Developmental Biology

チック小脳スライスと顆粒細胞前駆体の空間的にターゲットを絞ったエレクトロポレーションの ex vivo培養

Published: December 14, 2015 doi: 10.3791/53421

Michalina Hanzel¹, Richard J.T. Wingate¹, Thomas Butts²

¹MRC Centre of Developmental Neurobiology, King's College London, ²School of Biological and Chemical Sciences, Queen Mary, University of London

Summary

小脳外顆粒層は、脳の発達で最大のトランジット増幅のサイトです。ここでは、胚の14日目のニワトリ胚からex vivoでエレクトロポレーションおよび小脳スライスの文化を使用して、増殖のピーク時にこの層に遺伝子改変をターゲットにするプロトコルを提示します。

Abstract

小脳外顆粒層（EGL）は、脳の発達で最大のトランジット増幅のサイト、および神経増殖および分化を研究するための優れたモデルです。また、その増殖能力の進化の変更は、小脳脊椎動物の脳のEVO-DEVO研究のための優れたモデルを作り、羊膜における小脳のサイズの劇的な拡大を担当しています。 EGLを構成する細胞は、小脳顆粒前駆細胞は、また、髄芽腫のための最も一般的な小児神経腫瘍の起源の有意な細胞を表します。トランジット増幅後、顆粒の前駆体は、彼らが成熟した哺乳動物の脳における最大のニューロン集団を表す小脳の内部顆粒層に半径方向に移動します。ひよこでは、EGLの増殖のピークは妊娠の第2週の終わりに向かって発生します。この層での遺伝子改変を標的とするために増殖のピークは、我々は、胚14日目のニワトリ胚から小脳スライスのex vivoでのエレクトロポレーションを介して、遺伝子操作のための方法を開発しました。この方法は、 インビボでの顆粒ニューロンの発達のいくつかの重要な局面を再現すると、小脳顆粒細胞の増殖および分化の、ひいては小脳の開発、展開、および疾患の完全な理解を生成するのに有用であろう。

Introduction

小脳は、後脳の前方端に座って、成熟した脳内の感覚と運動処理の統合を担当するだけでなく、高い認知過程^1を規制です。哺乳類や鳥類では、成人の脳におけるニューロンの半分以上が生産する開発中に、前駆細胞の大規模なトランジット増幅の産物を精巧な形態を有し、重く葉状されます。小脳は、何世紀にもわたって、および分子時代の神経生物学者のための調査の対象となっている、同様に重要な注目を集めています。これは、本質的に興味深い生物学だけでなく、それが頻繁にそのような最も一般的な小児の脳である自閉症スペクトラム障害²と最も顕著に小脳癌、髄芽腫^3、などの発達の遺伝的障害を含む、ヒトの疾患に関与しているという事実だけでなく、関連します腫瘍。重要なことは、WH内の優れたモデル系でありますICHは、脳の発達⁴中に運命の割り当てと神経新生を研究します。近年では、それはまた、脊椎動物系統^5-10横切っ見小脳形態の巨大な多様性のために、脳の発達の比較研究のためのモデル系として確立されています。

小脳は、後脳¹¹でrhombomere 1の背側半分から発達と発達二つの主要な前駆細胞集団、菱形リップと脳室帯から構成されています。菱形リップは、屋根板との国境で後脳の神経上皮の背部の周りに延びます。これは、小脳^12-14のグルタミン酸作動性ニューロン興奮性の発祥の地です。脳室帯は最も顕著に抑制GABA作動性小脳ニューロン、大プルキンエニューロン^14,15を生じさせます。その後、開発中（マウスでは約胎生13.5から、ひよこ¹⁶でE6）、グルタミン酸作動PROGENitorsは菱形リップから接線方向に移動して、前駆細胞の軟膜層を形成：二前駆ゾーンは外部顆粒層（EGL）と呼ばれます。これは、成熟した脳で見つかった顆粒ニューロンの膨大な数につながる大規模なトランジット増幅を受け、この層です。

