。 2D-DIGEは、タンパク質電気泳動移動度への影響を最小限に抑えながら蛍光タンパク質のラベルを使用しています。異なるタンパク質サンプルは、単一のゲル16上の複数のサンプルの同時電気泳動を可能にする、一緒に混合し、同じゲルにより分離し、異なる蛍光色素で標識することができます。これは、ゲルベースの​​プロテオミクス研究における重要な問題であるゲルからゲルへの変化を、最小限に抑えることができます。

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Protocol

培養細胞からミトコンドリアの1の単離

  1. 細胞(IBC)バッファのための単離緩衝液の調製
    1. 0.1 Mトリス/ MOPS(トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン/ 3-(Nモルホリノ)プロパンスルホン酸)を準備し、蒸留水800mlにトリス12.1グラム溶かしMOPS粉末を使用してpHを7.4に調整し、合計の蒸留水を加えます4 O℃で1 Lと店舗の体積
    2. 0.1 M EGTA(エチレングリコールビス(2-アミノエチルエーテル)四酢酸)を準備/トリス:蒸留水800mlにEGTA 38.1グラム溶かしトリス粉末を使用してpHを7.4に調整し、1リットルの総容積まで蒸留水を加えますそして4 O℃で保存
    3. 1 Mスクロースを準備します。蒸留水100ml中のスクロースの34.23グラムを溶かし、C. oを -20℃で20ミリリットルのアリコート、および店舗を作ります
    4. バッファーC 0.1 Mトリス/ MOPSの10ミリリットルと20ミリリットルの0.1 M EGTA /トリスの1ミリリットルを追加することで、IBの100ミリリットルを準備します。IB cバッファを準備; 1 Mショ糖。 100ミリリットルの全容量に蒸留水を追加します。 pHを7.4に調整します。
  2. 細胞溶解バッファーの調製
    1. 20mMトリス塩酸(pH7.5)を含有する溶解緩衝液を調製し、150mMのNaCl、1mMのEDTA(エチレンジアミノ四酢酸)、1mMのEGTA、1%トリトンX-100、2.5 mMのピロリン酸ナトリウム、1mMのβ-グリセロリン酸、1mMのオルトバナジン酸ナトリウム。使用直前にプロテイナーゼ阻害剤を1μg/ mlのロイペプチンおよび1mM PMSF(フッ化フェニル)を追加します。
  3. ミトコンドリアの分離
    1. 収穫3×10の氷冷1×PBS(リン酸緩衝生理食塩水)、4 O℃で10分間、600×gでpHを7.4と遠心細胞と7細胞上清を捨て、5ミリリットルの氷冷IB cバッファでペレットを再懸濁。
    2. 約10分間、ガラス/ガラスの組織グラインダーを用いて細胞をホモジナイズします。 10マイル、600×gで15ミリリットルチューブと遠心分離機にホモジネートを転送4 O℃でn個それはガラス/ガラスの組織グラインダーよりもミトコンドリアに損傷が少ないですとして機能ミトコンドリアのために、ガラス/テフロンカップリングを使用します。
    3. 4 O℃で10分間、7000×gで1.5ミリリットルチューブと遠心分離機に上清を回収1.5mlチューブに上清を移し、サイトゾルタンパク質として保存します。
    4. 4 O℃で10分間、7000×gで200μlの氷冷IB cバッファと遠心機で二回(ミトコンドリア)ペレットを洗浄
    5. 上清を捨て、細胞溶解緩衝液中にペレットを再懸濁し、すぐにそれを使用するか、将来の使用のために-80 O Cで保管してください。機能的ミトコンドリアが必要な場合は、上清を廃棄した後、残りのバッファー中でペレットを再懸濁します。さらに、ミトコンドリア画分を希釈すると、ミトコンドリアの機能の喪失をもたらすことができます。氷上で保管し、1で準備を使用する - 最良の結果を得るために3時間。
    6. で30 3秒バーストのために、ペレットを超音波処理氷浴、5分間万×gで遠心分離し、ミトコンドリア画分として上清を保存します。

2. Cdk1の、サイクリンとCOXIVの共同免疫染色、ミトコンドリア常駐タンパク質

  1. 24ウェルプレートのO / Nまたは最大70%コンフルエンスにカバースリップ上に5×10 4細胞を増殖させます。培地を吸引し、500μlの氷冷1×PBS、pH7.4で細胞を2回洗浄します。
  2. 10分間室温で500μlの氷冷4%パラホルムアルデヒドで細胞を固定してください。定着液を吸引し、500μlの1×PBSで3回、5分間室温で穏やかに振盪しながら、それぞれで細胞を洗浄。
  3. 室温で5分間、PBS中の500μlの0.2%トリトンX-100で細胞を透過性。ソリューションを吸引し、500μlのPBSで細胞を3回、各5分洗浄します。 RTで30分間ブロッキング溶液(500μL、ツイーン20を1%含有PBS中の1%BSA(ウシ血清アルブミン))を加えます。
  4. 250:一次抗体を1希釈(Vを:v)の500で1;クロスシグナリングを回避するために、異なる種で育っ希望の一次抗体を用いて細胞をブロッキング溶液とインキュベートのリットル(サイクリン(マウス)および30 RTでCOXIV(ウサギ)またはCdk1の(マウス)とCOXIV(ウサギ) - 60分またはO / N 4 O℃
  5. 1×PBSで3回、5分ごとの500μlのカバーグラスを洗浄し、次に1を希釈した二次抗体とインキュベートする:500μlのPBSで3回、5分間ずつ洗浄した1時間室温でブロッキング溶液を500μl1,000。
  6. 退色防止マウント溶液20μlでカバースリップをマウントし、マニキュアとスライドをシール。画像スライドはすぐに蛍光顕微鏡を用いて、または1、4、O℃で暗所に保つ- 2週間。

