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Biology

Abordagens experimentais para estudar mitocondrial Localização e função de um ciclo celular Nuclear Kinase, Cdk1

doi: 10.3791/53417 Published: February 25, 2016

Introduction

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Nos mamíferos, a progressão do ciclo celular é dependente de acontecimentos altamente ordenadas controlados por ciclinas e cinases dependentes de ciclina (CDK) 1. Através de sua citoplasmático, nuclear, e localização centrosomal, CyclinB1 / Cdk1 é capaz de sincronizar diferentes eventos na mitose, tais como quebra envelope nuclear e separação centrossoma 2. CyclinB1 / Cdk1 protege as células mitóticas contra a apoptose 3 e promove a fissão mitocondrial, um passo crítico para uma distribuição igual das mitocôndrias das células filhas recém-formados 4.

Em proliferação de células de mamíferos, mitocondrial de ATP é gerado através da fosforilação oxidativa (FOX) construção (cadeia de transporte de electrões), o qual é composto por 5 complexos de multi-subunidades; Complexo I - V complexo (CI-CV). Nicotinamida adenina dinucleótido (NADH): oxidorredutase ubiquinona ou complexo I (CI) é a maior e menos compreendido dos cinco complexos de 5. O complexo Consists de 45 subunidades, das quais 14 formam o núcleo catalítico. Uma vez montado, o complexo assume uma estrutura em forma de L com um braço saliente na matriz e o outro braço incorporado na membrana interna 6,7. Mutações em subunidades de IC são a causa de uma variedade de doenças mitocondriais 8. Um IC funcionalmente eficiente em OXPHOS é necessário não só para a respiração mitocondrial geral 9, mas também para a progressão do ciclo celular bem sucedida 10. Unravelling os mecanismos subjacentes ao funcionamento deste complexo de enzima ligada à membrana na saúde e na doença pode permitir o desenvolvimento de novos processos de diagnóstico e estratégias terapêuticas avançadas. Em um estudo recente, verificou-se que o / complexo Cdk1 CyclinB1 transloca para dentro da mitocôndria na / (mitose) fase M (Gap 2) G2 e fosforila subunidades CI para aumentar a produção de energia mitocondrial, potencialmente, para compensar o aumento das necessidades energéticas das células durante celular ciclo de 11. Aqui nós showcase procedimentos experimentais e estratégias que podem ser usados ​​para estudar a translocação mitocondrial de cinases em contrário nucleares / citoplasmáticas, os seus substratos mitocondriais, bem como consequências funcionais da sua localização mitocondrial usando CyclinB1 / Cdk1 como um exemplo.

A constatação de que o / complexo Cdk1 CyclinB1 transloca para dentro da mitocôndria, quando necessário solicitado os estudos de sobre-expressão específicas de mitocôndrias e knockdown deste complexo. Para conseguir a expressão específica de mitocôndrias de proteínas, pode-se adicionar uma sequência de direccionamento mitocondrial (MTS) no N-terminal da proteína de interesse. Mitocôndrias alvo sequências permitem a ordenação das proteínas mitocondriais na mitocôndria onde eles residem normalmente 12. Temos usado uma sequência de direccionamento 87 mitocôndrias de base derivado do precursor do citocromo humano subunidade c oxidase 8A (COX8) e clonado-lo em Green Fluorescent Protein (GFP) tagged CyclinB1 ou vermelho fluorescenteProtein (RFP) tagged Cdk1 contendo plasmídeos no quadro. Este método permitiu-nos atingir CyclinB1 e Cdk1 na mitocôndria, que alterou a expressão mitocondrial destas proteínas sem afetar sua piscina nuclear. Por fluorescente marcação destas proteínas, fomos capazes de monitorar a sua localização em tempo real. Da mesma forma, nós introduzimos MTS em um plasmídeo contendo marcado-RFP dominante negativo Cdk1, o que nos permitiu bater especificamente para baixo a expressão mitocondrial e funções de Cdk1. É essencial para distinguir entre as funções mitocondriais e nucleares das quinases que têm localizações dupla como Cdk1. Engenharia MTS para o N-terminal destas cinases funcionais duais oferece uma grande estratégia que é fácil de ser utilizado e eficaz.

Desde Cdk1 é uma quinase do ciclo celular, que é fundamental para determinar a progressão do ciclo celular quando Cdk1 está localizada dentro da mitocôndria. Para conseguir isso, nós utilizamos uma nova metod para monitorizar o conteúdo em ADN em células. Os métodos tradicionais incluem a utilização de BrdU (bromodesoxiuridina), um análogo da timidina sintética, que incorpora-se no ADN sintetizado de novo durante a fase S do ciclo celular para substituir timidina. Em seguida, as células que estão a replicar o seu DNA activamente pode ser detectada utilizando anticorpos anti-BrdU. Uma desvantagem deste método é que ele exige a desnaturação de ADN para fornecer acesso para o anticorpo BrdU por métodos agressivos como tratamento com ácido ou calor, o que pode resultar em inconsistência entre os resultados 13,14. Alternativamente, utilizou-se uma abordagem semelhante para monitorar as células que se dividem activamente com um análogo da timidina diferente, EdU. detecção EdU não requer desnaturação DNA dura como o tratamento detergente suave permite que o reagente de detecção para acessar o EdU no DNA recém-sintetizado. O método EdU provou ser mais confiável, consistente e com potencial para a análise de alto rendimento 15.

Finalmente, to determinar os substratos mitocondriais de Cdk1, usamos uma ferramenta proteômica chamado 2D DIGE, que é uma versão avançada do eletroforese em gel clássico bidimensional. Electroforese bidimensional separa as proteínas de acordo com o seu ponto isoeléctrico na primeira dimensão e o peso molecular na segunda. Uma vez que as modificações pós-traducionais, tais como fosforilação afectar o ponto isoeléctrico e o peso molecular das proteínas, géis 2D podem detectar diferenças entre os estados de fosforilação de proteínas nas amostras diferentes. O tamanho (área e intensidade) de proteína acaba alterações com o nível de expressão de proteínas, permitindo a comparação quantitativa entre múltiplas amostras. Usando este método, fomos capazes de diferenciar as proteínas fosforiladas no tipo selvagem contra células que expressam CDK1 segmentada por mitocôndrias mutantes. Os spots de proteínas específicas que mostraram no tipo selvagem, mas estavam faltando no mutante preparação Cdk1 segmentada por mitocôndrias foram isoladas eidentificado através de espectrometria de massa.

Nos geles 2D tradicionais, corantes de trifenilmetano são utilizados para visualizar as proteínas no gel. 2D DIGE usa rótulos proteína fluorescente com um efeito mínimo sobre a mobilidade eletroforética de proteínas. Diferentes amostras de proteínas podem ser marcados com diferentes corantes fluorescentes, misturados entre si e separadas por os géis idênticos, permitindo que a co-electroforese de amostras múltiplas com uma única gel 16. Isto minimiza as variações de gel-a-gel, o que é um problema crítico nos estudos proteómica à base de gel.