EGLでの増殖は、長い細胞周期出口に切り替え、中央に外側EGL層からの出口に関連している前駆細胞の神経分化と、菱形^リップ 17から接線方向の移行から得られるサブ軟膜の場所にリンクされていますEGL ^18。内側-外側軸における有糸分裂後の顆粒細胞の広範な接線方向の移行は、成熟した小脳皮質の内側顆粒層への最終的な放射状の移行前に、ミドルとインナーEGL ¹⁹で発生します。小脳表面上の菱形リップからの細胞の移動は、軟膜^20-22からCXCL12シグナリングに依存しています23-25 の移行新皮質の接線方向のそれを彷彿とさせます。興味深いことに、電子顕微鏡の研究^{17は、増殖}形態を持つEGL細胞が哺乳類の大脳皮質²⁶の基底前駆細胞を連想させるようにして増殖能力を有する細胞の挙動を結ぶ、軟膜の接触を維持することを示唆しています。これは、個別の細胞外環境によって定義され、顆粒の前駆体は、異なる遺伝子発現シグネチャ¹⁸を持っているされている3つの副層へのEGLの前述の層別化に反映されています。

oEGLにおける前駆細胞の増殖は、前駆細胞を個別に遺伝的にマウスでは胚発生の末端で標識されたとき、彼らは250〜500グラムの有糸分裂後の中央値の平均を生じさせるようなクローンサイズの正規分布で発生ranuleニューロン^27,28。増殖は、プルキンエニューロン^{29-32の根底にある}から分裂促進Shhシグナル伝達に依存しています。 SHHに応答する能力は、in vitro およびin vivo ^{33 34,35} の両方において 、転写因子のAtoh1の細胞自律的な発現に完全に依存することが示されています。同様に、細胞周期の出口と分化は、おそらくのAtoh1 ³⁷の直接のリプレッサーである下流の転写因子NeuroD1 ³⁶の発現に依存することが示されています。

細胞周期出口^38〜42の細胞生物学的基礎を解読で、この進歩し、かなりの進歩にもかかわらず、意思決定の根底にある基本的な分子機構（複数可）は、細胞周期を終了し、差別化ニューロンへの前駆から移行すること、およびインナーEGLならびに後、スイッチの関連する有糸分裂後の接線方向の移行ラジアル移行に、完全には理解のまま。これは、EGLの実験的扱いにくさの大部分は次のとおりです。同じ神経性分子の多くが菱形リップで以前顆粒前駆体の生活の中でも極めて重要であるため、それが遅れて開発している、と遺伝的に標的にすることは困難。この問題を克服するために、多数の著者は、げっ歯類^43-48で出生後の小脳を対象とする方法として in vivo および ex vivoエレクトロポレーションで開発しています。ここでは、コストと利便性の面で顕著な利点を表すEGLを研究するために、ニワトリにex vivoでのエレクトロポレーションの使用を開拓します。私たちのエレクトロポレーションの方法とひよこのex vivoでのスライス培養小脳組織は、EGLの増殖のピークで組織胚の日から解剖14雛を使用しています。この方法は、独立して菱形リップのEGLの遺伝子ターゲティングを可能にし、顆粒からの移行の遺伝的解剖のための段階を設定します小脳における分裂停止後の顆粒ニューロンの前駆。

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Protocol

注意：全ての実験は、キングスカレッジロンドン、英国、英国内務省動物保護ガイドラインに基づいて実施しました。

E14小脳の1解剖

胚14日目に38℃で茶色の受精鶏卵をインキュベートします。
卵のはさみを使用すると、卵内ニワトリ胚を刎ねると氷冷PBS（ 図1A）を含むペトリ皿に頭を削除します。
標準の鉗子を使用して、目と上顎の除去、組織を通ってそれぞれの目の後ろにすべての方法を切開を行います。すべての方法下顎（ 図1B）を除去咽頭を介して第2の切開を行います。
標準の鉗子を使用して、（ 図1C）を 、それを剥がすことにより、頭蓋骨の表面からすべての皮膚を除去し、前頭葉と頭頂骨を削除し、脳を明らかにする。
腹側面から、咽頭軟骨と補助間葉を削除します。
背側面から、慎重にLY軟膜を損傷しないように注意しながら後脳、独立した脳全体（ 図1D）に間充織の背側を削除します。
すべての方法中脳と後脳と小脳（ 図1E）を含む別々の後脳の間の組織を通して切開を行います。
すべての方法小脳および後脳の翼板の両側接合部で組織を通って切開を行うことにより、解剖を通してPIAの整合性（ 図1F）を維持するために注意しながら、全体の小脳を削除します。形成脈絡叢（ 図1G）を取り外します。
氷冷HBSSに解剖小脳を移動します。