無傷ミトコンドリアの3炭酸ナトリウム抽出

  1. 部1ディバイドミトコンドリアに記載されているように収穫は、PBSで1回洗浄し、ミトコンドリアを単離し、約20×10 7細胞を増殖させるには、2パーに隔離します(ステップ1.3.4の前に)ミトコンドリアをペレット化し、最後の遠心分離前のts。合計の半分ミトコンドリア(ステップ3.2)として使用されるように保存、可溶性および膜結合タンパク質を分離するために(3.3から3.6までの手順を以下)の炭酸ナトリウム抽出のために残りの半分を使用します。
  2. 溶解は、全ミトコンドリアは、細胞溶解緩衝液30μlにペレット化し、免疫ブロッティングに使用するまで-80 O Cで溶解液を保存します。
  3. ミトコンドリアペレットの他の半分に、0.1 MのNa 2 CO 3(炭酸ナトリウム)、pHが11.0の250μLを加え、30分間氷上でインキュベートします。
  4. 20分間100,000×gで遠心分離します。上清を収集し、3.5に進みます。溶解ステップ1.3.6のように細胞溶解緩衝液と超音波処理の30μLを使用してペレット。イムノブロット法に用いるまで-80 O Cで保管してください。
  5. タンパク質を沈殿させ、氷上で30分間維持する上清に20%たてトリクロロ酢酸(TCA)を等量加えます。
  6. Centrif10分間15,000×gでUGE。上清を捨て、免疫ブロット法に用いるまで-80 O Cで細胞溶解緩衝液や店舗の80μlのペレットを溶解します。

ミトコンドリアの内膜と外膜(ミトプラストの単離)の4分離

  1. 約20×10 7細胞、収穫、PBSで1回洗浄を成長し、セクション1で述べたように、最後の遠心分離(ステップ1.3.4の前に)ミトコンドリアをペレット化する前に、10等分ミトコンドリア画分を分離し、ミトコンドリアを分離します。
  2. 低張性ショ糖バッファの表示濃度の30μlの各ペレットを溶解し(1mMのEDTA、10mMのMOPS / KOH(水酸化カリウム)、pHが7.2; 25の範囲のスクロース濃度 - 200 mM)の有無にかかわらず、50μg/ mlのトリプシン( 表1を参照)、氷上で30分間インキュベートします。
  3. トンを停止するには、バイアルを含むトリプシン(1mMのPMSFの最終濃度に達するように)10 mMのPMSFの3μLを追加彼は、トリプシン消化し、10分間氷上でインキュベートします。
  4. 10分間、4°Cので14,000×gで遠心分離します。 C. oを -80で、新しいチューブに上清を移すステップ1.3.6のように細胞溶解緩衝液、超音波処理の30μlにペレットを溶解し、店舗

5.の構築ミトコンドリア標的GFP / RFP-タグ付けされたサイクリン/ Cdk1のベクトルとそのミトコンドリア局在の確認

  1. pEGFP-N1またはpERFPのNheIおよびBamHI部位に、GFPまたはRFPのN末端にフレームで - ;(161ヌクレオチド76との間に人間のシトクロムcオキシダーゼサブユニット8A(COX8)の前駆体由来MTS)の配列を標的とするミトコンドリアのクローンを作成標準的な分子クローニング技術を用いて-N1ベクター。
  2. サイクリン及びCdk1の遺伝子のためのPCRプライマーを設計する場合、PCRプライマーの5 'にBamHI制限酵素認識部位(太字)を加えます。
    フォワードCdk1のBamH1で5 'CAG T GG ATC C AA TGG AAG ATT ATA CCA AAA T
    リバースCdk1のBamH1部位5 'CTG T GG ATC C TGのCAT CTT CTT AAT CTG ATT
    フォワードサイクリンのBamH1 5 'ATA TGG ATC CAA TGG CGC TCC GAG TCA
    リバースサイクリンのBamH1 5 'ATA TGG ATC CTG C​​AC CTT TGC CAC AGC C
  3. 標準的な技術を、以下、これらのプライマーを用いてCDK1及びサイクリン遺伝子を増幅します。 2時間37℃でBamHI制限酵素の1μlのPCR産物を消化します。 1%アガロースゲル上で消化産物を実行します。カミソリの刃を使用して、正しい-sized DNA断片を切り出し、ゲル抽出キットを用いてゲルからDNAを精製します。
  4. 37℃で2時間MTS-のpEGFP-N1およびBamHI酵素の1μlのとMTS-pERFP-N1プラスミド1μgのダイジェスト。カーフInt​​esの1μLを追加37℃で30分間tinalアルカリホスファターゼ(CIP)。 1%アガロースゲル上で消化産物を実行し、ステップ5.3のようにゲルから直線状のプラスミドを精製します。
  5. リガーゼ緩衝液3μl、T4リガーゼ0.5μlの、とのdH 2 Oを20.5μlにステップ5.3からCdk1のまたはサイクリンのステップ5.4および5μlのからプラスミドを1μlを追加することにより、連結反応を設定します4℃でO / Nインキュベートします。
  6. 標準的な技術、次の連結混合物の10μLで大腸菌 DH5αコンピテント細胞を形質転換および/ ​​mlのカナマイシンを含むコロニーを得るために37℃でLB寒天プレートO / Nを10 mgの上にバクテリアを育てます。
  7. 滅菌したピペットチップを使用してO / N成長プレートからコロニーを選び出し、カナマイシンLB-含むチューブ5mlに先端を挿入し、O / Nインキュベートします。製造業者のプロトコルに従ってミニプレップキットを用いてプラスミドを単離し、そして標準的な技術を用いてプラスミドを配列決定。
  8. 指数関数的に増殖MCF1をトランスフェクト2(ワット:V、100 ngの1のプラスミド/トランスフェクション試薬の比を調製し、ステップ5.7からMTS-Cdk1の-RFPまたはMTS-サイクリン-GFPプラスミドで0A細胞(1.5×10 4細胞を96ウェルプレートに播種) :100μlの血清および抗生物質を含まない培地で0.2μl)を。
  9. 湿度コントロール(5%CO 2、95%相対湿度)でのCO 2インキュベーター中で37℃で48時間、プラスミド/試薬混合物で細胞をインキュベートします。
  10. 100μlのDMSO中の粉末を50μgを溶解することによってミトコンドリアの赤と緑の蛍光染料の1 mMストック溶液を調製します。原液1を希釈:400を1×PBS中で解決策を働い2.5μMを取得します。ストック溶液は、年間-20℃で保存することができます。
  11. 50 nMの最終濃度を準備するために、培養培地の98μlの赤色色素の2.5μMの2μLを混ぜます。
  12. 2分間の培地を含有する赤色染料と(ステップ5.8で生成された)MCF10A細胞を保有するサイクリン-GFPの細胞培養培地を交換してください。繰り返しCdk1の-RFPベアリングのMCF10A細胞のための緑の染料と同じ手順。
  13. 100μlの1×PBS過剰染色液を取り除くためで二回洗浄し、96ウェルプレートに100μlの1×PBSを追加します。
  14. 40Xの倍率で蛍光顕微鏡下で96ウェルプレート上で - とCdk1の-RFP(620 nmの565で560 nmおよび放出による励起) - ミトコンドリアおよびサイクリン-GFP(536 nmの494で488 nmおよび放出による励起)を視覚化します。