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Protocol

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1. Isolamento de mitocôndrias de células de cultura

  1. Preparação de tampão de isolamento de células (IBC) Tampão
    1. Prepare 0,1 M Tris / MOPS (tris (hidroximetil) aminometano / 3- (N-morfolino) propanossulfónico): Dissolver 12,1 g de Tris em 800 ml de água destilada, ajustar o pH a 7,4 usando MOPS pó, adicionar água destilada até um total volume de 1 L e armazenar a 4 o C.
    2. Prepare a 0,1 M de EGTA (etileno glicol bis (éter 2-aminoetil) tetra-acético) / Tris: Dissolve-se 38,1 g de EGTA em 800 ml de água destilada, ajustar o pH para 7,4 utilizando Tris pó, adicionar água destilada até um volume total de 1 L e armazenar a 4 ° C.
    3. Prepare 1 M de sacarose: Dissolver 34,23 g de sacarose em 100 ml de água destilada, fazer 20 ml alíquotas e armazenar a -20 o C.
    4. Preparar tampão c IB: preparar 100 ml de tampão de IB C por adição de 10 ml de Tris 0,1 M / MOPS e 1 ml de 0,1 M de EGTA / Tris a 20 ml; De 1 M de sacarose. Adiciona-se água destilada até um volume total de 100 ml. Ajustar o pH para 7,4.
  2. Preparação de tampão de lise celular
    1. Preparar o tampão de lise contendo Tris-HCl 20 (pH 7,5), NaCl 150 mM, EDTA 1 mM (etileno diamino tetra-acético), 1 mM de EGTA, 1% de Triton-X-100, 2,5 mM de pirofosfato de sódio, 1 mM de β- glicerofosfato, 1 mM de ortovanadato de sódio. Adicionar inibidores de proteinase 1 ug / mL de leupeptina e 1 mM de PMSF (fluoreto de fenilmetilsulfonilo) imediatamente antes da utilização.
  3. Isolamento de mitocôndrias
    1. Colheita 3 x 10 7 células com gelo frio 1x PBS (Tampão fosfato salino), pH 7,4 e centrifugação as células a 600 xg durante 10 minutos a 4 o C. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 5 ml de tampão c IB gelada.
    2. Homogeneizar as células usando um moedor de tecido de vidro / vidro por cerca de 10 min. Transferir o homogeneizado para um tubo de 15 ml e centrifugar a 600 xg durante 10 min a 4 o C. Para mitocôndrias funcionais, usar acoplamento vidro / Teflon, pois é menos prejudicial para as mitocôndrias do que o triturador de tecidos de vidro / vidro.
    3. Recolhe-se o sobrenadante para tubos de 1,5 ml e centrifugar a 7000 xg durante 10 minutos a 4 o C. Transferir o sobrenadante para um tubo de 1,5 ml e guardar a proteína citosol.
    4. Lava-se a pelete (mitocôndria) duas vezes com tampão de IB c arrefecida em gelo de 200 mL e centrifugação a 7000 xg durante 10 minutos a 4 o C.
    5. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em tampão de lise de células e usar imediatamente ou armazenar a -80 ° C para uso futuro. Se forem necessários mitocôndrias funcionais, re-suspender o sedimento no tampão remanescente após o descarte do sobrenadante. Diluir a fracção mitocondrial ainda pode resultar na perda da função das mitocôndrias. Armazenar no gelo e utilize a preparação em 1-3 horas para obter melhores resultados.
    6. Sonicar a pelota foi ressuspensa por trinta rajadas 3-sec numabanho de gelo, centrifugar a 10000 xg durante 5 min, e guardar o sobrenadante como a fracção mitocondrial.

2. Co-imunocoramento Cdk1, CyclinB1 e COXIV, uma proteína mitocondrial Residente

  1. Cresça 5 x 10 4 células em lamelas em placas de 24 cavidades O / N ou até 70% de confluência. Aspirar o meio e lava-se as células duas vezes com 500 mL de gelo frio 1 x PBS, pH 7,4.
  2. Fixar as células com 500 uL gelada 4% de paraformaldeído à temperatura ambiente durante 10 min. Aspirar a solução fixadora e lavam as células com 500 ul de 1 x PBS 3 vezes, 5 minutos cada, com agitação suave à temperatura ambiente.
  3. Permeabilizar as células com 0,2% de Triton X-100 em 500 ul de PBS durante 5 min à TA. Aspirar a solução e lava-se as células 3 vezes, 5 minutos cada um com 500 ul de PBS. Adicionar a solução de bloqueio (500 ul, 1% de BSA (Albumina de Soro Bovino) em PBS contendo 1% de Tween 20) durante 30 min à TA.
  4. Dilui-se os anticorpos primários 1: 250 (v: v) em 5001; L de solução bloqueadora e incubar as células com anticorpos primários desejados levantadas em espécies diferentes para evitar a sinalização transversal (CyclinB1 (rato) e COXIV (coelho) ou Cdk1 (rato) e COXIV (coelho) à temperatura ambiente durante 30 - 60 min ou O / N a 4 o C.
  5. Lavam-se as lamelas com 500 ul de 1 x PBS 3 vezes, 5 min cada, e depois incubar com anticorpo secundário diluído 1: 1000 em 500 ul de solução à TA durante 1 h, seguida de lavagem com 500 ul de PBS 3 vezes, 5 min cada bloqueio.
  6. Montar as lamelas com 20 l de solução de montagem anti-fade e selar as lâminas com unha polonês. Imagem os slides usando um microscópio de fluorescência imediatamente ou manter no escuro a 4 ° C para 1 - 2 semanas.

3. Extracção de sódio Carbonato de mitocôndrias intactas

  1. Crescer aproximadamente 20 x 10 7 células, colheita, lavar uma vez com PBS e isolar mitocôndrias como descrito na seção 1. mitocondrial Divide isola em dois parTS antes da última centrifugação para sedimentar as mitocôndrias (antes do passo 1.3.4); salvo meio para ser utilizado como a mitocôndria total (passo 3.2), utilizar a outra metade para a extracção de carbonato de sódio (3,3-3,6 seguintes passos) para separar as proteínas ligadas membrana e solúveis.
  2. Lisar as mitocôndrias total de aglomerados com 30 ul de tampão de lise celular e armazenar o lisado a -80 ° C até serem usadas em imunotransferência.
  3. Adicionar 250 uL de 0,1 M de Na 2 CO 3 (carbonato de sódio), pH 11,0, para a outra metade do sedimento mitocondrial e incubar em gelo durante 30 min.
  4. Centrifugar a 100.000 xg durante 20 min. Recolher o sobrenadante e prossiga para a etapa 3.5. Lyse o sedimento utilizando 30 ul de tampão de lise celular e sonicado como no passo 1.3.6. Armazenar a -80 ° C até ser usado em immunoblotting.
  5. Adicionar um volume igual de 20% de ácido tricloroacético acabado de fazer (TCA) para o sobrenadante, para precipitar as proteínas e manter em gelo durante 30 min.
  6. CentrifUGE a 15000 xg durante 10 min. Descartar o sobrenadante, dissolve-se o sedimento em 80 ul de tampão de lise celular e armazenar a -80 ° C até serem usadas em imunotransferência.

4. Separação de interior e exterior membranas das mitocôndrias (Isolamento de Mitoplasts)

  1. Crescer aproximadamente 20 x 10 7 células, colheita, lavar uma vez com PBS e isolar mitocôndrias tal como descrito na secção 1. Separam-se as fracções mitocondriais em 10 porções iguais antes da última centrifugação para sedimentar as mitocôndrias (antes do passo 1.3.4).
  2. Dissolve-se cada pelete em 30 ul da concentração indicada de tampão de sacarose hipotónico (1 mM de EDTA, 10 mM de MOPS / KOH (hidróxido de potássio), pH 7,2; concentração de sacarose que varia 25-200 mM) com ou sem 50 ug / ml de tripsina ( ver Tabela 1) e incubar 30 minutos em gelo.
  3. Adicionar 3 mL de PMSF 10 mM (para atingir uma concentração final de 1 mM de PMSF), para a tripsina contendo frascos T para pararele digestão com tripsina e incubar em gelo durante 10 min.
  4. Centrifuga-se a 14000 xg, a 4 ° C durante 10 min. Transferir o sobrenadante para um novo tubo, lisar o granulado em 30 ul de tampão de lise celular, sonicado como no passo 1.3.6, e armazenar a -80 o C.