E14小脳の2スライス培養

開口部を広げるために切り取ら先端でヘラまたは3ミリリットルパスツールピペットを用いて組織チョッパーの無菌プラットフォームに全体小脳を転送します。ピペットを用いて余分な液体を除去します。
トンで全体の全体小脳をカット彼は最大の50％で切削速度で設定組織チョッパーを用いて300μmの厚さで向きを必要としました。組織の完全性は、最も簡単に矢状セクションに保存されます。しかしながら、配向はまた、細胞分析のための重要な考慮事項（顆粒細胞の軸索は、プルキンエ細胞の樹状突起の平面に垂直な、横方向に実行しつつ、プルキンエ細胞の樹状突起はサジタル、整列されている）です。
3ミリリットルパスツールピペットを用いて、氷でスライスした小脳冷HBSSをカバーしています。
カットチップを3ミリリットルパスツールピペットを用いて、氷冷新鮮なHBSSを含む60ミリメートルペトリ皿にHBSS中のスライスを転送します。
光ファイバー光源で照明解剖顕微鏡下で、時計メーカーの鉗子を使用して、個々のスライスの分離を確保します。スライスが自分の組織の完全性および内外方向の位置に基づいて、エレクトロポレーションすることが確認します。
注：培養培地中でのインキュベーションをスライスに至るまで胚からの各解剖は約10〜20分間応じUPOを取りますn個の経験。その小脳を確保するために、一度に解剖いずれかを実行は、断頭し、ex vivoでの文化の間の最小時間を費やしています。

スライスの3エレクトロポレーション

絶縁テープと60ミリメートルペトリ皿のベースにエレクトロのアノードを固定することにより、エレクトロポレーションチャンバーを構築します。電極を覆うHBSSの約1ミリリットルを追加します。
HBSS中で覆われた電極の上に0.4μmのカルチャーインサートを置きます。カルチャーインサートは、必ずインサートと電極との接触が常にある作る電極上に載るようにします。
注：この設定では、スライスを持つカルチャーインサートは、回路を維持するが、カソードの空間的な標的化を可能にする、溶液の表面に載るます。
転送特定されたスライス（培養インサートあたり最大5つの）カットの先端で3ミリリットルのパスツールピペットを用いて培養インサート上に。セパレートとsagitt培養インサート上に決済することができアル方向。
スライスがもはや溶液中に浸されるようにピペットを用いて、過剰のHBSSを削除しません。
スライスの標的領域の表面に20％速いグリーンで希釈した（1μg/μlの濃度で）P10ピペットチップ、ピペットDNAを使用。 20％速いグリーンは、粘性DNA溶液を保証し、法外DNAの広い分散を防ぐことができます。各スライス（ 図2B）に約5μlのDNA /ファストグリーンソリューションを追加します。
希望の標的組織の上に陰極を配置し、3×10 V、10ミリ秒持続時間のパルスでエレクトロポレーション。組織と陰極の直接の接触を避けてください。代わりに、（実際に組織に触れることなく、可能な限り組織の近くに陰極を配置）伝導性を維持するために、液体の表面張力を利用します。
必要に応じて、それぞれの個々の小脳スライスにEGLの複数の領域にDNA送達およびエレクトロポレーションを繰り返します。
エレクトロポレーションが完了すると、転送培養inse30ミリメートルペトリ皿に室温。
各培養物に、予め温めた培養培地1mlを加える（基礎培地イーグル、0.5％（w / v）のD - （+） - グルコース、1％のB27サプリメント、2mMのL-グルタミン、100 U / mlペニシリン、カルチャーインサート媒体と接触しているが、スライスは、それを浴びないように培養インサートの下に100μg/ mlのストレプトマイシン）。
最大3日間37℃/ 6％CO ₂で培養物をインキュベートします。培地新鮮予め温めた培地を用いて24時間毎の全てを交換してください。
文化に続いて、文化上のスライスを修正することはありません培養培地と新鮮な30ミリメートル皿に4％パラホルムアルデヒド（または4℃でO / N）で1時間挿入します。

