Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

Experimentella metoder för att studera mitokondrie Lokalisering och funktion av en kärnteknisk Cell Cycle kinas, Cdk1

doi: 10.3791/53417 Published: February 25, 2016

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hos däggdjur är cellcykelprogression beroende av höggradigt ordnade händelser som kontrolleras av cykliner och cyklinberoende kinaser (CDK: er) 1. Genom sin cytoplasma, kärnkraft, och centrosomal lokalisering, är CyclinB1 / Cdk1 kunna synkronisera olika händelser i mitos såsom kärnhöljet uppdelning och centrosom separation 2. CyclinB1 / Cdk1 skyddar mitotiska celler mot apoptos 3 och främjar mitokondriell fission, ett viktigt steg för en jämn fördelning av mitokondrier till nybildade dottercellerna 4.

I prolifererande däggdjursceller, är mitokondriella ATP genereras via oxidativ fosforylering (OXPHOS) maskiner (elektrontransportkedja), som består av 5 fler subenhet komplex; komplexa I - komplex V (CI-CV). Nikotinamidadenindinukleotid (NADH): ubikinon oxidoreduktas eller komplexa I (CI) är den största och minst förstådda av de fem komplexen 5. Komplexet consists av 45 subenheter, varav 14 bildar den katalytiska kärnan. En gång monterade, den komplexa antar en L-formad struktur med en arm som skjuter in i matrisen och den andra armen är inbäddad i det inre membranet 6,7. Mutationer i CI subenheter är orsaken till en mängd olika mitokondriella sjukdomar 8. En funktionellt effektiv CI i OXPHOS krävs inte bara för den övergripande mitokondrie andning 9, men även för framgångsrik cellcykelprogression 10. Unravelling mekanismerna bakom hur detta membranbundna enzymkomplexet i hälsa och sjukdom kan möjliggöra utveckling av nya diagnostiska metoder och avancerade terapeutiska strategier. I en nyligen genomförd studie, har vi funnit att CyclinB1 / Cdk1 komplex translokerar till mitokondrier i (Gap 2) G2 / (Mitos) M-fas och fosforylerar CI subenheter att öka mitokondriella energiproduktionen, potentiellt för att kompensera ökade behov av celler energi under cell cykel 11. Här sho viwcase experimentella procedurer och strategier som kan användas för att studera mitokondriella translokation av annars kärn / cytoplasmiska kinaser, deras mitokondriella substrat samt funktionella konsekvenserna av deras mitochondrial lokalisering med hjälp av CyclinB1 / Cdk1 som ett exempel.

Upptäckten att CyclinB1 / Cdk1 komplex translokerar i mitokondrier när det behövs uppmanas studier av mitokondrier specifika uttryck och knockdown av denna komplexa. Att uppnå mitokondrier specifik expression av proteiner, kan en lägga till en mitokondrier målsekvens (MTS) i den N-terminalen av proteinet av intresse. Mitokondrier är inriktade sekvenser tillåter sortering av mitokondriella proteiner i mitokondrierna där de normalt är bosatta 12. Vi har använt en 87 bas mitokondrier targeting sekvens härledd från prekursorn av human cytokrom c oxidas subenhet 8A (COX8) och klonades den in i grönt fluorescerande protein (GFP)-märkt CyclinB1 eller Red FluorescentProtein (RFP)-märkt Cdk1 innehållande plasmider i ram. Denna metod tillät oss att rikta CyclinB1 och Cdk1 in i mitokondrierna, specifikt förändras den mitokondriella expression av dessa proteiner utan att påverka deras nukleära pool. Genom fluorescerande märka dessa proteiner, kunde vi följa deras lokalisering i realtid. På samma sätt har vi infört MTS i en plasmid innehållande RFP-märkta negativ dominant Cdk1, som tillät oss att specifikt slå ner den mitokondriella uttryck och funktioner Cdk1. Det är väsentligt att skilja mellan mitokondriella och nukleära funktionerna hos de kinaser som har dubbla lokaliseringar som Cdk1. Engineering MTS till N-terminalen av dessa dubbla funktionella kinaser har en bra strategi som är lätt att vara anställd och effektiv.

Eftersom Cdk1 är en cellcykel kinas, är det fundamentalt för att bestämma cellcykelprogression när Cdk1 är lokaliserad i mitokondrier. För att uppnå detta har vi använt en ny metod för att övervaka DNA-innehållet i celler. Traditionella metoder innefattar användning av BrdU (bromdeoxiuridin), en syntetisk tymidin-analog, som inkorporerar in i det nyligen syntetiserade DNA under S-fasen av cellcykeln för att ersätta tymidin. Då cellerna som aktivt replikerande deras DNA kan detekteras med användning av anti-BrdU-antikroppar. En nackdel med denna metod är att den kräver denaturering av DNA för att ge tillträde för BrdU antikropp genom hårda metoder som syra eller värmebehandling, vilket kan resultera i inkonsekvens mellan resultat 13,14. Alternativt, utnyttjade vi en liknande metod för att övervaka aktivt delande celler med olika tymidinanalog, edu. Edu detektion kräver inte hårda DNA denaturering som mild behandling tvättmedel möjliggör detektion reagens för att komma åt edu i nyligen syntetiserade DNA. ENE metoden har visat sig vara mer tillförlitlig, konsekvent och med potential för hög genomströmning analys 15.

Slutligen to bestämma mitokondriella substrat av Cdk1 använde vi ett proteomik verktyg som heter 2D-DIGE, som är en avancerad version av klassiska tvådimensionell gelelektrofores. Tvådimensionell elektrofores separerar proteiner i enlighet med deras isoelektriska punkt i den första dimensionen och molekylvikt i den andra. Eftersom posttranslationella modifieringar såsom fosforylering påverkar den isoelektriska punkten och molekylvikten av proteinerna, kan 2D-geler detektera skillnaderna mellan fosforyleringsställen tillstånden hos proteiner i olika prover. Storleken (area och intensitet) av proteinfläckar förändringar med expressionsnivån av proteiner, vilket möjliggör kvantitativ jämförelse mellan multipla prover. Med denna metod kunde vi skilja fosforylerade proteiner i vildtyp kontra muterade mitokondrier riktade CDK1 uttryckande celler. De specifika proteinfläckar som visade i vildtypen men saknades i mitokondrierna inriktade mutant Cdk1 förberedelse isolerades ochidentifieras via masspektrometri.

I traditionella 2D geler är trifenylmetanpigment färgämnen används för att visualisera proteinerna på gelén. 2D-DIGE använder fluorescerande protein etiketter med minimal effekt på protein elektro rörlighet. Olika proteinprover kan märkas med olika fluorescerande färgämnen, blandade med varandra och separerade av de identiska geler, vilket gör att samtidig elektrofores av flera prover på en enda gel 16. Detta minimerar de gel-till-gel-variationer, vilket är ett kritiskt problem i gelbaserade proteomikstudier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Isolering av mitokondrier från odlade celler