5. Construção de mitocôndrias-alvo GFP / CyclinB1 marcado-RFP / Cdk1 vetores e confirmação da sua localização mitocondrial

  1. Clonar as mitocôndrias sequência de direccionamento (MTS; derivado do precursor do citocromo humano subunidade c oxidase 8A (COX8) entre os nucleótidos 76 - 161) na moldura para o terminal N de GFP ou RFP nos locais NheI e BamHI do pEGFP-N1 ou pERFP vectores -N1 utilizando técnicas convencionais de clonagem molecular.
  2. Ao conceber iniciadores de PCR para os genes CyclinB1 e CDK1, adicionar locais BamHI de reconhecimento de enzimas de restrição (negrito) para a 5 'dos ​​iniciadores de PCR.
    Adiante Cdk1 BamH15 'CAG T GG ATC C AA TGG AAG ATT ATA CCA AAA T
    Reverter Cdk1 BamH1 5 'CTG T GG ATC C TG CAT CTT CTT AAT CTG ATT
    Adiante CyclinB1 BamH1 5 'ATA TGG ATC CAA TGG CGC TCC GAG TCA
    Reverter CyclinB1 BamH1 5 'ATA TGG ATC CTG CAC CTT TGC CAC AGC C
  3. Amplificar os genes CDK1 e CyclinB1 utilizando estes iniciadores seguindo as técnicas convencionais. Digerir o produto de PCR com 1 ul de enzima de restrição BamHI a 37 ° C durante 2 h. Executar os produtos de digestão num gel de agarose 1%. Usando uma lâmina de barbear, cortar os fragmentos de ADN -sized correctas para fora e purifica-se o ADN a partir do gel utilizando um kit de extracção de gel.
  4. Digerir 1 ug de MTS-pEGFP-N1 e plasmídeos MTS-pERFP-N1 com 1 ul de enzima BamHI a 37 ° C durante 2 h. Adicionar 1 ml de Calf-IntesTiNAl fosfatase alcalina (CIP) durante 30 min a 37 ° C. Executar os produtos de digestão num gel de agarose 1% e purifica-se os plasmídeos lineares de gel como no passo 5.3.
  5. Defina-se uma reacção de ligação por adição de 1 ul de plasmídeo a partir do Passo 5.4 e 5 ul de Cdk1 ou CyclinB1 do Passo 5.3 a 3 ul de tampão ligase, 0,5 ul de ligase de T4, e 20,5 uL de dH2O Incubar O / N a 4 ° C.
  6. Transformar Escherichia coli DH5a competentes células com 10 uL da mistura de ligação de acordo com técnicas padrão e crescer as bactérias em 10 mg / ml de canamicina contendo agar LB placas de O / N a 37 ° C para se obter colónias.
  7. Escolher uma colónia de O / N placas crescidos utilizando uma ponta de pipeta estéril, insira a ponta a 5 ml de canamicina-LB contendo tubo e incubar O / N. Isolar o plasmídeo utilizando kits miniprep de acordo com o protocolo do fabricante, e a sequência do plasmídeo usando técnicas padrão.
  8. Transfectar exponencialmente crescente MCF1Células 0A (1,5 x 10 4 células semeadas em placas de 96 poços) com MTS-Cdk1-RFP ou MTS-CyclinB1-GFP plasmídeos a partir do Passo 5.7, preparando uma razão de reagente de plasmídeo / transfecção de 1: 2 (w: v, 100 ng : 0,2 ul) no sérica de 100 mL e meio sem antibiótico.
  9. Incubar as células em plasmídeo mistura / reagente durante 48 horas a 37 ° C em uma incubadora de CO 2 com controlo de humidade (5% de CO2, 95% de humidade relativa).
  10. Preparar solução de reserva 1 mM de corantes fluorescentes vermelho e verde mitocondriais por dissolução de 50 g de pó em 100 ul de DMSO. Dilui-se a soluções de 1: 400 em PBS 1X para se obter 2,5 uM soluções de trabalho. As soluções de reserva pode ser armazenado a -20 ° C durante um ano.
  11. Misturar 2 ul de 2,5 uM de corante vermelho com 98 ul de meio de cultura para preparar uma concentração final de 50 nM.
  12. Substituir o meio de cultura de células de CyclinB1-GFP rolamento células MCF10A (gerados no passo 5.8) com corante vermelho contendo meio durante 2 min. Repita omesmo procedimento com corante verde para células MCF10A rolamento Cdk1-RFP.
  13. Lave duas vezes com 100 mL 1 x PBS para se livrar da solução de coloração em excesso, adicione 100 mL 1x PBS à placa de 96 poços.
  14. Visualizar a mitocôndria e CyclinB1-GFP (por excitação a 488 nm e emissão a 494-536 nm) e Cdk1-RFP (excitação por 560 nm e emissão a 565-620 nm) em placas de 96 poços sob o microscópio de fluorescência a 40x de ampliação.