小脳スライスの4イメージング

固定後、PBSで5分間、切片を3回洗浄します。
かみそりの刃を使用して、スライスの周りに切断及びスライスし、それが接着されているインサートの領域を除去することにより培養インサートからそれぞれのエレクトロ培養小脳スライスを分析。行うカルチャーインサート表面からスライスを削除しようとしません。
レーザー走査型共焦点顕微鏡を用いてマウント気泡を導入しないように注意しながら、カバースリップ下（必要な場合）、DAPIを含む封入剤の約1ミリリットル中のスライス、および画像。
注：イメージングパラメータは、エレクトロポレーションの構築に応じて変化し、個々のユーザーの裁量ですることができます。

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Representative Results

このセクションでは、胚の14日目のニワトリからスライスエレクトロポレーションおよび小脳の文化を使用して得ることができる結果の例を示します。小脳の解剖は、図1に示され、セットアップのエレクトロポレーションチャンバーは、図2に示されている。我々は、それが成功したin vitroで （ 図3A）、その構造や細胞形態を保持して培養小脳スライスを、エレクトロポレーションとすることが可能であることを示しています。個々フォリアをターゲットにエレクトロポレーションが容易（ 図3B）が達成されます。我々は成功し、図3D（ii）の小脳細胞における機能のための可能なゲノム領域をテストするために、レポーターは彼らの行動（ 図3C）を観察するために構築物で細胞を標識する）EGL細胞に異なるプラスミドの数をエレクトロポレーションし、それが可能私であることを示します）、およびiii）遺伝的に操作すること目的のタンパク質をmisexpressingによってEGLのセル（ 図3E）。さらに、エレクトロポレーションスライスの薬理学的操作が（結果は示されていない）可能です。培養した後、それは、免疫組織化学または増殖アッセイ（ 図3F）のような追加の組織分析を行うことができます。我々は、カルビンジンとPH3の免疫染色によって、組織の健康分析を実行し、組織の完全性は、培養後に少なくとも3 DIV（ 図4）のために維持されることを示しています。これらの結果は、EGLが完全に検査され、遺伝的にニワトリモデル系に変更することができ、容易にアクセス可能な操作構造であることを示しています。

E14のニワトリ胚から小脳の解剖図1（A）卵でひよこを刎ねるとヘッドint型を削除氷冷PBSでOAシャーレ。目や咽頭（破線）の後ろに切開を行うことで、下顎と目を削除します。 （B）頭蓋骨の表面から皮膚を削除します。 （C）それを囲む間充織と軟骨から脳を削除前頭葉と頭頂骨と（D）を外します。解剖顕微鏡下で（E）は、脳の後方端部に小脳の位置を特定します。中脳と後脳（破線）との間のカットは、小脳および腹側後脳が残されています。 （F）後脳（点線）から小脳を分離するために小脳の横方向の接合（花柄）で切開を行います。あなたが添付PIAと全体そのまま小脳が残されるまで（G）小脳の腹側から脈絡叢（アスタリスク）を取り外します。組織choppでスライスを準備する前に、氷冷HBSSに小脳を転送えー。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

セットアップエレクトロポ室2図。 （A）カスタムメイドのエレクトロポレーションチャンバーの絵。チャンバーは60ミリメートルペトリ皿の底にしっかりと置いエレクトロのアノードから構成されています。料理は電極を覆うHBSSの約1ミリリットルが含まれています。カルチャーインサートは、回路を維持することが、手で操作されるカソードの空間的な標的化を可能にする、インサートと電極との間に一定の接触で電極上にくるようにしてください。スライスの（B）Aの画像は電気穿孔されます。スライスは、DNA /ファストグリーン溶液で覆われています。スライスは欲求としてエレクトロポレーションされていますD：エレクトロポレーションは1薄層または複数の場所を標的とすることができます。エレクトロポレーション後にインサートをインキュベーター中で予め温めた培地培養で30 mmのペトリ皿に置かれます。 1.アノード2.カソード3.文化は、高速グリーン染料と組織チョッパー7. DNA溶液から1ミリリットルのHBSS 5.解剖顕微鏡で6個々のスライスを4ペトリ皿を挿入します。これの拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください図。