2D-DIGEを介してディファレンシャルにリン酸化タンパク質の6同定

  1. 試料調製
    1. ミトコンドリアを単離し、ステップ1.3のように、ミトコンドリア画分を溶解します。 15秒間、各サンプルと渦に20%TCA(水中のトリクロロ酢酸)の同体積を追加します。タンパク質が溶液から沈殿として30分間氷上でサンプルをインキュベートします。
    2. 5分間、4℃、9300×gで遠心分離サンプルは、上清を除去し、続いて60μlの冷アセトン(100%)を追加します5分間、4℃、9300×gで遠心分離します。
    3. 、アセトン洗浄工程(ステップ6.1.2)1より多くの時間を繰り返し、上清を除去し、50μlのDIGE標識バッファー(7M尿素、2Mチオ尿素、4%CHAPS、30 mMトリス、pH8.5)中のサンプルを再懸濁。
  2. 蛍光色素を準備
    1. ストック溶液を準備します。1ナノモル/μlの最終濃度になるように新鮮なジメチルホルムアミド(DMF)5μlの中の染料(5ナノモル)を溶​​解します。数ヶ月のために使用するまで-20 O Cでストック染料溶液を保管してください。
    2. 染料は、室温で5分間に設定することを許可する:作業溶液を調製します。 200ピコモル/μlの最終濃度までDMFの4μlを有する色素の1μLを希釈します。使用中に氷の上に保管してください。注:作業溶液は、3週間-20 O Cに維持することができます。
  3. ラベルタンパク質
    1. 12.5μgタンパク質あたりの作業色素溶液1μlを混ぜます。必要に応じてスケールアップ。プールされた標準規格については、6を追加1;タンパク質をプールされた300μgのにCy2と作業溶液のリットル。
    2. 12,000 x gで30秒間4℃で30秒、遠心分離のための渦。暗所で30分間氷上でインキュベートします。使用するワーキング溶液1μl当たりの10mMリシンの1μLを追加することで、標識を停止します。よく混ぜ、10分間、暗所で氷上でインキュベートします。
    3. プールは個別にサンプルを標識し、再水和バッファー(7M尿素、2Mチオ尿素、4%CHAPS、1.2%destreak、1%pharmalytes、ブロモフェノールブルー)と混合します。総容積は125μLになります。
    4. 30秒間ボルテックスサンプルおよびサンプルを室温で30分間に設定することを可能にします。負荷7センチpHが4へサンプル125μlの - 9、等電点電気泳動(IEF)ストリップ。
  4. 第一次元電気泳動
    1. ストリップホルダーが完全に清潔で乾燥していることを確認すること、電極板上のストリップホルダー(棺)を配置します。全体棺全体に均一に広がり、棺の中に125μlのサンプルをピペット。
    2. ピンセットを使用してrsは、IEFストリップをピックアップし、慎重にプラスチック製の保護カバーを取り外し、棺/再水和バッファへ(ゲル側を下)に置きます。気泡を捕捉することは避けてください。ミネラルオイルを - (1.5ミリリットル1)と棺が棺の上にカバー置き、ゆっくりと棺を埋めます。
    3. 表2のプロトコル以下の等電点電気泳動を開始します。
      注:実行が完了すると、ストリップは-80 O℃でプラスチックチューブに格納されているか、直接平衡及び二次元へと移動させることができます。
  5. 二次元-ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)
    1. 平衡
      1. 解凍SDS平衡緩衝液(ストリップ当たり8 mlの6 M尿素、30%グリセロール、2%SDS)。ジチオスレイトール(; SDS平衡緩衝液の1ミリリットル当たり10ミリグラムのDTT DTT)を秤量。 4ミリリットルのSDS平衡緩衝液にDTTを溶解させます。
      2. IAA(ヨードアセトアミド、SDS平衡緩衝液の1ミリリットル当たり25ミリグラムのIAA)を秤量。4ミリリットルのSDS平衡緩衝液にIAAを溶解させます。
      3. 後で使用するために水浴中でアガロース溶液を密封する1ミリリットルを溶かします。
      4. ストリップを凍結した場合は、それらを完全に解凍することができます。場所は再膨潤トレイにアップゲル側を除去します。各ストリップにDTTを含むSDS平衡緩衝液の4ミリリットルを加え、穏やかに振盪しながら15分間インキュベートします。
      5. DTTを含むすべてのSDS平衡化緩衝液を捨てます。各ストリップにIAAでのSDS平衡化バッファーの4ミリリットルを加え、穏やかに振盪しながらさらに15分間インキュベートします。 IAA緩衝液で平衡化した後、SDS平衡緩衝液を注ぎます。
    2. SDS-PAGE
      1. 、ミニゲルをアンラップ櫛を削除し、ゲルとのddH 2 Oでウェルをすすぎます実行する前に、ゲルの底に白いテープを外します。オリエントは、ゲル上のストリップは正しく、ゲルの向きは、スポット切断のために重要です。
      2. アップ小さなプレートとゲルトップ直面電子とカウンターの上にゲルを平らに置きますxperimenter。陽極側と背の高いプレート上にストリップを置き、ゲルの左側に面した(++バーコードで終了)。定規を使用して、ゆっくりとゲルの表面にストリップを押し下げます。ストリップとゲルとの間に気泡を捕捉することは避けてください。ガラス板スタンドにゲルを立ちます。
      3. カセットの開口部にヒートシールアガロース溶液の1ミリリットルを追加します。すべての気泡がフラットな定規を使用して押されていることを確認します。装置を組み立て、90分間一定の125 Vでゲルを実行します。
      4. ゲルの実行が完了したら、2ミリリットルののddH 2 Oを持つ生体分子イメージャ上でゲルを配置し、635 nmの励起レーザーおよび665 nmの発光フィルターと蛍光取得モードでゲルをスキャンします。
    3. リンタンパク染色
      1. 二回30分間、50%メタノール、10%酢酸混合物(10ml)でゲルを固定します。続いて、90分 - 60のための染色をリン10mlで10分間、10mlの水で3回と汚れを洗います10mlで30分間3回脱色液を脱色。
      2. 波長532nm / 560 nmの励起/発光のレーザーゲルスキャナーでゲルを5分間二回10ミリリットルの水で洗浄した画像。
    4. タンパク質消化および同定
      1. 物品差次の全ては、製造業者の仕様書に従ってロボットスポットピッカーを使用して、マイクロプレートのウェルにゲルからタンパク質スポットを発現し、そしてゲル片を脱色するために室温で1時間、100 mMの重炭酸アンモニウム(2 ml)を加えます。 30分間真空濃縮器で2回洗浄、乾燥2 100mlの%アセトニトリルで脱水します。
      2. 13 ngの100μlのゲル片を再水和/μlを37℃で16時間、50mM炭酸水素アンモニウム中ブタトリプシンを変更しました。上清を収集し、さらに30分間50%アセトニトリルで5%のトリフルオロ酢酸100μlでタンパク質を抽出。
      3. 真空遠心コンセントによってダウンを5μlのペプチドを集中ratorとレーザー脱離イオン化マトリックス支援と分析-飛行時間-タンデム質量分析(MALDI-TOF-MS / MS)17。