  1. Framställning av isoleringsbuffert för Cells (IBC) Buffert
    1. Förbered 0,1 M Tris / MOPS (tris (hydroximetyl) aminometan / 3- (N morfolino) propansulfonsyra): Lös 12,1 g Tris i 800 ml destillerat vatten, justera pH till 7,4 med MOPS pulver, tillsätt destillerat vatten till en total volym av en L och förvara vid 4 ° C.
    2. Förbered 0,1 M EGTA (etylenglykol bis (2-aminoetyl eter) tetraättiksyra) / Tris: Lös 38,1 g EGTA i 800 ml destillerat vatten, justera pH till 7,4 med Tris pulver, tillsätt destillerat vatten till en total volym av 1 L och förvara vid 4 ° C.
    3. Förbered en M Sackaros: Lös 34,23 g sackaros i 100 ml destillerat vatten, göra 20 ml alikvoter och förvara vid -20 ° C
    4. Förbereda IB c buffert: Bered 100 ml IB c buffert genom att tillsätta 10 ml av 0,1 M Tris / MOPS och 1 ml av 0,1 M EGTA / Tris till 20 ml; 1 M sackaros. Tillsätt destillerat vatten till en total volym av 100 ml. Justera pH till 7,4.
  2. Beredning av Cell Lysis Buffer
    1. Förbered lysbuffert innehållande 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA (etylen diamino-tetraättiksyra), 1 mM EGTA, 1% Triton-X-100, 2,5 mM natriumpyrofosfat, 1 mM β- glycerofosfat, 1 mM natriumortovanadat. Lägg proteinasinhibitorer 1 pg / ml leupeptin och 1 mM PMSF (fenylmetylsulfonylfluorid) precis innan användning.
  3. Isolering av mitokondrier
    1. Skörd 3 x 10 7 celler med iskall 1 x PBS (fosfatbuffrad saltlösning), pH 7,4 och centrifugera cellerna vid 600 xg under 10 min vid 4 ° C Kassera supernatanten och återsuspendera pelleten i 5 ml iskall IB c buffert.
    2. Homogenisera cellerna med användning av en glas / glas vävnadskvarn under ca 10 min. Överför homogenatet till ett 15 ml rör och centrifugera vid 600 xg under 10 min vid 4 ° C. För funktionell mitokondrier, använda glas / Teflon koppling eftersom det är mindre skadligt för mitokondrier än glas / glas vävnadskvarn.
    3. Samla upp supernatanten i 1,5 ml rör och centrifugera vid 7000 xg under 10 min vid 4 ° C Överför supernatanten till ett 1,5 ml rör och spara som cytosolen protein.
    4. Tvätta pelleten (mitokondrier) två gånger med 200 | il iskall IB c buffert och centrifugera vid 7000 xg under 10 min vid 4 ° C
    5. Kassera supernatanten och återsuspendera pelleten i cellen lyseringsbuffert och använda den omedelbart eller förvara vid -80 ° C för framtida användning. Om funktionella mitokondrier behövs, återsuspendera pelleten i den återstående bufferten efter kasta supernatanten. Utspädning den mitokondriella fraktionen ytterligare kan resultera i förlust av funktion av mitokondrier. Förvara på is och använda preparatet i 1 - 3 h för bästa resultat.
    6. Sonikera den återsuspenderade pelleten i trettio 3-sek skurar i enisbad, centrifugera vid 10.000 xg under 5 min och spara supernatanten som den mitokondriella fraktionen.

2. Co-immunfärgning av Cdk1, CyclinB1 och COXIV, en mitokondriell Resident Protein

  1. Växa 5 x 10 4 celler på täckglas i 24-brunnars plattor O / N eller upp till 70% sammanflytning. Aspirera mediet och tvätta cellerna två gånger med 500 | il iskall 1 x PBS, pH 7,4.
  2. Fixera cellerna med 500 | il iskall 4% paraformaldehyd vid RT under 10 min. Aspirera fixeringslösningen och tvätta cellerna med 500 ^ il 1 x PBS tre gånger, 5 min vardera med försiktig skakning vid RT.
  3. Permeabilisera cellerna med 0,2% Triton X-100 i 500 | il PBS under 5 min vid RT. Aspirera lösningen och tvätta cellerna 3 gånger, 5 min vardera med 500 ^ il PBS. Lägga den blockerande lösningen (500 | il, 1% BSA (bovint serumalbumin) i PBS innehållande 1% Tween 20) under 30 min vid RT.
  4. Späd de primära antikropparna 1: 250 (volym: volym) i 5001; l av blockeringslösning och inkubera cellerna med önskade primära antikroppar framkallade i olika arter för att undvika kors signalering (CyclinB1 (mus) och COXIV (kanin) eller Cdk1 (mus) och COXIV (kanin) vid RT under 30 till 60 min eller O / N vid 4 ° C
  5. Tvätta täckglasen med 500 | il av 1 x PBS tre gånger, 5 min vardera och sedan inkubera med sekundär antikropp utspädd 1: 1000 i 500 pl blockeringslösning vid RT under 1 h följt av tvättning med 500 pl PBS 3 gånger, 5 min vardera.
  6. Montera täck med 20 pl anti-fade monteringslösning och försegla bilderna med nagellack. Bild bilderna med hjälp av en fluorescerande mikroskop direkt eller hålla i mörker vid 4 ° C under 1 - 2 veckor.

3. Natriumkarbonat Utvinning av Intakt mitokondrier

  1. Växa ungefär 20 x 10 7 celler, skörd, tvätta en gång med PBS och isolera mitokondrierna som beskrivs i avsnitt 1. Dela mitokondrie isolat i två parts före den sista centrifugering för att pelle mitokondrierna (före steg 1.3.4); spara hälften att användas som total mitokondrier (steg 3,2), använd den andra hälften för natriumkarbonat utvinning (efter steg 3,3-3,6) för att separera lösliga och membranbundna proteiner.
  2. Lyse de totala mitokondrier pellets med 30 pl cellysbuffert och lagra lysatet vid -80 ° C tills de användes i immunoblotting.
  3. Tillsätt 250 pl av 0,1 M Na 2 CO 3 (Natriumkarbonat), pH 11,0, till den andra halvan av den mitokondriella pelletten och inkubera på is under 30 min.
  4. Centrifugera vid 100.000 xg under 20 min. Samla supernatanten och fortsätt till steg 3,5. Lyse pelleten med hjälp av 30 pl cellysbuffert och låt ligga som i steg 1.3.6. Förvara vid -80 ° C tills de användes i immunoblotting.
  5. Tillsätt en lika volym av 20% nyligen gjort triklorättiksyra (TCA) till supernatanten för att fälla ut proteinerna och hålla på is under 30 min.
  6. centrifugeuge vid 15.000 xg under 10 min. Kassera supernatanten, lös pelleten i 80 pl av cell-lys-buffert och förvara vid -80 ° C tills de användes i immunoblotting.

4. Separation av inre och yttre membranen hos mitokondrier (Isolering av Mitoplasts)

  1. Växa ungefär 20 x 10 7 celler, skörd, tvätta en gång med PBS och isolera mitokondrierna som beskrivs i avsnitt 1. Separata mitokondriella fraktionerna i 10 lika stora portioner innan den sista centrifugering för att pelletera mitokondrier (före steg 1.3.4).
  2. Upplös varje pellet i 30 | il av den angivna koncentrationen av hypoton sackarosbuffert (1 mM EDTA, 10 mM MOPS / KOH (kaliumhydroxid), pH 7,2; sackaros koncentration som sträcker sig från 25 till 200 mM) med eller utan 50 | j, g / ml trypsin ( se tabell 1) och inkubera 30 min på is.
  3. Tillsätt 3 pl 10 mM PMSF (att nå en slutlig koncentration av 1 mM PMSF) till trypsin innehållande flaskor för att stoppa than trypsin matsmältningen och inkubera på is under 10 minuter.
  4. Centrifugera vid 14.000 xg vid 4 ° C i 10 min. Överför supernatanten till ett nytt rör, lysera pelleten i 30 pl cell-lys-buffert, sonikat som i steg 1.3.6, och förvara vid -80 ° C.