図3.代表的な結果。（A）複数の場所でのEGLへのRFPをコードするプラスミドの制御エレクトロポレーションの低倍率画像。組織は、その構造を保持し、エレクトロポレーションした細胞は、小脳の厚い軟膜下の層にはっきりと見えます。 （B）アンコントロールGFPプラスミドと対象とエレクトロポレーションの例。対象となる薄層は、アスタリスクで示されています。 = 500μmのスケールバーAB。 （C）のAtoh1エンハンサーにより駆動される構築物をコードするGFPはEGLにエレクトロポレーションされた例。 Atoh1の発現は、EGL内顆粒細胞前駆体を定義します。様々な細胞の形態は明確に3 DIVで表示され、細胞の挙動を監視することができます。 （D）GFPを駆動するNeuroD1遺伝子の推定保存された非コード要素（CNE）を含む構築物のエレクトロポレーション次標識化の例。 CNEは、開発中のこのCNEの積極的な役割を示唆している内因性NeuroD1発現に基づいて予想される細胞の活動を報告します。 NeuroD1の発現は顆粒細胞の分化の開始と相関します。 （E）組織は、遺伝的にNeuroD1タンパク質の異所性発現および顆粒細胞behavの変化により操作することができる例iourを観察することができます。 （F）電気穿孔組織を（GFPプラスミドを制御する）固定や、ホスホヒストンH3（PH 3）などの増殖細胞のマーカーのために染色することができる例。 =50μmのスケールバーCFは、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

培養中の4組織の完全性および増殖を図。 （A - C）は、インビトロ（DIV）で 1~3日でコントロールGFPプラスミドでエレクトロE14小脳組織のカルビンジン染色。カルビンジン染色は組織の完全性を少なくとも3 divのために培養物中で維持されることを示しています。プルキンエ細胞層は、ニワトリ開発のこの段階で単分子層を形成しないが、それは明らかに下の層を形成わかります顆粒細胞（緑）が配置されているEGL。 2 DIV培養小脳組織の（D）Phosphohistone H3（PH 3）染色。 PH 3染色はEGL（矢印）ではなく、他の小脳領域（矢印）で表示されます。この染色を調べ、培養中のすべての段階（1-3 DIV）の代表です。スケールバー=50μmのADは、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

ここで報告プロトコルは、解剖電気穿孔とひよこから胚14日目小脳のスライスを培養するための方法を説明します。このプロトコルは、個々の小脳ローブの孤立したターゲティングを含むEGLの小さな焦点領域にエレクトロポレーションのターゲティングが可能。これは、高解像度と利便性で遺伝子解析とイメージングを可能にし、低コストでげっ歯類^43-47で確立された技術と比較。このような分析が原因変更がEGLに影響を与える可能性があるということを意味し、拡張発育期間、マウスでEGL-特異的な遺伝子ターゲッティング可能性の不足、及び菱形リップとEGLの間の分子メカニズムの共通性、 インビボで現在は不可能です彼らは菱形リップ神経発生に影響を与え、EGLの形成^{49を無効に}するので生物学は頻繁に分析することができません。私たちのシステムは、このようにEGL sに遺伝子改変をターゲットの面で大きな進歩を表していますpecifically、そして我々はそれがこのような非モデル哺乳類や爬虫類など多分比較関心のひよこを越えて他の種に適用されます期待しています。