インビトロキナーゼアッセイ7.

  1. 基板の作製
    1. pGEX-5X-1ベクターへの差別的にリン酸化Cdk1の対象として特定されたサブクローン複合体I(CI)のサブユニット(NDUFV1、NDUFV3、NDUFS2、NDUFB6、およびNDUFA12)は、グルタチオンSトランスフェラーゼ(GST) - タグを生成します細菌発現は、11のプラスミド。以下のプロトコルに従って、高親和性グルタチオンカラムを用いてCIサブユニットを精製します。
      1. 0.6の光学密度(OD)が到達するまで37°Cの時シェーカーでアンピシリン50μg/ mlのルリア-ベルターニ(LB)ブロス中で大腸菌株BL-21を含む培養GST標識CIサブユニット。カルトにイソプロピル-BD-チオガラクトピラノシド(IPTG)を追加0.1mMの最終濃度でURE、そしてさらに3時間インキュベートします。
      2. 細菌を収集するために10分間、600×gで遠心分離で5 DTT 5mMの、1×プロテアーゼ阻害剤カクテルを含有する1×PBS緩衝液mlであり、0.1%のリゾチームを再懸濁します。溶解20 5秒のバーストのための超音波処理により細胞、および10分間、600×gでの遠心分離により細胞破片を除去。
      3. 上清を収集し、4の体積比で、グルタチオン - アガロース4Bビーズとインキュベートした:RTで1時間:(ビーズ上清)1。
      4. 高分子多孔質膜チューブ(分子量カットオフ12(10ミリモルを50mMのTris-HCl、pH8.0中還元グルタチオン)および透析に溶出したタンパク質を対象グルタチオン溶出緩衝液3mlでビーズからGST融合タンパク質を溶出1×PBS / 1mMのEDTAで-14キロダルトン)。 80℃。 -で精製したタンパク質を保存します
  2. CDK1キナーゼアッセイ
    1. キナーゼのお尻を開始する前にAY、30℃、100℃に加熱ブロックを設定します。氷上での商業サイクリン/ Cdk1の酵素複合体と基質を解凍します。
    2. 氷上で反応ミックスを調製します。 32 P ATPの同位体が関与しているので、放射能の拡散を防止するためのOリングを含むスクリューキャップで1.5ミリリットルのサンプルチューブ内の全ての反応混合物を準備します。
      注意:放射性物質の保護ルールに従ってください。少なくとも腕の長さで、厚さ8mmのシールドプレキシグラスと仕事を使用してください。水と任意の汚染領域を拭いてください。
    3. 、1×Cdk1の緩衝液(50mMのTris-HCl、10mMのMgCl 2を、2mMのDTT、1mMのEGTA、0.01%のBrij 35、pH7.5)を、0.6mMの冷ATP、0.1μCiの32 PのATPを含有する30μlの反応緩衝液を調製しますサイクリン/ CDK1及び基質タンパク質の6μgの2ユニット。 ddH 2 Oで30μLに音量を調整ポジティブコントロール反応について、0.01 mMのヒストンH1、よく知られたサイクリン/ Cdk1の基板と基板を交換してください。
      1. 負の制御のためのリットルの反応、(1)のみGSTタンパク質と基板を交換し、(2)0.01 mMのヒストンH1 + 0.5μMRO-3306、選択Cdk1の阻害剤で基板を交換してください。
    4. 汚染のリスクを最小限に抑え、チューブの底にすべての液体をもたらすために、ピペット、遠心分離でよく混ぜます。 60分間30℃でインキュベートします。
    5. 反応を停止し、10分間100°Cで変性させるために5×SDSサンプルバッファーの6μlを添加します。 2時間、160 Vで10%SDS-PAGEゲル上でサンプルを実行し、又は染料前線までゲルの終わりに達しています。クロマトグラフィーペーパー上にゲルを移し、ラップで包みます。
      注意:放射性同位体と接触したすべての液体は、放射性廃棄物として処理され、施設のガイドラインに従って、環境健康と安全サービスが提供する5ガロンのポリカーボイで処分しなければなりません。
    6. 使用する放射性同位体の比活性に応じて-20 O Cで1日または1週間までのX線フィルムにゲルを公開酵素。

8.部位特異的突然変異誘発は、ドミナントネガティブCdk1の(D146N)を生成します

  1. デザイン突然変異誘発プライマー;互いに相補的な2つのプライマーを、変異部位を含む各辺11の20塩基が隣接(Gは、Nの代わりにDアミノ酸をコードするヌクレオチドによって置換されます)。
  2. 1×反応バッファーを含む50μlのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の混合物を準備し、2.5mMのdNTPを、プライマーの10μMの(両方のフォワードおよびリバース)、テンプレート40ngの、とのddH 2 O反応にDNAポリメラーゼの2.5 Uを追加します。
  3. 以下のPCRプログラムを実行する:95℃3分、95℃30秒、55℃30分、68​​℃で6分。 16サイクル(注:68℃でのインキュベーション時間は、DNAの大きさによって決定されるが、1分/ kbの10 kbの≤DNAのために必要とされるより大きなDNA、2分/ kbのプラスサイクル当たり10秒)。 68℃7分でフォローし、使用する準備ができるまで4℃で保持します。
  4. 加えます私はバッファのDpn I制限酵素(10 U /μl)を5.7μlののDPN 2μlを、指で穏やかにタップするだけでよく混ぜ、1時間37 O Cで反応をインキュベートします。
  5. 形質転換のためのDH5αコンピテント細胞を50μlに転送10μlののDpn Iで処理したPCR産物。 42 O Cと氷上で5分で45秒間熱ショックに続いて、氷上で30分間インキュベートします。 LBの500μlを添加したLB寒天プレート上にプレーティングする前に、1時間37°Cの時に振ります。 37 O℃でO / Nインキュベート
  6. Oからコロニーを採取/ N無菌黄色のピペットチップを使用した寒天プレートを増殖させ、LBの5ミリリットルを含むチューブに先端をドロップし、37°C ​​のシェーカーでO / Nを成長させます。ミニプレップキットを用いてプラスミドを単離し、製造業者のプロトコルに従って変異を確認するために、プラスミドを配列決定。