5. Konstruktion av mitokondrier riktade GFP / RFP-märkta CyclinB1 / Cdk1 vektorer och bekräftelse av deras Mitochondrial Lokalisering

  1. Klona mitokondrierna inriktade sekvens (MTS, som härrör från föregångaren till cytokrom c oxidas subenhet 8A (COX8) mellan nukleotiderna 76 - 161) i ramen till N-terminalen av GFP eller RFP på Nhel och BamHI-ställena i pEGFP-N1 eller pERFP -n1 vektorer med användning av standard molekylära kloningstekniker.
  2. När man utformar PCR-primrar för CyclinB1 och CDK1 gener, tillsätt BamHI restriktionsenzymigenkänningsställen (fetstil) till 5 'av de PCR-primers.
    Framåt Cdk1 BamH15 'CAG T GG ATC C AA TGG AAG ATT ATA CCA AAA T
    Omvänd Cdk1 BamH1 5 'CTG T GG ATC C TG CAT CTT CTT AAT CTG ATT
    Framåt CyclinB1 BamH1 5 'ATA TGG ATC CAA TGG CGC TCC GAG TCA
    Omvänd CyclinB1 BamH1 5 'ATA TGG ATC CTG CAC CTT TGC CAC AGC C
  3. Förstärka Cdk1 och CyclinB1 gener som använder dessa primers enligt standardtekniker. Smälta PCR-produkterna med 1 | il av BamHI-restriktionsenzym vid 37 ° C under 2 h. Köra uppslutningsproduktema på en 1% agarosgel. Med användning av ett rakblad, skär de korrekta tänkas hamna DNA-fragment ut och rena DNA från gelén med användning av en gelextraheringskit.
  4. Digest 1 pg av MTS-pEGFP-N1 och MTS-pERFP-N1 plasmider med 1 | il av BamHI-enzym vid 37 ° C under 2 h. Tillsätt 1 pl av Calf-INTEStinal Alkaline Phosphatase (CIP) under 30 min vid 37 ° C. Köra uppslutningsproduktema på en 1% agarosgel och rena linjära plasmider från gel som i steg 5,3.
  5. Inrätta en ligeringsreaktion genom att tillsätta ett pl plasmid från steg 5,4 och 5 pl Cdk1 eller CyclinB1 från steg 5,3 till 3 pl ligasbuffert, 0,5 pl T4-ligas, och 20,5 pl dH 2 O. Inkubera O / N vid 4 ° C.
  6. Transformera Escherichia coli DH5a-kompetenta celler med 10 mikroliter av ligeringsblandningen enligt standardtekniker och växa bakterierna på 10 mg / ml kanamycin-innehållande LB-agarplattor O / N vid 37 ° C för att erhålla kolonier.
  7. Välj ut en koloni från O / N odlas plattor med hjälp av en steril pipett spets, in spetsen i en 5 ml kanamycin-LB-innehållande rör och inkubera O / N. Isolera plasmid med användning miniprep kit enligt tillverkarens protokoll, och sekvensera plasmid med användning av standardtekniker.
  8. Transfektera exponentiellt växande MCF10A-celler (1,5 x 10 4 celler ympades på 96-brunnars plattor) med MTS-Cdk1-RFP eller MTS-CyclinB1-GFP-plasmider från Steg 5,7 genom framställning av en plasmid / transfektionsreagens förhållande av 1: 2 (vikt: vol, 100 ng : 0,2 | il) i 100 | j, l serum- och antibiotikafritt medium.
  9. Inkubera cellerna i plasmid / reagens mix för 48 timmar vid 37 ° C i en CO2-inkubator med fuktstyrning (5% CO2, 95% relativ fuktighet).
  10. Förbereda en mM stamlösning av mitokondriella rött och grönt fluorescerande färgämnen genom att lösa upp 50 jig av pulver i 100 pl DMSO. Späd stamlösningarna 1: 400 i 1 x PBS för erhållande av 2,5 ^ M arbetslösningar. Stamlösningarna kan lagras vid -20 ° C i ett år.
  11. Blanda 2 | il av 2,5 | iM av rött färgämne med 98 | il av odlingsmedium för att framställa en 50 nM slutlig koncentration.
  12. Ersätta cellodlingsmediet av CyclinB1-GFP bärande MCF10A celler (som genererats i steg 5,8) med rött färgämne innehållande medium under 2 min. UpprepaSamma procedur med grönt färgämne för Cdk1-RFP lager MCF10A celler.
  13. Tvätta två gånger med 100 | il 1 x PBS för att bli av med överskottet av färglösningen, tillsätt 100 | il 1 x PBS till 96-brunnar.
  14. Visualisera mitokondrierna och CyclinB1-GFP (excitation vid 488 nm och emission vid 494-536 nm) och Cdk1-RFP (excitation vid 560 nm och emission vid 565-620 nm) på plattor med 96 brunnar i fluorescensmikroskop vid 40X förstoring.

6. Identifiering av differentiellt fosforylerade proteiner via 2D-DIGE

  1. prov~~POS=TRUNC
    1. Isolera mitokondrier och lysera mitokondrie-fraktioner som i steg 1,3. Tillsätt en lika volym av 20% TCA (triklorättiksyra i vatten) till varje prov och vortexa i 15 sek. Inkubera prover på is under 30 min som proteinerna fällas ut ur lösningen.
    2. Centrifugera proverna vid 9300 xg vid 4 ° C under 5 min, avlägsna supernatanten och tillsätt 60 | il kall aceton (100%) följt avcentrifugering vid 9300 xg vid 4 ° C under 5 min.
    3. Upprepa acetontvättningen (steg 6.1.2) en gång till, ta bort supernatanten och återsuspendera proverna i 50 pl Dige märkning buffert (7 M urea, 2 M tiourea, 4% CHAPS, 30 mM Tris, pH 8,5).
  2. Förbereda de fluorescerande färgämnena
    1. Bereda stamlösning: Lös färgämnen (5 nmol) i 5 | il färskt dimetylformamid (DMF) till en slutlig koncentration av 1 nmol / | j, l. Lagra aktiefärgämneslösningen vid -20 ° C fram till användning för ett par månader.
    2. Bered arbetslösning: Tillåt färgämnen för att ställa om vid RT under 5 min. Späd 1 l av färgämne med 4 pl av DMF till en slutlig koncentration av 200 pmol / | il. Håll på is under användning. Obs: Den arbetslösning kan hållas vid -20 ° C i 3 veckor.
  3. etikett Proteiner
    1. Blanda 1 pl arbetsfärgämneslösning per 12,5 mikrogram protein. Skala upp vid behov. Utjämnings standarder, tillsätt 61; l Cy2 arbetslösning till 300 mikrogram poolade protein.
    2. Vortex under 30 sek och centrifugera vid 4 ° C under 30 sek vid 12000 x g. Inkubera på is i mörker i 30 min. Stoppa märkningen genom att tillsätta 1 pl 10 mM lysin per 1 pl arbetslösning som används. Blanda väl och inkubera på is i mörker i 10 min.
    3. Pool individuellt märkta prover och blanda med rehydrering buffert (7 M urea, 2 M tiourea, 4% CHAPS, 1,2% destreak, ett% pharmalytes, bromofenolblått). Total volym kommer att vara 125 l.
    4. Virvel prover för 30 sek och tillåter prov att ställa om vid RT under 30 min. Belastning 125 pl prov på 7 cm pH 4-9, isoelektrisk fokusering (IEF) remsor.
  4. Första dimensionens elektrofores
    1. Placera bandhållare (kistor) på elektrodplattan och se till att bandhållarna är helt ren och torr. Pipett 125 ul prov i en kista, sprider sig jämnt över hela kistan.
    2. med användning av pincettliknanders, plocka upp IEF remsan, försiktigt bort plastskyddet och placera den (gel sidan nedåt) i kistan / rehydrering buffert. Undvik att droppa luftbubblor. Långsamt fylla kista (1 - 1,5 ml) med mineralolja och placera kistan täcker på kistorna.
    3. Börja isoelektrisk fokusering enligt protokollet i tabell 2:
      Obs! När körningen är klar, kan remsorna förvaras i plaströr vid -80 ° C eller direkt flyttade till jämvikt och den andra dimensionen.
  5. Andra dimensionen - natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE)
    1. ekvilibrering
      1. Tina SDS ekvilibreringsbuffert (8 ml per remsa, 6 M urea, 30% glycerol, 2% SDS). Väg upp ditiotreitol (DTT; 10 mg DTT per 1 ml av SDS jämviktsbuffert). Upplösa DTT i 4 ml SDS ekvilibreringsbuffert.
      2. Väg upp IAA (jodacetamid, 25 mg lAA per 1 ml av SDS jämviktsbuffert).Upplösa lAA i 4 ml SDS ekvilibreringsbuffert.
      3. Smält 1 ml tätnings agaroslösningen i ett vattenbad för senare användning.
      4. Om remsorna frystes, låta dem tina helt. Plats remsor gel sidan uppåt i reswelling facket. Tillsätt 4 ml av SDS ekvilibreringsbuffert med DTT till varje remsa och inkubera under 15 min med försiktig skakning.
      5. Häll av alla SDS jämviktsbufferten med DTT. Tillsätt 4 ml av SDS ekvilibreringsbuffert med lAA till varje remsa och inkubera under ytterligare 15 min med försiktig skakning. Efter jämviktning med IAA buffert, häll av SDS ekvilibreringsbuffert.
    2. SDS-PAGE
      1. Packa mini geler, ta bort kammen och skölj gel och brunnarna med DDH 2 O. Bort den vita tejpen vid botten av gelén innan du kör. Orientera remsan på gelén korrekt, är gel orientering kritisk för punktskärning.
      2. Placera gelen platt på disken med den lilla plattan upp och gel topp inför experimenter. Låg remsan på hög skylt med anodänden (++ avslutas med streckkoden) vänd den vänstra sidan av gelén. Med hjälp av en linjal, tryck långsamt bandet ner på gelytan. Undvik att droppa luftbubblor mellan remsan och gelén. Ställ gel i en glasplatta monter.
      3. Tillsätt 1 ml varm tätnings agaroslösningen till öppningen av kassetten. Se till att alla luftbubblor pressas ut med hjälp av en platt linjal. Sätt ihop apparaten och kör gelén vid en konstant 125 V under 90 min.
      4. När gelen har körts, placera gelen på en biomolekylär kameran med 2 ml DDH 2 O och skanna gelen i fluorescens förvärvsläge med 635 nm excitation laser och 665 nm emissionsfilter.
    3. fosfoprotein Färgning
      1. Fixera gelén med 50% metanol och 10% ättiksyra-blandning (10 ml) under 30 min två gånger. Tvätta med 10 ml vatten under 10 minuter tre gånger och fläcken med 10 ml fosfoprotein fläck för 60-90 minuter, följt avavfärgning med 10 ml avfärgning lösning under 30 minuter tre gånger.
      2. Tvätta med 10 ml vatten 5 minuter två gånger och bild gelen med en laser gel scanner vid 532 nm / 560 nm excitation / emission.
    4. Protein Digestion och identifiering
      1. Punkt alla av det differentiellt uttryckta proteinfläckar från gelén in i brunnarna med användning av en robot spot-picker enligt tillverkarens specifikationer, och tillsätt 100 mM ammoniumbikarbonat (2 ml) under 1 h vid RT för att avfärgning gelen bitar. Dehydrera med 2 ml 100% acetonitril tvätta två gånger och torka i en vakuum koncentrator under 30 min.
      2. Rehydrera gelstycken med 100 pl av 13 ng / ul modifierad porcint trypsin i 50 mM ammonium-bikarbonat för 16 timmar vid 37 ° C. Samla supernatanterna och ytterligare extrahera proteinerna med 100 pl av 5% trifluorättiksyra i 50% acetonitril under 30 min.
      3. Koncentrera peptiderna ner till 5 pl genom vakuumcentrifug concentrator och analysera med Matrix Assisted Laser Desorption lonization - Time of Flight - tandem-masspektrometri-analys (MALDI TOF-MS / MS) 17.