6. Identificação de fosforiladas Proteínas diferencialmente através 2D-DIGE

  1. Preparação de amostra
    1. Isolar mitocôndrias e lisar frações mitocondriais como no Passo 1.3. Adicionar um volume igual de 20% de TCA (ácido tricloroacético em água) a cada amostra e vortex durante 15 seg. Incubar as amostras em gelo durante 30 min como as proteínas precipitar para fora da solução.
    2. Centrifugar as amostras a 9300 xg, a 4 ° C durante 5 minutos, remover o sobrenadante e adicionar 60 ul de acetona fria (100%) seguido porcentrifugação a 9300 xg, a 4 ° C durante 5 min.
    3. Repetir o passo de lavagem com acetona (Passo 6.1.2) mais uma hora, remover o sobrenadante e suspender novamente as amostras em 50 uL de tampão de rotulagem DIGE (7 M de ureia, 2 M tioureia, 4% CHAPS, 30 mM Tris, pH 8,5).
  2. Prepare o corantes fluorescentes
    1. Preparar a solução de estoque: Dissolve-se corantes (5 nmol) em 5 mL de formamida de dimetilo fresco (DMF) a uma concentração final de 1 nmol / l. Guardar a solução estoque de corantes à temperatura de -20 ° C até à sua utilização por alguns meses.
    2. Preparar solução de trabalho: Permitir corantes para definir à TA durante 5 min. Dilui-se 1 ul de corante com 4 mL de DMF a uma concentração final de 200 pmoles / ul. Manter em gelo durante o uso. Nota: A solução de trabalho pode ser mantida a -20 ° C durante 3 semanas.
  3. Proteínas de etiqueta
    1. Misturar 1 uL de solução de trabalho de corante por 12,5 mg de proteína. Intensificar conforme necessário. Para os padrões combinados, adicione 61; L de solução de trabalho Cy2 a 300 ug de proteína reunidas.
    2. Vortex durante 30 segundos e centrifugar a 4 ° C durante 30 segundos a 12.000 x g. Incubar em gelo no escuro durante 30 min. Pare a rotulagem através da adição de 1 ml de lisina 10 mM por 1 mL de solução de trabalho utilizados. Misturar bem e incubar em gelo no escuro durante 10 min.
    3. Piscina rotulados individualmente amostras e misturar-se com tampão de reidratação (7 M de ureia, 2 M tioureia, 4% CHAPS, 1,2% destreak, 1% pharmalytes, azul de bromofenol). O volume total será de 125 ul.
    4. amostras vortex durante 30 seg e permitir que as amostras para definir a TA durante 30 min. Carga de 125 l de amostras sobre sete centímetros pH 4-9, focagem isoeléctrica (IEF) Tiras.
  4. Electroforese primeira dimensão
    1. Coloque os titulares Strip (caixões) na placa de eletrodo, certificando-se os titulares de tiras são completamente limpos e secos. Pipetar 125 amostras ul em um caixão, espalhando uniformemente em todo o caixão.
    2. usando tweezers, pegar a tira IEF, retire cuidadosamente a tampa protectora de plástico e coloque-o (lado gel para baixo) no tampão caixão / reidratação. Evite bolhas de interceptação. Lentamente encher caixão (1 - 1,5 ml) com óleo mineral e colocar o caixão cobre sobre os caixões.
    3. Comece a focagem isoeléctrica seguindo o protocolo da Tabela 2:
      Nota: Uma vez que o prazo é completa, as tiras podem ser armazenadas em tubos de plástico a -80 ° C ou diretamente mudou-se para o equilíbrio e a segunda dimensão.
  5. Segunda dimensão - dodecilsulfato de sódio-gel de poliacrilamida de electroforese (SDS-PAGE)
    1. Equilíbrio
      1. Descongelar tampão de equilíbrio de SDS (8 ml por tira, 6 M de ureia, 30% glicerol, 2% SDS). Pesar ditiotreitol (DTT; 10 mg de DTT por 1 ml de tampão de equilíbrio SDS). Dissolve-se TDT em 4 ml de tampão de equilíbrio de SDS.
      2. Pesar IAA (iodoacetamida, 25 mg de IAA por 1 ml de tampão de equilíbrio SDS).Dissolver IAA em 4 ml de tampão de equilíbrio de SDS.
      3. Melt 1 ml de solução de agarose de vedação em um banho de água para uso posterior.
      4. Se as tiras foram congelados, permitir-lhes para descongelar completamente. Coloque tiras lado gel-se na bandeja de reswelling. Adicionar 4 ml de tampão de equilíbrio de SDS com DTT a cada tira e incubar durante 15 min com agitação suave.
      5. Deitar fora todo o tampão de equilíbrio SDS com a TDT. Adicionar 4 ml de tampão de equilíbrio com IAA SDS a cada tira e incubar durante mais 15 min com agitação suave. Após o equilíbrio com o tampão de IAA, derrame do tampão de equilíbrio de SDS.
    2. SDS-PAGE
      1. Desembrulhar mini-géis, retire o pente e lavar o gel e os poços com DDH 2 O. Remover a fita branca na parte inferior do gel antes de executar. Orientar a tira no gel corretamente, orientação gel é fundamental para o corte local.
      2. Coloque o plano gel no contador com a pequena placa de cima e de cima gel de frente experimenter. Colocar a tira sobre a placa de extremidade de altura com anódica (++ terminar com o código de barras) voltado para o lado esquerdo do gel. Usando uma régua, empurrar lentamente a tira para baixo na superfície gel. Evite bolhas de interceptação entre a tira eo gel. Suportar o gel em uma posição placa de vidro.
      3. Adicionar 1 ml de solução de agarose quente para selagem da abertura da cassete. Certifique-se de todas as bolhas de ar são pressionadas para fora usando uma régua plana. Montar o aparelho de funcionar e o gel a uma constante de 125 V durante 90 min.
      4. Quando o gel termina a execução, coloque o gel em um imager biomolecular com 2 ml DDH 2 O e digitalizar o gel em modo de aquisição de fluorescência com 635 nm laser de excitação e 665 filtro de emissão nm.
    3. fosfoproteína coloração
      1. Corrigir o gel com 50% de metanol e 10% de mistura de ácido acético (10 ml) durante 30 min, duas vezes. Lava-se com 10 ml de água durante 10 minutos e três vezes com 10 ml de mancha fosfoproteína mancha por 60 - 90 min, seguido peladescoloração com 10 ml destain solução para 30 min três vezes.
      2. Lavar com 10 ml de água a 5 min duas vezes e imagem do gel com um scanner de gel de laser a 532 nm / 560 nm excitação / emissão.
    4. Proteína Digestão e Identificação
      1. Especial de consumo de todos os pontos de proteínas diferencialmente expressas a partir do gel em poços de microplacas utilizando um local-robot de recolha de acordo com as especificações do fabricante, e adicionar bicarbonato de amónio 100 mM (2 mL) durante 1 hora à TA a Destain os pedaços de gel. Desidratar com 2 ml de 100% de acetonitrilo lavar duas vezes e seco num concentrador de vácuo durante 30 min.
      2. Re-hidratar os pedaços de gel com 100 ul de 13 ng / mL de tripsina porcina modificado em bicarbonato de amónio 50 mM durante 16 horas a 37 ° C. Recolhe-se os sobrenadantes e extrai-se ainda mais as proteínas com 100 ul de ácido trifluoroacético a 5% em 50% de acetonitrilo durante 30 min.
      3. Concentra-se os péptidos para baixo para 5 ul por centrifugação de vácuo concentrador e analisar com Matrix Assisted Laser dessorção de ionização - Time of Flight - tandem análise de espectrometria de massa (MALDI TOF-MS / MS) 17.