EDU取り込みアッセイで細胞周期フェーズ長の9決意

  1. 細胞選別
    1. Trのansfect指示されたベクターを用いた2×10 5細胞(MTS-GFP / RFP、MTS-サイクリン-GFP / Cdk1の-WT-RFPまたはMTS-Cdk1の-DN-RFP)1使用して6ウェルプレート中:2(W:V 、2.5μgの:DNAの5μl)を比率:トランスフェクション試薬混合物2.5ミリリットル血清および48時間のための抗生物質を含まない培養培地中で調製。ライブソート細胞を安定的に、フローサイトメーターを介して、GFPタグCDK1及びRFPタグ化サイクリンのタンパク質を発現します。
      1. 1×PBSで細胞を洗浄し、皿にトリプシンの100μlを添加し、5分間37°Cのでインキュベートします。細胞を回収し、単一細胞懸濁液を生成するために、70μmのフィルターを介してそれらを通過する培地2 mlを加え。フローサイトメーターの上にそれらをロードする前に、PBS中の1%ウシ胎児血清(FCS / PBS)500μlの持つ単一の細胞懸濁液を洗​​浄します。
      2. GFPとRFPの両方で染色された二重陽性細胞のために確立されたプロトコル18ゲーティングを次の並 ​​べ替えのパラメータを設定します。チューブcontaiにサイトメーターから出てきた選別細胞を収集寧細胞培養培地およびプロトコル9.2とEDUパルスチェイス標識で細胞周期進行の分析のために、これらの細胞を使用します。
  2. EDUの標識フローサイトメトリーアッセイを用いて細胞周期の長さの測定
    1. シードは、CO 2インキュベーター内で37°Cの時だけでなく、文化O / Nあたり2.5×10 5細胞の密度で6ウェルプレート中の細胞を選別しました。 25μMの最終濃度で培地にEDUを追加します。 1時間CO 2インキュベーター中で37°Cのでインキュベートします。
    2. 500μlのPBS中の1%BSAで細胞を洗浄し、10の合計2時間間隔で1.5 mlチューブにそれらを収集 - 12時間。
    3. 5分間、350×gで遠心分離細胞は、上清を捨てます。 RTで15分間(EDUラベリングキット内の製造業者によって提供された)定着液100μlを加えることにより、ペレットを除去し、よく混ぜます。
    4. PBS中の1%BSA 1mlで細胞を3回洗浄します。フィックス細胞を再び4 O℃で70%エタノールO / Nを0.5 mlの
      注:エタノールの固定が原因で、組換えタグ付きタンパク質発現に内部GFP / RFPの蛍光を消光することが重要です。
    5. 遠心分離5分間350×gで再び細胞を一度PBS中の1%BSA 1mlでペレットを洗浄します。 RTで20分間透過化緩衝液(PBS中0.1%トリトンX-100、1%BSA、0.2 mg / mlでのRNase A)を1mlで細胞を再懸濁します。
    6. 一度PBS中の1%BSAの1mlで細胞を洗浄。各チューブに反応カクテルの0.5 mLを加え、よく混ぜます。暗所で30分間室温で反応混合物をインキュベートします。
    7. PBS中の1%BSA 1ml中50μg/ mlのヨウ化プロピジウム(PI)で1回、PBS中1%BSA及び染色DNA 1mlで洗浄します。
    8. EDU-陽性集団を追跡するために、フローサイトメトリーにより細胞を分析します。 DNA含量について染色EDU標識細胞(PI染色、X軸)とEDU(アレクサ647染色、Y軸)の現在の散乱ドットプロット。
      1. アレックスのためのAPCチャネルを使用しますすべての存在する光と、そのフィルタを打つ未満685ナノメートルを30分の670のバンドパスフィルタを用いたA647-EDU。全て存在する光とその前に15分の581のバンドパスフィルタとPIおよびフィコエリトリン(PE)チャンネルそのフィルタを打つ600nm未満。
      2. フローサイトメトリーに細胞を含む第1のチューブを挿入し、取得するための標準的なゲーティング戦略を使用:細胞染色のためにPI​​が続く形態のためのプロットFSC-エリアX SSC-エリア(PEチャネル)X Alexa647-EDU(APCチャネル)。全てのチューブサンプルあたり10,000事象を獲得する一つ一つのレコードデータ。
      3. 確立されたプロトコール11,30以下のフローサイトメトリーデータ分析ソフトウェアを使用して、細胞および位相長の細胞周期の分布を決定します。

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Representative Results

サイクリンおよびCdk1ののサブミトコンドリア局在

炭酸ナトリウム抽出は、タンパク質がミトコンドリア内部又は外部表面、すなわち、外膜上に位置しているかどうかを決定するために使用されます。タンパク質は、ミトコンドリア内部で局在することが示されたら、サブミトコンドリア局在のさらなる決意は、プロテアーゼ消化と組み合わせmitoplastingを介して行うことができます。サイクリンまたはCdk1ののサブミトコンドリア局在を指定するには、ミトプラストは25 mmまでの200mMから浸透圧のスクロースの濃度を減少させて低張緩衝液中のミトコンドリアを希釈することによって単離しました。内膜は、ショ糖の25 mMの( 図1A)での最終濃度まで無傷のまま外膜は、ショ糖の150 mMので破裂し始めます。 mitoplastingと組み合わせて、プロテアーゼ保護アッセイはtrypsを用いて行うことができます外破水次の露出したタンパク質を消化します。これは膜間腔タンパク質の消化になります。関心対象のタンパク質をトリプシン消化から保護されている場合、これは、タンパク質のミトコンドリアマトリックス局在化を示しています。この代表的な図では、ミトコンドリアマトリックスタンパク質のHsp60および膜間空間タンパク質Timm13サブミトコンドリア局在マーカーとして使用しました。 Hsp60を有するがTimm13、サイクリンおよびCdk1のとは異なり、同様のは、そのミトコンドリアマトリックス局在化( 図1B)を示し、トリプシン消化から保護されていました。