7. In vitro-kinasanalys

  1. Framställning av substrat
    1. Sub-klon Complex I (CI) subenheter (NDUFV1, NDUFV3, NDUFS2, NDUFB6 och NDUFA12), som identifieras som differentiellt fosforylerade Cdk1 mål i pGEX-5X-1-vektor för att generera glutation-S-transferas (GST)-märkt bakteriell expressionsplasmider 11. Rena CI subenheter med hjälp av hög affinitet glutation kolonner efter nedanstående protokoll.
      1. Kultur GST-märkt Cl-subenhet innehållande Escherichia coli stam BL-21 i Luria-Bertani (LB) buljong med 50 ^ g / ml ampicillin i en skakapparat vid 37 ° C tills en optisk densitet (OD) av 0,6 uppnåddes. Lägg isopropyl-BD-tio-galaktopyranosid (IPTG) till kultenure vid en slutlig koncentration av 0,1 mM, och inkubera under ytterligare 3 h.
      2. Centrifugera vid 600 xg under 10 min för att samla bakterierna och återsuspendera i 5 ml 1 x PBS-buffert innehållande 5 mM DTT, 1 x proteinasinhibitor cocktail, och 0,1% lysozym. Lyserar cellerna genom sonikering i tjugo 5 s skurar, och avlägsna celldebris genom centrifugering vid 600 xg under 10 min.
      3. Samla upp supernatanten och inkubera med glutation-agaros-4B-pärlor vid ett volymförhållande av 4: 1 (supernatant: bead) under 1 h vid RT.
      4. Eluera GST-fusionsproteiner från pärlorna med 3 ml glutation elueringsbuffert (10 mM reducerat glutation i 50 mM Tris-HCl, pH 8,0) och underkasta de eluerade proteiner till dialys i molekylär porösa membranslang (molekylviktsgräns 12 -14 kilodalton) med en x PBS / 1 mM EDTA. Förvara renade proteiner vid - 80 ° C
  2. CDK1 kinasanalys
    1. Före start kinas assay, inställd uppvärmningsblock till 30 ° C och 100 ° C. Tina kommersiell CyclinB1 / Cdk1 enzymkomplex och substrat på is.
    2. Förbered reaktionsblandningen på is. Sedan 32 P ATP isotop är inblandad, förbereda alla reaktionsblandningar i 1,5 ml provrör med skruvlock innehållande en O-ring för att förhindra spridning av radioaktivitet.
      Varning: Följ radioaktiva reglerna material skydd. Använd en 8 mm tjocka plexiglas skärm och arbete åtminstone på en armslängds avstånd. Torka någon förorenat område med vatten.
    3. Bered en 30 | il reaktionsbuffert innehållande 1 x Cdk1-buffert (50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 2 mM DTT, 1 mM EGTA, 0,01% Brij 35, pH 7,5), 0,6 mM kall ATP, 0,1 ^ Ci 32 P-ATP, 2 enheter CyclinB1 / Cdk1 och 6 mikrogram av substratproteinet. Justera volymen till 30 pl med DDH 2 O. För positiv kontrollreaktion, ersätta substratet med 0,01 mM Histon H1, en välkänd CyclinB1 / Cdk1 substrat.
      1. För negativ control reaktioner (1) ersätta substrat med GST-protein endast och (2) ersätta substratet med 0,01 mM Histon H1 + 0,5 | iM RO-3306, en selektiv Cdk1 hämmare.
    4. Blanda väl med pipett och centrifugera för att få all vätska till botten av röret, vilket minimerar risken för kontaminering. Inkubera vid 30 ° C under 60 min.
    5. Tillsätt 6 pl av 5x SDS-provbuffert för att stoppa reaktionen och denaturera vid 100 ° C i 10 min. Kör prover på 10% SDS-PAGE-gel vid 160 V under 2 timmar eller tills färgfronten har nått slutet av gelen. Överför gelen på en kromatografi papper och linda med plastfolie.
      Varning: All vätska i kontakt med radioisotoper ska behandlas som radioaktivt avfall och kasseras en 5-gallon poly damejeanne från miljö hälso- och säkerhetstjänster enligt institutionens riktlinjer.
    6. Exponera gelén för röntgenfilm under en dag eller upp till en vecka vid -20 ° C beroende på den specifika aktiviteten av radioisotop som användsoch enzymet.