スライス培養エレクトロポレーション法を行う際には、技術的な検討事項の数が最も重要です。まず、大規模な細胞死を受けている一方で、または他失う構造的完全性にすることなく、文化の中で生き残るためにスライスの堅牢性は、私たちの手の中に300μmのスライスの厚さを制限します。第二の重要な考慮事項は、遺伝的改変の可視または関連するレベルを誘導するのに十分に高い濃度でDNAのエレクトロポレーションを確実にDNA溶液の粘度です。初期胚の後脳に注入DNA溶液のOVOエレクトロポレーションでは、約1％の高速グリーン染料の濃度が典型的です。しかし、我々のプロトコルでは、我々は一般的に20％の高速グリーンの濃度を使用しています。これは十分にVISを保証cous DNA溶液をピペッティングが、エレクトロポレーションの前に、以下のDNAの飛散を防止するために、しかし、十分に効率的な電気伝導を媒介するために1を希釈。

これらの技術的な考慮事項に加えて、我々はex vivoで観察し、その増殖挙動を観察し軟膜整合性は組織調製によって破壊されることにおそらくin vivoでの研究から予測されない正確に一致します。 GFP発現構築物がエレクトロポレーションされたときにこのような条件下では、エレクトロポレーションした細胞の大部分は、PH 3染色（ 図3F）によって判断されるように文化のちょうど1日後、細胞周期を残しているように見えます。これはマウスとニワトリの両方でクローンの増殖が大きい期間²⁷にわたって延び期待EGL増殖挙動と相関しません。 PIAは増殖を調節することを含意は、我々は、レポーターconstrucをエレクトロポレーション時という観察によって支持されていますNeuroD1調節エレメントは、すべてのエレクトロポレーションした細胞は、培養中の1日（ 図3D）の後にGFPを発現するGFPの発現を駆動すると、T。 インビボ 、この構築物は、有糸分裂後の^36,37ですインナーEGLの細胞をマーキングにおける内因性NeuroD1の発現を反映し全長NeuroD1は細胞分化（ 図3E）を駆動するのに十分であるが。これは、 インビボでの同等の段階で外側にEGLであるような特定の条件下では、細胞の増殖能力を維持できないことを示唆しています。 PH 3の染色は、しかし、多くの場合、EGLエリア（ 図4D）に局在し、培養中の増殖の多くは、そこにあることを示唆しているん。 EGL外広範な増殖が白質にPAX2 GABA作動性前駆体の可能性が強化された神経膠形成または増殖を示しています。意味は、任意の実験手順の解釈は、アカウントに上記proliferativを取らなければならないということです電子の振る舞い、プルキンエ細胞は、ニワトリでE18まで単層を形成し、通常の開発は（登山繊維などとの相互作用が不足しているため、例えば ）スライス標本後に損なわれる可能性があることないという事実

これらの制限にもかかわらず、我々のプロトコルは、顆粒細胞生物学の多くの側面を研究に関連した重要な一歩を表しています。菱形リップと区別して空間的かつ時間的にEGLの特異的標識を可能にする重要な利点は、顆粒前駆細胞の細胞生物学の両方と、in vivoで 、現時点では不可能であるようにし、それを支える遺伝子調節の複数の検査を容易にするであろう。ひよこにおける当社の技術は、げっ歯類^43-48内の既存のex vivo培養およびエレクトロポレーションプロトコルを補完し、ひよこに関連付けられているコストと利便性にかなりの利点を運ぶでしょう。さらに、それはよりも大幅な進歩を示します顆粒前駆細胞^{39を培養する}既存の技術。それは補完ではなく、後者を交換しますが、私たちのプロトコルは薬品治療の多種多様にし、ヒナが可能である細胞自律的な遺伝子操作の多様性に顆粒ニューロン分化の制御を開きます。これは前例のない詳細に顆粒細胞生物学を調べるための基盤を提供します。

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Acknowledgments

この記事で紹介した方法は、BBSRC BB / I021507 / 1（TB、RJTW）から資金提供を受け、仕事とMRC博士学生の身分（MH）から生じました。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
McIlwain tissue chopper	Mickle Laboratory Engineering Ltd		Cut at 300 μm for best results.
Basal Medium Eagle (Gibco)	Life Technologies	41010-026
L-glutamine	Sigma	G7513
penicillin/streptomycin	Sigma	P4333
0.4 μm culture insert	Millipore	PICM0RG50
TSS20 Ovodyne electroporator	Intracel	01-916-02	Use 3 x 10 V, 10 msec pulses for electroporation.