MTS-およびGFPタグサイクリンおよびCdk1のタンパク質のミトコンドリア発現

MTSは、そのC末端にGFPまたはRFPタグを有するサイクリンまたはCdk1の遺伝子のN末端にフレーム内にクローニングします。得られた組換えタンパク質は、ミトコンドリアを標的とGFP-またはRFPタグ付きのCyでありますclinB1またはCdk1の。生成され、この研究で使用した構築物のリストは、図に示されています。これらの構築物を用いて、ミトコンドリアにおけるサイクリンおよび/ ​​またはCdk1のの過剰発現は、単離されたミトコンドリア画分( 図2)のウェスタンブロッティングによってここに示され、達成されました。

2D-DIGEにより決定サイクリン/ Cdk1のの潜在的なミトコンドリア標的

CDK1はSまたはT残基を配向(P)のプロリンするATPからのリン酸の転移を触媒するセリン/トレオニン(S / T)キナーゼファミリーに属します。 Cdk1の(D146N)の位置146のアスパラギン(N)とアスパラギン酸(D)残基を置き換える点突然変異は、ドミナントネガティブ(DN)Cdk1の突然変異体19を生成します 。ミトコンドリアCdk1の機能を研究するために、ミトコンドリアを標的とCdk1の-dnのタンパク質は、29アミノ酸経度を含む(pERFP-N1-MTS-Cdk1の-DN)プラスミドを構築することによって生成されましたRFPタグ付きDN-Cdk1のに連結されたヒトチトクロームCオキシダーゼのサブユニットVIII由来グラムのミトコンドリアターゲティング配列(MTS)。 pERFP-N1-MTS生産ミトコンドリア標的ERFPタンパク質は、空のベクター対照として使用しました。両方の構築物でトランスフェクトされたG2 / M細胞内のミトコンドリアのリンタンパク質は、pH 4-10ゲルストリップとの2Dゲル分析によってプロファイルしました。空のベクタートランスフェクタント( 図3、上パネル)と比較して、ミトコンドリアのリンタンパク質のグループが明らかに存在しなかったか、Cdk1の-dnのトランスフェクタント( 図3、下のパネル)に減少しました。検出されたスポットの質量分析は、ミトコンドリアにCdk1のによりリン酸化タンパク質の同一性を決定しました。

EDUパルスチェイスアッセイとの相長さの細胞周期の進行と決意

細胞周期WHEの進行を調べるためnはミトコンドリアのサイクリンは/ Cdk1のレベルが増加する、チミジン類似体を使用して、パルスチェイス標識実験は、エチニルウリジン(EDU)は、DNA合成の20を受ける細胞の集団を標識するために行きました。この方法は、細胞がSおよびG2 / M期を経て進行し、G1期に蓄積するときにEDU-陽性集団を追跡することによって22時間のウィンドウの上に捕捉された細胞周期の可視化を可能にします。結果は、ベクトル制御または突然変異サイクリン/でトランスフェクトした細胞に6時間と比較して、ラベルされたS期細胞は、G2 / M期を通じて進行し、野生型ミトコンドリアサイクリン/ Cdk1のを発現する細胞に4時間ほど速くG1期に登場したことを示していますCDK1( 図4A)は 、ミトコンドリアのサイクリンの増強を示す/ CDK1は、細胞周期の進行を加速させます。

図1
図1. ミトコンドリアサイクリン1 / Cdk1のは、マトリックスにローカライズします。保護アッセイをmitoplastingおよびプロテアーゼによって検出されたサイクリンとCdk1のの(AB)サブミトコンドリア局在、図は、Wang から変更されている。201411。合計(T)、ペレット(P)および上清(S)画分を示した抗体を用いたウエスタンブロット分析に供しました。 TIMM13(インタースペースタンパク質)、およびHSP60(マトリックスタンパク質)が。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
ミトコンドリアCdk1の構築物の 図2 発現。ミトコンドリアを標的としたサイクリンおよび/ ​​または野生型またはドミナントネガティブ変異体Cdk1のでトランスフェクトされた細胞から単離したミトコンドリア画分のウェスタンブロッティング(プラスミドが示されています底部11に。 pEGFP-N1-MTSとpERFP-N1-MTSベクトル)は、それぞれMTS-サイクリンとMTS-Cdk1のために空のベクター対照であった。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
図3. Cdk1のの潜在的なミトコンドリア基質。ミトコンドリアを標的とした空ベクター(pERFP-N1-MTS、上パネル)または変異Cdk1の(pERFP-N1-MTS-Cdk1の-dnにトランスフェクトしたG2 / M-ピークに達した細胞から抽出したミトコンドリアタンパク質、下のパネル)は2-Dゲルで分離し、リン酸化タンパク質をリン酸化色素(赤色)で染色した、のCy5(緑色)で標識しました。この図は、Wangら 2014年11から変更されています。">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4
図4. ミトコンドリアCdk1の増強G2 / M移行と全体のサイクル進行。
EDUパルスチェイスラベル付けされた細胞周期分析。 EDU標識細胞の散布図ヒストグラムはDNA含有量(X軸)とEDU(Y軸)のために採取しました。各パネルの下の数字は、EDUの平均蛍光強度は、核標識示します。時点は、EDUパルス11後の時間で示されました。 G0 / G1、S、およびG2 / M:全ての時点については、以下の集団を表示するゲートが描かれました。 6,8、および10時間の時点については、EdU-は*、S / G2 G1を標識し、G2は/ M *集団が示されています。この図は、王らから変更されている。2014年11。 をクリックしてくださいここで、この図の拡大版を表示します。

ショ糖濃度
いいえトリプシンありません 25 mMの 50 mMの 100 mMの 150mMの 200 mMの
+トリプシン 25 mMの 50 mMの 100 mMの 150mMの 200 mMの

ステップ4.2のために使用される表1.低張スクロースバッファ

ステップ1 30 V 12時間ステップとホールド
ステップ2 300 V 0.5時間ステップとホールド
ステップ3 千V 0.5時間勾配
5000 V 1.33時間勾配
ステップ5 5000 V 2万Vの時間ステップとホールド