8. ställesriktad mutagenes för att generera Dominant Negative Cdk1 (D146N)

  1. Utformning mutagenes primers; två primers, som är komplementära till varandra, som innehåller det muterade stället (G kommer att ersättas av en nukleotid för att koda för N i stället för D-aminosyra) flankerad av 20 baser på vardera sidan 11.
  2. Bered en 50 | il polymeraskedjereaktion (PCR) blandning innehållande 1x reaktionsbuffert, 2,5 mM dNTP, 10 | iM av primers (framåt och bakåt), 40 ng av mall och DDH 2 O. Lägg 2,5 U av DNA-polymeras i reaktionen.
  3. Kör följande PCR-program: 95 ° C 3 min, 95 ° C 30 sek, 55 ° C 30 min, 68 ° C 6 min; 16 cykler (Obs: 68 ° C inkubationstiden bestäms av storleken av DNA 1 min / kb krävs för DNA ≤ 10 kb För större DNA, 2 min / kb plus 10 sek per cykel..). Följ med 68 ° C 7 min och håll vid 4 ° C tills den ska användas.
  4. Lägg till2 pl av Dpnl restriktionsenzym (10 U / | il) och 5,7 pl Dpnl-buffert, blanda väl med lätt tryck med fingret och inkubera reaktionen vid 37 ° C i 1 timme.
  5. Överföring 10 pl Dpnl-behandlat PCR-produkter in i 50 pl DH5a-kompetenta celler för transformation. Inkubera på is under 30 min, följt av 45 sek värmechock vid 42 ° C och 5 minuter på is. Tillsätt 500 pl av LB och skaka vid 37 ° C i 1 h före utstrykning på LB-agarplattor. Inkubera O / N vid 37 ° C
  6. Plocka en koloni från O / N vuxit agarplattor med användning av en steril gul pipettspets, släpp spetsen i ett rör innehållande 5 ml LB, och växa O / N i en 37 ° C skakapparat. Isolera plasmid med användning av en miniprep kit och sekvensera plasmid för att bekräfta mutationen enligt tillverkarens protokoll.

9. Fastställande av cellcykeln fas Längder med edu Incorporation analys

  1. cellsortering
    1. transfect 2 x 10 5 celler med indikerade vektorer (MTS-GFP / RFP, MTS-CyclinB1-GFP / Cdk1-wt-RFP eller MTS-Cdk1-dn-RFP) i en 6-brunnars platta med användning av 1: 2 (vikt: volym , 2,5 mikrogram: 5 l) förhållandet mellan DNA: transfektionsreagens blandningen framställd i 2,5 ml serum- och antibiotikafritt odlingsmedium under 48 timmar. Levande sorterings celler som stabilt uttrycker de GFP-märkta Cdk1 och RFP-märkta CyclinB1 proteiner via flödescytometer.
      1. Tvätta cellerna med 1 x PBS, tillsätt 100 | il av trypsin in i skålen och inkubera vid 37 ° C i 5 min. Tillsätt 2 ml av odlingsmedia för att samla upp cellerna och passera dem genom en 70 ^ m filter för att generera en enkelcellsuspension. Tvätta enda cellsuspensionen med 500 pl 1% fetalt kalvserum i PBS (FCS / PBS) innan du lägger dem på flödescytometer.
      2. Ställ in sorteringsparametrarna efter etablerade protokoll 18 grind för dubbel positiva celler färgade med både GFP och RFP. Samla upp den sorterade cellerna som kommer ut ur cytometern till ett rör Containing cellodlingsmedium och använda dessa celler för analys av cellcykelprogression med edu puls chase märkning som i protokoll 9,2.
  2. Mätning av cellcykelns längd Använda edu Märkning flödescytometri analys
    1. Utsädes sorterade celler i 6-brunnsplattor vid en densitet av 2,5 x 10 5 celler per brunn och kulturen O / N vid 37 ° C i en CO2-inkubator. Lägga edu till odlingsmediet vid en slutlig koncentration av 25 ^ M. Inkubera vid 37 ° C i en CO2-inkubator under en timme.
    2. Tvätta cellerna med 1% BSA i 500 ^ il PBS och samla dem i ett 1,5 ml rör vid 2 h intervall under totalt 10-12 h.
    3. Centrifugera cellerna vid 350 xg under 5 min, kasta supernatanten. Rubba pelleten genom tillsats av 100 pl av fixeringslösning (tillhandahålls av tillverkaren inom EDU märkningskit) under 15 min vid RT och blanda väl.
    4. Tvätta cellerna med 1 ml 1% BSA i PBS tre gånger. Fästceller igen med 0,5 ml av 70% etanol O / N vid 4 ° C
      Obs: Etanol fixering är avgörande för att släcka den interna GFP / RFP fluorescens på grund av den rekombinanta-märkta proteinuttryck.
    5. Centrifugera cellerna igen vid 350 x g under 5 min och tvätta pelleten med 1 ml 1% BSA i PBS en gång. Återsuspendera cellerna i 1 ml av permeabilisering buffert (0,1% Triton-X-100, 1% BSA, 0,2 mg / ml RNas A i PBS) under 20 min vid RT.
    6. Tvätta cellerna med 1 ml 1% BSA i PBS en gång. Tillsätt 0,5 ml av reaktions cocktail i varje rör och blanda väl. Inkubera reaktionsblandningen vid RT under 30 min i mörker.
    7. Tvätta med 1 ml 1% BSA i PBS en gång och fläck DNA med 50 ^ g / ml propidiumjodid (PI) i 1 ml 1% BSA i PBS.
    8. Analysera cellerna genom flödescytometri att följa edu-positiva populationen. Föreliggande scatter dot plot av EDU-märkta celler som färgats för DNA-innehåll (PI färgning, X-axeln) och EDU (Alexa 647 färgnings, Y-axel).
      1. Använd APC-kanalen för Alexa647-edu utnyttjar en 670/30 bandpassfilter med allt ljus närvarande mindre än 685 nm slå filtret; och fykoerytrin (PE) kanal för PI med en 581/15 bandpassfilter framför den med allt ljus närvarande mindre än 600 nm slå filtret.
      2. Sätt det första röret som innehåller celler i flödescytometri och använder en standardgrind strategi för förvärv: Plot FSC-området X SSC-området för morfologi följt av PI (PE-kanal) X Alexa647-edu (APC-kanal) för cellfärgning. Spela in data för alla rör en efter en att förvärva 10.000 händelser per prov.
      3. Bestämma cellcykel fasfördelningen av cellerna och fas längder med hjälp av en flödescytometri dataanalys programvara följande etablerade protokoll 11,30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Sub-mitokondriell lokalisering av CyclinB1 och Cdk1

Natriumkarbonat extraktion används för att bestämma huruvida ett protein är placerad inuti mitokondrier eller på den yttre ytan, det vill säga yttre membranet. När ett protein har visat sig lokalisera i mitokondrierna, kan ytterligare bestämning av sub-mitokondriell lokalisering göras via mitoplasting kombination med proteas matsmältningen. För att ange under mitokondriell lokalisering av CyclinB1 eller Cdk1 var mitoplasts isoleras genom att späda mitokondrier i hypotona buffertar med minskande koncentrationer av osmotiska sackaros från 200 mM till 25 mM. Det yttre membranet börjar att brista vid 150 mM sackaros, medan det inre membranet förblir intakt tills den slutliga koncentrationen vid 25 mM sackaros (Figur 1A). I kombination med mitoplasting, kan utföras proteas-skyddsanalys med användning Trypsför att smälta exponerade proteiner efter yttermembranbrott. Detta kommer att resultera i nedbrytning av intermembrane rymd proteiner. Om proteinet av intresse är skyddat från trypsindigerering, indikerar detta mitokondriella matrisen lokalisering av proteinet. I detta representativt värde, var mitokondriens matrix protein Hsp60 och intermembrane utrymme protein Timm13 som under mitokondriell lokaliseringsmarkörer. Liknande med Hsp60 men till skillnad från Timm13, CyclinB1 och Cdk1 skyddades från trypsin matsmältning, vilket indikerar deras mitochondrial matrix lokalisering (Figur 1B).

Mitochondrial Expression av MTS- och GFP-märkta CyclinB1 och CDK1 Proteiner

MTS klonas i ram vid N-terminalen av CyclinB1 eller CDK1 gener, som har GFP eller RFP taggar vid deras C-terminal. Den resulterande rekombinanta proteinet är mitokondrier riktade GFP- eller RFP-märkta CyclinB1 eller Cdk1. Listan av konstruktionerna som genereras och används i denna studie visas i figuren. Med användning av dessa konstruktioner, överexpression av CyclinB1 och / eller Cdk1 i mitokondrierna uppnåddes, som visas här genom western blotting av de isolerade mitokondriella fraktionerna (Figur 2).