7. In Vitro Ensaio de Quinase

  1. Preparação de Substratos
    1. Sub-clone de complexo I (CI) subunidades (NDUFV1, NDUFV3, NDUFS2, NDUFB6, e NDUFA12), que são identificados como alvos diferencialmente fosforilados CDK1, em pGEX-5X-1 para gerar vector de glutationa-S-transferase (GST) tagged plasmídeos de expressão bacteriana 11. Purifica-se subunidades CI Utilizando as colunas de afinidade de glutationa alta seguindo o protocolo abaixo.
      1. Cultura de GST-tagged subunidade CI contendo Escherichia coli estirpe BL-21 em caldo com 50 ug / ml de ampicilina num agitador a 37 ° C de Luria-Bertani (LB) até uma densidade óptica (DO) de 0,6 foi atingido. Adicionar isopropil-BD-tio-galactopiranósido (IPTG) ao cultoure, a uma concentração final de 0,1 mM, e incubar durante mais 3 horas.
      2. Centrifuga-se a 600 xg durante 10 minutos para recolher as bactérias e re-suspensão em 5 ml de tampão 1 x PBS contendo 5 mM de DTT, 1 x cocktail inibidor de proteinase, e 0,1% de lisozima. Lisar as células por sonicação durante 5 s vinte rajadas, e remover os restos celulares por centrifugação a 600 xg durante 10 min.
      3. Recolhe-se o sobrenadante e incubar com 4B de glutationa-agarose em uma proporção em volume de 4: 1 (sobrenadante: grânulo) durante 1 h à TA.
      4. Elui-se as proteínas de fusão com GST a partir dos grânulos com 3 ml de tampão de glutationa de eluição (10 mM de glutationa reduzida em mM Tris-HCl, pH 8,0 a 50) e sujeitar as proteínas eluidas a diálise em tubo de membrana porosa molecular (cut-off de peso molecular 12 -14 quilodaltons) com EDTA 1 x PBS / 1 mM. Armazenar as proteínas purificadas a - 80 o C.
  2. Cdk1 Kinase Assay
    1. Antes de iniciar o rabo quinaseay, definir blocos de aquecimento a 30 ° C e 100 ° C. Thaw CyclinB1 / complexo comercial enzima Cdk1 e substratos no gelo.
    2. Preparar a mistura de reacção em gelo. Desde 32 P ATP isótopo está envolvido, preparar todas as misturas de reacção em tubos de 1,5 ml da amostra com tampas de rosca contendo um anel O para evitar a disseminação da radioatividade.
      Cuidado: Siga as regras de protecção de material radioativo. Use um de 8 mm de espessura Plexiglas Blindagem e de trabalho, pelo menos, à distância de um braço. Limpe qualquer área contaminada com água.
    3. Preparar um tampão de reacção de 30 ul contendo 1 x tampão de Cdk1 (Tris-HCl 50, MgCl2 10 mM, DTT 2 mM, EGTA 1 mM, 0,01% Brij 35, pH 7,5), 0,6 mM de ATP frio, 0,1 uCi de 32 P ATP, 2 unidades de CyclinB1 / Cdk1 e 6 ug de proteína de substrato. Ajuste o volume para 30 mL com DDH 2 O. Por reacção de controlo positiva, substituir o substrato com 0,01 mM histona H1, um CyclinB1 / substrato Cdk1 bem conhecido.
      1. Para contro negativoreacções l, (1) substituir o substrato, com apenas proteína GST e (2) substituir o substrato com 0,01 mM de Histona H1 + 0,5 fiM RO-3306, um inibidor selectivo Cdk1.
    4. Misturar bem com pipeta e centrifugar para levar o líquido para o fundo do tubo, minimizando o risco de contaminação. Incubar a 30 ° C durante 60 min.
    5. Adicionar 6 ul de tampão de amostra de SDS 5x para parar a reacção e desnaturar a 100 o C durante 10 min. Executar amostras em gel de SDS-PAGE a 10% a 160 V durante 2 horas, ou até a frente do corante atingiu a extremidade do gel. Transferir gel num papel de cromatografia e embrulhe com filme plástico.
      Atenção: Todos os líquidos em contacto com radioisótopos devem ser tratados como resíduos radioactivos e eliminados de um garrafão de 5 litros poli fornecida pelos serviços de saúde e de segurança ambiental conforme as diretrizes institucionais.
    6. Expor o gel a película de raios X durante 1 dia ou até uma semana à temperatura de -20 ° C, dependendo da actividade específica do radioisótopo usadoe a enzima.

8. mutagénese dirigida para gerar Dominante Cdk1 Negativo (D146N)

  1. primers projeto mutagênese; dois iniciadores, complementares uns aos outros, contendo o sítio mutante (L será substituído por um nucleótido de codificar para N em vez de D aminoácido) flanqueada por 20 bases de cada lado 11.
  2. Prepara-se uma 50 ul de Reacção em Cadeia da Polimerase (PCR) de uma mistura contendo 1x tampão de reacção, dNTP 2,5 mM, 10 uM de iniciadores (tanto para a frente e para trás), 40 ng do modelo, e ddH 2 O. Adicionar 2,5 L de polimerase de ADN na reacção.
  3. Executar o seguinte programa de PCR: 95 ° C 3 min, 95 ° C 30 seg, 55 ° C 30 min, 68 ° C 6 min; 16 ciclos (Nota: 68 ° C tempo de incubação é determinado pelo tamanho do DNA 1 min / kb é necessário para ADN ≤ 10 kB para o ADN maior, 2 min / kb, mais 10 segundos por ciclo..). Siga pela 68 ° C 7 min e mantenha a 4 ° C até que esteja pronto para uso.
  4. Adicionar2 ul da enzima de restrição Dpnl (10 U / ul) e 5,7 ul de tampão Dpnl, misturar bem com toque suave com o dedo e incubar a reacção a 37 ° C durante 1 h.
  5. Transferir 10 uL Dpnl-tratados produtos de PCR em 50 ul de células competentes DH5a para transformação. Incubar em gelo durante 30 min, seguido por 45 segundos de choque térmico a 42 ° C e 5 min em gelo. Adicionar 500 mL de LB e agitar a 37 ° C durante 1 hora antes do plaqueamento em placas de LB-agar. Incubar O / N a 37 o C.
  6. Escolha uma colônia do O / N crescido placas de agar utilizando uma ponta de pipeta amarela estéril, gota a ponta para um tubo contendo 5 ml de LB, e crescer O / N em um C shaker 37 o. Isolar o plasmídeo utilizando um kit de miniprep e a sequência do plasmídeo para confirmar a mutação de acordo com o protocolo do fabricante.

9. Determinação da Fase do Ciclo Celular comprimentos com EdU Ensaio de Incorporação

  1. Separação celular
    1. Transfect 2 x 10 5 células com vectores indicados (MTS-GFP / RFP, MTS-CyclinB1-GFP / Cdk1-WT-RFP ou MTS-Cdk1-DN-RFP) numa placa de 6 poços utilizando 1: 2 (w: v , 2,5 g: 5 ul) proporção de DNA: Transfection Reagent mistura preparada em 2,5 ml sérica e antibiótico meios de cultura livre para 48 horas. células de ordenação ao vivo expressando estavelmente as proteínas CyclinB1-GFP marcado Cdk1 e marcou-RFP através de citometria de fluxo.
      1. Lavar as células com 1 x PBS, adicionar 100 uL de tripsina para o prato e incubar a 37 ° C durante 5 min. Adicionar 2 ml de meio de cultura para recolher as células e passá-los através de um filtro de 70 | iM para gerar uma suspensão de célula única. Lava-se a suspensão de células individuais com 500 ul de 1% de soro fetal de vitela em PBS (FCS / PBS) antes de colocá-los no citómetro de fluxo.
      2. Configurar os parâmetros de classificação seguintes protocolos estabelecidos 18 gating para células duplamente positivas coradas com ambos GFP e RFP. Recolher as células ordenadas saindo do citômetro em um tubo contaimédio e cultura de células ning usar essas células para análise da progressão do ciclo celular com rotulagem EdU pulse-chase como no protocolo 9.2.
  2. Medição da duração do ciclo celular utilizando o ensaio de citometria de fluxo EdU Etiquetagem
    1. Semear as células classificados em placas de 6 poços a uma densidade de 2,5 x 10 5 células por poço e cultura O / N a 37 ° C numa incubadora com CO 2. Adicionar EdU para o meio de cultura a uma concentração final de 25 uM. Incubar a 37 ° C numa incubadora de CO 2 durante 1 h.
    2. Lavar as células com 1% de BSA em 500 ul de PBS e recolhê-las em um tubo de 1,5 mL em intervalos de 2 horas para um total de 10 - 12 h.
    3. centrifugar células a 350 xg durante 5 minutos, descarta-se o sobrenadante. Desalojar o sedimento através da adição de 100 ul de solução de fixação (fornecida pelo fabricante, com o kit de marcação de EdU) durante 15 min à temperatura ambiente e misture bem.
    4. Lavar as células com 1 ml de 1% de BSA em PBS três vezes. corrigir océlulas de novo com 0,5 ml de etanol a 70% O / N a 4 o C.
      Nota: fixação Etanol é fundamental para extinguir a fluorescência da GFP / RFP interna devido à expressão da proteína recombinante marcado.
    5. Centrifugar as células novamente em 350 xg durante 5 min e lava-se a pelete com 1 ml de 1% de BSA em PBS uma vez. Re-suspender as células em 1 ml de tampão de permeabilização (0,1% de Triton-X-100, 1% de BSA, 0,2 mg / ml de RNase A em PBS) durante 20 min à TA.
    6. Lavar as células com 1 ml de 1% de BSA em PBS uma vez. Adicionar 0,5 ml de mistura de reacção em cada tubo e misturar bem. Incubar mistura reaccional à TA durante 30 min no escuro.
    7. Lava-se com 1 ml de BSA a 1% em PBS e uma vez com ADN mancha 50 ug / mL de iodeto de propídio (PI) em 1 ml de 1% de BSA em PBS.
    8. Analisar as células por citometria de fluxo a seguir a população EDU-positiva. gráfico de dispersão de pontos presente de células EDU-rotulados coradas para conteúdo de DNA (coloração PI, eixo X) e Edu (Alexa 647 de coloração, eixo Y).
      1. Use canal APC para Alexa647-EDU utilizando um filtro de passagem de banda 670/30 com todos os presentes luz inferior a 685 nm atingir esse filtro; e ficoeritrina (PE) para o canal de PI com um filtro passa-banda de 581/15 em frente do mesmo com toda a luz presente menos do que 600 nm atingir esse filtro.
      2. Insira as primeiras células do tubo contendo na citometria de fluxo e usar uma estratégia de gating padrão para aquisição: Lote FSC-Area X SSC-área para a morfologia seguido de PI (canal PE) X Alexa647-EDU (canal APC) para a coloração celular. Gravar dados para todos os tubos, um por um aquisição de 10.000 eventos por amostra.
      3. Determinar a distribuição de fases do ciclo celular das células e comprimentos de fase utilizando um software de análise de citometria de fluxo de dados de acordo com protocolos estabelecidos 11,30.