ステップ6.4.5のために使用される表2等電点電気泳動プロトコル

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Discussion

他の細胞内小器官宛のタンパク質と同様に、ミトコンドリアの標的タンパク質は、精巧なタンパク質のトランスロケーションと折り機21,22の支援を受けて細胞小器官にそれらを向ける彼らの一次または二次構造内ターゲティングシグナルを有しています。例えばCOX8としてのみミトコンドリア常駐タンパク質から得られた配列(MTS)を標的とするミトコンドリアは、ミトコンドリア11,23,24に特定のタンパク質を標的とする任意の遺伝子配列のN末端 ​​に付加することができます。ここでは、サイクリンおよびCdk1の遺伝子がベクターを含むCOX8のMTSへと発現の際にクローン化した、組換えサイクリンおよびCdk1のは、ミトコンドリアに局在していました。このアプローチの利点は、全体的な遺伝子発現を変化させることなく、この場合、ミトコンドリアに、特定の副細胞区画に遺伝子発現の改変を可能にすることです。この戦略では、ミトコンドリア特異的核キナーゼの機能は、Cdk1のがdeましたtermined。同様に、ドミナントネガティブCdk1のにMTSを添加することにより、ダウンCdk1のミトコンドリア特有の機能のノックミトコンドリアCDK1の比標的の同定を可能にし、Cdk1の機能のミトコンドリアの欠如の機能的結果の分析を可能にするものでした。ミトコンドリアおよび核の両方でCdk1のの発現増強でMTSタグ結果なしCdk1のの過剰発現は、そのためには、Cdk1ののミトコンドリア固有のアクションの結果のさらなる調査を複雑にしています。

私たちはMTSタグの添加によりミトコンドリアにいくつかのキナーゼを移転しようとする試みに失敗した数を経験しているようしかし、このアプローチは、すべての遺伝子産物に適していないかもしれません。いくつかの細胞株は、トランスフェクションに非常に耐性があり、最適なプロトコルを見つけることは時間がかかるかもしれません。細胞が健康であるとトランスフェクションは、蛍光標識されたタンパク質と協力し、成功した場合であってもいくつかの問題のSUCを示します集約、不正確なローカリゼーション、非機能の融合、および弱い信号として時間。

ミトコンドリアとミトプラストの分離の主な制限は、他の細胞またはサブミトコンドリアのコンパートメントからの低収量及び汚染の可能性があります。接着性細胞は、それが困難な培養接着細胞からミトコンドリアの高い量を得ることができるので、従来の化学的または機械的な方法によって効率的に破断されていないことが示唆されます。ここでは、MCF10A細胞の接着培養を利用しました。出発量を50μgのミトコンドリアタンパク質の3 - -約30を得るために、5×10 7細胞を使用しました。均質化工程は、ミトコンドリアの準備の最終収量のためのもう一つの重要なポイントです。使用される細胞株に依存して、ストロークおよび/または均質化の時間数が変化してもよいです。 MCF10A細胞のために、私たちはガラス/ガラスホモジナイザーにより均質化の10分は、マウス胚性fibroblaながら、必要とされることを観察しました均質化の5分 - STS(MEF)はわずか3を必要としました。過度の均質化は、ミトコンドリア膜に損傷を引き起こし、ミトコンドリアの成分の放出を誘発することができるので、各細胞株のための標準的な条件は、経験的に決定されるべきです。ガラス - ガラスホモジナイザーの使用は、ガラス/テフロンホモジナイザーに比べてミトコンドリア調製物の収量を増加させます。出発細胞の量だけでなく、細胞の凍結/解凍はオープン細胞を破壊するために必要なストローク数を変更することができます。最後に、タンパク質の変性や凝集が原因で均質化中の試料の局所的な加熱に発生する可能性があります。組織グラインダーを事前に冷やすと、この手順の実行中にサンプルを氷上で維持するために、したがって、必要不可欠です。

この記事で紹介したもう一つの方法は、リアルタイムで細胞周期を監視するEDUのラベリングを使用することです。 EDUは、蛍光明るく、光安定アレクサフルオロ色素で標識された修飾チミジン類似体です。 EDUはEFFIです効率良く新たに合成されたDNAに組み込まれました。この方法は、ヌクレオシドアナログ、ブロモデオキシウリジン(BrdUを)で細胞を増殖させる伝統的な標識の使用に優れた代替手段です。 BrdUの活性DNA合成中にDNAに組み込まれます。 BrdUで標識されたDNAの定量化は、このようなBrdU抗体結合のためのBrdU分子を露出させるために高熱や高酸度などの比較的過酷な方法により、DNAの変性を必要とします。 DNAの変性のための過酷な治療には、サンプルの質に影響を与え、時間がかかることができます。 EDUと、界面活性剤透過性は、DNAへのアクセスを得るためにEDU検出試薬に一般的に十分です。 DNAへのアクセスのために過酷な化学物質または熱を使用する必要なしに、EDUの方法は、より正確で一貫性のある使用が容易です。別にEDUが提供する利点から、増殖を研究するためにEDUの使用に関するいくつかの懸念がありました。 EDUはneglに減らすことができ、72時間以上のトリートメント、でわずかな抗増殖活性を示しましたEDUパルスが1時間25℃で維持したigibleレベル。

EDUのラベリングに使用されている1つの変更が定着時間及び方法です。キットには、設けられた固定液で15分間固定を示唆しました。しかし、70%エタノールで追加の固定は、この実験で使用しました。細胞は2時間毎に採取した、時点の実験を行ったところ、1)時間をかけて細胞周期の進行を追跡する:エタノールの使用のための2つの理由があります。実験時間点の全てが完了するまで細胞を4°Cの 70%エタノール中で保存しました。必要であれば実際に、細胞は、(カ月に数週間)より長い、70%エタノール中で維持することができます。 2)実験に使用した細胞は、安定にGFPタグ付きCDK1及び/またはRFPタグ付きサイクリントランスフェクトしました。 GFP / RFP蛍光のEDU及びPI信号を分離するために、エタノールの固定は、GFP及びRFPタンパク質を変性させ、ひいてはEDU行う前に蛍光を消光するために利用されましたD PI染色。変性GFP / RFPタンパク質は、本質的に完全に非蛍光性、発色団はもはや26,27を急冷から保護されているためと考えています。