Potentiella Mitochondrial Målen för CyclinB1 / Cdk1 Avgörs av 2D-DIGE

Cdk1 tillhör serin / treonin (S / T) kinasfamiljen katalyserar överföringen av en fosfat från ATP till prolin (P) -orienterad S eller T-rester. En punktmutation som ersätter en aspartat (D) rest med asparagin (N) vid position 146 av Cdk1 (D146N) genererar en dominant negativ (dn) Cdk1 mutant 19. Att studera funktionen av mitokondriell Cdk1 ades ett mitokondrier inriktade Cdk1-dn protein genereras genom att konstruera en plasmid (pERFP-N1-MTS-Cdk1-dn) innehållande en 29 aminosyra-long mitokondriell målsekvensen (MTS) härrör från subenheten VIII av cytokrom c oxidas kopplad till RFP-märkta DN-Cdk1. pERFP-N1-MTS producerar mitokondrier-riktade ERFP protein användes som en tom vektor kontroll. Mitokondriella fosfoproteiner i G2 / M-celler som transfekterats med båda konstruktioner profilerade av 2D-gelanalys med pH 4-10 gel remsor. Jämfört med tomma vektor transfektanter (Figur 3, övre panel), var en grupp mitokondriella fosfoproteiner tydligen frånvarande eller minskas i Cdk1-dn transfektanterna (Figur 3, lägre panelen). Masspektrometri-analys av fläckarna som detekteras bestäms identiteten av proteinerna fosforyleras av Cdk1 i mitokondrierna.

Cellcykelprogression och bestämning av fas längder med edu Puls chase analys

För att undersöka fortskridandet av cellcykeln when mitokondriell CyclinB1 / CDK1 nivåer ökar, en puls-chase märkning experiment med användning av en tymidinanalog, etynyl deoxiuridin (EDU) utfördes för att märka populationen av celler som undergår DNA-syntes 20. Denna metod tillåter visualisering av cellcykeln fångas under en 22 timmar fönster genom att spåra edu-positiva populationen när celler utvecklas genom S och G2 / M faser och ackumuleras i G1-fasen. Resultaten visar att märkta S-fasceller utvecklats genom G2 / M-fasen och syntes i G1-fasen så snabbt som 4 h i celler som uttrycker vildtyp mitokondriell CyclinB1 / Cdk1, jämfört med 6 h i celler transfekterade med en vektorkontroll eller mutant CyclinB1 / CDK1 (Figur 4A), vilket indikerar att förbättringen av mitokondriell CyclinB1 / Cdk1 påskyndar cellcykelprogression.

Figur 1
Figur 1. Mitochondrial cyklinB1 / Cdk1 lokaliserar i matrisen. (AB) Under mitokondriell lokalisering av CyclinB1 och Cdk1 detekteras genom mitoplasting och proteas-skyddsanalys, figur har modifierats Wang et al., 2014 11. Den totala (T), pellet (P), och supernatanten (S) -fraktioner utsattes för western blotting-analys med angivna antikropparna. TIMM13 (en mellanrummet protein), och HSP60 (ett matrisprotein). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2. Expression av mitokondriell Cdk1 konstruktioner. Western blotting av mitokondriella fraktioner som isolerats från celler transfekterade med mitokondrier inriktade CyclinB1 och / eller vild typ eller dominant negativ mutant Cdk1 (plasmider indikeras på botten 11. pEGFP-N1-MTS och pERFP-N1-MTS vektorer var tomma vektorkontroller för MTS-CyclinB1 och MTS-Cdk1 respektive). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Potentiella Mitochondrial Substrat av Cdk1. Mitochondrial proteiner extraherade från G2 / M-toppade celler transfekterade med mitokondrier inriktade tom vektor (pERFP-N1-MTS, övre panelen) eller mutant Cdk1 (pERFP-N1-MTS-Cdk1-dn, nedre panel) märktes med Cy5 (grön), åtskilda av 2-D gel och fosforylerade proteiner färgades med fosfoprotein färgämne (röd). Denna siffra har ändrats från Wang et al. 2014 11."> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4. Mitochondrial Cdk1 Förbättrar G2 / M Transition och totalt cykelns förlopp.
Cellcykelanalys med edu puls chase märkning. Scatter plot histogram av EDU-märkta celler drogs för DNA-innehåll (x-axeln) och EDU (Y-axeln). De lägre siffrorna i varje panel visar den genomsnittliga fluorescensintensiteten hos ENE märkta kärnor. Tidpunkterna angavs i timmar efter edu pulsen 11. För alla tidpunkter, var grindarna visar följande grupper dras: G0 / G1, S, och G2 / M. För 6, 8, och 10-hr tidpunkter, utbildnings märkt G1 *, S / G2 *, och G2 / M * populationer är visade. Denna siffra har ändrats från Wang et al., 2014 11. Klickahär för att se en större version av denna siffra.

Sackaros koncentrationer som användes
Ingen trypsin 25 mM 50 mM 100 mM 150 mM 200 mM
+ trypsin 25 mM 50 mM 100 mM 150 mM 200 mM

Tabell 1. Hypoton sackaros buffertar som användes för steg 4,2

Steg 1 30 V 12 tim Steg och Hold
Steg 2 300 V 0,5 h Steg och Hold
steg 3 1000 V 0,5 h Lutning
5000 V 1,33 h Lutning
steg 5 5000 V 20000 V hr Steg och Hold

Tabell 2. Isoelektrisk Protokoll som används för steg 6.4.5

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Liksom de proteiner som är avsedda för andra subcellulära organeller, mitokondriella riktade proteiner har inriktnings signaler inom deras primära eller sekundära struktur som leder dem till organellen med hjälp av genomarbetade protein translokerande och fällbara maskiner 21,22. Mitokondrier målsökningssekvenser (MTS), som erhölls från enbart mitokondriella bosatta proteiner såsom COX8 kan tillsättas till N-terminalen i varje gensekvens att inrikta sig på specifika proteiner in i mitokondrierna 11,23,24. Här var CyclinB1 och Cdk1 gener klonas in COX8 MTS innehåller vektorerna och vid uttryck, var det rekombinanta CyclinB1 och Cdk1 lokaliserade i mitokondrier. Fördelen med detta tillvägagångssätt är att det möjliggör modifiering av genuttryck i en speciell subcellulär avdelning, i detta fall mitokondrier, utan att ändra den totala genexpression. Med denna strategi, mitokondrier-specifika funktioner i en nukleär kinas, var Cdk1 frånstämd. På liknande sätt, genom att tillsätta MTS till en dominant negativ Cdk1, slå ner av mitokondrier specifika funktioner Cdk1 uppnåddes, vilket möjliggjorde identifiering av mitokondrier specifika målen i Cdk1, och möjliggjorde analys av funktionella konsekvenserna av mitokondrie frånvaro av Cdk1 funktion. Överuttryck av Cdk1 utan MTS taggresulterar i ökat uttryck av Cdk1 i både mitokondrier och kärna, och därför ytterligare undersökningar av konsekvenserna av mitokondrier specifika åtgärder Cdk1 komplicerar.

Dock kan detta tillvägagångssätt inte lämpar sig för alla genprodukter som vi har upplevt några misslyckade försök att flytta vissa kinaser i mitokondrierna via tillsättning av MTS tag. Vissa cellinjer kan vara helt resistenta mot transfektion, och att hitta det optimala protokollet kan vara tidskrävande. Även när cellerna är friska och transfektion är framgångsrik, arbetar med fluorescerande taggade proteiner uppvisar några problem SUCh som aggregering, felaktig lokalisering, icke-funktionella fusioner och svaga signaler.