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Representative Results

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Localização sub-mitocondrial de CyclinB1 e Cdk1

extracção de carbonato de sódio é usado para determinar se uma proteína está localizada no interior da mitocôndria ou na superfície exterior, ou seja, da membrana externa. Uma vez que uma proteína é mostrada para localizar dentro da mitocôndria, nova determinação da localização sub-mitocondrial pode ser feita através de mitoplasting combinado com digestão com protease. Para especificar a localização sub-mitocondrial de CyclinB1 ou Cdk1, mitoplasts foram isolados por diluição de mitocôndrias nos buffers hipotónicas com concentrações decrescentes de sacarose a osmótica de 200 mM a 25 mM. A membrana externa começa a romper-se a 150 mM de sacarose, enquanto a membrana interna permanece intacta até que a concentração final a 25 mM de sacarose (Figura 1A). Em combinação com mitoplasting, ensaio de protecção de proteases pode ser realizada utilizando Trypspara digerir proteínas expostas após ruptura da membrana exterior. Isto irá resultar na digestão de proteínas espaço intermembranar. Se a proteína de interesse é protegida contra a digestão com tripsina, isso indica a localização da matriz mitocondrial da proteína. Nesta figura representativa, proteína da matriz mitocondrial Hsp60, e proteína espaço intermembranar Timm13 foram utilizados como marcadores de localização sub-mitocondrial. Semelhante com Hsp60, mas ao contrário Timm13, CyclinB1 Cdk1 e foram protegidos contra a digestão com tripsina, indicando a sua localização matriz mitocondrial (Figura 1B).

Expressão de MTS-mitocondrial e CyclinB1 marcado com GFP e CDK1 Proteínas

MTS é clonado em enquadramento na extremidade N-terminal ou de genes CyclinB1 CDK1, que tem GFP ou RFP etiquetas na sua extremidade C-terminal. A proteína recombinante resultante é segmentada por mitocôndrias GFP ou com etiquetas-RFP CyclinB1 ou Cdk1. A lista das construções produzidas e utilizadas neste estudo é mostrado na figura. Usando estas construções, a sobreexpressão de CyclinB1 e / ou Cdk1 na mitocôndria foi alcançado, mostrado aqui por transferência de Western das fracções mitocondriais isoladas (Figura 2).

Os alvos mitocondriais potenciais de CyclinB1 / Cdk1 Determinado pelo 2D DIGE

Cdk1 pertence à serina / treonina (S / T) da família cinase catalisa a transferência de fosfato a partir de ATP a prolina (P) orientada resíduos de S ou T. Uma mutação pontual que substitui um resíduo de aspartato (D) com a asparagina (N) na posição 146 de Cdk1 (D146N) gera um negativo dominante (DN) Cdk1 mutante 19. Para estudar a função de Cdk1 mitocondrial, uma proteína Cdk1-DN-alvo a mitocôndria foi gerado através da construção de um plasmídeo (pERFP-N1-MTS-Cdk1-DN), que contém um ácido amino-lon 29g sequência de direccionamento mitocondrial (MTS) derivada da subunidade VIII da citocromo C oxidase humano ligado a uma RFP marcado com DN-Cdk1. pERFP-N1-MTS produzir proteína ERFP mitocôndrias-alvo foi usado como um controle do vetor vazio. fosfoproteínas mitocondrial em G2 / M células transfectadas com ambas as construções foram perfilado por análise em gel de 2D com pH 4-10 tiras de gel. Em comparação com os transfectantes vector vazio (Figura 3, painel superior), um grupo de fosfoproteínas mitocondrial foi aparentemente ausente ou diminuído na Cdk1-DN transfectantes (Figura 3, painel inferior). A análise por espectrometria de massa dos pontos detectados determinada a identidade das proteínas fosforiladas por Cdk1 nas mitocôndrias.

Progressão do ciclo celular e determinação da fase Lengths com Ensaio EdU Pulso-chase

Para investigar a progressão do ciclo celular wheN CyclinB1 mitocondrial / CDK1 níveis são aumentados, uma experiência de marcação pulse-chase usando um análogo da timidina, etinilo desoxiuridina (EdU) foi realizada para identificar a população de células que sofrem a síntese de ADN 20. Este método permite a visualização do ciclo celular capturado sobre uma janela de 22 horas, acompanhando a população EDU-positivo quando as células progredir através S e G2 / M fases e se acumulam na fase G1. Os resultados mostram que as células em fase S marcadas progredido através da fase G2 / M e apareceu em fase G1 tão rápido quanto 4 h em células que expressam o tipo selvagem CyclinB1 mitocondrial / Cdk1, em comparação com 6 h em células transfectadas com um controlo de vector ou CyclinB1 mutante / Cdk1 (Figura 4A), indicando que o aumento de CyclinB1 mitocondrial / CDK1 acelera a progressão do ciclo celular.

figura 1
Figura 1. mitocondrial CyclinB1 / CDK1 localiza na Matriz. (AB)-Sub mitocondrial localização de CyclinB1 e Cdk1 detectados pelo mitoplasting e ensaio de protecção de protease, figura foi modificado a partir Wang et al., 2014 11. O total (T), sedimento (P), e as fracções de sobrenadante (S) foram submetidas a análise de transferência de Western com os anticorpos indicados. TIMM13 (uma proteína inter-espaço), e HSP60 (a proteína de matriz). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. Expressão de Construções de CDK1 mitocondriais. Transferência de Western de fracções mitocondriais isoladas a partir de células transfectadas com CyclinB1-alvo a mitocôndria e / ou do tipo selvagem ou mutante negativo dominante Cdk1 (plasmídeos estão indicados na parte inferior 11. os vetores pERFP-N1-MTS pEGFP-N1-MTS e foram os controles vazios vetor para MTS-CyclinB1 e MTS-Cdk1 respectivamente). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. Potenciais mitocondriais Substratos de Cdk1. Proteínas mitocondriais extraídos de células / M-peaked G2 transfectadas com alvo-mitocôndrias vazio vetor (pERFP-N1-MTS, painel superior) ou Cdk1 mutante (pERFP-N1-MTS-Cdk1-dn, painel inferior) foram marcadas com Cy5 (verde), separados por electroforese em gel 2-D e as proteínas fosforiladas foram coradas com corante fosfoproteína (vermelho). Este valor foi modificado a partir de Wang et al. 2014 11."> Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4. mitocondrial Cdk1 Melhora G2 / M Transição e Ciclo de Progressão geral.
análise do ciclo celular com rotulagem EdU pulse-chase. histogramas gráfico de dispersão de células EDU-rotulados foram atraídos para conteúdo de DNA (eixo X) e Edu (eixo Y). Os valores mais baixos em cada painel mostram a intensidade de fluorescência média do EdU núcleos marcados. Os pontos de tempo foram indicados em h após o pulso EdU 11. Para todos os pontos temporais, portões exibindo as seguintes populações foram sorteados: G0 / G1, S e G2 / M. Para os momentos de 6, 8 e 10 h, educação etiquetado G1 *, S / G2 *, e G2 / M * populações são mostrados. Este valor foi modificado a partir de Wang et al., 2014 11. Por favor cliqueaqui para ver uma versão maior desta figura.

As concentrações de sacarose Usados
Sem tripsina 25 mM 50 mM 100 mM 150 mM 200 mM
+ tripsina 25 mM 50 mM 100 mM 150 mM 200 mM

Tabela 1. hipotônicas sacarose buffers usados ​​para o Passo 4.2

Passo 1 30 V 12 hr Passo and Hold
Passo 2 300 V 0,5 hr Passo and Hold
Passo 3 1.000 V 0,5 hr Gradiente
5.000 V 1.33 hr Gradiente
passo 5 5.000 V 20.000 V hr Passo and Hold

Tabela 2. Protocolo Isoeléctrico utilizados no passo 6.4.5

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Discussion

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Como as proteínas destinadas para outros organelos subcelulares, proteínas mitocondriais possuem sinais alvo específicas no interior da sua estrutura primária ou secundária que os dirigem para o organelo, com a assistência de translocação de proteína elaborada e máquinas de dobragem 21,22. As mitocôndrias sequências de direccionamento (MTS) obtidos a partir de proteínas residentes exclusivamente mitocondriais tais como COX8 pode ser adicionado ao terminal-N de qualquer sequência de genes para proteínas alvo específicas para a mitocôndria 11,23,24. Aqui, genes CyclinB1 e CDK1 foram clonados em MTS COX8 contendo vetores e sobre a expressão, o CyclinB1 recombinante e Cdk1 foram localizadas nas mitocôndrias. A vantagem desta abordagem é que ela permite que a modificação da expressão de genes num compartimento subcelular particular, neste caso mitocôndrias, sem alterar a expressão de genes em geral. Com esta estratégia, as mitocôndrias-específicas funções de uma quinase nuclear, Cdk1 foram deminado. Da mesma forma, adicionando MTS a um Cdk1 dominante negativo, derrubar as funções específicas de mitocôndrias de Cdk1 foi alcançado, o que permitiu a identificação das mitocôndrias objectivos específicos do Cdk1, e possibilitou a análise das consequências funcionais de ausência mitocondrial da função Cdk1. Superexpressão de Cdk1 sem a etiqueta de resultados do STM em maior expressão da Cdk1 em ambas as mitocôndrias e núcleos, e, portanto, dificulta as investigações adicionais sobre as consequências das ações específicas de mitocôndrias de Cdk1.

No entanto, esta abordagem pode não ser adequado para todos os produtos de genes, temos experimentado algumas falhas na tentativa de realocar alguns quinases na mitocôndria através da adição de MTS tag. Algumas linhas celulares podem ser bastante resistentes a transfecção, e encontrar o protocolo óptimo pode ser demorado. Mesmo quando as células saudáveis ​​e a transfecção bem sucedida é, trabalhar com proteínas fluorescentes com etiquetas apresenta alguns problemas SUCH como agregação, localização incorrecta, fusões não-funcionais, e os sinais fracos.

As principais limitações do isolamento de mitocôndrias e mitoplasts incluem o baixo rendimento e possível contaminação de outros compartimentos celulares ou sub-mitocondriais. Sugere-se que as células aderentes não são rompidos de forma eficiente por meio de métodos químicos ou mecânicos convencionais, por conseguinte, tornando-se difícil obter grandes quantidades de mitocôndrias de células aderentes em cultura. Aqui, utilizamos culturas aderentes de células MCF10A. Para se obter cerca de 30 - 50 ^ g de proteína mitocondrial, uma quantidade inicial de 3-5 x 10 7 células foram utilizadas. O passo de homogeneização é outro ponto crítico para o rendimento final das preparações mitocondriais. Dependendo das linhas celulares utilizadas, o número de acidentes vasculares cerebrais e / ou o tempo de homogeneização podem variar. Para as células MCF10A, observamos que 10 min de homogeneização por homogeneizador de vidro / vidro é necessária, enquanto rato fibrobla embrionáriasSTS (MEF) necessária apenas 3-5 min da homogeneização. Desde homogeneização excessiva pode causar danos à membrana mitocondrial e desencadear a libertação de componentes mitocondriais, as condições padrão para cada linha de células deve ser determinado por experiência. O uso de um homogeneizador de vidro-vidro aumenta o rendimento das preparações mitocondriais, em comparação com homogeneizadores de vidro / teflon. A quantidade inicial de células, bem como de congelação / descongelação das células pode alterar o número de pancadas necessárias para quebrar as células. Finalmente, a desnaturação e agregação das proteínas pode ocorrer devido a um aquecimento localizado da amostra durante a homogeneização. É, portanto, essencial para pré-arrefecer o moinho de tecido e manter as amostras em gelo durante este procedimento.

Outro método apresentado neste artigo é a utilização de rotulagem EdU para monitorizar ciclo celular em tempo real. EdU é um análogo da timidina modificada que é marcado por fluorescência com um, fotoestável corante Alexa Fluor brilhante. EdU é eficientemente incorporada no ADN recentemente sintetizado. Este método é uma alternativa melhor para a utilização de rotulagem tradicional de proliferação de células com o análogo de nucleósido, bromodesoxiuridina (BrdU). BrdU é incorporada no ADN durante a síntese de ADN activa. A quantificação de ADN marcadas com BrdU requer desnaturação do DNA por métodos relativamente severas, tais como calor ou alta acidez elevada para expor as moléculas de BrdU para a ligação do anticorpo BrdU. O tratamento dura para desnaturação de ADN podem afetar a qualidade da amostra e é demorado. Com edu, detergente permeabilização é geralmente suficiente para o reagente de detecção EdU para ter acesso ao DNA. Sem a necessidade de utilizar produtos químicos ou calor para o acesso de DNA, o método EdU é mais fácil de usar, mais precisos e consistentes. Para além das vantagens EdU fornece, tem havido algumas preocupações sobre o uso de EdU para estudar a proliferação. EdU mostrou uma actividade anti-proliferativa em ligeiro tratamentos ao longo de 72 h, o que pode ser reduzido a neglníveis igible quando pulso EdU foi mantida em 1 h 25.