Cdk1のミトコンドリアの標的を同定するために、多くの点で従来の2Dゲルよりも優れている2D-DIGE法は、使用されました。 例えば、2D-DIGE、異なる蛍光色素では、Cy 3、図5及び図2に示すように、ラベルのサンプルに使用され、標準的な2Dゲルのように複製を実行することなくばらつきを低減し、1つのゲルで3サンプルまで実行可能にします。 2D-DIGEに使用される蛍光色素は、0.2 ngの非常に高い感度を持っている/高いスポット分解能2D-DIGEゲル上で実行したタンパク質の少量を必要とする、このようにして、100 ngの/スポットでのトリフェニルメタン染料に比べてスポットと出版品質のゲルをスキャンします。自動化されたソフトウェアは、示差的に発現するタンパク質を検出、定量化および定義するために使用されます。高いスポット分解能のため、サンプルCAにおけるタンパク質発現を差動nはソフトウェア支援スポット定量化を使用して正確に比較すること; 10%という低い差が容易に翻訳後修飾の可視化を可能にする、2D-DIGEを介して検出することができます。ソフトウェア支援ゲル内分析の使用は、データのより速い取得を可能にします。例えば、蛍光スキャナーなどの機器が、画像取得のために必要とされるので、この方法の使用は、追加費用を伴います。 2D-DIGEの他の制限は、貧しい疎水性タンパク質の表現だけでなく、極端な等電点と大きな分子量を28,29を有するタンパク質が含まれます。このような免疫細胞化学またはウェスタンブロットのような代替技術を使用して、2D-DIGEを用いて得られた結果のさらなる検証は、新規の知見を確認するために必要とされます。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
32P ATP  PerkinElmer BLU002001MC 
Anti-mouse secondary antibody Invitrogen  A-11003 Alexa-546 conjugated
Anti-rabbit secondary antibody Invitrogen  A11029 Alexa-488 conjugated
ATP Research Organics 1166A For in vitro kinase assay
Cdk1 antibody Cell Signaling Technology 9112
Cdk1 kinase buffer New England Biolabs P6020S
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit Life Technologies C10337 For cell cycle analysis with EdU labeling
COX IV antibody Cell Signaling Technology 4844S For mitochondrial immunostaining
Cyclin B1 antibody Santa Cruz Biotech sc-752
CyclinB1/Cdk1 enzyme complex New England Biolabs P6020S Avoid freeze/thaw
CyDye DIGE Fluor Labeling Kit GE Healthcare Life Sciences 25-8009-83
DIGE Gel and DIGE Buffer Kit GE Healthcare Life Sciences 28-9480-26 AA
Dimethylformamide  Sigma Aldrich 319937 DMF
Dithiothreitol Bio-Rad 161-0611 DTT
dNTP EMD Millipore 71004 For site-directed mutagenesis
Dpn I enzyme Stratagene 200519-53 For site-directed mutagenesis
Dry Strip cover fluid GE Healthcare Life Sciences 17-1335-01 Used as mineral oil
EDTA J.T. Baker 4040-03
EGTA Acros Organics 409910250
Eppendorf Vacufuge Concentrator Fisher Scientific 07-748-13 Used as vacuum centrifuge concentrator
Fluoromount G Southern Biotech 0100-01 Anti-fade mounting solution
Fortessa Flow Cytometer BD Biosciences 649908 For cell cycle analysis with EdU labeling
Histone H1 Calbiochem 382150 For in vitro kinase assay
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704 For purifying DNA fragments from agarose gels
Immobiline DryStrip Gels GE Healthcare Life Sciences 18-1016-61 IEF (isoelectric focusing) strips
Immobilized Glutathione Thermo Scientific 15160 Glutathione-agarose beads
Iodoacetamide Sigma Aldrich I1149 IAA
IPGphor 3 Isoelectric Focusing Unit GE Healthcare Life Sciences 11-0033-64 IPGphor strip holders
Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside  RPI Corp 156000-5.0 IPTG
Leupeptin Sigma Aldrich L9783 For cell lysis buffer
Lipofectamine 2000 Life Technologies 11668027 Transfection reagent
Lysine Sigma Aldrich L5501 For CyDye labeling
Lysozyme EMD Chemicals 5960
Mitoctracker Red/Green Invitrogen  M7512/M7514 Mitochondrial fluorescent dyes
MOPS EMD Chemicals 6310
pEGFP-N1 Clonetech 6085-1 GFP-expressing vector
Pfu Stratagene 600-255-52
pGEX-5X-1  GE Healthcare Life Sciences 28-9545-53 GST-expressing vector
Phenylmethylsulfonyl fluoride Shelton Scientific IB01090 PMSF
Phosphate buffered saline Life Technologies 14040 PBS
Spectra/Por 4 dialysis tubing Spectrum Labs 132700 as porous membrane tubing for dialysis
Pro-Q Diamond Phosphoprotein Gel Stain Life Technologies P-33300 For staining phosphoproteins on 2D gels
Proteinase inhibitor cocktail Calbiochem 539134 For cell lysis buffer
QuikChange site-directed mutagenesis kit Stratagene 200519-5
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27104 MiniPrep Plasmid Isolation Kit
RO-3306 Alexis Biochemicals 270-463-M001 Cdk1 inhibitor
Rotenone MP Biomedicals 150154 Complex I inhibitor
Sodium carbonate Fisher Scientific S93359
Sodium chloride EMD Chemicals SX0420-5 For cell lysis buffer
Sodium orthovanadate MP Biomedicals 159664 For cell lysis buffer
Sodium pyrophosphate decahydrate Alfa Aesar 33385 For cell lysis buffer
Sodium β-glycerophosphate Alfa Aesar L03425 For cell lysis buffer
SpectraMax M2e  Molecular Devices M2E Microplate reader
Sucrose Fisher Scientific 57-50-1
Tissue Grinder pestle Kimble Chase 885301-0007 For mitochondria isolation
Tissue Grinder tube Kimble Chase 885303-0007 For mitochondria isolation
Trichloroacetic acid solution Sigma Aldrich T0699 TCA
Tris MP Biomedicals 103133
Triton-x-100 Teknova T1105
Trypsin Calbiochem 650211
Typhoon Imager GE Healthcare Life Sciences 28-9558-09 Laser gel scanner fro 2D-DIGE
Ubiquinone Sigma Aldrich C7956

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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ミトコンドリア局在と原子力細胞周期キナーゼ、Cdk1のの機能を研究するための実験的アプローチ
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Candas, D., Qin, L., Fan, M., Li, J. J. Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1. J. Vis. Exp. (108), e53417, doi:10.3791/53417 (2016).More

Candas, D., Qin, L., Fan, M., Li, J. J. Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1. J. Vis. Exp. (108), e53417, doi:10.3791/53417 (2016).

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