Stora begränsningar av isolering av mitokondrier och mitoplasts inkluderar det låga utbytet och eventuella föroreningar från andra cellulära eller sub-mitokondriella fack. Det föreslås att vidhäftande celler inte bringas att brista effektivt genom konventionella kemiska eller mekaniska metoder, därför, vilket gör det svårt att erhålla höga kvantiteter av mitokondrier från odlade vidhäftande celler. Här utnyttjade vi vidhäftande kulturer av MCF10A celler. Att ge ca 30-50 mikrogram av mitokondrie protein, ett utgångsbelopp på 3-5 x 10 7 celler användes. Homogeniseringssteget är en annan kritisk punkt för det slutliga utbytet av mitokondriella förberedelser. Beroende på de cellinjer som används, kan antalet slag och / eller tiden för homogenisering variera. För MCF10A celler, observerade vi att 10 min för homogenisering av glas / glashomogenisator krävs medan mus embryonala fibroblam (MEF) krävs bara 3-5 minuter av homogenisering. Eftersom överdriven homogenisering kan orsaka skador på mitokondriemembranet och plötsligt frisätter mitokondriella komponenter bör standardvillkor för varje cellinje bestämmas genom erfarenhet. Användning av en glas-glas homogeniseringsanordning ökar utbytet av mitokondriella preparat jämfört med glas / Teflon homogenisatorer. Utgångs mängd celler såväl som frysning / upptining av celler kan ändra antalet slag som behövs för att bryta upp cellerna. Slutligen kan proteindenaturering och aggregering uppstå på grund av lokal uppvärmning av provet under homogenisering. Det är därför viktigt att i förväg kyla vävnadskvarn och hålla prover på is under denna procedur.

En annan metod presenteras i denna artikel är användningen av edu märkning för att övervaka cellcykeln i realtid. Edu är en modifierad tymidinanalog som fluorescens är märkt med en ljus, fotostabil Alexa Fluor färgämne. Edu är effekräckligt införlivas i nyligen syntetiserad DNA. Denna metod är ett bättre alternativ till användning av traditionella märkning av prolifererande celler med nukleosidanalogen, bromodeoxiuridin (BrdU). BrdU införlivas i DNA under aktiv DNA-syntes. Kvantifieringen av BrdU-märkta DNA kräver DNA denaturering av relativt hårda metoder såsom hög värme eller hög syra för att exponera BrdU molekylerna för BrdU antikroppsbindning. Den hårda behandlingen för DNA denaturering kan påverka prov kvalitet och är tidskrävande. Vid ENE, är i allmänhet tillräckligt för edu detektionsreagens för att få tillgång till DNA tvättmedels permeabilization. Utan att det är nödvändigt att använda starka kemikalier eller värme för DNA tillgång är EDU metoden enklare att använda, mer korrekt och konsekvent. Bortsett från fördelarna edu ger, har det funnits en viss oro när det gäller användningen av edu för att studera spridningen. Edu visade en liten anti-proliferativ aktivitet vid behandlingar under 72 h, vilket kan reduceras till negligible nivåer när edu pulsen hölls vid 1 timme 25.

En modifiering används med EDU märkning är fixeringstiden och metod. Satsen föreslog en 15 min fixering med den medföljande fixeringslösningen. Emellertid var en ytterligare fixering med 70% etanol som användes i detta experiment. Det finns två skäl för användning av etanol: 1) för att följa cellcykelprogression över tiden, var en tidspunkt experiment utförda, där celler samlades in varje 2 h. Cellerna hölls i 70% etanol vid 4 ° C till dess att allt av de experimentella tidpunkterna har avslutats. Egentligen kan celler förvaras i 70% etanol under längre (flera veckor till månader) om så behövs. 2) De celler som användes för experimentet var stabilt transfekterade med GFP-tagged Cdk1 och / eller RFP-taggade CyclinB1. För att separera edu och PI signaler från GFP / RFP fluorescens, tillsattes etanol fixering används för att denaturera GFP och RFP proteiner och därmed släcka sin fluorescens innan du utför edu end PI färgning. Denaturerade GFP / RFP proteiner är i huvudsak helt icke-fluorescerande, förmodligen på grund kromoforen inte längre skyddas från härdning 26,27.

Att identifiera mitokondriella mål för Cdk1 var 2D-DIGE metoden, som är överlägsen traditionella 2D geler på många sätt som används. I 2D-DIGE, distinkta fluorescerande färgämnen, t ex Cy 3, 5 och 2, används för att etikettprover, som tillåter kör upp till 3 prov i en gel, minska variationen utan att behöva köra repliker som i vanliga 2D gel. De fluorescerande färgämnena som används i 2D-DIGE har en mycket hög känslighet på 0,2 ng / fläck jämfördes med den för trifenylmetanpigment färgämnen vid 100 ng / fläck, på så sätt, som kräver mindre mängd proteiner köras på de 2D-DIGE geler med hög plats upplösning och publiceringskvalitet gel skanningar. En automatiserad mjukvara används för att upptäcka, kvantifiera och definiera differentiellt uttryckta proteiner. På grund av hög plats upplösning differentiell proteinuttryck i prover can jämföras exakt med hjälp av programmet stödda plats kvantifiering; en skillnad så låg som 10% kan detekteras via 2D-DIGE, vilket möjliggör visualisering av posttranslationella modifieringar lätt. Användningen av mjukvarustödd i-gelanalys möjliggör också snabbare insamling av data. Eftersom utrustning, såsom fluorescerande skannrar krävs för bildinhämtning, användningen av denna metod innebära ytterligare kostnader. Andra begränsningar av 2D-DIGE inkluderar dålig representation av hydrofoba proteiner samt proteiner med extrema isoelektriska punkter och stora molekylvikt 28,29. Ytterligare validering av resultat som erhållits med 2D-DIGE använda alternativa tekniker, såsom immunocytokemi eller western blot krävs för att bekräfta nya rön.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
32P ATP  PerkinElmer BLU002001MC 
Anti-mouse secondary antibody Invitrogen  A-11003 Alexa-546 conjugated
Anti-rabbit secondary antibody Invitrogen  A11029 Alexa-488 conjugated
ATP Research Organics 1166A For in vitro kinase assay
Cdk1 antibody Cell Signaling Technology 9112
Cdk1 kinase buffer New England Biolabs P6020S
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit Life Technologies C10337 For cell cycle analysis with EdU labeling
COX IV antibody Cell Signaling Technology 4844S For mitochondrial immunostaining
Cyclin B1 antibody Santa Cruz Biotech sc-752
CyclinB1/Cdk1 enzyme complex New England Biolabs P6020S Avoid freeze/thaw
CyDye DIGE Fluor Labeling Kit GE Healthcare Life Sciences 25-8009-83
DIGE Gel and DIGE Buffer Kit GE Healthcare Life Sciences 28-9480-26 AA
Dimethylformamide  Sigma Aldrich 319937 DMF
Dithiothreitol Bio-Rad 161-0611 DTT
dNTP EMD Millipore 71004 For site-directed mutagenesis
Dpn I enzyme Stratagene 200519-53 For site-directed mutagenesis
Dry Strip cover fluid GE Healthcare Life Sciences 17-1335-01 Used as mineral oil
EDTA J.T. Baker 4040-03
EGTA Acros Organics 409910250
Eppendorf Vacufuge Concentrator Fisher Scientific 07-748-13 Used as vacuum centrifuge concentrator
Fluoromount G Southern Biotech 0100-01 Anti-fade mounting solution
Fortessa Flow Cytometer BD Biosciences 649908 For cell cycle analysis with EdU labeling
Histone H1 Calbiochem 382150 For in vitro kinase assay
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704 For purifying DNA fragments from agarose gels
Immobiline DryStrip Gels GE Healthcare Life Sciences 18-1016-61 IEF (isoelectric focusing) strips
Immobilized Glutathione Thermo Scientific 15160 Glutathione-agarose beads
Iodoacetamide Sigma Aldrich I1149 IAA
IPGphor 3 Isoelectric Focusing Unit GE Healthcare Life Sciences 11-0033-64 IPGphor strip holders
Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside  RPI Corp 156000-5.0 IPTG
Leupeptin Sigma Aldrich L9783 For cell lysis buffer
Lipofectamine 2000 Life Technologies 11668027 Transfection reagent
Lysine Sigma Aldrich L5501 For CyDye labeling
Lysozyme EMD Chemicals 5960
Mitoctracker Red/Green Invitrogen  M7512/M7514 Mitochondrial fluorescent dyes
MOPS EMD Chemicals 6310
pEGFP-N1 Clonetech 6085-1 GFP-expressing vector
Pfu Stratagene 600-255-52
pGEX-5X-1  GE Healthcare Life Sciences 28-9545-53 GST-expressing vector
Phenylmethylsulfonyl fluoride Shelton Scientific IB01090 PMSF
Phosphate buffered saline Life Technologies 14040 PBS
Spectra/Por 4 dialysis tubing Spectrum Labs 132700 as porous membrane tubing for dialysis
Pro-Q Diamond Phosphoprotein Gel Stain Life Technologies P-33300 For staining phosphoproteins on 2D gels
Proteinase inhibitor cocktail Calbiochem 539134 For cell lysis buffer
QuikChange site-directed mutagenesis kit Stratagene 200519-5
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27104 MiniPrep Plasmid Isolation Kit
RO-3306 Alexis Biochemicals 270-463-M001 Cdk1 inhibitor
Rotenone MP Biomedicals 150154 Complex I inhibitor
Sodium carbonate Fisher Scientific S93359
Sodium chloride EMD Chemicals SX0420-5 For cell lysis buffer
Sodium orthovanadate MP Biomedicals 159664 For cell lysis buffer
Sodium pyrophosphate decahydrate Alfa Aesar 33385 For cell lysis buffer
Sodium β-glycerophosphate Alfa Aesar L03425 For cell lysis buffer
SpectraMax M2e  Molecular Devices M2E Microplate reader
Sucrose Fisher Scientific 57-50-1
Tissue Grinder pestle Kimble Chase 885301-0007 For mitochondria isolation
Tissue Grinder tube Kimble Chase 885303-0007 For mitochondria isolation
Trichloroacetic acid solution Sigma Aldrich T0699 TCA
Tris MP Biomedicals 103133
Triton-x-100 Teknova T1105
Trypsin Calbiochem 650211
Typhoon Imager GE Healthcare Life Sciences 28-9558-09 Laser gel scanner fro 2D-DIGE
Ubiquinone Sigma Aldrich C7956