Uma modificação empregada com rotulagem EdU é o tempo de fixação e método. O kit sugeriu uma fixação 15 min com a solução de fixação fornecida. No entanto, uma fixação adicional com 70% de etanol foi utilizada nesta experiência. Há duas razões para a utilização de etanol: 1) para seguir a progressão do ciclo celular ao longo do tempo, um experimento ponto de tempo foi realizada, em que as células foram recolhidas a cada 2 h. As células foram mantidas em 70% de etanol a 4 ° C até que todos os pontos de tempo experimentais foram concluídos. Na verdade, as células podem ser mantidas em 70% de etanol por longos (várias semanas ou meses), se necessário. 2) As células utilizadas para a experiência foram estavelmente transfectadas com Cdk1 GFP e / ou CyclinB1 RFP-tag. Para separar os sinais de Edu e PI a partir de GFP / RFP fluorescência, a fixação de etanol foi utilizado para desnaturar as proteínas GFP e RFP, e, portanto, saciar a sua fluorescência antes de realizar o EdU umPI coloração d. Proteínas GFP / RFP desnaturadas são essencialmente totalmente não-fluorescente, presumivelmente porque o cromóforo não é mais protegido de têmpera 26,27.

Para identificar alvos mitocondriais de Cdk1, foi utilizado o método de 2D-DIGE, o que é superior aos géis 2D tradicionais de muitas maneiras. Em 2D-DIGE, corantes fluorescentes distintos, por exemplo, Cy 3, 5 e 2, são usados ​​para amostras de etiquetas, o que permite a execução de até 3 amostras num gel, a redução da variabilidade, sem a necessidade de executar repetições como em gel de 2D padrão. Os corantes fluorescentes utilizados em 2D-DIGE têm uma sensibilidade muito elevada de 0,2 ng / local em comparação com a de corantes de trifenilmetano a 100 ng / local, portanto, o que requer uma quantidade menor de proteínas de executar sobre os géis 2D-DIGE com resolução alta local e publicação scans de gel de qualidade. Um software automatizado é utilizado para detectar, quantificar e definir proteínas diferencialmente expressas. Por causa da alta resolução de ponto, a expressão diferencial de proteínas em amostras de can ser comparado com precisão usando a quantificação local auxiliados por software; uma diferença tão baixo quanto 10% pode ser detectada através de 2D-DIGE, permitindo a visualização de modificações pós-traducionais facilmente. O uso de software-auxiliada em gel de análise também permite a aquisição de dados mais rápida. No entanto, uma vez que o equipamento, como scanners fluorescentes, são necessários para a aquisição de imagem, a utilização deste método envolve custos adicionais. Outras limitações de 2D-DIGE incluem a fraca representação de proteínas hidrofóbicas, bem como proteínas com pontos isoeléctricos extremas e grandes pesos moleculares 28,29. Uma validação adicional dos resultados obtidos com o 2D-DIGE utilizando técnicas alternativas, tais como imunocitoquímica ou Western blot é necessária para confirmar a novas descobertas.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
32P ATP  PerkinElmer BLU002001MC 
Anti-mouse secondary antibody Invitrogen  A-11003 Alexa-546 conjugated
Anti-rabbit secondary antibody Invitrogen  A11029 Alexa-488 conjugated
ATP Research Organics 1166A For in vitro kinase assay
Cdk1 antibody Cell Signaling Technology 9112
Cdk1 kinase buffer New England Biolabs P6020S
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit Life Technologies C10337 For cell cycle analysis with EdU labeling
COX IV antibody Cell Signaling Technology 4844S For mitochondrial immunostaining
Cyclin B1 antibody Santa Cruz Biotech sc-752
CyclinB1/Cdk1 enzyme complex New England Biolabs P6020S Avoid freeze/thaw
CyDye DIGE Fluor Labeling Kit GE Healthcare Life Sciences 25-8009-83
DIGE Gel and DIGE Buffer Kit GE Healthcare Life Sciences 28-9480-26 AA
Dimethylformamide  Sigma Aldrich 319937 DMF
Dithiothreitol Bio-Rad 161-0611 DTT
dNTP EMD Millipore 71004 For site-directed mutagenesis
Dpn I enzyme Stratagene 200519-53 For site-directed mutagenesis
Dry Strip cover fluid GE Healthcare Life Sciences 17-1335-01 Used as mineral oil
EDTA J.T. Baker 4040-03
EGTA Acros Organics 409910250
Eppendorf Vacufuge Concentrator Fisher Scientific 07-748-13 Used as vacuum centrifuge concentrator
Fluoromount G Southern Biotech 0100-01 Anti-fade mounting solution
Fortessa Flow Cytometer BD Biosciences 649908 For cell cycle analysis with EdU labeling
Histone H1 Calbiochem 382150 For in vitro kinase assay
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704 For purifying DNA fragments from agarose gels
Immobiline DryStrip Gels GE Healthcare Life Sciences 18-1016-61 IEF (isoelectric focusing) strips
Immobilized Glutathione Thermo Scientific 15160 Glutathione-agarose beads
Iodoacetamide Sigma Aldrich I1149 IAA
IPGphor 3 Isoelectric Focusing Unit GE Healthcare Life Sciences 11-0033-64 IPGphor strip holders
Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside  RPI Corp 156000-5.0 IPTG
Leupeptin Sigma Aldrich L9783 For cell lysis buffer
Lipofectamine 2000 Life Technologies 11668027 Transfection reagent
Lysine Sigma Aldrich L5501 For CyDye labeling
Lysozyme EMD Chemicals 5960
Mitoctracker Red/Green Invitrogen  M7512/M7514 Mitochondrial fluorescent dyes
MOPS EMD Chemicals 6310
pEGFP-N1 Clonetech 6085-1 GFP-expressing vector
Pfu Stratagene 600-255-52
pGEX-5X-1  GE Healthcare Life Sciences 28-9545-53 GST-expressing vector
Phenylmethylsulfonyl fluoride Shelton Scientific IB01090 PMSF
Phosphate buffered saline Life Technologies 14040 PBS
Spectra/Por 4 dialysis tubing Spectrum Labs 132700 as porous membrane tubing for dialysis
Pro-Q Diamond Phosphoprotein Gel Stain Life Technologies P-33300 For staining phosphoproteins on 2D gels
Proteinase inhibitor cocktail Calbiochem 539134 For cell lysis buffer
QuikChange site-directed mutagenesis kit Stratagene 200519-5
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27104 MiniPrep Plasmid Isolation Kit
RO-3306 Alexis Biochemicals 270-463-M001 Cdk1 inhibitor
Rotenone MP Biomedicals 150154 Complex I inhibitor
Sodium carbonate Fisher Scientific S93359
Sodium chloride EMD Chemicals SX0420-5 For cell lysis buffer
Sodium orthovanadate MP Biomedicals 159664 For cell lysis buffer
Sodium pyrophosphate decahydrate Alfa Aesar 33385 For cell lysis buffer
Sodium β-glycerophosphate Alfa Aesar L03425 For cell lysis buffer
SpectraMax M2e  Molecular Devices M2E Microplate reader
Sucrose Fisher Scientific 57-50-1
Tissue Grinder pestle Kimble Chase 885301-0007 For mitochondria isolation
Tissue Grinder tube Kimble Chase 885303-0007 For mitochondria isolation
Trichloroacetic acid solution Sigma Aldrich T0699 TCA
Tris MP Biomedicals 103133
Triton-x-100 Teknova T1105
Trypsin Calbiochem 650211
Typhoon Imager GE Healthcare Life Sciences 28-9558-09 Laser gel scanner fro 2D-DIGE
Ubiquinone Sigma Aldrich C7956

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References

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Abordagens experimentais para estudar mitocondrial Localização e função de um ciclo celular Nuclear Kinase, Cdk1
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Candas, D., Qin, L., Fan, M., Li, J. J. Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1. J. Vis. Exp. (108), e53417, doi:10.3791/53417 (2016).More

Candas, D., Qin, L., Fan, M., Li, J. J. Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1. J. Vis. Exp. (108), e53417, doi:10.3791/53417 (2016).

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