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Weinert, T., Hartwell, L. Control of G2 delay by the rad9 gene of Saccharomyces cerevisiae. J Cell Sci Suppl. 12, 145-148 (1989).
  2. Takizawa, C. G., Morgan, D. O. Control of mitosis by changes in the subcellular location of cyclin-B1-Cdk1 and Cdc25C. Curr Opin Cell Biol. 12, (6), 658-665 (2000).
  3. Allan, L. A., Clarke, P. R. Phosphorylation of caspase-9 by CDK1/cyclin B1 protects mitotic cells against apoptosis. Mol Cell. 26, (2), 301-310 (2007).
  4. Cerveny, K. L., Tamura, Y., Zhang, Z., Jensen, R. E., Sesaki, H. Regulation of mitochondrial fusion and division. Trends Cell Biol. 17, (11), 563-569 (2007).
  5. Brandt, U. Energy converting NADH:quinone oxidoreductase (complex I). Annu Rev Biochem. 75, 69-92 (2006).
  6. Hofhaus, G., Weiss, H., Leonard, K. Electron microscopic analysis of the peripheral and membrane parts of mitochondrial NADH dehydrogenase (complex I). J Mol Biol. 221, (3), 1027-1043 (1991).
  7. Weiss, H., Friedrich, T., Hofhaus, G., Preis, D. The respiratory-chain NADH dehydrogenase (complex I) of mitochondria. Eur J Biochem. 197, (3), 563-576 (1991).
  8. Janssen, R. J., Nijtmans, L. G., van den Heuvel, L. P., Smeitink, J. A. Mitochondrial complex I: structure, function and pathology. J Inherit Metab Dis. 29, (4), 499-515 (2006).
  9. Roessler, M. M., et al. Direct assignment of EPR spectra to structurally defined iron-sulfur clusters in complex I by double electron-electron resonance. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (5), 1930-1935 (2010).
  10. Owusu-Ansah, E., Yavari, A., Mandal, S., Banerjee, U. Distinct mitochondrial retrograde signals control the G1-S cell cycle checkpoint. Nat Genet. 40, (3), 356-361 (2008).
  11. Wang, Z., et al. Cyclin B1/Cdk1 coordinates mitochondrial respiration for cell-cycle G2/M progression. Dev Cell. 29, (2), 217-232 (2014).
  12. Omura, T. Mitochondria-targeting sequence, a multi-role sorting sequence recognized at all steps of protein import into mitochondria. J Biochem. 123, (6), 1010-1016 (1998).
  13. Konishi, T., Takeyasu, A., Natsume, T., Furusawa, Y., Hieda, K. Visualization of heavy ion tracks by labeling 3'-OH termini of induced DNA strand breaks. J Radiat Res. 52, (4), 433-440 (2011).
  14. Leif, R. C., Stein, J. H., Zucker, R. M. A short history of the initial application of anti-5-BrdU to the detection and measurement of S phase. Cytometry A. 58, (1), 45-52 (2004).
  15. Li, K., Lee, L. A., Lu, X., Wang, Q. Fluorogenic 'click' reaction for labeling and detection of DNA in proliferating cells. Biotechniques. 49, (1), 525-527 (2010).
  16. Kondo, T., et al. Application of sensitive fluorescent dyes in linkage of laser microdissection and two-dimensional gel electrophoresis as a cancer proteomic study tool. Proteomics. 3, (9), 1758-1766 (2003).
  17. Gundry, R. L., et al. Chapter 10, Preparation of proteins and peptides for mass spectrometry analysis in a bottom-up proteomics workflow. Curr Protoc Mol Biol. Unit 10.25 (2009).
  18. Davies, D. Chapter 11, Cell Sorting by Flow Cytometry. Flow Cytometry. Macey, M. G. Humana Press. 257-276 (2007).
  19. van den Heuvel, S., Harlow, E. Distinct roles for cyclin-dependent kinases in cell cycle control. Science. 262, (5142), 2050-2054 (1993).
  20. Terry, N. H. A., White, R. A. Flow cytometry after bromodeoxyuridine labeling to measure S and G2+M phase durations plus doubling times in vitro and in vivo. Nat. Protcols. 1, (2), 859-869 (2006).
  21. Becker, L., et al. Preprotein translocase of the outer mitochondrial membrane: reconstituted Tom40 forms a characteristic TOM pore. J Mol Biol. 353, (5), 1011-1020 (2005).
  22. Karniely, S., Pines, O. Single translation--dual destination: mechanisms of dual protein targeting in eukaryotes. EMBO Rep. 6, (5), 420-425 (2005).
  23. Candas, D., et al. CyclinB1/Cdk1 phosphorylates mitochondrial antioxidant MnSOD in cell adaptive response to radiation stress. J Mol Cell Biol. 5, (3), 166-175 (2013).
  24. Nantajit, D., et al. Cyclin B1/Cdk1 phosphorylation of mitochondrial p53 induces anti-apoptotic response. PLoS One. 5, (8), e12341 (2010).
  25. Cappella, P., Gasparri, F., Pulici, M., Moll, J. A novel method based on click chemistry, which overcomes limitations of cell cycle analysis by classical determination of BrdU incorporation, allowing multiplex antibody staining. Cytometry A. 73, (7), 626-636 (2008).
  26. Niwa, H., et al. Chemical nature of the light emitter of the Aequorea green fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, (24), 13617-13622 (1996).
  27. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
  28. Marouga, R., David, S., Hawkins, E. The development of the DIGE system: 2D fluorescence difference gel analysis technology. Anal Bioanal Chem. 382, (3), 669-678 (2005).
  29. Timms, J. F., Cramer, R. Difference gel electrophoresis. Proteomics. 8, (23-24), 4886-4897 (2008).
  30. Crane, J., Mittar, D., Soni, D., McIntyre, C. Cell Cycle Analysis Using the BD BrdU FITC Assay on the BD FACSVerse System. BD Biosciences Appl Notes. (2011).
Experimentella metoder för att studera mitokondrie Lokalisering och funktion av en kärnteknisk Cell Cycle kinas, Cdk1
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Candas, D., Qin, L., Fan, M., Li, J. J. Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1. J. Vis. Exp. (108), e53417, doi:10.3791/53417 (2016).More

Candas, D., Qin, L., Fan, M., Li, J. J. Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1. J. Vis. Exp. (108), e53417, doi:10.3791/53417 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter